JPH11509554A - 精製核酸の製法及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１％未満の含量のタンパク質、好ましくは、0.1％未満の含量のタンパク質をもち、臭化エチジウム、フェノール、塩化セシウム及びオクチル・フェノール・ポリ（エチレン・グリコール・エーテル）_nに基づく界面活性剤を含まず、そして１EU／mg DNA未満の含量の内毒素をもつ核酸調製物に関する。本調製物は、特に遺伝子治療における医薬として好適である。

Description

【発明の詳細な説明】 精製核酸の製法及びその使用 本発明は、精製核酸の製法及び特に遺伝子治療におけるその使用に関する。 複製可能な核酸は、通常、グラム陰性バクテリア、例えばイー・コリ(E．coli )内で複製可能なプラスミドDNAを増幅することにより製造される。そのバイオマ スの溶解（通常、リソザイム又は超音波によるアルカリ分解）の後、それは遠心 分離され、そしてその上清はフェノールを用いて振とう分離される。次に、塩化 セシウム勾配上の超遠心分離が行われる(Birnboim & Doly，Nucleic Acid Res． 7（1979）1513-1523，Garger et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm．117（198 3）835-842)。しかしながら、このような調製物は、内毒素、フェノール、塩化 セシウム及び／又は染料としての臭化エチジウムを含む。 atsworth，USA)とEP-B 0 268 946中に記載されている。この方法に ィーにかけられる。この方法の欠点は、DNA結合性タンパク質がそのDNAから完全 に脱着されず、そしてそれ故、その精製されたプラスミド画分が、かなりの量の タンパク質及び特に（そのグラム陰性宿主細胞の膜からの）内毒素を含むという ことである。 E．coliバイオマスのアルカリ溶解後の他の方法において、その遠心分離上清 は、アニオン交換カラム（例えば、PharmaciaからのMono-Q、Source-Q、BioRad からのMacroprep-Q、Perseptive Biosy stemsからのPoros-Q又はBiosepraからのHyper D-Q、N Chandra et al.，Analyt ．Biochem．203（1992）169-172；Dion et al.，J．Chrom．535（1990）127-147 参照）上の高温条件下でBirnboim & Dolyに従ってクロマトグラフィーにかけら れる。この場合においても、その精製されたプラスミド画分は、かなりの量でタ ンパク質及び特に内毒素を含む。 他の方法においては、アルカリ溶解及びその後のフェノール／クロロホルム抽 出後、ゲル濾過によるクロマトグラフィーにかけることができる(McClung & Gon zales，Analyt．Biochem．177（1989）378-382；Raymond et al.，Analyt．Bioc hem．173（1988）125-133)。この精製の後でさえ、このプラスミド調製物は、不 純物及び特にフェノールを含む。 遺伝子治療における使用のための核酸の単離及び精製のための方法は、WO 95 ／21177中に記載されており、ここでは、その精製は、本質的に、遠心分離、濾 過、アフィニティー・クロマトグラフィー又はその後のイオン交換基上のクロマ トグラフィーを伴う無機クロマトグラフィー材料上のクロマトグラフィーにより 行われる。内毒素の追加の除去は、次に、WO 95／21177に従って達成されるこ 去バッファー及び40mmol／ｌ MOPSバッファー（３−モルフォリノ−１−プロパ ンスルホネート・バッファー）により処理される。こ ッファーの不純物を含むということである。内毒素は、約100EU／mg DNAの含有 量まで上記方法により除去されることができるけれども(Qiagen News 1／96，3- 5)、この方法によりより高い程度まで内毒素を除去することは不可能である。 しかしながら、治療用途のために、例えば遺伝子治療のために、 不純物の全てをできるだけ含まない（特に、内毒素を実質的に含まない）核酸調 製物が要求される。とりわけ、プラスミド調製物の内毒素含量は、例えばCotten et al.，Gene Therapy 1（1994）239-246により記載されるように今日まで未解 決の問題であった。