CN105287612A - 共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体及其制备方法与应用。本发明涉及医药领域，具体是共载盐霉素与阿霉素纳米脂质体，其制备方法及其在肝癌治疗中的应用。共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体可以将不同比例的盐霉素和阿霉素共同包载于同一纳米脂质体中，可以协同比例同时靶向作用于肝癌干细胞和肝癌细胞。这是肝癌治疗的一种新策略，利用纳米脂质体的优势，再结合抗干细胞药物与传统化疗药物的联用效果，充分发掘出两药联合使用的最佳比例，可以从根源上治疗肝癌，对肝癌的治疗和预后具有广阔的应用前景。

Description

共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，是共载盐霉素与阿霉素纳米脂质体，其制备方法及其在肝癌治疗中的应用。

背景技术

根据美国肿瘤协会(ACS)调查分析，从全世界肝癌分布区域图发现，不论是男性还是女性，中国是世界肝癌发病率最高的国家，目前治疗肝癌的主要手段是手术和放疗，但是治愈效果均不理想。因此，开展药物对肝癌的治疗的研究是非常迫切的。

肿瘤干细胞(CSCs)是能产生肿瘤细胞的一个亚群，在肿瘤的发生、转移、复发中起着关键作用。因此，在肿瘤的治疗过程中对肿瘤干细胞的作用是非常关键的。尽管目前研究者们对此提出了很多策略，肿瘤干细胞的消除仍然是很困难的。传统的化疗药物如多柔比星(阿霉素)和紫杉醇可以杀死多数肿瘤细胞，但是对肿瘤干细胞的作用极弱甚至耐药，从而导致肿瘤中肿瘤干细胞比例的升高。研究人员通过高通量筛选等方法鉴定出几种旧的药物(如全反式维甲酸、二甲双胍、盐霉素、硫利达嗪、姜黄素)具有对抗肿瘤干细胞的作用。盐霉素，是一种环醚类的离子载体抗生素，可以作用于多种肿瘤干细胞。实际上，根据最新非肿瘤干细胞向肿瘤干细胞转化的依据，同时清除非肿瘤干细胞和肿瘤干细胞可以最大程度的提高肿瘤患者的预后。

盐霉素，是一种脂溶性药物，难溶于水，在体液循环中难以达到治疗浓度；而阿霉素具有较大的心脏毒性及对正常细胞的毒副作用，降低剂量又很难达到治疗效果，因此，盐霉素与阿霉素的联用也存在上述问题，迫切需要解决。

纳米给药系统可为传统化疗药物和抗肿瘤干细胞药物的共同递送提供便利。为了达到此目的，已经有多种纳米药物诞生，脂质体(liposome)因其具有独特的类似生物双分子层脂质膜结构，具有良好的生物相容性，可以包载亲水性药物和疏水性药物，将其作为多种药物尤其抗肿瘤药物的载体已得到广泛应用。脂质体作为抗肿瘤药物载体可以解决药物的溶解性问题，稳定性问题和体内快速降解问题，通过调节脂质材料的比例可以控制药物的包封率和释放速率，从而制备出具有抗肿瘤活性的，可控的长循环脂质体，为肿瘤的进一步治疗奠定良好的制剂学基础。载药脂质体，可以以一种脂质体同时包载两种药物或是两种单独的纳米脂质体药物的形式存在。这些共同递送传统化疗药物和抗肿瘤干细胞药物的纳米给药系统在清除实体肿瘤和肿瘤干细胞的肿瘤治疗中均取得了优越的效果。

单独载阿霉素纳米脂质体技术已比较成熟(R.Sadasivan,R.Morgan,C.Fabian,R.Stephens.ReversalofmultidrugresistanceinHL-60cellsbyverapamilandliposome-encapsulateddoxorubicinCancerLetters,Volume57,Issue2,1May1991,Pages165-171)，而载盐霉素纳米脂质体的文献鲜有报道。且目前尚无文献报道共载盐霉素与阿霉素的纳米脂质体、其制备方法和对肝癌干细胞和肝癌细胞的治疗作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种共包载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体及其制备方法和该纳米脂质体在治疗肝癌中的应用。

本发明选择盐霉素钠-阿霉素联合给药基于以下两点原因：(1)两种药物分别作用于肿瘤干细胞和肿瘤细胞。已报道盐霉素可以作用于多种肿瘤干细胞，而阿霉素是传统的作用于肿瘤细胞的化疗药物。(2)盐酸阿霉素通过脱盐酸，可以转化为阿霉素，脂溶性增加。盐霉素钠为脂溶性药物，盐霉素钠与阿霉素作为脂溶性药物共同包载于同一纳米脂质体，更利于实现两种药物的协同释放。我们旨在通过纳米脂质体共包载盐霉素和阿霉素提高对肝癌干细胞和肝癌细胞的治疗作用。

