CN103976950B - 一种阿霉素纳米载药系统、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿霉素纳米载药系统、其制备方法及应用。所述载药系统按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.02%~1.5%、固体脂质1~20%、液体脂质0.1~20%、乳化剂0.5%~20%以及等渗调节剂0.1%~5%;固体脂质和液体脂质形成纳米颗粒包裹含阿霉素的活性成分。其制备方法包括:(1)将含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及脂溶性乳化剂均匀分散于有机溶剂,蒸干有机溶剂获得油相;(2)将其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于水中获得水相;(3)将水相逐滴添加到油相中乳化;(4)高压均质;(5)冷却除菌。所述阿霉素纳米载药系统,实现阿霉素与化疗增敏剂的共输送,增强阿霉素对肝癌细胞的杀伤力。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,更具体地,涉及一种纳米载药系统、其制备方法及应用。
背景技术
原发性肝细胞癌是严重危害人类健康的重大疾病,其恶性程度极高,侵袭生长迅速,治疗后易复发,5年生存率不到5%,被称为“癌中之王”。目前,治疗原发性肝癌的化疗药物包括阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂、丝裂霉素、喜树碱、吉西他滨、索拉菲尼等,其中阿霉素为治疗原发性肝癌的临床标准用药。但是,肝癌细胞通常存在着原发性耐药,并且多数肝癌发生在已存在的肝脏疾病的基础上,影响药物的吸收与代谢,使得单一化疗药物的治疗效果有限。因此,目前抗肝癌药物研究关注的热点是联合用药制剂。
联合用药主要有三种方式,分别为多种化疗药物联合使用、分子靶向药物与化疗药物联合使用以及化疗增敏剂与化疗药物联合使用。多种化疗药物联合使用具有毒性小、有效率高的优势,但仍未解决耐药性的问题;分子靶向药物与化疗药物联合使用通过抑制特定的分子靶点提高化疗药物的治疗效果,但是治疗前检测靶点表达和突变较难,不易选择合适的分子靶向药物;化疗药物与增敏剂联合使用,通过增敏剂与化疗药物的协同作用,逆转多药耐药,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力,有可能达到良好的治疗效果。
目前,临床治疗时化疗药物与化疗增敏剂的联用方法仅是简单地将二者的普通制剂混合使用,由于存在大多数化疗药物生物利用度不高、增敏剂与化疗药物体内药代动力学行为不一致等问题,导致二者普通制剂的混合使用治疗效果仍然有限。
阿霉素已在肝癌的临床治疗中得到广泛应用,但是,原发性肝癌细胞中存在的多药耐药基因MDR高表达、抗凋亡基因Bcl-2过表达、核转录因子NFκB高表达、p53基因突变等复杂因素,使得单一使用阿霉素的治疗效果有限。为解决阿霉素治疗过程中产生的耐药性等副作用,有人采用联合用药的方式,包括阿霉素与另一种化疗药物联合使用,以及阿霉素与化疗增敏剂联合用药两种方式。前者是利用不同化疗药物具有不同的抗肿瘤作用,产生协同治疗效果。如使用胶束分别载负阿霉素与紫杉醇,研究发现二者联合使用对乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多种耐药癌细胞具有协同的杀伤作用。后者则是将阿霉素与耐药抑制剂(如siRNA)联合使用,降低了肿瘤细胞对阿霉素的耐药性,增强了阿霉素的治疗作用。但是,上述联合用药是将二种活性成分的不同制剂混合使用,不是采用同一载体进行药物共输送,因此存在两种不同的活性成分(不同化疗药物、增敏剂与化疗药物)体内药代动力学行为不一致、两种活性成分无法同时输送到肿瘤细胞以及药物生物利用度低等问题,导致其治疗效果仍然有限。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种阿霉素纳米载药系统、其制备方法及应用,其目的在于通过纳米载药系统共输送化疗增敏剂与化疗药物,使得化疗增敏剂与化疗药物产生协同作用,逆转多药耐药,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力,由此解决目前抗癌药物,尤其是抗肝癌药物,药效有限且容易产生耐药性的问题的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种阿霉素纳米载药系统,其特征在于,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.02%~1.5%、固体脂质1~20%、液体脂质0.1~20%、乳化剂0.5%~20%以及等渗调节剂0.1%~5%,余量为注射用水;
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:10~10:1的混合物;
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。
优选地,所述纳米载药系统,其按照质量比例包括所述含阿霉素的活性成分0.1%~0.7%、固体脂质2%~6%、液体脂质0.2%~5%、乳化剂1%~10%以及等渗调节剂0.5%~3%,余量为注射用水。