減少された内毒素含量（約100EU／mg DNA）は、その核酸が 非イオン界面活性剤、例えばTriton（WO 95／21177からの内毒素除去バッファー ）で処理される場合に、例えば、WO 95／21177に従う技術水準 、生物学的作用、例えば肺変化（lung changes）又は血圧低下をもつ(Fiedler, “Lexikon der Hilfstoffe fuer Pharmazie und Kosmetik und angrenzende Geb iete(Band 9，3rd edition，1989，Editio Cantor，DE))。さらに要求されるMOP Sバッファーも、治療用途に関してやっかいな物質を含む。 本発明は、内毒素が実質的に除去され、そして好ましくは臭化エチジウム、フ ェノール、塩化セシウム、ポリミキシン又は非イオン界面活性剤を含まない高純 度の核酸調製物、好ましくはプラスミドDNAを提供し、そしてまた、特に内毒素 除去のためのこのような核酸の単純かつ有効な精製方法を提供する。 本発明は１未満のタンパク質含量、好ましくは0.1％未満のタンパク質含量及 び１EU／mg DNA未満の内毒素(endotoxin)含量、好ましくは0.01〜0.1EU／mg DNA の内毒素含量をもつ、グラム陰性バクテリア内で複製されることができる核酸、 好ましくはプラスミドDNAに関する。このプラスミドDNAは、好ましくは臭化エチ ジウム、フェノール及び塩化セシウムを含まず、オクチルフェノールポリ（エチ レン・グリコール・エーテル）_nに基づく界面活性剤、例え びRNAseを含まない。 増幅は、ベクターの複製に基づく核酸(特にDNA及びプラスミドDNA)のコピー数 の増加として理解される。この方法においては、多数のコピーが１の鋳型から作 られる。上記核酸を提示し又はそのクローン化された核酸を含むベクターが複製 される。 プラスミドDNAは、染色体外DNA２本鎖分子と理解される。DNAプラスミドのサ イズは、通常、１〜200kb超であり、そして１〜数百のコピーが宿主細胞内に存 在する。プラスミドDNAは、通常、グラム陰性バクテリア、例えばE．coli内で増 幅され、そしてその後単離される。プラスミドは、しばしば、原核及び真核細胞 のトランスフェクションのための、クローニング・ベクターを構築するために、 使用される。治療用途は、インビボ及びエクスビボの遺伝子治療の点で、特に重 要である。治療的に使用されるプラスミドDNAは、好ましくは、５〜20kb、特に 好ましくは５〜10kbの長さをもち、そして２本鎖である。上記プラスミドDNAは 線状であることも環状に閉じていることもできる。好ましくは、本質的に環状に 閉じたDNAが使用される。 従って、本発明はさらに、治療的有効量における本発明に係る核酸、好ましく はプラスミドDNA、及び場合により追加の医薬補助物質、増量剤又は添加物を含 む医薬組成物に関する。 内毒素は、グラム陰性バクテリアからのリポポリサッカライドである。内毒素 は、哺乳類における発熱物質効果をもち、そして内毒素ショックを誘発すること ができる。内毒素の主要な毒性成分は、リピッドＡ(lipid A)であり、その多糖 部分が水溶性を仲介し、そしてその脂質部分が毒性効果をもつ。哺乳類における 内毒素の生物学的効果は、特に過敏症、及び発熱に伴う他の反応である。 プラスミドDNAは、E．coli、すなわち、グラム陰性バクテリア内で標準的な方 法により増幅される。発酵の後、その方法において 得られたバイオマスが溶解され、そしてその細胞が溶解される。この方法におい ては、その内毒素はその細胞膜から放出される。これは、このプラスミドDNAが 治療的に使用することを意図される場合に、グラム陰性バクテリア、特にE．col i内での核酸、特にプラスミドDNAの増幅後に、内毒素を除去することが必要であ る。 その用途に依存して、50μｇ〜10mg以上の投与量が、複製可能な核酸、特にプ ラスミドDNAの治療用途のために使用され又は計画される。この投与量は、その 疾患及び投与のタイプに依存する。例えば、嚢胞性線維症の治療のためのエアロ ゾルにおいては、400μｇ以上の投与量が使用される。これは、脂質複合体（例 えば、リポソーム）内に封入されたプラスミドDNAにも同様に適用される。治療 的に使用されることができる複製可能な核酸の上記量を提供するためには、その 複製可能な核酸を大規模に製造することが必要である。このためには、１〜５ｇ の核酸がそれから単離されることができるところの１〜５kgのバイオマスをもつ 発酵調製物が好都合である。 