CN107920994A - 用于治疗目的的板层小体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

生物膜的生成提供了多个微生物一个多层结构的群落，所述多层结构化群落附着在一表面，并且被包裹在一外聚合物材料的一基质中，所述生物膜的生成与向上调节的感染毒性相关联，并且能够限制免疫系统的反应和/或多个治疗剂的效果。本发明提供一种将多个板层小体应用于调节群体感应的用途，以抑制或减少生物膜的生成以及用于多个微生物感染的治疗。

Description

用于治疗目的的板层小体的组合物和方法
技术领域
本发明有关于将多个板层小体应用于调节群体感应的用途，以抑制或减少生物膜的生成。生物膜的生成提供多个微生物一个多层结构的群落，所述多层结构化群落附着在一表面，并且被包裹在一外聚合物材料的一基质中，所述生物膜的生成与向上调节的感染毒性相关联，并且能够限制免疫系统的反应和/或多个治疗剂的效果。因此，多个板层小体在多种微生物感染的所述治疗中具有一个重要作用。
背景技术
阻断细菌中的群体感应已被确定可以阻止所述多个细胞起始多个行为，例如毒性因子的生成，所述毒性因子的生成是通过群体感应被同步化(Rutherford,S.T.和Bassler,B.L.的《细菌群体感应：在毒性的重要性及控制群体感应的多个可能性》(2012))。进一步地，已形成多个生物膜的多个微生物感染的地方越趋具有临床意义，并且难以使用多个抗生素治疗。多种持续性慢性感染通常涉及多个微生物生物膜的所述形成。
多个生物膜是嵌入在一自体生成的细胞外聚合基质中的多个密集堆积的多个微生物细胞群落。所述多种生物聚合物的基质如DNA、蛋白质和多糖保护所述多个微生物细胞免于脱水、所述免疫系统及多个抗菌剂。多个生物膜可以与多种真菌物种例如白色念珠菌，多种细菌例如假单胞菌，多种病毒例如HTLV-1，以及多种原生动物例如棘阿米巴相关。在多个生物膜中生长的所述多个微生物细胞在生理学上不同于相同生物体的多个浮游细胞，所述多个浮游细胞为在一液体介质中的多个单细胞。多个临床上重要的细菌如假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克氏菌属(Burkholderia)和葡萄球菌属(Staphylococcus)所形成的多个生物膜保护它们免于宿主的所述免疫防御和多个抗生素。生物膜的形成已经与许多慢性感染和疾病，例如囊性纤维化(CF)相关联，以及与植入的医疗装置相关的感染包括支架、分流器、人工关节、植入物、气管导管和导管。以及在所述免疫系统和多个抗感染剂中屏蔽多个微生物，多个生物膜还具有堵塞多管线、水棚、储藏区和污染食品的能力。
一般而言，细菌在生长和增殖期间具有两种生命形态，在当它们执行单独的行为的时候的周期以及在当他们执行多个群体行为的时候的周期之间循环。在所述前者，细菌是以多个单一、独立、活跃地分裂及生长的(浮游动物)细胞存在，而在所述后者，它们被组织成多个细胞聚集体，具有一减少的(固着的)代谢活动，但具有一增加的能力通过对于多个抗生素或所述免疫防御系统的回复力以导致疾病(毒性)。所述多个转变是通过一种被称为群体感应的细胞至细胞的通信过程所控制。多个群体感应分子被释放、累积，以及同时地被一群细菌侦测，导致在整个社区范围内的基因表达的细菌发生变化，以共同执行多个行为，例如生物发光、生物膜的形成以及进一步地毒性因子的生成。
已有一些证据提出，如同在多个固着的细胞中所观察到的，下降的生长速度可以有助于抗药性。所述多个固着的聚集体通常被称为生物膜生长表现型，以识别在此状态下的所述多个细菌的所述基因表达情况。当多个细菌在多个水性环境中粘附在多个表面上时会形成多个生物膜，并且开始分泌一种粘性的、胶状的物质。典型地，所述第一个细菌群聚者最初通过引发多个被称为范德华力的微弱、可逆的键结而粘附到一表面上，如果所述细菌群聚者没有被立刻与表面分离，则它们可以使用多个细胞粘附分子以更永久地锚定自己。所述多个细菌群聚者通过提供更多样的粘附位点来促进其它病原体的所述来临。它们也开始构建基质，所述基质把保持所述生物膜在一起。如果存在不能与它们自身的表面连接的物种，它们经常能够将它们自己锚定到所述基质上或是直接连接到多个较早的细菌群聚者。
所述生物膜的所述基质或外聚物物质(EPS)包裹多个固着的细胞群落，被认为作为对于所述宿主的多个天然防御机制的有效部署的一屏障，以及作为对多个抗生素的扩散和/或与多个抗生素结合的带电表面的一屏障。多种生物膜为基础的慢性感染通常对于多个抗生素和许多其它传统的抗菌剂具有极度的耐受性，此外，还具备一种极度的能力用于预防所述宿主的防御。生物膜的抗生素耐受性不应与抗生素抗药性混淆，虽然在一生物膜内的多细菌倾向于在抗生素治疗中存活，但当所述生物膜被破坏或去除时，生物膜内的细菌对所述治疗变得敏感。
目前，为了预防或抑制多种细菌生物膜感染，有两种方法被使用：(1)早期侵袭性抗生素治疗；以及(2)长期的抑制性抗生素治疗，在当所述生物膜被建立时以及如果不能物理性地去除生物膜时。然而，治疗细菌生物膜的所述多个抗生素的给药经常需要组合高剂量的几种不同的抗生素，并且使用一段延长的时间，由于传统的抵抗机制会加强所述天生的生物膜耐受性机制。因此，存在一公认的需求以开发一种更有效的方法治疗多个微生物生物膜相关的感染，所述感染包括抑制，破坏或去除所述细菌生物膜，使得所述微生物能被宿主的免疫系统和/或抗生素破坏。通常与生物膜的形成并行地向上调节的所述感染的所述毒性情况以及一固着状态的转变也被减少。
发明内容
所述发明人已经测定出多个板层小体能够：干扰细菌用来从浮游动物变成固着状态的所述群体感应讯息系统；移除多个生物膜，特别是多个细菌的生物膜；抑制生物膜的形成；和/或增加细菌的细胞壁的渗透性。特别地，所述发明人已经测定出将多个板层小体施用至一患有微生物感染的宿主主体，致使针对所述多个微生物的一增强的免疫反应和/或提供至所述宿主主体的多个抗生素的所述增强，以抑制所述多个微生物的所述生长或破坏。
在广泛的实验之后，本发明人发现板层小体能够通过破坏和/或移除生物膜增强所述宿主的免疫反应，从而使所述微生物保持或还原至一浮游状态。由于不希望受到理论所约束，所述发明人认为所述多个板层小体破坏生物膜，特别是细菌的生物膜，并且抑制或中断细菌生成和/或释放所述群体感应的分子，以致抑制了所述多个细菌彼此之间的沟通，所述沟通是细菌开始生物膜生成和表达多个毒性相关基因的所述“决定”的一必需的前体。因此，所述生物膜被移除，并且减少或防止所述生物膜的形成，使细菌对于宿主的防御和/或抗感染治疗更敏感。
根据本发明的一第一方面，提供了使用板层小体抑制或破坏微生物群体感应。在多个实施例中，提供了应用多个板层小体以抑制或破坏微生物群体感应的用途，用于破坏微生物生物膜的存在或形成的用途。
在多个实施例中，所述多个板层小体的用途允许了在一宿主主体的微生物感染的所述治疗，特别是在一宿主中与生物膜的生成相关的微生物感染。在多个实施例中，所述板层小体可以作为一种群体感应拮抗剂。
在多个实施例中，所述多个板层小体包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇以及胆固醇。特别地，所述多个板层小体可以包括或包含以重量计在44至70％的范围内的磷脂酰胆碱、在15至23％的范围内的鞘磷脂、在6至10％的范围内的磷脂酰乙醇胺、在2至6％的范围内的磷脂酰丝氨酸、在2至4％的范围内的磷脂酰肌醇以及在4至12％的范围内的胆固醇。在另一个实施例中，所述组合物进一步包括以重量计在0至3％的范围内的溶血磷脂酰胆碱。