本发明选择一线化疗药物-阿霉素和抗肝癌干细胞特异性药物-盐霉素，将其分别及共同包载入可生物降解、安全无毒的纳米脂质体中用于肝癌的靶向治疗。载阿霉素(DOX)纳米脂质体(DLN)用于消除肿瘤内已分化的肝癌细胞，载盐霉素(SAL)的纳米脂质体(SLN)用于消除肝癌干细胞，通过两种药物的脂质体联用SDLN与SLN+DLN实现同时杀伤肝癌细胞与肝癌干细胞，以期实现肝癌的彻底治愈。

本发明的技术方案包括：

体外验证盐霉素与阿霉素对肝癌干细胞与肝癌细胞的特异性，筛选两种药物针对肝癌细胞与肝癌干细胞的协同比例；本发明首次共包载不同剂量比例的盐霉素和阿霉素于同一纳米脂质体中，实现两种药物以协同作用；

共载盐霉素和阿霉素脂质体的制备；

载药纳米脂质体的体外抗肝癌细胞与肝癌干细胞活性分析；

载药纳米脂质体的体内药代动力学；

载药纳米脂质体的体内抗肝肿瘤及肝癌干细胞活性分析。

首先，肝癌干细胞的分选与鉴定。肝癌干细胞的分选方法有无血清悬浮培养分选、磁珠分选、流式细胞仪分选等方法，本发明选择无血清悬浮培养的方法富集分选肝癌干细胞。肝癌干细胞的鉴定通过干细胞的表型标记物CD133以及肝癌干细胞更易诱发肿瘤的产生对其进行鉴定。

其次，通过体外细胞实验验证盐霉素与阿霉素对肝癌干细胞与肝癌细胞的特异性，筛选两种药物针对肝癌细胞与肝癌干细胞的协同比例。本发明采用CCK-8法测定经不同药物、不同浓度处理后的细胞存活率，从而评价药物的细胞毒性。细胞的生存曲线经对数模拟后，计算细胞的IC50来定量比较其细胞毒性大小。其次，本发明结合协同处理软件Concusyn软件分析筛选不同比例盐霉素与阿霉素对肝癌细胞与肝癌干细胞的协同作用比例。

上述所述盐霉素浓度范围为1-1000μM，阿霉素浓度范围为0.1-100μM；盐霉素与阿霉素间的比例范围为40:1-1:40(摩尔比)；肝癌细胞与肝癌干细胞为肝癌细胞系及具有干细胞特征的肝癌细胞，本发明中使用肝癌HepG₂细胞作为肝癌细胞与由肝癌HepG₂细胞分选得到的HepG₂-TS作为肝癌干细胞。

本发明的第一方面，提供一种共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体，由药物、磷脂、胆固醇类化合物及水化介质制成；其中，药物、磷脂和胆固醇类物质的摩尔比为(1～10):(60～100):(0～40)。

所述的药物为盐霉素类化合物和阿霉素类药物，盐霉素类药物包括盐霉素及其盐类如盐霉素钠，阿霉素类药物包括阿霉素及其与酸所构成的盐类如盐酸阿霉素，盐霉素类药物与阿霉素类药物的摩尔比为40:1～1:40，其比例可以根据实际需要任意调整，其摩尔比优选为1:10～10:1，最优选为1:1。

所述的磷脂可选用天然磷脂或合成磷脂中的一种或多种，其中天然磷脂为大豆磷脂、卵磷脂中的一种或多种；合成磷脂为氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)中的一种或两种以上。

所述的胆固醇类化合物为普通胆固醇。

所述的水化介质可选用pH＝7.4的HEPES缓冲液或PBS缓冲液，其作用为乳化磷脂和胆固醇，从而得到纳米脂质体。

本发明的第二方面，提供上述共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法，具体方法如下：

(A)配置水化介质；称取磷脂，胆固醇溶于有机溶剂；称取盐霉素类药物和阿霉素类药物与三乙胺溶于甲醇；

(B)将药物与脂质混合均匀，连接旋转蒸发仪，转速为60-100rpm，水浴温度为50-70℃，待脂质和药物成均匀薄膜后，水化介质于50-70℃进行水化30-60min，充氮气，对纳米脂质体进行粒径均一，除去未包载的游离药物，即制备得到共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体。

优选的，上述共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法，具体方法如下：

1)配置水化介质pH＝7.4的HEPES缓冲液或PBS缓冲液；称取一定比例的氢化大豆卵磷脂(HSPC)，胆固醇(CHOL)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2K)溶于有机溶剂；称取一定量盐霉素钠，盐酸阿霉素与三乙胺溶于甲醇。