本発明は、１EU／mg DNA未満の、好ましくは、0.01〜0.1EU／mg DNAの内毒素 含量をもつプラスミドDNAの製法であって、プラスミドDNAがグラム陰性バクテリ ア内で複製され、そのバイオマスが溶解され、そしてその可溶性成分がヒドロキ シルアパタイト上でクロマトグラフィーにかけられ、そしてその後そのプラスミ ドDNAが単離されることを特徴とする、前記製法にも関する。ヒドロキシルアパ タイト上のクロマトグラフィーの前に、RNAと外来タンパク質を本質的に除去す るイオン交換クロマトグラフィーを行うことが好ましい。これは、場合によりさ らに不純物を除去することができ、そして臭化エチジウム、フェノール及び塩化 セシウムを含まない１％未満のタンパク質、好ましくは0.1％未満のタンパク質 の核酸含量 を達成することができる。このような調製物は、好ましくは、オクチルフェノー ル・ポリ（エチレン・グリコール・エーテル）_nに基づく界面活性剤及びNOPSバ ッファー物質をも含まない。 本発明に係る方法は、それが当業者に馴染みのある方法により製造される場合 に、プラスミドDNAが含有する多数の不純物が回避され又は除去されることを可 能にする。とりわけ、驚ろくべきことに、簡単なやり方でその内毒素含量をドラ スティックに減少させることができる。 本発明に係る方法においては、内毒素の顕著な除去が、ヒドロキシルアパタイ トを用いたクロマトグラフィーにより達成される。これは、なおさら驚ろくべき ことである。なぜなら、ヒドロキシルアパタイト上のクロマトグラフィーは、DN A及びRNAを分離するための文献においてのみ使用されているからである(Johnson & Ilan，Analyt．Biochem．132（1983）20-25)。 ヒドロキシルアパタイトのクロマトグラフィー効果は、本質的に、カルシウム²⁺ 基と精製されるべき核酸の負電荷との間の相互作用に、そしてより低い程度に 、精製されるべき核酸と結晶性ヒドロキシルアパタイトの表面上のPO₄ ^3-基との 相互作用に基づく（例えば、Protein Purification Methods，Ed．by Elv．Hari es and S．Angal，Oxford University Press 1989，238-244参照）。ヒドロキシ ルアパタイト上のクロマトグラフィーは、本質的には、結合したDNAがヒドロキ シルアパタイト・マトリックスから、イオン強度（例えば、NaCl）の単なる増加 によっては溶出されることができないが、むしろ好ましくはホスフェート又はシ トレート、２価金属イオン及び／又はEDTA濃度の増加によって溶出されることが できる、核酸についてのイオン交換段階ということができる。 本発明に係る方法においては、内毒素と精製されるべき核酸は、 まず、主に、ヒドロキシルアパタイト上のクロマトグラフィー(例えば、Biorad DEからのHA-ceramic、BioGel HPHT、Bio-Gel HT/HTP、IBFからのHA-Ultrogel又 はBDHからのHA-spheroidal、Sterling OrganicsからのMacrosorb C)における双 極子−双極子相互作用を介して、ヒドロキシルアパタイトに結合される。この平 衡は、通常、ホスフェート・バッファー中の中性pHにおいて行われる。例えば、 そのカラムのその後の洗浄において変性剤が好ましくは添加される。驚ろくべき ことに、その内毒素を結合したままにして、ホスフェート、シトレート又はカル シウム・イオンを用いて、ヒドロキシルアパタイトへのその結合からその核酸を 変位させることができる。カルシウムの代わりに、ヒドロキシルアパタイトへの その結合からのその核酸の置換は、そのアパタイト中でカルシウムを置換するこ とができる他の２価金属イオン、例えばMg，Fe，Mnによって達成されることがで きる。溶出のためには、そのイオン濃度は、好ましくは、100mmol／ｌ以上であ る。100〜500mmol／ｌ又は200〜500mmol／ｌの間のイオン濃度が特に好ましい。 ホスフェート・イオンを含む溶液（例えば、ホスフェート・バッファー）が、特 に好ましくは使用される。（変性剤によらない）溶出の前に、（変性剤を用いて ）洗浄することが好都合である。例えば、DNA変性濃度（例えば、６mol／ｌウレ ア）において変性剤（例えば、ウレア又はグアニジン・ヒドロクロリド）がそれ に添加されているところのスルフェート溶液のホスフェート（100〜200mmol／ｌ ）を使用することが有利であることが判明している。 好ましい態様においては、限外濾過が、さらに、ヒドロキシルアパタイト上で のクロマトグラフィーの後に行われる。 