在多个实施例中，所述多个板层小体包括或包含以重量计约55％的磷脂酰胆碱、约19％的鞘磷脂、约8％的磷脂酰乙醇胺、约4％的磷脂酰丝氨酸、约3％的磷脂酰肌醇以及约10％的胆固醇(本文讨论的LMS-611)。具体地，在多个实施例中，所述板层小体组合物可包含55.1％的磷脂酰胆碱(PC)、0.37％的鞘磷脂(SP)、8.2％的磷脂酰乙醇胺(PE)、4.1％的磷脂酰丝氨酸(PS)、3.1％的磷脂酰肌醇(PI)和10.1％的胆固醇(CH)。在一个实施例中，所述组合物进一步包含以重量计约2％的溶血磷脂酰胆碱。
在多个实施例中，所述生物膜可以存在在一动物上，适当地在一哺乳动物上，特别是一人类对象；一植物；或一惰性材料。
在多个实施例中，通过将所述多个板层小体应用于已形成或正在形成生物膜的一装置或一部位中，本发明的一板层小体/多个板层小体能够有效地抑制所述多个生物膜的形成并减少由细胞造成的污染。
在多个实施例中，提供了一种减少细菌污染的方法，所述方法包括使一物体与根据本发明的一板层小体接触的步骤。
在一实施例中，提供了一种在情况是由多个微生物的多个群体信号/感应分子引起时治疗或预防或减缓一宿主中的一过程或情况的方法，所述方法包括将多个板层小体提供至多个微生物所在的一部位。
在一实施例中，所述板层小体与应用了所述板层小体的所述对象或主体之间的接触可以通过喷雾、浸渍、刷涂或通过包含本发明的一板层小体的一溶液的其他应用至待治疗的一部位。
根据本发明的一第二方面，提供了一种组合物应用在一微生物感染的治疗上的用途，所述组合物包括一治疗有效量的板层小体及至少一第一非板层小体的抗菌活性剂，优选地一抗生素，应用于一微生物感染的所述治疗。
在多个实施例中，所述多个板层小体可以被提供或施用作为一组合物，用于与一抗菌剂用途同时、独立或依序使用。
根据本发明的一第三方面，提供了一种治疗多个微生物感染的方法，所述方法包括施用一治疗有效量的板层小体，以抑制或破坏一需要治疗的对象中的微生物生物膜的所述形成。在多个实施例中，所述主体是一动物。在多个实施例中，所述主体合适地为一人类。
根据本发明的一第四方面，提供了一种包括多个板层小体和一组合治疗的部件的套组，例如：一抗菌活性剂用于多个微生物生物膜的独立、依序或同时的治疗，特别是一宿主主体的微生物感染。适当地，所述套组包含一治疗有效量的抗菌剂。适当地，所述抗菌剂或所述多个板层小体配制成与一待治疗的特定部位相关的用途，例如用于鼻内给药，用于局部给药或用于静脉内给药。适当地，所述抗菌剂或所述多个板层小体被配制成通过不同的给药途径提供至所述待治疗对象。
在多个实施例中，所述微生物生物膜是由选自于包括细菌，病毒，真菌，酵母和原生动物所组成的群组中的一微生物所形成。在多个实施例中，所述微生物生物膜可以是由细菌所形成。
在多个实施例中，所述被破坏的群体感应可以是来自于一革兰氏阳性细菌。在多个实施例中，所述被破坏的群体感应可以是来自于革兰氏阴性细菌。
在多个实施例中，所述微生物感染可以是一植入物相关的和/或一导管相关的和/或一植入的医疗装置相关的感染。
在文献中被很好地确立了生物膜的所述生成是一关键的毒性因素，用于一些常常发生的致命感染，包括由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和耶氏肺孢子虫(Pneumocystisjirovecii)所引起的那些感染。
多个真菌生物膜是以胞外多糖为基础，并且所述真菌生物膜也被认为受多个板层小体影响，特别是所述LMS-611组合物。多种病毒，例如包括HTLV-1，也已知会形成生物膜，多个板层小体被认为，特别是LMS-611，可用于抑制所述多个生物膜的形成。
在多个实施例中，可与一板层小体结合使用的一抗菌活性剂可以是任何抗生素或多个抗生素，包括但不限于哌拉西林、氮丙啶、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、红霉素、他汀、头孢他尼和环丙沙星或它们的组合。
在多个实施例中，所述抗生素可以选自于由哌拉西林、氨曲南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、红霉素、特治星及环丙沙星、头孢他啶或其组合。
多个合适的板层小体，特别是LMS-611，在以一联合治疗，例如一抗生素，例如妥布霉素、头孢他啶、特治星或环丙沙星的治疗之前被提供给一细菌菌落。适当地，一浓度为至少10微克/毫升(μg/ml)、至少15微克/毫升、至少20微克/毫升、至少30微克/毫升、至少40微克/毫升的板层小体被提供到所述待治疗部位。在多个实施例中，多个板层小体，特别是LMS-611，可以同时或在例如：特治星之前提供，例如用于所述肺部的多个感染的治疗。
适当地，所述待治疗的部位可以是所述眼睛。适当地，所述待治疗的部位可以是所述肺部。适当地，所述多个板层小体可以通过与所述联合治疗例如被提供的(多个)抗生素不同的一给药途径被提供至所述待治疗的所述部位，例如所述多个板层小体可以通过鼻部提供，同时所述抗生素可以通过静脉提供。
群体感应和在一些情况下的生物膜的生成可能是有问题的，其中微生物以足够的密度生长以允许多个发酵产物的高产量的生产。调节群体感应以允许在所述多个生产设施中的细胞密度的增加，以及最小化生物膜的生成的一能力是有利的。
因此，提供了一种提高一群落的多个已知微生物体的体积生产率的方法，所述方法包括：
a)引入多个板层小体到能够形成生物膜的多个微生物体的一培养基中，例如细菌；以及
b)培养所述微生物体，例如细菌；
其中，所述多个微生物体在所述多个板层小体的存在下相关于由所述多个微生物体所产生的一发酵产物的所述体积生产率大于在缺乏多个板层小体下的所述微生物体的所述发酵产物的所述体积生产率。
本发明还提供了一种增加一群落的多个微生物体的细胞密度的方法，所述方法包括：
a)引入所述多个板层小体到能够形成生物膜的多个微生物体的一培养基中，例如细菌，
b)使所述多个微生物体在含有多个板层小体的所述培养基中生长，其中所述多个微生物体当在含有多个板层小体的一培养中生长时，所述多个微生物体生长至一细胞密度大于多个相同微生物体在不含所述多个板层小体的一培养基并且在相同的培养条件下生长的细胞密度。
本发明还提供了一种生产一发酵产物的方法，所述方法包括：
a)提供能够产生一发酵产物的一个经过遗传修饰的微生物体，例如细菌；
将所述多个经过修饰的微生物体培养在已应用多个板层小体的一培养基中，其中所述多个经过遗传修饰的微生物体具有能力达到所述发酵产物的一体积生产率高于当在不含所述多个板层小体的一培养基中时产生的相同的所述发酵产物的所述体积生产率。
在多个实施例中，所述方法可包括进一步的步骤：从所述培养基中收获至少一发酵产物。
根据本发明的另一方面，提供了一种应用如本发明中所述的多个板层小体来治疗、预防和/或减慢群体感应的进展的方法
附图说明
现在将仅以示例的方式参考下面描述的多个附图来描述本发明的多个实施例。
图1示出了(A)LMS-611的治疗后的基因表达数据，其中通过鼻部将在50微升的磷酸缓冲盐(PBS)中的一新鲜的对数中期的2×106菌落形成单位(CFU)的剂量的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株LESB65感染多个小鼠的肺部。在0、24、48、72和128小时从小鼠组织中分离出的核糖核酸(RNA)进行治疗，以移除所有的宿主RNA和细菌RNA来检测多个毒性因子algD、flgD、lasR、rhlR、phzF和pelB,；以及(B)示出了在所述鼻咽中的铜绿假单胞菌的基因表达，其中在所述未治疗的样品flgD和pelB中的表达在所述7天期间显示出一显着的增加(点1为时间0，点2为时间24h，点3为时间48h，点4为时间72h和点5为时间168h(7天)，以及在所述多个经治疗的样品中也存在pelB的一增加，但与所述对照组相比，所述增加是减少的。所述多个未治疗的样品在algD和lasR中显示出非常大的增加，在所述多个LMS-611治疗过的样品中没有看到；