2)将药物与脂质混合均匀，连接旋转蒸发仪，转速为60-100rpm，水浴温度为50-70℃，待脂质和药物成均匀薄膜后，水化介质于50-70℃进行水化30-60min，充氮气，对纳米脂质体进行粒径均一，除去未包载的盐霉素和阿霉素，即制备得共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体。

上述步骤(A)中的有机溶剂可选用甲醇或三氯甲烷(氯仿)。

上述步骤(B)中完成共载盐霉素和阿霉素纳米脂质体的制备后，采用超声、依次经过模孔直径为400，200nm，100nm聚碳酸酯膜、微射流等方法对载药纳米脂质体进行粒径均一，得到粒径约为100nm的载药纳米脂质体。

上述步骤(B)中除去未包载游离药物的方法可以采用透析法或超速离心法。

本发明的第三方面，提供上述任一共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体在制备治疗肝癌药物中的应用。

所述的共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体靶向已分化的肝癌细胞和肝癌干细胞。

本发明采用CCK-8法测定肝癌细胞与肝癌干细胞在经不同浓度的载药纳米脂质体联用处理后的细胞存活率，来评价载药纳米脂质体对肝癌细胞与肝癌干细胞的细胞毒性。细胞的生存曲线经对数模拟后，计算细胞IC50值来定量比较其细胞毒性大小。

本发明比较了共载盐霉素和阿霉素纳米脂质体(SDLN)与单载药纳米脂质联用(SLN+DLN)在体内的药代动力学，考察共载药纳米脂质体保持药物间协同比例的能力及在体内的缓释效果。

本发明的共载盐霉素和阿霉素纳米脂质体的体内抗肿瘤活性与抗肿瘤干细胞活性分析：

(1)体内抗肿瘤效果评价：

在BABL/c裸鼠的后背皮下注射乳腺癌细胞悬液，建立肝癌荷瘤小鼠模型。待肿瘤生长到一定体积，药物经尾静脉注射，每三天注射一次，一共注射六次。每三天测定肿瘤的大小(肿瘤体积＝长边×短边2/2)和称量小鼠的体重，分别用于评价抗肿瘤生长曲线和毒副作用。荷瘤裸鼠经38天治疗观察后，处死将肿瘤剥离，用PBS洗净血渍，并用滤纸片吸干水分后，称量肿瘤的重量，计算各给药组的肿瘤抑制率。

(2)体内抗肿瘤干细胞活性评价：

经不同药物组分治疗后的离体肿瘤，经消毒处理后，消化成单细胞悬液，再经无血清培养后，计算和观察肝癌细胞球的的成球率和大小。

本发明成功制备共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体，该载药纳米脂质体分布均匀、粒径均一、具有明显脂质双分子层结构、具有一定程度的缓释效果；且载药纳米脂质体保持了游离药物的体外细胞毒性；体内药代动力学实验显示SLN-DLN具有较好的缓释效果，SDLN可更好的保持SAL-Na与DOX的协同比例；体内抗肿瘤实验显示SLN-DLN与SDLN的抗肿瘤效果及抗肿瘤干细胞活性均最佳。因此，该纳米脂质体联用处方用于治疗肝癌可以达到同时杀灭肝癌细胞和肝癌干细胞的目的。

本发明优点在于：

共载盐霉素钠和阿霉素的纳米脂质体可以将不同比例的盐霉素钠和阿霉素共同包载于同一纳米脂质体中，可以协同比例同时靶向作用于肝癌干细胞和肝癌细胞。这是肝癌治疗的一种新策略，利用纳米脂质体的优势，再结合抗干细胞药物与传统化疗药物的联用效果，充分发掘出两药联合使用的最佳比例，可以从根源上治疗肝癌，对肝癌的治疗和预后具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.CD133在HepG₂细胞和HepG₂细胞球中阳性表达率，A：HepG₂细胞；B：HepG₂细胞球。

图2.SAL-Na，DOX体外对HepG₂细胞和HepG₂细胞球的细胞毒性。(A：游离DOX；B：游离SAL-Na；C：HepG₂细胞；D：HepG₂细胞球。)

图3.纳米脂质体的表征。(A：SDLN的粒径分布，电位分布，表观形态；B：载药纳米脂质体的体外释放行为。)

图4.体外细胞毒性实验-48h。(A：空白纳米脂质体；B：HepG₂细胞；C：HepG₂细胞球。)