优选地,所述纳米载药系统,其纳米颗粒粒径在10nm至1000nm之间,多分散指数PDI≤0.50,含阿霉素的活性成分包封率≥60%。
优选地,所述纳米载药系统,其纳米颗粒粒径在50nm至400nm之间,多分散指数PDI≤0.30,含阿霉素的活性成分包封率≥90%。
优选地,所述纳米载药系统,其增敏剂为姜黄素。
优选地,所述纳米载药系统,其含阿霉素的活性成分为阿霉素与姜黄素1:2~2:1的混合物。
优选地,所述纳米载药系统,其所述乳化剂中含有不超过乳化剂总质量25%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS),其中聚乙二醇分子量为100~10000,优选500~2000。
优选地,所述纳米载药系统,其所述乳化剂还含有聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、磷脂、短链醇中的一种或二种。优选为聚氧乙烯氢化蓖麻油、大豆磷脂、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或聚山梨醇酯。
优选地,所述纳米载药系统,其所述固体脂质为饱和脂肪酸、饱和脂肪酸的单、双、三甘油酯、胆固醇、鲸蜡醇十六酸酯、鲸蜡醇棕榈酸酯和/或微晶石蜡。优选为单硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯或山嵛酸甘油酯。
优选地,所述纳米载药系统,其所述饱和脂肪酸为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或山嵛酸中的一种或两种。
优选地,所述纳米载药系统,其所述液体脂质为肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯、丙二醇单辛酸酯、油酸、大豆油或液体石蜡。优选为辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯或丙二醇单辛酸酯。
优选地,所述纳米载药系统,其所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、果糖或木糖醇;优选为甘油。
按照本发明的另一方面,提供了一种所述的阿霉素纳米载药系统的制备方法,包括以下步骤:
(1)将配方比例的含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及脂溶性乳化剂均匀分散于有机溶剂,65℃至80℃蒸干有机溶剂,获得油相,维持温度;
(2)将配方比例的其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于超纯水中,65℃至80℃保温,获得水相;
(3)65℃至80℃下,将水相逐滴添加到油相中,均匀混合后乳化,获得初乳;
(4)65℃至80℃下,将初乳高压均质,获得纳米乳;
(5)将纳米乳冷却,除菌后获得所述纳米载药系统。
按照本发明的另一方面,提供了所述的阿霉素纳米载药系统,应用于制备抗原发性肝癌药物。
以人肝癌细胞HepG2为体外模型对所述阿霉素纳米载药系统物的抗肝癌活性进行评价。结果显示,与阿霉素溶液和单一阿霉素纳米脂质组合物相比,所述阿霉素纳米载药系统能够显著增强抗肿瘤细胞增殖的作用。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,由于采用阿霉素和增敏剂的共输送纳米载药系统,与现有的联合使用阿霉素与姜黄素的普通制剂或单一载阿霉素的纳米载药系统比较,显示出以下技术进步:
1.本发明提供的阿霉素-姜黄素纳米脂质组合物,由于化疗药物和化疗增敏剂被共载于同一纳米载药系统中,包封率高,粒径均一,纳米脂质组合物粒径适宜,易于通过增强渗透滞留(EPR)效应靶向输送至肿瘤病灶部位。
2.本发明提供的阿霉素-姜黄素纳米脂质组合物,相较于单独使用阿霉素纳米脂质组合物,对人肝癌细胞增殖的抑制作用更明显,增强了抗癌效果。
3.聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS)通过影响ATP酶的构象和活性来抑制P-糖蛋白对药物的外排作用,可有效地逆转肿瘤细胞的多药耐药性。本发明采用TPGS修饰纳米脂质组合物,实验结果表明有效逆转肿瘤细胞对阿霉素的耐药,抗肿瘤效果明显增强。同时,TPGS中PEG链段可避免血浆中蛋白的调理作用,延长阿霉素-姜黄素纳米脂质组合物体内循环时间,增强其在肿瘤部位的EPR效应。
4.本发明提供的纳米脂质组合物采用具有良好生物相容性的药用辅料制备,对人正常肝细胞安全、无明显毒副作用;同时,制备工艺稳定,易于工业化,具有很好的市场开发前景。
附图说明
图1是实施例4激光粒度仪测得的阿霉素载药系统的粒径分布;
图2是实施例4制得的阿霉素载药系统的TEM表征结果;
图3是阿霉素纳米载药系统的X射线粉末衍射结果;
图4是实施例16阿霉素体外释放曲线;
图5是实施例19实验动物生存曲线;
图6是实施例19谷丙转氨酶检测结果(***p<0.001,与正常组比较;##p<0.01,#p<0.05,与模型组比较);
图7是实施例19二乙基亚硝胺诱导小鼠产生原发性肝癌组织病理观察结果;
其中图7(A)为正常组肝组织,图7(B)为生理盐水组出现肿瘤肝组织,图7(C)为正常肝组织HE染色结果,图7(D)为生理盐水组肿瘤肝组织HE染色结果
图8是实施例19药效学研究的组织病理观察结果(第30周时各组HE染色结果);