图2示出了在LMS-611的治疗后在人工痰液培养中检测到的绿脓菌素的水平，其中将细菌生长至一生物膜状态3天，然后用不同浓度的LMS-611治疗24小时，伴随所述ASM生物膜分析(A)所拍摄的多个照片，通过在550纳米(B)处的吸亮度进行绿脓菌素的生成的定量，次数(n)＝2；
图3示出了铜绿假单胞菌(PA)维持在一活性生长阶段，在所述活性生长阶段中，在LMS-611治疗后的所述铜绿假单胞菌是代谢活跃的，其中刃天青(Resazurin)是一种测量多个微生物的所述代谢活性的染料。使多个生物膜生长3天，然后再加入不同浓度的LMS-611至一另一个24小时。ASM是人工痰液培养基。然后使用痰消化液(Sputasol)均质化多个培养物，并加入刃天青，以及放置在37℃1小时后进行多个测量(等级方差分析(ANOVA)和邓恩(Dunn)的事后检验)以及每一个治疗均与所述B65对照组进行比较。*＝p＜0.05)；
图4示出了LMS-611对于在多个生物膜中生长3天的PA的作用，并且接着以不同浓度的LMS-611的浓度治疗24小时，在ASM中的PA生物膜的多个影像。从所述ASM生物膜(CFU/毫升)中的细菌计数的定量。使用一个等级方差分析(ANOVA)和邓恩(Dunn)的事后检验以测定每一个治疗的CFU/毫升是否显着地不同于所述对照组。*＝p＜0.05；
图5示出了抗生素的协同作用，其中一范围的细菌浓度生长至一细胞膜3天，然后用不同浓度的LMS-611和/或抗生素妥布霉素(A)和环丙沙星(B)治疗24小时。使用一个等级方差分析(ANOVA)和邓恩(Dunn)的事后检验以测定每一个治疗的CFU/毫升是否显着不同于所述对照组。*＝p＜0.05；
图6示出了在一小鼠感染模型中的PA的定量，其中多个小鼠的肺部通过鼻部感染LESB65(2×106CFU在50微升的PBS中)并且在感染后24及48小时通过鼻部给予LMS-611(每剂量1毫克(mg))和/或通过静脉给予特治星(每剂量2毫克的哌拉西林和0.5毫克他唑巴坦)。从鼻咽(A)和肺组织(B)量化细菌。数据是来自于每组5只小鼠。在双因子方差分析中：*＝p＜0.05，**＝p＜0.01；
图7示出了(A)LMS-611的体内测试能够显着地减少在一鼠类肺部模型(在第3天p＝0.01)中的假单胞菌的多个菌落形成单位(CFUs)(在第3天p＝0.01)，以及(B)对带有LMS-611的假单胞菌感染具有一显着增加的巨噬细胞反应(p＝0.05于第1至3天，含)；
图8：多个铜绿假单胞菌(菌株PA01)生物膜在聚苯乙烯栓子上形成24个小时。用三种不同浓度的LMS-611(10毫克/毫升、1.25毫克/毫升及0.03毫克/毫升)治疗多个生物膜。然后多个生物膜被临床上重要的多个抗生素：氨曲南(A)、头孢他啶(B)、环丙沙星(C)、美罗培南(D)、妥布霉素(E)在1倍的最小抑制浓度(MIC)的一浓度下治疗18小时。使用一代谢的XTT分析评估与生物膜相关的多个细胞的所述生存能力，并将多个已治疗的生物膜与多个未治疗对照组生物膜进行比较，以计算出细胞的所述存活率(％)。多个误差线表示两重复的生物膜之间的所述标准偏差。通过对在对照组和多个经治疗的生物膜之间的比较进行未成对的，双尾T检验来分析多个结果。*＝p≤0.05，**＝p≤0.001，***＝p≤0.0001。
图9示出了用于PA控制组菌株及Burkholderia cepacia复合物(BCC)控制组菌株，以及经LMS-611治疗的PA菌株及BCC菌株的扫描电子显微照片的一组合，所述组合显示出在多个LMS-611治疗的菌株中，多个生物膜变稀薄并且被破坏。
图10：多个未治疗的PA01的生物膜(A)生长24小时以及的PA01的生物膜生长24小时后，在生理盐水中以40毫克/毫升(B)、1.25毫克/毫升(C)以及0.325毫克/毫升(D和E)的LMS-611治疗18小时的扫描电子显微镜(SEM)图像(5000x放大倍数)。多个生物膜被固定并且镀金，然后在一台JEOL 6400扫描电子显微镜上成像。所述未治疗的对照组生物膜(A)示出了多层的多个杆状的铜绿假单胞菌细胞被包覆在所述生物膜的所述网状基质内，所述网状基质是由多糖，蛋白质和DNA(脱氧核糖核酸)组成。在以最高剂量的LMS-611(40毫克/毫升)治疗的所述生物膜中(B)，所述LMS似乎覆盖在所述生物膜的表面，在所述3D结构中似乎是一减少。与多层未治疗的生物膜相比，以1.25毫克/毫升(C)和0.325毫克/毫升(D)的LMS-611治疗的所述多个生物膜显示出在存在的细胞的数量中的一显着的减少。在以0.325毫克/毫升治疗的所述生物膜的所述放大图像(E)中，不仅减少了铜绿假单胞菌细胞的数量，亦减少了维持一形态改变的多个细胞。许多细胞因治疗而变得受损，并非多个健康的杆状细胞。
图11示出了以LMS-601培养多个假单胞菌细胞(在左手侧的放大倍数为x100以及右手侧的放大倍数为1200x)，使碘化丙啶可渗透至多个细菌细胞膜，如它们的荧光染色证明(左图为只有碘化丙啶，右图为碘化丙啶及LMS-611)；
图12示出了环丙沙星及LMS-611对铜绿假单胞菌ATCC 15692(PA01)在多个雌性C57BL/6小鼠中的眼睛感染的多个效果的结果。在第0天，以在5微升PBS的铜绿假单胞菌悬液接种在多个动物上，在细菌接种后的5和10小时向多个每组五只的动物组施予多个试验物质。在接种后的7.5、11、13、15和17小时，从多个安乐死的动物中如外科手术般地取得所述多个个别的眼睛。将所述多个眼睛在1毫升的PBS中均质化，并且在多个MacConkey琼脂板上稀释以用于CFU测定。为每个采集时间点计算每克的眼睛中的CFU(CFU/g eye)。数据以平均值正负平均值标准误差(Mean+/-SEM)显示。单因子方差分析(one-way ANOVA)和图基的多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test)被应用在各测量时间点中的所述经治疗的组别和载体组别之间的比较，以及应用在所述只有环丙沙星的组别与环丙沙星联合LMS-611的组别之间的比较。*：p＜0.05治疗vs.载体，**：p＜0.001治疗vs.载体，***：p＜0.0005治疗vs.载体，ns：无明显影响，投药量为每小鼠5微升；
图13示出了环丙沙星及LMS-611对铜绿假单胞菌ATCC 15692(PA01)在多个雌性C57BL/6小鼠中的眼睛感染的多个效果。在第0天，以在5微升PBS的铜绿假单胞菌悬液接种在多个动物上。在细菌接种后的5和10小时向多个每组五只的动物组施予多个试验物质。在接种后的12、18和26小时，从多个安乐死的动物中如外科手术般地取得所述多个个别的眼睛。将所述多个眼睛在1毫升的PBS中均质化，并且在多个MacConkey琼脂板上稀释以用于CFU测定。为每个采集时间点计算每克的眼睛中的CFU。数据以正负平均值标准误差(+/-SEM)显示。单因子方差分析和图基的多重比较检验被应用在各测量时间点中的所述经治疗的组别和载体组别之间的比较，以及应用在所述只有环丙沙星的组别与环丙沙星联合LMS-611的组别之间的比较。*：p＜0.05治疗vs.载体，**：p＜0.001治疗vs.载体，***：p＜0.0005治疗vs.载体，ns：无明显影响，Cipro：环丙沙星；
图14示出了LMS-611与庆大霉素在减少铜绿假单胞菌菌株PA01的多个生物膜MIC中的效果，并且这比只有庆大霉素更有效；
图15示出了LMS-611与头孢他啶在减少铜绿假单胞菌菌株PA01的多个生物膜的MIC的效果，并且这比只有头孢他啶更有效；
图16示出了LMS-611与多粘菌素在减少铜绿假单胞菌菌株PA01的多个生物膜的MIC的效果，并且这比只有多粘菌素更有效；