图5.盐霉素钠的血浆浓度-时间曲线。

图6.阿霉素的血浆浓度-时间曲线。

图7.不同药物联用组中DOX/SAL-Na的浓度比例随时间变化曲线。

图8.体内抗肿瘤活性。(A：肿瘤生长曲线；B：F-DOX，DLN，F-D-S，SLN-DLN，SDLN处理组的肿瘤生长曲线；C：肿瘤大小直观图；D：给药38天后的离体肿瘤体重，标尺为1厘米。)上述不同组的显著性差异由Student’st检验和ANOVA软件统计分析。**p<0.01vsPBS组；△p<0.05vs单一药物组；☆p<0.05vs游离药物联用组(n＝6)。

图9.裸鼠的体重变化。

图10.体内抗干细胞活性。(A：离体肿瘤的体外培养成球率；B：离体肿瘤的体外成球图谱。)上述不同组的显著性差异由Student’st检验和ANOVA软件统计分析。**p<0.01vsPBS组；△p<0.05vs单一药物组；☆p<0.05vs游离药物联用组(n＝3)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

材料和仪器：

氢化大豆卵磷脂(HSPC)，德国Lipoid公司；

胆固醇(CHOL)，美国Sigma公司；

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2K)，德国Lipoid公司；

盐酸阿霉素(DOX·HCL)，大连美仑生物技术有限公司；

盐霉素钠(SAL-Na)，美国TOKU-E公司；

三乙胺(TEA)，美国Sigma公司；

肝癌HepG₂细胞，本实验室所有；

胎牛血清、胰酶、青链双抗，美国Gibico公司；

CCK-8试剂盒，日本同仁化学研究所；

其他化学试剂均购自上海国药集团；

万分之一电子天平AL104，梅特勒托利多公司；

十万分之一电子天平MS205DU，梅特勒托利多公司；

ZetasizernanoZS激光粒度分析仪，英国马尔文公司；

岛津高效液相色谱仪LC-20A，日本岛津公司。

实施例1：肝癌干细胞的分选与鉴定

1、无血清悬浮培养富集肝癌干细胞

(1)配制无血清培养基，以下为500mlDMEM/F12培养基中添加物配方：

将配制好的无血清培养基分装置于多个50ml离心管，每管45ml(防止放入-20℃冰箱冷冻后回温导致热胀冷缩，损失培养基)，置于-20℃冰箱保存；

(2)分别选择对数生长期的HepG₂细胞，胰酶消化、PBS洗涤；用无血清培养基对细胞沉淀进行重悬，计数(10％台盼蓝溶液染色)，以1×10⁴/ml的密度培养于超低吸附培养皿或者悬浮培养皿中，用75％酒精棉对培养皿外周擦拭灭菌、标记，放置于含5％CO₂的孵箱中孵育。三天后补充无血清培养基以维持细胞所需营养，六天后对其进行传代。

2、肝癌干细胞的鉴定。

(1)成球率的比较，分别比较HepG₂细胞与第三代HepG₂-TS的成球率。

选择对数生长期的HepG₂细胞，胰酶消化、PBS洗涤；用无血清培养基重悬细胞沉淀，计数(10％台盼蓝溶液染色)，以2000个/孔的密度接种培养于超低吸附6孔板中(n＝4)，用75％酒精棉对培养板外周擦拭灭菌、标记，放置于含5％CO₂的孵箱中孵育，3天后补充1ml无血清培养基，第6天观察第一代HepG₂-TS的形成情况。通过显微镜观察并统计HepG₂-TS形成个数，按公式“微球体形成率％＝HepG₂-TS形成个数/接种的HepG₂单细胞数×100”计算HepG₂-TS的成球率。

选择第二代对数生长期的HepG₂-TS，70μm无菌筛网过滤收集、消化、PBS洗涤；用无血清培养基重悬细胞沉淀，计数(10％台盼蓝溶液染色)，以1000个/孔的密度接种培养于超低吸附6孔板中(n＝3)。培养6天，形成的细胞球为第三代HepG₂-TS，其成球率的考察统计方法同上。

(2)肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞在裸鼠模型中的致瘤能力的比较。

选用6周龄，体重约为20±2g的雄性裸鼠(SPF级)。将裸鼠随机分为10组，每组5只，分笼标记。分别接种不同数量的HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞。具体操作步骤为：

选择对数生长期的HepG₂细胞和第三代HepG₂-TS细胞，分别对其进行消化，PBS洗涤，用预冷的PBS溶液重悬，计数(10％台盼蓝溶液染色)；

调整HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞的浓度分别为2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、5×10³个/ml，将等体积不同浓度细胞悬液与基质胶混合，置于冰盒中保存，运至动物房(由于基质胶在0℃呈液态，具有较好流动性，高于0℃则转变为凝胶态，流动性降低，因此该操作需在低温条件下快速完成)；

将细胞与基质胶混合液吸置1ml注射器，排空气泡，每只裸鼠注射200μl细胞与基质胶混合液，接种于裸鼠后背部左侧皮下。在正常饲养条件下，每三天观察记录不同细胞量细胞对裸鼠的致瘤情况。