其中图8(A)为空白脂质纳米粒组组织病理HE染色结果图,图8(B)为阿霉素溶液组组织病理HE染色结果图,图8(C)为阿霉素纳米脂质组合物组组织病理HE染色结果图,图8(D)为阿霉素-姜黄素混合溶液组组织病理HE染色结果图,图8(E)为实施例3的阿霉素纳米载药系统组组织病理HE染色结果图,图8(F)为实施例4的阿霉素纳米载药系统组组织病理HE染色结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.02%~1.5%、固体脂质1~20%、液体脂质0.1~20%、乳化剂0.5%~20%以及等渗调节剂0.1%~5%,余量为注射用水。优选地,所述阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括所述含阿霉素的活性成分0.1%~0.7%、固体脂质2%~6%、液体脂质0.2%~5%、乳化剂1%~10%以及等渗调节剂0.5%~3%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:10~10:1的混合物,所述增敏剂优选为姜黄素。当增敏剂为姜黄素时,所述含阿霉素的活性成分,优选为阿霉素与姜黄素1:2~2:1的混合物。
所述乳化剂中含有不超过乳化剂总质量25%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(TPGS),其中聚乙二醇分子量为100~10000,优选500~2000。所述乳化剂还含有聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、磷脂、短链醇中的一种或二种,优选为聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或聚山梨醇酯。
所述固体脂质为饱和脂肪酸、饱和脂肪酸的单、双、三甘油酯、胆固醇、鲸蜡醇十六酸酯、鲸蜡醇棕榈酸酯和/或微晶石蜡。饱和脂肪酸如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或山嵛酸或其两种的混合物。优选的固体脂质为单硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯或山嵛酸甘油酯。
所述液体脂质为肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯、丙二醇单辛酸酯、油酸、大豆油或液体石蜡。优选的液体脂质为辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯或丙二醇单辛酸酯。
所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、果糖或木糖醇。优选的等渗调节剂为甘油
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在10nm至1000nm之间,优选粒径在50nm至400nm之间;多分散指数PDI≤0.50,优选多分散指数PDI≤0.30;含阿霉素的活性成分包封率≥60%,优选包封率≥90%。
本发明提供的阿霉素纳米载药系统,其制备方法包括以下步骤:
(1)将配方比例的含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及脂溶性乳化剂均匀分散于有机溶剂,65℃至80℃蒸干有机溶剂,获得油相,维持温度。
所述脂溶性乳化剂,如磷脂等。
所述阿霉素为脂溶性的阿霉素,可按照如下方法获取:将水溶性盐酸阿霉素溶解于有机溶剂中,加入盐酸阿霉素2~5倍摩尔质量的三乙胺进行中和,避光搅拌过夜,旋转蒸干溶剂,得到脂溶性的阿霉素。
所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或乙醇,优选为无水乙醇。
(2)将配方比例的其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于超纯水中,65℃至80℃保温,获得水相。
(3)65℃至80℃下,将水相逐滴添加到油相中,均匀混合后乳化,获得初乳。
优选的,使用磁力搅拌使得水相和油相均匀混合,磁力搅拌时间为5~15min;采用高剪切的方法使得混合物乳化,高剪切速率为8000~13000rpm,剪切时间为1~3min。
(4)65℃至80℃下,将初乳高压均质,获得纳米乳。高压均质压力为600~1200bar,循环次数为2~10次。
(5)将纳米冷却,除菌后获得所述纳米载药系统。
一般,可将纳米乳迅速置放于冰箱中冷却,采用微孔滤膜过滤除菌,常用规格为0.45μm的微孔过滤膜。
本发明提供的阿霉素纳米载药系统,能应用于制备抗原发性肝癌的药物。
以人肝癌细胞HepG2为体外模型对阿霉素纳米载药系统的抗肝癌活性进行评价。结果显示,与阿霉素溶液和单一阿霉素纳米脂质组合物相比,本发明提供的阿霉素纳米载药系统能够显著增强抗肿瘤细胞增殖的作用。
以小鼠原发性肝癌模型对阿霉素纳米载药系统抗原发性肝癌活性进行药效学评价。结果显示,阿霉素纳米载药系统对原发性肝癌具有明显的协同治疗效果,优于联合使用阿霉素与姜黄素的普通制剂以及单一阿霉素纳米脂质组合物。
以下为实施例:
实施例1