图17示出了LMS-611与哌拉西林在减少铜绿假单胞菌菌株PA01的多个生物膜的MIC的效果，并且这比只有哌拉西林更有效；
图18示出了当使用具有两种不同操作模式(Pari-boy(喷射式)以及Pari Flow(振荡网格))的喷雾器，与多粘菌素和PA菌株217M组合时的LMS-611的雾化效果，其中一台多级液体冲击器(MSLI)被用来测量来自雾化的LMS-611组合物的所述空气动力学粒度分布和沉积，其中来自根据所述欧洲药典指南(第29.9.18章)的科普利测量的颗粒大小的所述MSLI以及所述冲击器具有五个阶段，所述五个阶段模拟人体呼吸系统的所述各个部件。具有相同惯性的多个颗粒会影响一特定阶段，同时较小的颗粒会传递到下一冲击级上，从而通过分析在所述各个阶段所沉积的LMS-611的数量，可以计算出所述细颗粒剂量和细颗粒分数，其中所述细颗粒剂量(可吸入分数)是来自一吸入装置(雾化器)的所述剂量的所述比例，所述吸入装置可用于所述多个气道，并且所述吸入装置与在吸入期间到达所述多个导气道的LMS-611的剂量相关；
图19示出了当与多粘菌素与PA2783菌株组合时的LMS-611的所述雾化效果，并且如图21所示，当与LMS-611结合时，多粘菌素被更有效地递送，并且所述组合物具有它的所述多个MLSI阶段中的最大杀菌效果，所述MLSI阶段代表所述肺部的多个分支，所述肺部为囊性纤维化肺疾病的所述部位；
图20示出了当LMS-611与妥布霉素与PA菌株217M组合时的雾化效果；
图21示出了LMS-611与妥布霉素与PA菌株27853组合时的雾化效果，并且证明与LMS-611联合的妥布霉素被递送至MLSI的所有阶段，所述组合的所述杀菌效果在所述冲击器的6.8微米、3.1微米和1.7微米的多个阶段似乎更大，所述冲击器代表囊性纤维化肺疾病的所述部位。
具体实施方式
本发明的本发明人令人惊奇地发现将多个板层小体施用于细菌所导致一基因表达情况与一浮游状态相符，而非固着状态。由于不希望受到理论所约束，本发明人认为所述多个板层小体破坏生物膜的所述形成以及向下调节毒性相关的基因表达，从而减少所述细菌的所述致病性，并且使所述宿主主体的免疫反应和/或多个抗菌剂进入多个微生物中。因此，所述多个板层小体抑制生物膜的形成的所述作用被认为是允许细菌被所述免疫系统和/或多个抗感染剂例如多个抗生素抑制和/或杀灭。本发明人还证实了在体外，由铜绿假单胞菌生成的绿脓菌素于板层小体作用下减少；在群体感应机构的所述控制下，由所述细菌产生的绿脓菌素是一关键的毒性因子。所述发明人已经证明，对于微生物感染的一部位的多个板层小体的施用可导致被招募到所述感染部位的巨噬细胞的数量的一显着的增加。多个板层小体进一步地被推测可以改变多个细菌壁的所述渗透性，使得细菌对于所述宿主的免疫反应及多个抗生素更加敏感。
尽管不希望受到理论的约束，所述多个微生物被认为，特别是细菌，成为参与群体感应的一生物膜的一部分，所述群体感应是一种细胞至细胞的通讯，所述通讯支持微生物的细胞过程。尽管群体感应背后的所述机制仍未完全被了解，但是所述通信过程被认为允许，例如：一单细胞的细菌感应其它细菌的接近程度。如果一细菌可以感应到其被一足够密集的其它病原体群落所包围，所述细菌通过基因表达的多个修饰变得被激发以促进生物膜的形成以及绿脓菌素和其它毒性因子的生成。多个板层小体被认为可能具有隔离及终止多个群体感应分子例如N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的所述信号的所述能力。
本发明人已经证明，将多个板层小体施用至一宿主，特别是LMS-611，产生对于由所述宿主的所述免疫系统的多个细胞增强了对微生物感染的所述清除的结果。在多个实施例中，一板层小体包括一磷脂组合物，所述磷脂组合物在以重量计在44至77％的范围内的磷脂酰胆碱，在15至23％的范围内的鞘磷脂(SP)、在6至10％的范围内的磷脂酰丝氨酸(PS)、在2至4％的范围内的磷脂酰肌醇(PI)以及在4至12％的范围内的胆固醇(CH)，特别地，多个LMS-611板层小体包含约55％的PC、19％的SP、8％PE、4％PS、3％PI及10％CH。
LMS-611还似乎通过降低多个抗生素对于细菌的多个所述最小抑制浓度(MIC-抑制一微生物的可见生长的一抗微生物剂的最低浓度)增强了一系列的抗生素，以提供增强细菌清除和/或使用在多个较低剂量(或通过不同的途径)具有相同的功效的LMS-611/抗生素组合物的用途。已知多个抗生素的所述使用和剂量经常受到所述多个抗生素的副作用和/或毒性情况的限制，这也增加了多个强效抗生素的所述潜在用途，否则所述多个强效抗生素的所述用途将被限制。
多个定义：
如本说明书和所附的权利要求书中所使用的单数形式“一(a)”，“一(an)”以及“所述(the)”除非在上下文另有明确指出，否则本发明可包括复数个参考物。因此，例如：“所述方法”的多个引用包括一种或多种方法，和/或在此描述的所述类型的多个步骤，和/或本领域技术人员在阅读本公开时将变得显而易见的。
除非另加说明，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含意。虽然本文所述的任何方法及材料与本发明中所描述的方法或材料相似或相等可用于本发明的实践或测试中，所述多个优选的方法和材料被描述。本文中提及的所有出版物都是以引用的形式完整地包含在本文中。
在本文中所用的“多个板层小体”或“多个微体”是指磷脂、多层、双层结构。
“治疗(Treat)”，“治疗(Treating)＂或“治疗(Treatment)＂是指治疗，防止(prevention)和预防(prophylaxis)，特别是指给予药物或关于主体的多个医疗过程的所述进行，用于预防(防止)其中一者或治愈或减轻在受试者受折磨的情况下发生的虚弱或疾病或病症或事件的程度或可能性。
一“治疗有效量”是足以减少或预防与本发明的组合物治疗的病症或缺陷相关联的多个症状的数量。
“联合治疗”是指本发明的药剂与其它活性剂或治疗方式的用途。这些其它药剂或治疗剂可包括例如多个抗菌剂的多个药物，特别是多个抗菌剂，例如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂或抗原生动物剂；皮质类固醇、非甾体抗炎化合物，或其它用于治疗或缓解感染的药剂。本发明的所述多个试剂与这些其它的治疗或治疗方式的联合用途可以是同时的，或者，所述多个治疗可以被分开，使得本发明的所述药剂可以在所述其它治疗或治疗方式之前、之后、或一不同于所述其它治疗或治疗方式的途径来施予。
"局部施用"是指通过在一生物膜痛苦或感染的所述部位的附近或一非全身性途径直接给药。
"多个治疗部分"是指任何治疗有效分子，无论它是一个小的有机化合物，或一蛋白质或一胜肽，或一核酸，或一抗体或一抗体片段，或一碳水化合物，所述有机化合物可附着在所述多个板层小体并施予患有用于治疗的疾病或病症的多个主体。任选地，多个治疗部分可以包含在构成所述多个板层小体的所述磷脂双层之上或之内。
多个合成的板层小体的生成：
本发明的所述焦点是将多个板层小体应用于治疗多个细菌感染和/或抑制生物膜的形成的所述治疗用途。以下信息提供了用于生成多个板层小体的一方法的多个细节。
本发明中使用的多个板层小体的所述主要磷脂成分是磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SP)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和胆固醇。
所述多个板层小体可以包含或基本上由在44至70％的范围内的PC、在15至23％的范围内的SP、在6至10％的范围内的PE、在2至6％的范围内的PS、在2至4％的范围内的PI以及在4至12％的范围内的胆固醇的这些成分组成，这些数字是按重量百分比计算的。