本発明に従って核酸を製造するために、その核酸を提示し又は含むプラスミド を、通常、グラム陰性バクテリアの培養において増幅 させる。このような方法は、当業者に知られており、そして例えば、Sambrook e t al．(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press及びF．M．Ausubel et al.，eds．(1991)，Cur rent Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New Yorkにより 記載されている。このために、そのプラスミドを含むバクテリアのカルチャーを まず、事前培養し、そしてその後、場合により選択剤の添加を伴って好適な培地 中で培養する。 上記バイオマスは、RNAseの添加によらない当業者に馴染みのある方法（機械 的な溶解又は酵素による溶解、例えば、Birnboim and Doly，Nucleic Acids Res earch 7（1979）1513-1423）によっても溶解される。そのタンパク質がアニオン 交換基上のクロマトグラフィーにより分離される場合には、フェノールを用いた 振とう分離を省略することができる。好ましくは、遠心分離及びフィルター・キ ャンドル（５μｍ孔）上での濾過による不溶性成分の溶解及び分離の後、その細 胞上清は、好ましくは、まず、タンパク質を除去するためにアオニン交換基上で クロマトグラフィーにかけられる。好適なアニオン交換基は、アガロースに基づ くアニオン交換基、例えばQ-Sepharoseである。他の好適なアニオン交換基は、 ポリメタクリレート（Macroprep／Bio-Rad，Germany）、ポリスチレン／ジビニ ルベンゼン（Poros／Perseptive，Hyper D／Biosepra，Source／Pharmacia）又 は、その表面上に、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）又はジメチルアミノエ チル（DMAE）基が結合されているところのシリカ・ゲルに基づくものである。 精製効果を最適化するために、核酸は、TEバッファー中の高塩勾配、例えばNa Cl勾配（好ましくは、0.65mol／ｌ〜0.85mol／ｌ）により溶出される。これは、 驚ろくべきことに、多数の不純物（RNA 、タンパク質）が１段階で分離されることを可能にする。 その生物負荷を最小化し、そして脱塩のために、好ましくは、ヒドロキシルア パタイト・クロマトグラフィーの後に、追加のイソプロパノール／エタノール沈 殿を行うことも好ましい。その後、本発明に係る核酸は、無菌条件下でボトルに 入れられることができる。 以下の実施例は、本発明をより詳細に記載する。 実施例１ E．coliバイオマスからの核酸の単離 プラスミドDNAを含むE．coliバイオマスを、アルカリ溶解により溶解し、そし てその放出されたプラスミドDNAを、Q-Sepharose及びHA-Ceramic上でクロマトグ ラフィーにかける。この溶出液を、イソプロパノール／エタノール沈殿により脱 塩し、そして濃縮し、そしてそのプラスミドDNA沈殿物をTEバッファー中に再懸 濁させる。 再懸濁バッファー：50mmol／ｌ Tris／HCl，10mmol／EDTA-Na２，pH8.0±0.2 酢酸カリウム・バッファー：３mol／ｌ酢酸カリウム・バッファーpH5.5 発酵槽からの60ｇバイオマス(湿、E．coli)を、脱発熱源遠心分離ビーカー内 に満たす。750ml再懸濁バッファーを添加し、そしてそのバイオマスが完全に懸 濁されるまで、５±４℃において少なくとも24時間にわたり、それを、ゆっくり と(約35rpm)撹拌する。この行程の間、その懸濁液の温度を25℃までゆっくりと 上昇させる。 750ml 0.2mol／ｌ NaOH/１％SDSを、約80rpmにおいて撹拌しながら上記懸濁 液に添加し、そして25℃で５分間インキュベートする。750ml酢酸カリウム・バ ッファー（上記参照）を撹拌しながら 添加し、そしてそのバイオマスの温度を、４℃までできるだけ速く低下させる。 このバイオマスを、26000×ｇ及び４℃において30分間遠心分離する。プラス ミドDNAを含む上清を、デカントし、そして５μｍフィルター・キャンドル上で 清澄に濾過する。 