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分1.5%、固体脂质20%、液体脂质20%、乳化剂5%以及等渗调节剂5%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:10的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量10%的聚乙二醇5000维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量90%的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物
所述固体脂质包括固体脂质总质量100%的单硬脂酸甘油酯。
所述液体脂质包括液体脂质总质量50%的亚油酸甘油酯和50%的肉豆蔻酸异丙酯。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的葡萄糖。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在921.2nm,多分散指数PDI 0.48,含阿霉素的活性成分包封率65.3%。
实施例2
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.02%、固体脂质1%、液体脂质0.2%、乳化剂10%以及等渗调节剂0.5%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:1的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量5%的聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量95%的聚山梨醇酯。
所述固体脂质包括固体脂质总质量100%的硬脂酸。
所述液体脂质包括液体脂质总质量100%的丙二醇单辛酸酯。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的甘油。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在245.6nm,多分散指数PDI 0.164,含阿霉素的活性成分包封率90.1%。
实施例3
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.1%、固体脂质4%、液体脂质0.8%、乳化剂4%以及等渗调节剂2%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂2:1的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量25%的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量75%的聚氧乙烯氢化蓖麻油。
所述固体脂质包括固体脂质总质量100%的棕榈酸硬脂酸甘油酯。
所述液体脂质包括液体脂质总质量100%的辛酸/癸酸甘油三酯。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的甘油。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在110.5nm,多分散指数PDI 0.231,含阿霉素的活性成分包封率93.6%。
实施例4
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.1%、固体脂质3%、液体脂质1%、乳化剂3.5%以及等渗调节剂2.5%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:1的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量0%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量75%的聚氧乙烯氢化蓖麻油和25%的大豆磷脂。
所述固体脂质包括固体脂质总质量100%的山嵛酸甘油脂。
所述液体脂质包括液体脂质总质量100%的亚油酸甘油酯。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的甘油。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在90.4nm,多分散指数PDI 0.223,含阿霉素的活性成分包封率96.5%。
实施例5
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.1%、固体脂质2%、液体脂质0.1%、乳化剂1%以及等渗调节剂1.5%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:2的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量0%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量100%的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
所述固体脂质包括固体脂质总质量60%的棕榈酸硬脂酸甘油酯和40%的单硬脂酸甘油酯所述液体脂质包括液体脂质总质量100%的辛酸/癸酸三甘油脂。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的氯化钠。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在98.8nm,多分散指数PDI 0.216,含阿霉素的活性成分包封率92.1%。