用于多个磷脂多层微体(多个板层小体)的多个磷脂及胆固醇的所述优选组合物包括：PC 55％：SP 19％：PE 8％：PS 4％：PI 3％：胆固醇10％。
多个合成的板层小体可以通过取得一磷脂混合物，与胆固醇一并以上述提供的重量的多个百分比来制备，并且把它们溶于一氯仿/甲醇溶剂混合物中(2：1体积/体积)。然后将所述脂质溶液导入一圆底烧瓶中，并连接至一旋转蒸发器。将所述烧瓶抽真空并且在一个30℃的温度下于一恒温控制的水浴中以60r.p.m(每分钟转速)旋转直至沉积了一干燥的脂质膜。将氮气导入所述烧瓶中，并且在所述烧瓶连接至一冻干器之前移除所述残余的溶剂，所述冻干器是所述烧瓶在室温下接受高真空一小时的地方。在释放真空以及接着用氮气冲洗后，加入用于包封的含盐的溶质(选定的抗原)。在烧瓶中将所述脂质水合，用氮气冲洗，连接到所述蒸发器，并且在室温下以60r.p.m.旋转30分钟，使所述悬浮液在室温下静置2小时以完成所述溶胀过程。
在多个实施例中，所述多个板层小体与一药学上可接受的载体以一治疗有效量提供。在一个实施例中，所述多个板层小体可以以多个单位剂量的形式呈现，以便于精确的给药。术语“多个单位剂量形式”是指适合作为在特定哺乳动物中的人类主体和其它动物的多个单一剂量的多个物理上离散的单位，每个单位包含一预定数量的活性物质，所述活性物质被计算以产生所述期望的治疗效果，与一合适的药物赋形剂相关联。多个典型的单位剂型包括在固体组合物的情况下的液体组合物的预装，预定安瓿或注射器或药丸，药片，胶囊等。所述单位可以是，例如：一个一次性使用的小瓶，一预填的充注射器，一单一透皮贴剂等。所述单位剂量形式可以是单位剂量包装或单位使用包装。如本领域技术人员已知的，一单位剂量包装是方便的、患者就绪单位。“一单位剂型”可以是一个五毫升悬浮液的多个板层小体，其中所述悬浮液可以具有55毫克的磷脂酰胆碱、19毫克的鞘磷脂，8毫克的磷脂酰乙醇胺，4毫克的磷脂酰丝氨酸，3毫克的磷脂酰肌醇及l0毫克的胆固醇
在一特定实施例中，术语“药学上可接受的”的意思是由联邦或一国家政府的一管理机构批准的或是列于美国药典或其它一般认可的药典中用于动物，更具体地，用于人类。术语“载体”是指所述治疗与一稀释剂、一辅助剂、一赋形剂或一载体给药。所述多个药物载体可以是多种无菌液体，例如水和多种油类，包括石油、动物、植物或合成来源的多种油类，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。
当所述药物组合物是通过静脉给药时，无菌等渗性缓冲液是一优选的载体。多个生理盐水以及含水葡萄糖以及多个甘油溶液也可用作多个液体载体，特别是用于多个可注射溶液。
多个合适的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述多个组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。所述多个组合物可以配制成一栓剂，具有传统的粘合剂和载体，例如多个甘油三酯。口服制剂可以包含多个标准载体，例如药用等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。多个合适的药物载体的多个例子描述在E.W.Martin的《雷明顿药学科学》中。所述多个组合物将包含一治疗有效量的所述化合物，优选地以纯化的形式，与一合适数量的载体一起，以提供给所述主体正确给药的形式，所述制剂应适合所述给药的模式。
在一优选的实施例中，所述组合物是按照多个常规步骤配制成适用于静脉给药至一主体的一药物组合物。典型地，用于静脉给药的多个组合物是在无菌等渗性缓冲液中的溶液。在必要时，所述多个组合物还可以包括一增溶剂和一局部麻醉剂，例如利多卡因，以使消除注射部位的疼痛。通常地，所述多个成分是单独地或以单位剂量的形式混合在一起来供应。例如：在气密性密封的容器中，例如：具有指示所述活性剂的数量的一安瓿或一小袋子，作为一干燥的冻干粉或一无水浓缩物。在所述组合物要通过输注给药的情况下，所述组合物可以使用含有无菌药物等级的水或盐水的输液瓶来分配所述组合物。在所述组合物通过注射给药的情况下，可以提供一安瓿的无菌水或盐水用于注射，使得所述成分可以在给药前混合。
在本文所述的多个疾病情况的治疗中有效的所述板层小体组合物和/或板层小体与抗菌组合物的数量可以通过基于本说明的描述中的多个标准临床技术来确定。此外，多个体外分析中可任选地用于帮助辨识多个最佳剂量范围。在所述配方中使用的所述精确剂量也将取决于所述给药途径，以及所述疾病或所述病症的严重性，并且应根据所述医师的判断和各个主体的情况来决定。然而，用于静脉给药的合适的剂量范围通常约为每千克体重20-500微克的活性化合物。用于鼻内给药的合适剂量范围通常为约0.01皮克(pg)/千克体重至1毫克/千克体重。有效剂量可从体外或动物模型测试系统中获得的剂量响应曲线中推断。
本发明还提供了包含一药物包装或一套组包含填充有一本发明组合物的一个或多个容器。可选地与所述(多个)容器相关联，可以是由一政府机构管理多个药品或多个生物制品的所述制造、使用或销售，所规定的形式的通知，药物或生物产品的使用或销售，所述通知反映了(a)用于人类管理的生产、使用或销售的机构的批准，(b)使用说明，或两者。
在一特定的实施例中，可期望将本发明的所述多个组合物的局部施用到所述需要治疗的区域；这可以通过，例如，而不是作为限制限制，在手术期间通过局部输注，或通过在手术后将含有所述多个板层小体的所述溶液喷洒在所述暴露的组织上，通过使用局部应用、通过注射、通过借助一导管、或通过一植入物，所述植入物是一多孔的、非多孔的或凝胶状的材料，包括多个膜，例如硅橡胶膜、或纤维、或共聚合物来实现，例如Elvax(参见Ruan等，1992，《美国科学院院报》，美国，89：10872-10876)。在一个实施例中，给药可通过直接注射及通过雾化吸入。
在另一个实施例中，所述多个板层小体可以在一控制释放系统中递送。在一个实施例中，可以使用一个泵(参见Langer、supra；Sefton(1987)《生物医学工程评论杂志》14：201；Buchwald等(1980)，《手术》88：507；Saudek等(1989)，《新英格兰医学杂志》，321：574)。在另一实施例中，可使用多个聚合材料(见《受控释放的医学应用》，Langer和Wise(编辑)，CRC出版社，博卡拉顿市、佛罗里达州(1974)。《控制药物的生物利用度，药物产品的设计和性能》，Solen和Ball(编辑)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas,J.(1983)，《高分子》，《高分子科学杂志》23:61；又见Levy等(1985)《科学》228:190；During等人(1989)，《神经学年报》71:105。在另一个实施例中，一控制释放系统可以放置在所述治疗目标的近处，因此只需要所述全身剂量的一部分(参见，例如：Goodson，《控制释放在医学上的应用》(1984)同上，卷2，页115-138)。其他合适的控制释放体系是在Langer的综述(1990)，《科学》249：1527–1533中讨论。
现在将参考下面的多个实施例描述本发明，这些实施例是为了说明目的而提供，而不是被理解为对本发明的限制。
多个实施例：
实施例1：
多个合成的板层小体对形成多个细菌生物膜的多个基因的表达的作用：
已知的是许多细菌，例如假单胞菌，伯克氏菌和葡萄球菌，产生多个生物膜，所述生物膜用于保护所述细菌免于所述宿主的免疫防御和多个抗菌剂。