(3)肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞中CD133的表达量的比较

选择对数生长期的HepG₂细胞和第三代HepG₂-TS细胞，分别对其进行消化，PBS洗涤，计数(10％台盼蓝溶液染色)，以5×10⁵个/管的细胞量置于多个2mlEP管中，离心；

用500μlPBS重悬细胞沉淀，分为三组(n＝3)：A：空白细胞组，不做处理；B：空白细胞+10μlIgG-PE同型对照；C：空白细胞+10μlCD133⁺-PE实验组。混匀，置于4℃冰箱，避光孵育30min；

将三组样品离心，PBS洗涤2次，最后用300-500μlPBS重悬细胞沉淀并转移至流式管中，避光保存，按A、B、C顺序依次通过流式细胞仪检测。

表1肝癌HepG₂细胞的成球率

表2肝癌HepG₂微球体的成球率

表3肝癌HepG₂细胞和HepG₂微球体在裸鼠模型中的致瘤情况

通过对HepG₂细胞进行无血清悬浮培养形成细胞球HepG₂-TS，并对其进行微球体形成率、裸鼠体内成瘤率以及表型标记物CD133进行鉴定，结果显示，HepG₂-TS经传代后成球率增加(表1，表2)；在接种低浓度的细胞量时，HepG₂-TS细胞较HepG₂细胞有更强的致瘤效果(表3)；HepG₂-TS中CD133⁺比例约为HepG₂细胞的5倍(图1)，综合上述结果，我们可得出结论，HepG₂-TS细胞较HepG₂细胞具有干细胞特征，富集了更高比例的肝癌干细胞，可作为肝癌干细胞用于后续研究。

实施例2：体外验证盐霉素与阿霉素对肝癌干细胞与肝癌细胞的特异性，筛选两种药物针对肝癌细胞与肝癌干细胞的协同比例

通过CCK-8法体外细胞实验考察游离SAL-Na与DOX分别对肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS的细胞毒性。简要步骤如下，HepG₂细胞和HepG₂-TS以3000个/孔的密度接种于96孔板，孵育12h过夜，将原有培养基跟换为含有不同浓度的游离SAL-Na与DOX新鲜培养基，分别孵育48h，72h；小心除去含药培养基，PBS洗涤一次，每孔加入100μl10％(V/V)CCK-8培养基溶液，孵育2-4h，借助酶标仪，振摇20s后于450nm处测定各孔OD值，按照公式“细胞存活率(％)＝(实验组OD值-阴性对照组OD值)/(空白对照组OD值-阴性对照组OD值)×100％”计算细胞的存活率。

其次，按照上述方法结合Compusyn软件，筛选游离SAL-Na与DOX在肝癌HepG2细胞和HepG2-TS中共同的协同比例，其中CI<1，为协同作用；CI＝1，为相加作用；CI>1，为拮抗作用。

体外细胞毒性实验显示(图2)，SAL-Na对HepG₂-TS具有选择特异性(图2B)，而DOX对HepG₂-TS具有耐药性，选择性作用于肝癌HepG₂细胞(图2A)；且在肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞中筛选出DOX与SAL-Na共同的协同比例为摩尔比1:1(图2C，2D)。

实施例3：载药纳米脂质体的制备与表征

采用薄膜分散水化法，盐酸阿霉素脱盐酸，分别制备空白纳米脂质体、载阿霉素纳米脂质体(DLN)、载盐霉素钠纳米脂质体(SLN)以及共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体(SDLN)。简要步骤如下：将1ml溶解SAL-Na和脱盐酸处理的DOX(DOX·HCl:TEA＝1:2,摩尔比)甲醇溶液与4ml溶解脂质(HSPC:CHOL:DSPE-PEG-2K＝85:10:5，摩尔比)的三氯甲烷溶液混合，转移至250ml圆底烧瓶中，连接旋转蒸发仪，转速为60rpm，水浴温度为65℃，待脂质溶液旋转蒸发为均匀薄膜后，使用5mlPBS(pH＝7.4)于65℃条件下水化30min，即得纳米脂质体溶液。将该脂质体溶液在冰浴条件下探头超声10min(200w，超声5s/间隔5s)，在65℃条件下，依次通过膜孔直径为400，200nm聚碳酸酯膜5次，即得到载药纳米脂质体。

采用透射电子显微镜(TEM)观察纳米脂质体的表观形态和粒径，将纳米脂质体用超纯水稀释至脂质浓度为2mg/mL，滴加样品至TEM铜网，待样品挥干，滴加2.0％磷钨酸溶液，染色3min，吸水纸吸去多余染色液，挥干溶剂，即制得TEM样品；采用激光粒度分析仪考察纳米脂质体的粒径分布和Zeta电位分布，用超纯水将纳米脂质体稀释至适当浓度，取1ml置于样品池中，用激光粒度分析仪分别测定纳米脂质体的粒径分布和Zeta电位分布。