实施例6
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.5%、固体脂质6%、液体脂质5%、乳化剂20%以及等渗调节剂3%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂2:1的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量25%的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量75%的聚氧乙烯氢化蓖麻油。
所述固体脂质包括固体脂质总质量100%的山嵛酸甘油酯。
所述液体脂质包括液体脂质总质量100%的棕榈酸异丙酯。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的氯化钠。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在56.4nm,多分散指数PDI 0.243,含阿霉素的活性成分包封率92.5%。
实施例7
阿霉素纳米载药系统,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.7%、固体脂质4%、液体脂质1%、乳化剂0.5%以及等渗调节剂0.1%,余量为注射用水。
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂10:1的混合物,所述增敏剂为姜黄素。
所述乳化剂中含有乳化剂总质量0%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯,所述乳化剂还含有乳化剂总质量80%的聚山梨醇和20%的大豆磷脂
所述固体脂质包括固体脂质总质量40%的单硬脂酸甘油酯和60%的棕榈酸硬脂酸甘油酯
所述液体脂质包括液体脂质总质量100%的油酸。
所述等渗调节剂包括等渗调节剂总质量100%的果糖。
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂和等渗调节剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内。所述纳米颗粒粒径在415.7nm,多分散指数PDI 0.346,含阿霉素的活性成分包封率75.3%。
实施例8
实施例1中的阿霉素载药系统,其制备方法包括以下步骤:
(1)将配方比例的含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及脂溶性乳化剂均匀分散于乙醇中,65℃蒸干有机溶剂,获得油相,维持温度。
所述阿霉素为脂溶性的阿霉素,可按照如下方法获取:将水溶性盐酸阿霉素溶解于二氯甲烷中,加入盐酸阿霉素三倍摩尔量的三乙胺进行中和,避光搅拌过夜,旋转蒸干溶剂,得到脂溶性的阿霉素。
(2)将配方比例的其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于超纯水中,65℃保温,获得水相。
(3)65℃下,将水相逐滴添加到油相中,均匀混合后乳化,获得初乳。
使用磁力搅拌使得水相和油相均匀混合,磁力搅拌时间为10min;采用高剪切的方法使得混合物乳化,高剪切速率为10000rpm,剪切时间为2min。
(4)65℃下,将初乳高压均质,获得纳米乳。高压均质压力为1200bar,循环次数为2次。
(5)将纳米冷却,除菌后获得所述纳米载药系统。
将纳米乳迅速置放如冰箱中冷却,冰箱温度4℃,采用微孔滤膜过滤除菌,常用规格为0.45μm的微孔过滤膜。
激光粒度仪测得的阿霉素载药系统的粒径分布如图1所示,电镜照片如图2所示。
实施例9
实施例6中的阿霉素载药系统,其制备方法包括以下步骤:
(1)将配方比例的含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及脂溶性乳化剂均匀分散于二氯甲烷中,80℃蒸干有机溶剂,获得油相,维持温度。
所述阿霉素为脂溶性的阿霉素,可按照如下方法获取:将水溶性盐酸阿霉素溶解于二氯甲烷中,加入盐酸阿霉素两倍摩尔量的三乙胺进行中和,避光搅拌过夜,旋转蒸干溶剂,得到脂溶性的阿霉素。
(2)将配方比例的其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于超纯水中,80℃保温,获得水相。
(3)80℃下,将水相逐滴添加到油相中,均匀混合后乳化,获得初乳。
使用磁力搅拌使得水相和油相均匀混合,磁力搅拌时间为5min;采用高剪切的方法使得混合物乳化,高剪切速率为8000rpm,剪切时间为3min。
(4)80℃下,将初乳高压均质,获得纳米乳。高压均质压力为600bar,循环次数为10次。
(5)将纳米冷却,除菌后获得所述纳米载药系统。
将纳米乳迅速置放如冰箱中冷却,冰箱温度4℃,采用微孔滤膜过滤除菌,常用规格为0.45μm的微孔过滤膜。
实施例10
实施例7中的阿霉素载药系统,其制备方法包括以下步骤:
(1)将配方比例的含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及脂溶性乳化剂均匀分散于氯仿中,75℃蒸干有机溶剂,获得油相,维持温度。
所述阿霉素为脂溶性的阿霉素,可按照如下方法获取:将水溶性盐酸阿霉素溶解于二氯甲烷中,加入盐酸阿霉素五倍摩尔质量的三乙胺进行中和,避光搅拌过夜,旋转蒸干溶剂,得到脂溶性的阿霉素。