在假单胞菌感染的一小鼠模型中，用LESB65鼻内感染多只小鼠，所述LESB65是一铜绿假单胞菌(2×106CFU在50微升的PBC中)，以及多个LMS-611治疗的小鼠被给予每剂量1毫克的LMS-611。
在第0、1、2、3和7天，从小鼠的肺部及鼻咽中分离出细菌RNA。
通过多个qPCR(定量聚合酶链式反应)分析以完成所述对照组(LMS-611未治疗)的小鼠以及用LMS-611治疗的小鼠的多个基因表达情况，所述多个基因表达情况允许了多个细胞内的已表达的基因(信使RNA)的一快照。
多个LMS-611未治疗的样品显示出与胞外多糖(一生物膜的构建模块)的生成以及群体感应相关的基因的一向上调节。具体地，pelB(与生物膜的形成相关的胞外多糖)、flgD(鞭毛/运动相关基因)、algD(生物膜藻酸盐基因)和lasR(在群体感应中的中心基因)在多个未治疗的样品中增加，并且在来自于LMS-611治疗的小鼠的所述多个样品中显着地减少。
在图1B中，表示了在多个LMS-611未治疗的样品中，flgD和pelB在所述七天期间在表达中表现出了一显着的增加。尽管在多个经治疗的样品中的pelB中存在一增加，但与对照组相比是减少的。将所述多个标记物的表达以proC作为一参考基因来标准化，因此所述多个数字不受所观察到的所述细菌的数量的所述增加的影响。
所述数据支持LMS-611通过干扰所述群体感应的机制来抑制生物膜形成的所述判定。
提供低水平的LMS-611(30-40微克/毫升的LMS-611)可能是有利的，如对于所述肺部，多个抗生素被雾化，以及所述雾化可以需要20-30分钟，因此，如果减少了所述体积，则可以减少所述治疗时间、多个抗生素的体积以及多个相关的副作用。相似地，对于所述眼睛，所述眼睛只能容纳那么多的数量，因此减少可能是有利的。
实施例2：
在体外，多个人工痰液模型(ASM)被认为代表在CF中所见的生物膜，用于研究铜绿假单胞菌感染。
绿脓菌素，一种由绿脓杆菌产生的蓝绿色吩嗪色素，并且由所述群体感应系统控制(细胞间信号传导的系统，与群体密度相关)并且因此所述绿脓菌素在一细菌培养物中的存在和浓度可用于提供群体感应活动的强度。测量被一PA感染的ASM被暴露在一浓度范围内的LMS-611中所侦测的所述多个水平。
如图2所示，在人工痰液培养物中侦测到的多个绿脓菌素水平表示在多个LMS-611治疗的培养物中的革兰素的可利用性被减少了—在以越高的浓度的LMS-611治疗的孔洞中拍摄的所述多个影像中，所述绿脓菌素的所述蓝绿色可看作逐渐减弱，可获得的绿脓菌素的浓度从10微克/毫升降至0.3125微克/毫升。
多个假单胞菌菌落和多个伯克氏菌菌落在含有或缺乏LMS-611下生长的多个扫描电子显微镜(SEM)图像，图9示出了在存在LMS-611的情况下，消除了细菌生物膜。
图11：未治疗的PA01的生物膜(A)生长24小时以及的PA01的生物膜生长24小时后，在生理盐水中以40毫克/毫升(B)、1.25毫克/毫升(C)以及0.325毫克/毫升(D和E)的LMS-611治疗18小时的扫描电子显微镜(SEM)图像(5000x放大倍数)。多个生物膜被固定并且镀金，然后在一JEOL6400扫描电子显微镜上成像。所述未治疗的对照组生物膜(A)示出了多层的多个杆状的铜绿假单胞菌细胞被包覆在所述生物膜的所述网状基质内，所述网状基质是由多糖，蛋白质和DNA(脱氧核糖核酸)组成。在以最高剂量的LMS-611(40毫克/毫升)治疗的所述生物膜中(B)，所述LMS似乎覆盖在所述生物膜的表面，在3D结构中似乎是一减少。与多层未治疗的生物膜相比，以1.25毫克/毫升(C)和0.325毫克/毫升(D)的LMS-611治疗的所述生物膜显示出在存在的细胞的数量中的一显着的减少。在以0.325毫克/毫升治疗的所述生物膜的所述放大图像(E)中，不仅减少了铜绿假单胞菌细胞的数量，亦减少了维持一形态改变的多个细胞。许多细胞因治疗而变得受损，并非多个健康的杆状细胞。
实施例3：
利用一刃天青分析对假单胞菌在所述人工痰液模型(ASM)中的代谢活性的测量，其中所述荧光检测直接与所述细菌的所述代谢活性成正比。
图3中所示的所述多个结果表明所述铜绿假单胞菌保持在一活跃的生长阶段，其中所述铜绿假单胞菌处于其最高的生物活性并且对所述宿主的免疫反应和多个抗菌剂更加敏感。
这说明LMS-611具有一亲浮游效应(pro-planktonic effect)。
当铜绿假单胞菌菌生长至一生物膜3天后，再以不同浓度的LMS-611治疗24小时后，所述亲浮游效应进一步如图4所示，经过LMS-611治疗的生物膜被测定出细菌数量增加。所述人工痰液模型似乎与所述小鼠模型一致。与所述未治疗的对照组相比，在对于一已形成的生物膜的LMS-611治疗之后，每毫升的菌落形成单位显着的增加。所述增加似乎是剂量依赖于以越高浓度的LMS-611(10-20毫克/毫升)治疗的多个培养物的最大增加。在三种治疗(20毫克/毫升，10毫克/毫升，0.313毫克/毫升)中通过刃天青检测代谢活性具有一显着的增加，证明LMS-611可以在所述多个培养物的所述代谢活性中引起的一增加。
实施例4：
在一人工痰液培养基中的一预先形成的生物膜上，与单独的抗生素治疗相比，以LMS-611联合环丙沙星和妥布霉素的治疗产生显着地更大的细菌清除(图5)。
在一MBEC栓板上的一个预先形成的生物膜上，多个成熟的铜绿假单胞菌生物膜形成了24小时，并且以在一浓度范围内的LMS-611预治疗1小时。在LMS治疗后，用生理盐水彻底地清洗多个生物膜以除去所述LMS，然后用所述多个抗生素：氨曲南、环丙沙星、头孢他啶、美罗培南和妥布霉素以1/10x、1/5x及1x MIC治疗所述多个生物膜。治疗后的与生物膜相关的多个细胞的所述存活率(％)使用所述代谢的XTT分析来评估，LMS预治疗似乎增加了在生物膜内的多个细胞对所有抗生素的所述活性的所述敏感性。
当LMS-611以40微克/毫升使用时，所述抗生素增强作用变得最大，如图5中所示，其中对于妥布霉素和环丙沙星都观察到总细菌杀灭。
在体内验证所述效应。开发一小鼠模型，在所述小鼠模型中，用假单胞菌感染多个小鼠的肺部，以及然后用吸入的LMS-611或盐水治疗。使用菌落形成单元(CFUs)作为所述主要变量，证明LMS-611在第3天显着地减少CFU计数。支持了LMS-611通过预防和/或暴露细菌的隐藏来增强了所述身体的免疫反应的所述说法，还证实了在巨噬细胞数目上的一显着增加，表明生物膜的所述移除及或生物膜的抑制使细菌对于多个免疫细胞有更大的可见性。这些均示出在图7B和图13中。
在所述鼠类呼吸道感染模型中，多个BALB/c小鼠组被轻度麻醉，并且通过鼻部滴注将50微升LMS-611(20毫克/毫升)或载体对照组(0.9％NaCl)治疗(Carter等，2010)。在治疗后约120分钟，所有小鼠受到1×106个菌落形成单位(CFU)的细菌的攻击，所述细菌是铜绿假单胞菌(LES65B)。约24小时、48小时及72小时后重复LMS-611的治疗以及对照组。，在第0天的感染后5小时，以及在第1、2、3天治疗后5小时，以及在第7天的所述感染后当多个菌落形成单元、炎性细胞浸润剂及促炎介质可以被测量时，以鼻咽，肺和血液样本(每个时间点5只动物)监测多个临床症状。
当LMS-611输注在用铜绿假单胞菌(LES65B)感染的多个小鼠的肺部中时，在鼻咽和肺中的菌落形成单元的数量中产生一减少。在第3天，与多个对照组相比，在LMS-611治疗的多个小鼠中的菌落形成单位的数量被显着地(p＜0.05)减少1.5个对数(logs)(92％)，表示一较不严重的感染。所述对照组的感染的情况与历史数据在第3天的感染“尖峰”一致(Carter等，2010年)。所述感染被追踪至第7天，此时所述多个治疗组之间没有差异。