采用乙醇对载药纳米脂质体进行破乳后，分别借助HPLC对SAL-Na、DOX在纳米脂质体中的包封率、载药量进行测定。其中SAL-Na的液相条件为C18反相色谱柱(Diamonsil(2)，250×4.6mm,5μm)，乙腈:水:THF:H₃PO₄＝85:10:5:0.1％(V/V)，206nm；DOX的液相条件为C18反相色谱柱(Diamonsil(2),250×4.6mm,5μm)，乙腈:水:TEA＝25:75:0.1％(V/V)(水相用磷酸调节pH＝3.0)，1.2ml/min，253nm。

最后，考察了载药脂质体在PBS溶液中的释放行为。简要步骤如下，分别取2ml载药纳米脂质体置于截留分子量为10kDa的透析管中，SLN的释放介质为40mlPBS(pH＝7.4)，DLN的释放介质为40mlPBS(pH＝5.0)，在37℃、100rpm条件下，于规定时间点各取2ml释放介质，并补充2ml新鲜释放介质。DOX的释放液直接测定；SAL-Na的释放液需经浓缩，溶解于甲醇，按实施例2上述SAL-Na和DOX的方法学进样分析。

表4.纳米脂质体的表征

HSPC/CHOL/DSPE-PEG-2k＝85/10/5，SLN中的药脂比为1/10，DLN中DOX/DSPE-PEG-2k的比例为1/2，SDLN中DOX/SAL-Na的投药比例为3/4，最终制备的SDLN中包裹DOX/SAL-Na比例为1/1。

采用薄膜分散法，我们成功制备空白纳米脂质体、载盐霉素钠纳米脂质体(SLN)、载阿霉素纳米脂质体(DLN)及按协同比例共载盐霉素钠与阿霉素的纳米脂质体(SDLN)并对其进行表征，如图3和表4所示，各纳米脂质体组分布均匀、粒径在100nm附近、Zeta电位在-35mV附近、具有明显脂质双分子层结构，且在72h内均具有一定程度的缓释效果。

实施例4：载药纳米脂质体的细胞毒性

同样，采用上述CCK-8法检测空白纳米脂质体、载药纳米脂质体单用及联用对肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS的细胞毒性。

表5.不同药物组对HepG₂细胞和HepG₂细胞球的IC₅₀值

上述IC50值的比较由t检验进行统计分析。n.s：载药纳米脂质体vs游离药物，p>0.05；a:：HepG₂细胞球vsHepG₂细胞，p<0.05(n＝3)。

体外细胞毒性实验显示(图4，表5)，空白纳米脂质体对肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞均无明显细胞毒性(图4A：a，b)；载药纳米脂质体可保持游离药物对肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞的细胞毒性(图4B：a，b；图4C：a，b)；SLN-DLN、SDLN可保持F-SAL-Na-DOX对肝癌HepG₂细胞和HepG₂-TS细胞的细胞毒性(图4B：c；图4C：c)，说明SLN-DLN、SDLN可同时作用于肝癌细胞和肝癌干细胞且具有较强的杀伤作用。

实施例5：载药纳米脂质体的体内药代动力学分析

选用SD雄性大鼠12只，随机分为3组，每组4只，分别给予F-SAL-Na-DOX、SLN-DLN以及SDLN。按照SD大鼠的体重为200g进行给药，分别以2mg/kg的SAL-Na剂量、3mg/kg的DOX剂量静脉给药。分别在1min、5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h经眼眶取全血约0.5ml置于2ml肝素EP管中，上下震荡，防止凝血，-20℃冰箱保存。将上述不同时间点收集的血浆样品，离心3500rpm，10min。血浆中SAL-Na通过HPLC-MS检测，HPLC色谱条件为色谱柱：WatersC18(3.0mm×100mm,3.5μm)，流动相：乙腈-水(内含2％冰乙酸+2mM乙酸铵)(90:10,V/V)，流速：0.4ml/min，柱温：40℃，进样量：5μL，内标：非诺贝特；质谱条件为：离子源：电喷雾正模式电离(ESI+)，检测模式：SIM检测，检测对象：m/z773.4(SAL-Na的[M+H]+)和m/z361.1(FNBT的[M+H]+)，毛细管电压：3000V，雾化器压力：45psig，干燥气流速：8.0L·min-1，干燥气温度：350℃，碎片离子电压：70eV；血浆中DOX通过HPLC-DAD检测，条件为：色谱柱：C18反相色谱柱(Diamonsil(2),250×4.6mm,5μm)，流动相：乙腈:水:TEA＝25:75:0.1％(V/V)(水相用磷酸调节pH＝3.0)，流速：1.2ml/min，紫外检测器波长：232nm，柱温：35℃，进样量：20μL，内标：柔红霉素。实验数据经DAS2.0软件进行分析处理。