(2)将配方比例的其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于超纯水中,75℃保温,获得水相。
(3)75℃下,将水相逐滴添加到油相中,均匀混合后乳化,获得初乳。
使用磁力搅拌使得水相和油相均匀混合,磁力搅拌时间为15min;采用高剪切的方法使得混合物乳化,高剪切速率为13000rpm,剪切时间为1min。
(4)75℃下,将初乳高压均质,获得纳米乳。高压均质压力为900bar,循环次数为6次。
(5)将纳米冷却,除菌后获得所述纳米载药系统。
将纳米乳迅速置放如冰箱中冷却,冰箱温度4℃,采用微孔滤膜过滤除菌,常用规格为0.45μm的微孔过滤膜。
实施例11
空白脂质纳米粒的制备
根据实施例4的处方组成及制备工艺,不加药物,制备空白脂质纳米粒,粒径为93.1nm,PDI为0.221。
实施例12
阿霉素纳米脂质组合物的制备
根据实施例4的处方组成及制备工艺,不加姜黄素,制备阿霉素纳米脂质组合物,粒径为92.5nm,PDI为0.218。
实施例13
阿霉素纳米载药系统包封率测定
取阿霉素纳米载药系统,采用超滤离心法测定阿霉素与姜黄素的包封率。测定方法为:取阿霉素纳米载药系统,加入超滤离心管(Millipore,MWCO 10000)中,离心,测定超滤液中阿霉素与姜黄素的含量,记为W1;另取阿霉素纳米载药系统,加甲醇破乳,离心,测定上清液中阿霉素与姜黄素的浓度,计算阿霉素、姜黄素的含量,记为W。按照以下公式计算包封率(Entrapment Efficacy,EE):
其中,阿霉素含量采用荧光分光光度法测定,激发波长EX=500nm,发射波长EM=556nm,阿霉素浓度在0.05~0.8μg/mL范围内时荧光强度与浓度线性关系良好;姜黄素含量采用高效液相色谱法测定,色谱条件为:流动相为乙腈:1%冰醋酸=50:50,流速1mL/min,检测波长420nm,柱温30℃,进样体积20μL,姜黄素浓度在0.1~8μg/mL范围内时峰面积与浓度线性关系良好,方法的专属性、精密度、稳定性、重复性、回收率等均符合中国药典的相关规定。包封率测定结果如表1所示。
表1 阿霉素与姜黄素的包封率
实施例14
阿霉素纳米载药系统主要理化性质测定
(1)Zeta电位
将制得的阿霉素纳米载药系统稀释至适宜浓度,通过激光粒度仪分析Zeta电位,测得Zeta电位结果如表2所示。
表2 Zeta电位测定结果
(2)形貌观察
采用透射电子显微镜(TEM)观察实施例4制备的阿霉素纳米载药系统的微观形貌。将纳米脂质组合物混悬液滴加在覆盖有碳膜的铜网上,用2%的磷钨酸溶液染色,在TEM(HITACH,3H-7000FA,加速电压75kV)下观察粒径大小及微观形貌,结果见图2。
在电镜下所见的纳米粒呈规整圆形或椭圆形,表面平滑,粒径均一,平均粒径在70~80nm,与激光粒度仪所测数据基本一致。
(3)药物在纳米载体中的物理状态考察
采用X射线粉末衍射(XRD)考察阿霉素、姜黄素在纳米载体中的物理状态,分别测定并记录阿霉素、姜黄素、固体脂质、固体脂质与阿霉素和姜黄素的物理混合物、空白脂质纳米粒、阿霉素纳米载药系统的衍射峰形,结果见图3。
由图3可知,阿霉素与姜黄素均存在尖锐的衍射峰,表明以结晶状态存在;固体脂质没有尖锐的衍射峰,为无定型状态;固体脂质与阿霉素、姜黄素的物理混合物,表现出固体脂质的衍射峰,以及阿霉素和姜黄素的特征衍射峰,表明物理混合中药物与载体无相互作用,仍以混合物形式存在;空白脂质纳米粒表现出固体脂质的衍射峰;阿霉素纳米载药系统的峰形与空白脂质纳米粒一致,无阿霉素、姜黄素的衍射峰,表明药物完全被包封于纳米载体中,以无定型状态存在。
实施例15
阿霉素纳米载药系统储存稳定性试验
将实施例6制备的阿霉素纳米载药系统置于冰箱4℃储存,每隔一定时间取样,测定粒径、PDI、包封率,评价其储存稳定性。结果见表3。
表3 储存稳定性试验结果
测定项目 | 0个月 | 1个月 | 3个月 | 6个月 |
平均粒径(nm) | 56.4 | 57.6 | 58.6 | 60.3 |
PDI | 0.243 | 0.239 | 0.247 | 0.274 |
阿霉素包封率(%) | 92.5 | 92.3 | 91.6 | 88.4 |
姜黄素包封率(%) | 92.4 | 91.8 | 91.2 | 90.8 |
由表3可知,阿霉素纳米载药系统冰箱4℃放置,在6个月内粒径、PDI、包封率等质量指标无显著变化,表明阿霉素纳米载药系统低温储存稳定性良好。
实施例16
阿霉素体外释放考察
采用透析袋法对实施例3、实施例4、实施例5制备的阿霉素纳米载药系统和实施例12制备的阿霉素纳米脂质组合物进行体外释放实验,释放介质为1%Tween 80-PBS(0.01M,pH 7.4),透析袋截留分子量为8000~14000。将1mL上述实验样品装入透析袋中,放入50mL释放介质中,在37℃摇床中100rpm振摇,于第0.5、1、2、4、8、12、24、48h取1mL释放介质,再补充1mL新鲜释放介质。荧光分光光度法测定阿霉素浓度,计算累积释放率,结果见图4。
由图4可知,阿霉素的释放量因处方而异,但均呈现缓释效应。在开始的8h内整体表现为突释,是因为吸附在纳米粒子表面的阿霉素快速的释放出来;随后阿霉素释放呈现出明显的缓释效应。
实施例17
空白脂质纳米粒细胞毒性试验