与对照组相比，LMS-611治疗刺激了所述多个巨噬细胞数量的一显着增加。相反，在两组中的多核细胞白细胞数量、单核细胞数量、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP2)水平以及肿瘤坏死因子(TNF)水平的增加均相似。在LMS-611治疗的多个动物中的多个菌落形成单元的所述显着减少似乎归因于吞噬性巨噬细胞的一增加，足以减少所述细菌感染的所述严重性和/或归因于LMS-611的亲浮游效应增加了所述细菌的所述暴露至所述多个小鼠的所述炎性反应中。
本研究表明重复施予LMS-611(20毫克/毫升)具有一抗感染作用，显着地减少所述多个小鼠的肺部中引起的所述铜绿假单胞菌感染。
实施例5：
本发明人还研究了LMS-611是否起到增强多个抗生素效应的作用。为了测试所述理论，本发明人测定了各种抗生素与或不与LMS-611对抗多个假单胞菌菌落的MIC。
LMS-611被发现增强了一系列的抗生素，以提供增强细菌清除和/或使用在多个较低剂量(或通过不同的途径)具有相同的功效的LMS-611/抗生素组合物的用途。已知多个抗生素的所述使用和剂量经常受到所述多个抗生素的副作用和/或毒性情况的限制，这也增加了使用多个强效抗生素的潜在用途，否则所述多个强效抗生素的用途将被限制。
LMS-611对多个抗生素的增强作用可以是多因素的。被认为除了使细菌采用或保持在浮游状态之外，LMS-611可改变多个细菌壁的所述渗透性，潜在地使它们对多个抗生素和所述免疫反应更敏感(见图14)。
实施例6：
多个铜绿假单胞菌菌株PA01、PA14，两种临床囊性纤维化(CF)菌株H183、YH1以及多个伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)菌株K56-2，YHBCC5，YHBCC6、YHBCC7和YHBCC8生长在一摇摆的平台上的Nunc Immunosorp聚乙二醇(PEG)盘子上48小时。使用LMS-611(1.8毫克/毫升)联合多个抗生素在一棋盘阵列测试多个生物膜，所述多个抗生素对于多个PA菌株：哌拉西林、氨曲南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素，以及对于多个BCC菌株：哌拉西林、庆大霉素、红霉素和环丙沙星。在使用哌拉西林和庆大霉素攻击之前，在不同的时间点(5分钟、1小时、8小时及24小时)以LMS-611对所述生物膜进行预治疗的所述效果也被研究。使用扫描电子显微镜来评估所述多个被治疗的生物膜。
当对多个所述多个PA菌株进行测试时，联合用于呼吸道感染的所述治疗的多种抗生素，LMS-611(9.8毫克/千克)被发现显着降低了哌拉西林(4至16倍)、庆大霉素(4至8倍)和环丙沙星(1至16倍)的所述固着的MIC，也证实了与氨曲南(2至4倍)、美罗培南(1至2倍)和妥布霉素(1至4倍)的协同作用。
当使用多个所述BCC菌株测试时，联合用于治疗呼吸道感染的所述治疗的多种抗生素，发现LMS-611(9.8毫克/千克)显着降低了哌拉西林(4至8倍)、庆大霉素(4至8倍)和环丙沙星(2至4倍)的所述固着的MIC，红霉素没有观察到效果(表1和表2)。
表1：不同的抗生素在缺乏和存在LMS-611(10毫克/毫升)的情况下利用所述MBEC分析对铜绿假单胞菌的四种菌株的所述固着最小抑制浓度(MIC毫克/毫升)
表2：不同的抗生素在缺乏和存在LMS-611(10毫克/毫升)的情况下利用所述MBEC分析对伯克氏菌(Burkholderia cenocepacia)的四种菌株的所述固着最小抑制浓度(MIC毫克/毫升)
对所述多个PA和BCC对照组菌株，以及LMS-611治疗的多个PA和BCC菌株的扫描电子显微照片的一比较表示了以LMS-611治疗后，多个细菌生物膜变稀薄且分散。
实施例7：
在一种假单胞菌小鼠模型中，鼻内给药LMS-611并且以静脉提供他汀(包含2毫克的哌拉西林及每剂量0.5的他唑巴坦的药物，其中他唑巴坦是一种β-内酰胺抑制剂，所述抑制剂防止对于哌拉西林的抗药性)，在感染后72小时从鼻咽组织以及的肺部组织生长的菌落在假单胞菌的菌落计数中显示一显着的下降。所述对于肺部组织的结果特别令人惊讶是因为两个原因。第一，在体内模型中，与特治星结合的LMS-611给出完全的细菌杀灭。第二，即使LMS-611和他汀分别通过不同的途径，即分别地使用鼻内和静脉注射，都得到了他汀的所述增强作用。所述第二个发现证实了LMS-611的亲浮游/群体感应信号干扰的手法，使得所述细菌向所述抗生素和免疫防御系统的所述效果开放。(参见实施例，图7B)。
实施例8：
在C57BL/6小鼠的一角膜感染模型中进行一研究以评估环丙沙星和LMS-611对于铜绿假单胞菌菌株，ATCC 15692(PA01)，的所述抗菌活性。将所述左角膜划破并以一接种量为1.79×106CFU/小鼠的铜绿假单胞菌菌株ATCC 15692(PA01)的多个悬浮液接种。在感染后5及10小时施用多个试验物质的局部治疗，每次施用为5微升。
所述多个试验物质是以0.001％单独施予的环丙沙星(单药治疗)以及联合LMS-611(于10毫克/毫升)以及LMS-611的单独给药(10毫克/毫升)。
在接种后7.5、11、13、15、17小时后将多个动物安乐死，并且对所述多个左眼进行拍照及切除。以每克的所述眼部组织的菌落形成单位(CFU)来测量所述多个细菌计数。
与所述多个载体治疗组相比，以0.001％的环丙沙星的单药治疗的所述给药在感染后的7.5、11、13、15和17小时，所述多个细菌计数产生一显着减少(图15)。
与所述载体治疗组相比，LMS-611(10毫克/毫升)与环丙沙星的所述多个组合物也在感染后的7.5、11、13、15和17小时显着地有效降低多个细菌计数；然而，与所述多个环丙沙星单药治疗组相比，所述多个组合物在所有时间点均没有造成显着的影响。
与所述载体治疗组相比，仅有以10毫克/毫升的LMS-611的治疗在所有的所述测试的时间点中与减少所述多个细菌计数的任何显着效果均没有关联。
实施例9：
在C57BL/6小鼠的一角膜感染模型中进行一研究以评估环丙沙星和LMS-611对于铜绿假单胞菌菌株，ATCC 15692(PA01)，的所述抗菌活性。将所述左角膜划破并以一接种量为1.74×106CFU/小鼠的铜绿假单胞菌菌株ATCC 15692(PA01)的多个悬浮液接种。在感染后5及10小时施用多个试验品的局部治疗，每次施用为5微升。以0.001％单独施予的环丙沙星(单药治疗)以及联合LMS-611(于10毫克/毫升)。当LMS-611单独测试时的剂量为10及20毫克/毫升。在接种后2、5、12、18、26或36小时后将多个动物安乐死，并且将所述多个左眼切除。以每克的所述眼部组织的菌落形成单位(CFU)来测量所述多个细菌计数。
环丙沙星，0.001％，在减少细菌计数的所述效果为时间依赖性。相对于所述多个载体治疗组，环丙沙星的单药治疗在感染后的18、26和36小时在所述多个细菌计数中产生一显着减少。然而，当在感染后12小时测量时，环丙沙星单药治疗没有产生一显着的影响(图16)。
环丙沙星与LMS-611(10毫克/毫升)的所述联合治疗在感染后12小时在所述多个细菌计数中产生一显着的减少。，所述显着在相对于所述多个载体治疗组以及所述环丙沙星单独治疗组中令人注意。与多个载体控制组相比，LMS-611(10毫克/毫升)与环丙沙星的所述多个组合物也在感染后的18、26和36小时显着地有效降低多个计数；然而，与所述多个环丙沙星单药治疗组相比，所述多个组合物在这些之后的时间点均没有造成一显着的影响。
与所述多个载体治疗组相比，仅有以10毫克/毫升的LMS-611的治疗在所有测试的时间点中与减少所述多个细菌计数的任何显着效果均没有关联。所述20毫克/毫升的剂量在所述18小时的时间点，在减少多个细菌计数中具有一显着、尽管是短暂的效果。