表6盐霉素钠的药代动力学参数

上述显著性差异由Student’sttest和ANOVA统计分析。^ap<0.05，SDLNv.sF-S-D；^bp<0.05，SLN-DLNvsF-S-D；^cp<0.05，SLN-DLNv.sSDLN(n＝4)。

表7阿霉素的药代动力学参数

上述显著性差异由Student’sttest和ANOVA统计分析。ap<0.05，SDLNv.sF-S-D；bp<0.05，SLN-DLNvsF-S-D；cp<0.05，SLN-DLNv.sSDLN(n＝4)。

经分析本发明中SAL-Na、DOX的代谢模型符合双室模型的特点。，三组药物处方中SAL-Na、DOX在不同时间点的C-t曲线如图5，图6所示。应用双室模型计算了三组药物处方中SAL-Na、DOX的体内药物动力学参数，如表6，表7所示，在SAL-Na的代谢过程中，SDLN组的t_1/2是F-SAL-Na-DOX的1.16倍，无显著性差异；SLN-DLN组的t_1/2是F-SAL-Na-DOX的1.70倍，有显著性差异；SLN-DLN组相较于SDLN组曲线下面积AUC更大、清除速率更小，有显著性差异，因此SLN-DLN组在SAL-Na的代谢过程中更具缓释效果。在DOX的代谢过程中，SDLN组的t_1/2是F-SAL-Na-DOX的2.07倍，有显著性差异；SLN-DLN组的t_1/2是F-SAL-Na-DOX的2.74倍，有显著性差异；但是，SLN-DLN组相较于SDLN组曲线下面积AUC较小、清除速率较大，有显著性差异，SLN-DLN组在DOX的代谢过程中更具缓释效果。

其次，我们考察了DOX与SAL-Na在大鼠体内随时间代谢过程中两药的浓度比的变化，结果如图7所示，结合给药剂量：C_DOX/C_SAL-Na＝1.5，在12h内，SDLN组中DOX与SAL-Na的浓度比例维持在1:1-3:1范围内；SLN-DLN组与F-SAL-Na-DOX组中DOX与SAL-Na比例变化趋势相似，两药比例失调。我们认为SDLN组较SLN-DLN组能更好的维持DOX与SAL-Na的代谢比例，SDLN组发挥了其作为单一剂型保持两种药物以相似速率代谢的优点。

实施例6：载药纳米脂质体的体内抗肿瘤活性

通过皮下注射HepG2细胞，200万/只建立肝癌裸鼠模型。待肿瘤体积达到约50mm3，挑选肿瘤体积大小相近的裸鼠，随机分为9组，每组6只。给药方案。A：PBS(对照组)；B：空白脂质体组(Blankliposomes)；C：游离盐霉素钠组(F-SAL-Na，2mg/kg)；D：载盐霉素钠纳米脂质体组(SLN，2mg/kg)；E：游离阿霉素组(F-DOX，1.875mg/kg)；F：载阿霉素纳米脂质体组(DLN，1.875mg/kg)；G：游离盐霉素钠与阿霉素组(F-SAL-Na-DOX，SAL-Na，2mg/kg；DOX，1.875mg/kg)；H：载盐霉素钠纳米脂质体与载阿霉素纳米脂质体组(SLN-DLN，SAL-Na，2mg/kg；DOX，1.875mg/kg)；I：共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体组(SDLN，SAL-Na，2mg/kg；DOX，1.875mg/kg)，以上各联合给药组中两药摩尔比例均为1:1。

上述9组样品均提前制备并过0.22μm滤膜除菌，给药途径为静脉给药，给药周期为30天，分别在HepG2细胞接种的第8、11、14、17、20、23天静脉给药，共给药6次，每3天用游标卡尺对肿瘤体积大小进行测量并对裸鼠进行称重，停药后继续观察记录2周，猝死裸鼠，剥离肿瘤进行后续实验并通过肿瘤体积生长曲线(肿瘤体积V＝1/2肿瘤长径L×肿瘤短径W²)、裸鼠的体重变化(裸鼠体重变化率％＝BW_实验结束/BW_实验开始×100)、离体肿瘤的大小、重量及药物处方的肿瘤抑制率(IRT％＝(W_实验组-W_对照组)/W_对照组×100)评价各组药物处方的抗肿瘤效果。

表8.不同处方的肿瘤抑制率(n＝6)