采用噻唑蓝体外实验法(MTT法)检测实施例11中的空白脂质纳米粒的细胞毒性。人肝癌HepG2细胞贴壁生长于含10%FBS、1%盘尼西林-链霉素的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,取对数生长期的细胞用于实验。细胞以每孔5.0×103的密度培养在96孔板上,24h后换用100μL含有不同粒子浓度空白脂质纳米粒的培养基,再培养48h;然后加入25μL MTT溶液(5.0mg/mL),培养3h后除去MTT,再加入100μL裂解液溶解产生的甲瓒;过夜培养;最后用酶标仪在570nm波长下测定光密度OD,根据抑制率=(A–B)/A×100%计算抑制率,A表示用正常培养基培养下的吸收值,B表示用包含不同粒子浓度空白脂质纳米粒的培养基培养下的吸收值。
人正常肝细胞HL 7702的培养条件及实验操作同上。不同粒子浓度的空白脂质纳米粒的细胞毒性结果见表4。
表4 空白脂质纳米粒的细胞毒性
由表4可知,空白脂质纳米粒在低浓度时,对HepG2和HL 7702的抑制率均较低;高浓度下对HepG2的抑制率均较高。空白脂质纳米粒对HepG2的半数抑制浓度IC50值为22.7μg/mL,可能与肿瘤细胞较强的吞噬能力有关。对HL 7702的IC50值为2893.4μg/mL,表明本发明提供的纳米载体对正常细胞细胞毒性小,安全可靠。
实施例18
阿霉素纳米载药系统抗人肝癌细胞增殖试验
采用MTT法检测实施例3、实施例4、实施例5制备的阿霉素纳米载药系统、实施例12制备的阿霉素纳米脂质组合物和阿霉素DMSO溶液对HepG2细胞增殖的抑制作用。方法同实施例17,测定不同浓度阿霉素溶液、阿霉素纳米脂质组合物、阿霉素纳米载药系统对HepG2细胞的抑制率,根据抑制率=(A–B)/A×100%计算抑制率,A表示用正常培养基培养下的吸收值,B表示用包含不同浓度阿霉素的培养基培养下的吸收值。不同浓度阿霉素纳米载药系统抗HepG2细胞增殖结果见表5。
表5 对HepG2细胞生长的抑制效果
由表5可知,各组对HepG2细胞的抑制率呈浓度依赖性,随着阿霉素浓度的增加,抑制率相应增加。在相同浓度下,阿霉素纳米脂质组合物的细胞抑制率均高于阿霉素溶液,同时各组共输送纳米载药系统的细胞抑制率均高于阿霉素纳米脂质组合物,尤其是低浓度下,共输送纳米载药系统的细胞抑制率显著高于阿霉素纳米脂质组合物。其中实施例3抑制作用明显强于实施例4与实施例5,可能的机理是由于实施例3采用TPGS修饰纳米载药系统。TPGS可通过影响ATP酶的构象和活性来抑制P-糖蛋白对药物的外排作用,可有效抑制肝癌细胞的多药耐药性,增强阿霉素纳米载药系统的抗肿瘤效果。
以上结果表明,本发明将姜黄素与阿霉素共输送,增强了阿霉素对人肝癌细胞的抑制作用,同时TPGS的加入能增强纳米脂质组合物对肝癌细胞的杀伤作用。
实施例19
阿霉素纳米载药系统抗肝癌药效学研究
取实施例3、实施例4制备的阿霉素纳米载药系统,实施例11制备的空白脂质纳米粒,实施例12制备的阿霉素纳米脂质组合物,用于药效学研究。另用1%Tween 80分别溶解阿霉素及阿霉素与姜黄素的混合物,制备阿霉素溶液、阿霉素-姜黄素混合溶液作为对照。
64只雄性昆明小鼠,随机分为8组,每组8只,分别为正常组、模型组包括生理盐水组、空白脂质纳米粒组、阿霉素溶液组、阿霉素-姜黄素混合溶液组、阿霉素纳米脂质组合物组、阿霉素共输送纳米载药系统组1(实施例3)、阿霉素共输送纳米载药系统组2(实施例4)。
小鼠原发性肝癌模型建立:经口给药二乙基亚硝胺(Diethylnirtosamine,DEN),每周一次,到第15周时停止。DEN溶于麻油中,给药剂量为1.65mg/μL·10g。
正常组以等量生理盐水灌喂,至第15周时停止。
给药方案:第15周开始尾静脉注射给药,每周1次,至第30周停止。各给药组给药剂量以阿霉素计为2mg/kg,生理盐水组、空白脂质纳米粒组剂量0.1mL/10g。
实验结果
(1)体重变化及行为学观察
每天观察实验动物的生存状态,记录体重,结果显示DEN对实验动物的体重有负面影响,但整体呈增长趋势,模型组动物生命体征尚可。
(2)生存率
实验动物生存曲线见图5。由图5可知,35周时生理盐水组生存率为25%,阿霉素溶液组为25%,阿霉素纳米脂质组合物组为37.5%,阿霉素-姜黄素混合溶液组为37.5%,阿霉素共输送纳米载药系统组为62.5%,表明给药提高了实验动物的生存率,并且共输送给药效果优于单独给药。另外由生存曲线可知,同时期给药组的生存率高于生理盐水组,给药组延长了动物的生存时间,提示药物对肝癌可能具有治疗作用。
(3)观察肝脏病变
将动物断头放血后开腹,肉眼观察肝脏病变。结果正常组肝组织紧实,未见肿瘤结节;生理盐水组肝组织表面出现多个大小不一的灰白色结节,且肝组织表面血管发达,部分组织可见出血和坏死;空白脂质纳米粒组与生理盐水组基本一致;阿霉素溶液组肝组织表面出现少量结节和增生血管;阿霉素纳米脂质组合物组出现少量结节;阿霉素-姜黄素纳米载药系统组未出现结节。结果表明DEN对肝组织造成损伤,给药可减轻损伤的程度,其中阿霉素纳米脂质组合物效果优于阿霉素溶液,阿霉素共输送纳米载药系统效果优于阿霉素纳米脂质组合物。
(4)相对肝重量
处死动物前称量体重,记为W;处死动物后,取下肝组织,生理盐水漂洗,滤纸吸干水分,称重,记为W1,根据以下公式计算相对肝重量(RLW)。结果见表6。
表6 相对肝重量测定结果
组别 | RLW |
正常组 | 3.8±0.4 |
生理盐水组 | 5.2±0.1 |
空白脂质纳米粒组 | 5.1±0.3 |
阿霉素溶液组 | 4.8±0.3 |
阿霉素-姜黄素混合溶液组 | 4.4±0.3 |