Q-Sepharose ff上でのクロマトグラフィー： バッファー：10mmol／ｌ Tris-HCl，１mmol／ｌ EDTA pH8.0±0.2 平衡／洗浄バッファー＝勾配（グラジエント）バッファーＡ：10mmol／ｌ Tr is-HCl，１mmol／ｌ EDTA，0.65mol／ｌ NaCl pH8.0±２。 グラジエント・バッファーＢ：10mmol／ｌ Tris-HCl，１mmol／ｌ EDTA，0. 85mol／ｌ NaCl pH8.0±0.2。 デカントされた遠心分離上清を、約350mlのTEバッファー／遠心分離上清の添 加により、49〜50mS／cm導電率に調整し、そして５±４℃に冷却する。このクロ マトグラフィー全体をこの温度で行う。遠心分離上清を、５〜８カラム容量（CV ）／時において平衡カラムに通す。その後、このカラムを、５〜８CV／時の流速 において、約８CV 10mmol／ｌ Tris-HCl，１mmol／ｌ EDTA，0.65mol／ｌ N aCl pH8.0±0.2で洗浄する。 溶出 グラジエントをカラム（５CVバッファーＡ，５CVバッファーＢ）に通し、そし て溶出液を、５〜８CV／時の流速で分画する。この検出を254nmで行う。ピーク 前（不純物）を、別個の容器内に、増加する側面前方（increasing flank onwar ds）からメイン・ピークを採取することにより、そのメイン・ピーク(プラスミ ドDNA)から分離する。この溶出物の内毒素含量は、1200〜12000EU／mgプラスミ ドDNAの間にある。 ヒドロキシルアパタイト（HA ceramic）上のクロマトグラフィー 上記クロマトグラフィーを、５±４℃で行う。 平衡バッファー：0.1mol／ｌリン酸カリウム、６mol／ｌウレアpH7.0±0.2 洗浄バッファー１：0.15mol／ｌリン酸カリウム、６mol／ｌウレアpH7.0±0.2 洗浄バッファー２：0.02mol／ｌリン酸カリウム・バッファーpH7.0±0.2 溶出バッファー：0.5mol／ｌリン酸カリウムpH7.0±0.2 検出を、UV検出器／プロッター装置を使用して254nmで行う。換算光度計を用 いて計測された１％生成物溶液（プラスミドDNA）を、換算溶液として使用する 。 度に調整し、そして５〜８CV／時の流速で平衡化カラムに通す。 その後、そのカラムを、５〜８CV／時の流速で、以下の： 1. 0.1mol／ｌリン酸カリウム、６mol／ｌウレア pH7.0±0.2、（吸光度が上 記検出器でもはや検出可能でなくなるまで） 2. ２〜４CV，0.15mol／ｌリン酸カリウム、６mol／ｌウレア pH7.0±0.2 3. ５CV，0.02mol／ｌリン酸カリウム pH7.0±0.2で、続けて、洗浄する。 上記洗浄段階の後、それを、５〜６CV／時の流速で0.5mol／ｌリン酸カリウム ・バッファー pH7.0±0.1で溶出する。 上記ピークを集め、25℃に加熱し、そしてその容量の10％の４mol／ｌ KCl溶 液を添加する。その後、(上記溶出液の容量に対して)0.7容量部のイソプロパノ ールを添加し、上記溶液を混合し、そし て25℃において５〜10分間インキュベートする。それを、≧20,000×ｇで30分間 遠心分離する。そのプラスミドDNAは沈殿物中に在る。 20ml 70％ エタノールを上記沈殿物に添加し、そして４℃において≧20,000 ×ｇで10〜15分間再び遠心分離する。 プラスミドDNAを含む沈殿物を、TEバッファー(10mmol／ｌ Tris-HCl，１mmol ／ｌ EDTA pH8.0±0.2)に再懸濁させ、そして１mg／mlのプラスミド濃度に調整 する。内毒素含量は、典型的には、0.06EU／mg DNA未満、そして0.01〜0.06EU／ mg DNAの間にある。 上記内毒素含量は、調べられる予定の溶液にカブトガニ変形細胞（limulus am oebocyte）溶解産物溶液（LAL溶液）を添加することにより測定される。内毒素 は、この混合物中でゲル形成をもたらす。 ネガティブ・コントロールにおいてはゲル形成は全く生じないはずであり、そ して、ポジティブ・コントロール並びに２つのλコントロール標準内毒素を補っ たサンプル溶液においては、ゲル形成が生じるはずである。 それについて上記基準が適用される活性物質の溶液及びゲル形成が全く生じな い溶液の最初の希釈段階は、以下の式に従って活性物質の溶液の内毒素含量を計 算するために使用される： Ｅ＝Ｖ×λ（EE／ml） Ｅ：内毒素含量 Ｖ：希釈率 λ：溶解産物感受性（EE／ml） 実施例２ 技術水準に従うプラスミド調製 プラスミド調製を、Birnboim et al.，Nucl．Acids Res．