如图8，图9，表8所示，我们分别考察了PBS组、Blankliposomes组、F-SAL-Na组、SLN组、F-DOX组、DLN组、F-SAL-Na-DOX组、SLN-DLN组以及SDLN组的体内抗肿瘤活性。体内抗肿瘤活性实验结果显示，空白纳米脂质对裸鼠没有明显毒性，验证了载体材料的安全性；药物联用组的抗肿瘤效果优于单独药物使用组；脂质体联用组优于游离药物联用组；体内抗肿瘤活性最高的为SLN-DLN及SDLN，但两组的抗肿瘤活性无统计学差异，抑瘤率分别为76.46±5.49、71.55±5.26％。

实施例7：载药纳米脂质体的体内抗肝癌干细胞活性

裸鼠肝癌模型经治疗后，从离体肿瘤中分离出肿瘤细胞进行悬浮培养，以各组肿瘤细胞形成微球体的个数及体积来考察各组药物处方抗肝癌干细胞的活性。简要步骤如下，将离体肿瘤用手术剪将肿瘤组织剪切为体积约为1mm3的碎小块，加1ml预先配制的胶原酶Ⅰ溶液，置于孵箱中消化20min，每5min振摇一次；将消化后的肿瘤组织液通过40μm的细胞滤网，收集于离心管中，离心，PBS洗涤，用含血清DMEM高糖培养基重悬，各取2ml该细胞悬液培养于6孔板中；待上述细胞贴壁，PBS洗涤，除去死细胞及未贴壁其它细胞组织，胰酶消化，PBS洗涤，用无血清培养基重悬细胞沉淀，计数(10％台盼蓝溶液染色)，稀释细胞浓度为1000个/ml，各取1ml培养于12孔板中，第三天补充1ml无血清培养基，待到第六天，取出12孔板，对各组微球体形成情况进行统计与记录。

通过对离体肿瘤进行无血清悬浮培养HepG₂-TS，各处方的体内抗肝癌干细胞活性结果显示(图10)，SAL-Na选择性杀伤肝癌干细胞，DOX选择性杀伤肝癌细胞，SAL-Na与DOX联用，尤其通过纳米脂质体作为载体进行包裹后，SLN-DLN组与SDLN组均可显著的抑制HepG₂-TS的数量及体积，说明SLN-DLN组与SDLN组对肝癌干细胞具有很强的抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体，包括药物、磷脂、胆固醇类化合物及水化介质，所述的药物为盐霉素类药物和阿霉素类药物，其中，药物、磷脂和胆固醇类化合物的摩尔比为(1～10):(60～100):(0～40)，盐霉素类药物和阿霉素类药物的摩尔比为40:1～1:40。

2.根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于，所述的盐霉素类药物包括盐霉素及其盐类，阿霉素类药物包括阿霉素及其与酸所构成的盐类，盐霉素类药物与阿霉素类药物的摩尔比为1:10～10:1。

3.根据权利要求2所述的纳米脂质体，其特征在于，所述的盐霉素的浓度范围为1-1000μM，阿霉素的浓度范围为0.1-100μM。

4.根据权利要求2所述的纳米脂质体，其特征在于，所述的盐霉素盐为盐霉素钠，所述的阿霉素与酸所构成的盐类为盐酸阿霉素。

5.根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于，所述的磷脂为天然磷脂或合成磷脂中的一种或多种，其中天然磷脂为大豆磷脂、卵磷脂中的一种或多种；合成磷脂为氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或多种；所述的胆固醇类化合物为普通胆固醇；所述的水化介质为pH＝7.4的HEPES缓冲液或PBS缓冲液。

6.一种如权利要求1所述的共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，具体方法如下：

(A)配置水化介质；称取磷脂，胆固醇溶于有机溶剂；称取盐霉素类药物和阿霉素类药物与三乙胺溶于甲醇；

(B)将药物与脂质混合均匀，连接旋转蒸发仪，转速为60-100rpm，水浴温度为50-70℃，待脂质和药物成均匀薄膜后，水化介质于50-70℃进行水化30-60min，充氮气，对纳米脂质体进行粒径均一，除去未包载的游离药物，即制备得到共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(A)中的有机溶剂为甲醇或三氯甲烷。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(B)中完成共载盐霉素和阿霉素纳米脂质体的制备后，采用超声、依次经过模孔直径为400，200nm，100nm聚碳酸酯膜、微射流等方法对载药纳米脂质体进行粒径均一，得到粒径约为100nm的载药纳米脂质体；除去未包载游离药物的方法采用透析法或超速离心法。

9.一种如权利要求1-5任一所述的共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体在制备治疗肝癌药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的共载盐霉素和阿霉素的纳米脂质体靶向已分化的肝癌细胞和肝癌干细胞。