在本说明书中引用的所有文献均作为参考文献引入于本文中。在不脱离本发明的范围的情况下，对本发明所描述的实施例的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。虽然本发明已经结合多个具体的优选实施例进行描述，应当理解，要求保护的本发明不应该被不当地局限于所述多个特定的实施例。实际上，本发明旨在涵盖那些对于本领域技术人员来说显而易见的对于所描述的实施本发明的方式进行的各种修改。

Claims (24)

1.一种破坏能够形成生物膜的多个微生物/多个微生物体的群体感应的方法，其特征在于，所述方法包括：将多个板层小体应用在所述多个微生物上。
2.一种组合物应用在一微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包括一治疗有效量的板层小体。
3.一种组合物应用在一微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包括一治疗有效量的板层小体及至少一第一非板层小体的抗菌活性剂。
4.如权利要求3所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包括一治疗有效量的板层小体及至少一第一非板层小体的抗菌活性剂，其中所述抗菌剂是一抗生素。
5.如权利要求2至4中任一项所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包括一治疗有效量的板层小体，其中所述组合物用于一细菌感染的治疗。
6.如权利要求5所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包含一治疗有效量的板层小体，其中所述组合物用于选自于假单胞菌属、伯克氏菌属和葡萄球菌属的一细菌感染的治疗。
7.如权利要求2至6中任一项所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包含一治疗有效量的板层小体，其中所述感染是肺部或眼睛的一感染。
8.如权利要求3至7中任一项所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包含一治疗有效量的板层小体，其中所述第一非板层小体的抗菌活性剂是通过相异于所述多个板层小体的一途径的一不同的途径而被提供至一微生物感染部位。
9.如权利要求8所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包含一治疗有效量的板层小体，所述组合物用于肺部或多个呼吸道的一微生物感染的治疗，其中所述第一非板层小体的抗菌活性剂是通过静脉提供，及所述多个板层小体是通过鼻部提供。
10.如权利要求3至9中任一项所述的组合物应用在微生物感染的治疗上的用途，其特征在于，所述组合物包含一治疗有效量的板层小体，其中所述至少第一抗菌活性剂及所述多个板层小体是独立地、依序地或同时地以组合方式来提供。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用以增加一群落的多个微生物体的一细胞密度，所述方法包括多个步骤：
-引入多个板层小体到能够形成一生物膜的多个微生物体的一培养基中，以应用所述多个板层小体；及
-使所述多个微生物体在含有多个板层小体的所述培养基中生长，其中所述多个微生物体当在含有多个板层小体的一培养中生长时，所述多个微生物体生长至一细胞密度大于多个相同微生物体在不含所述多个板层小体的一培养基并且在相同的培养条件下生长的细胞密度。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用以增加一群落的多个微生物体的体积生产率，所述方法包括：
a)引入所述多个板层小体到能够形成生物膜的多个微生物体的一培养基中，以应用所述多个板层小体；以及
b)培养所述多个微生物体；
其中，所述多个微生物体在所述多个板层小体的存在下相关于由所述多个微生物体所产生的一发酵产物的所述体积生产率大于在缺乏多个板层小体下的所述微生物体的所述发酵产物的所述体积生产率。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法用以提供一发酵产物，所述方法包括：
a)提供能够产生一发酵产物的多个经过遗传修饰的微生物体；及
b)将所述多个经过修饰的微生物体培养在已应用多个板层小体的一培养基中，其中所述多个经过遗传修饰的微生物体具有能力达到所述发酵产物的一体积生产率高于当在不含所述多个板层小体的一培养基中时产生的相同的所述发酵产物的所述体积生产率。
14.一种多个部件的套组，其特征在于，所述套组包括多个板层小体和一抗菌活性剂，用于多个微生物的独立、依序或同时的治疗，以破坏微生物群体感测以及微生物生物膜的形成。
15.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，其中所述多个板层小体包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇以及胆固醇。
16.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，所述多个板层小体包括以重量计在44至70％的范围内的磷脂酰胆碱、在15至23％的范围内的鞘磷脂、在6至10％的范围内的磷脂酰乙醇胺、在2至6％的范围内的磷脂酰丝氨酸、在2至4％的范围内的磷脂酰肌醇以及在4至12％的范围内的胆固醇。
17.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，所述多个板层小体包含以重量计约55％的磷脂酰胆碱、约19％的鞘磷脂、约8％的磷脂酰乙醇胺、约4％的磷脂酰丝氨酸、约3％的磷脂酰肌醇以及约10％的胆固醇。
18.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，所述微生物生物膜是由选自于细菌、病毒、真菌、酵母和原生动物所组成的群组中的一微生物所形成的。
19.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，所述微生物生物膜是由细菌形成。
20.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性菌。
21.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，所述微生物感染是与一植入物相关的感染，及/或与一导管相关的感染，及/或与一植入的医疗装置相关的感染。
22.如前述权利要求任一项所述的方法或组合物或套组，其特征在于，用于与一板层小体结合的一抗菌活性剂是选自于由哌拉西林、氨曲南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、红霉素、特治星及环丙沙星、头孢他啶或其组合所组成的群组中的一抗生素。
23.一种治疗与在一宿主主体中的生物膜生成相关的微生物感染的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将多个板层小体提供至一宿主中的微生物感染的一部位，其中所述多个板层小体作为一群体感应的拮抗剂。
24.一种在情况是由多个微生物的多个群体信号/感应分子引起时治疗或预防或减缓一宿主中的一过程或情况的方法，其特征在于，所述方法包括将多个板层小体提供至多个微生物所在的一部位。
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