7（1979）1513-1523 及びMeth．Enzymol．100（1983）243-255と同様に行 う。従って、バクテリア細胞は、RNaseの存在下NaOH／SDS中で溶解される。それ を遠心分離し、そしてプラスミドDNAを含む上清を にロードする。 バクテリアのマスを、４mlバッファー(100μｇ／ml RNase A，50mmol／ｌ Tr is-HCl，10mmol／ｌ EDTA，pH8.0)中に再懸濁させる。４ml溶解バッファー(200 mmol／ｌ NaOH，１％SDS)を添加し、そしてそれを室温で５分間インキュベート する。その後、４ml中和バッファー(３mol／ｌ酢酸カリウム、pH5.5)を添加し、 そして４℃で15分間にわたりインキュベートする。それを、同一温度で30,000× ｇにおいて30分間遠心分離し、そしてその上清をさらに処理する 0)で平衡化し、そしてその上清を上記カラムに通す。それを、１mol／ｌ NaCl ，50mmol／ｌ MOPS，15％エタノール、pH7.0で洗浄し、そして５ml溶出バッフ ァー(1.25mol／ｌ NaOH，50mmol／ｌ Tris-HCl，15％エタノール、pH8.5)で溶 出させる。 この溶出液を、イソプロパノール(0.7容)で沈殿させ、そして４℃で15,000× ｇにおいて30分間遠心分離する。このDNAペレットを70％エタノール中で洗浄し 、そして再び遠心分離する。次に、このペレットを、10mmol／ｌ Tris-HCl，１ mmol／ｌ EDTA，pH8.0中に再溶解させる。 このようなプラスミド調製物の内毒素含量は、典型的には、300〜3000EU／mg である。WO 95／21177及びQiagenニュース１／96，ｐ．３〜５に従う内毒素除去 バッファーを使用して、その内毒素含量を、約100EU／mgまでさらに減少させる ことができる。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年８月３日 【補正内容】 請求の範囲 １．0.1％未満のタンパク質含量及び１EU／mg DNA未満の内毒素含量をもつ核 酸調製物。 ２．治療的有効量の0.1％未満の含量のタンパク質及び１EU／mg DNA未満の量 の内毒素をもつ複製可能な核酸、及び場合により医薬補助物質、増量剤又は添加 物を含む医薬組成物。 ３．１EU／mg未満の内毒素含量をもつ核酸の製法であって、その核酸がグラム 陰性バクテリア内で複製され、そのバイオマスが溶解され、そしてその可溶性成 分がヒドロキシルアパタイト上でクロマトグラフィーにかけられ、そして上記核 酸がホスフェート−、シトレート−、スルフェート・イオン又は２価金属イオン により、ヒドロキシ・アパタイトへのその結合から置換されることにより溶出さ れ、そして単離される、前記製法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．0.1％未満のタンパク質含量及び１EU／mg DNA未満の内毒素含量をもつ核 酸調製物。 ２．0.01〜0.1EU／mg DNAの内毒素含量をもつ、請求項１に記載の核酸調製物 。 ３．臭化エチジウム、フェニル、塩化セシウム、MOPSバッファー物質及びオク チルフェノールポリ（エチレン・グリコール・エーテル）_nに基づく界面活性剤 を含まない、請求項１又は２に記載の核酸調製物。 ４．前記核酸がグラム陰性バクテリア内で複製されることができる、請求項１ 〜３のいずれか１項に記載の核酸調製物。 ５．前記核酸がプラスミドDNAである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の 核酸調製物。 ６．前記プラスミドDNAが複製可能である、請求項５に記載のプラスミドDNA。 ７．治療的有効量の0.1％未満の含量のタンパク質及び１EU／mg DNA未満の量 の内毒素をもつ複製可能な核酸、及び場合により医薬補助物質、増量剤又は添加 物を含む医薬組成物。 ８．0.01〜0.1EU／mg DNAの内毒素含量を特徴とする、請求項７に記載の医薬 組成物。 ９．１EU／mg未満の内毒素含量をもつ核酸の製法であって、その核酸がグラム 陰性バクテリア内で複製され、そのバイオマスが溶解され、そしてその可溶性成 分がヒドロキシルアパタイト上でクロマトグラフィーにかけられ、そして上記核 酸が単離される、前記製法。 10．エクスビボ及び／又はインビボの遺伝子治療のための医薬製 剤の製造のための、0.1％未満の含量のタンパク質及び１EU／mg未満の含量の内 毒素をもつ複製可能な核酸の使用。