阿霉素纳米脂质组合物组 | 4.5±0.2 |
实施例3 | 4.0±0.1 |
实施例4 | 4.1±0.2 |
由表6可知,生理盐水组RLW显著高于正常组,表明DEN对肝组织造成损伤;空白脂质纳米粒组RLW与生理盐水组基本一致,表明空白脂质纳米粒对DEN造成的肝损伤无作用;给药组RLW均小于生理盐水组,其中共输送纳米载体组接近正常组水平,表明共输送给药治疗可明显减轻DEN对肝脏造成的损伤。
(5)肝功能检测
采用BECKMANAU5400自动生化分析仪检测实验动物血清的肝功能,肝功能指标分别为谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(AKP)。其中,ALT检测结果见图6。
结果显示,DEN使肝功能指标ALT、AST、AKP水平升高;空白脂质纳米粒对模型组肝功能无影响;各种给药方案均可减轻DEN对肝功能水平的影响,其中阿霉素纳米脂质组合物效果优于阿霉素溶液,阿霉素共输送纳米载药系统组效果优于阿霉素纳米脂质组合物组。以上结果表明共输送纳米载体对肝癌具有较好的治疗效果。
(6)组织病理观察
将动物断头放血后开腹,肉眼观察肝脏病变后,分别取左、中、右叶肝组织经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,5μm连续切片,苏木精-伊红染色(HE染色),光镜组织病理观察。
第25周时正常组和模型组肝组织HE染色结果见图7。在图7中,正常组肝组织紧实,未见脂肪化、空泡、炎细胞浸润、增生结节、肝细胞坏死等异常情况;而模型组经DEN诱导,在25周时肝组织表面出现多个明显的大小不一的灰白色结节,并且肝组织表面血管发达,部分肝组织可见出血和坏死,切片中可见明显的肝脂肪化空泡和肿瘤增生性结节,说明肝癌已发生发展到严重的程度。以上结果表明本实验成功的利用DEN诱导小鼠产生了原发性肝癌。
不同组药物第15周开始给药,在第20周、25周和30周进行组织病理观察评价治疗结果。图8为第30周时组织病理HE染色结果。
空白脂质纳米粒组(A):第20周出现增生性结节、炎细胞浸润,第25周出现肝细胞坏死、纤维化、肿瘤结节,与同时期的生理盐水组相比,空白脂质纳米粒基本没有减轻肝损伤,表明空白脂质纳米粒对肝癌无治疗作用。
阿霉素溶液组(B):第20周出现肝淤血、槽状炎细胞,第25周出现肝细胞坏死、纤维化,第30周可见少量增生性结节,与同时期的生理盐水组相比,阿霉素溶液组肝损伤较轻,表明阿霉素对DEN诱导的肝损伤、肿瘤形成具有治疗效果。
阿霉素纳米脂质组合物组(C):第20周肝组织出现肝细胞萎缩、肝细胞坏死、肝淤血,第25周肝组织出现轻度肝血窦充血。与同时期的阿霉素溶液组相比,阿霉素纳米脂质组合物组肝损伤较轻,表明阿霉素纳米脂质组合物对DEN诱导的肝损伤、肿瘤的治疗效果优于阿霉素溶液。
阿霉素-姜黄素混合溶液组(D):第20周出现肝细胞坏死、肝淤血,第25周时出现炎细胞浸润,治疗效果优于同时期的阿霉素溶液组。
阿霉素纳米载药系统组(E和F):第20周出现肝淤血,第25周时出现急性炎症、肝细胞坏死,未出现肿瘤,第30周肝损伤程度低于同时期的阿霉素-姜黄素混合溶液组和阿霉素纳米脂质组合物组,表明阿霉素共输送纳米载药系统对肝癌具有最优的协同治疗作用。
综合上述结果,本发明建立小鼠原发性肝癌模型,通过行为学观察、肝功能检测、病理形态观察等指标,考察了空白脂质纳米粒、阿霉素溶液、阿霉素-姜黄素混合溶液、阿霉素纳米脂质组合物、阿霉素共输送纳米载药系统对肝癌的治疗作用。阿霉素-姜黄素混合溶液对肝癌的治疗效果优于阿霉素溶液,表明姜黄素能增强阿霉素抗肝癌的效果;阿霉素纳米脂质组合物对肝癌的治疗效果优于阿霉素溶液,表明将阿霉素载入纳米载药系统能增强其抗肝癌作用;阿霉素、姜黄素共输送纳米载药系统对肝癌的治疗效果最优,表现出显著的协同治疗作用。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种阿霉素纳米载药系统,其特征在于,按照质量比例包括含阿霉素的活性成分0.02%~1.5%、固体脂质1~20%、液体脂质0.1~20%、乳化剂0.5%~20%以及等渗调节剂0.1%~5%,余量为注射用水;
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:10~10:1的混合物;所述增敏剂为姜黄素;
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内;
所述固体脂质为饱和脂肪酸、饱和脂肪酸的单、双、三甘油酯、胆固醇、鲸蜡醇十六酸酯、鲸蜡醇棕榈酸酯和/或微晶石蜡;
所述液体脂质为肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯、丙二醇单辛酸酯、油酸、大豆油或液体石蜡;
所述乳化剂中含有不超过乳化剂总质量25%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯;还含有聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、磷脂、短链醇中的一种或二种;
所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、果糖或木糖醇。
2.根据权利要求1所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,按照质量比例包括所述含阿霉素的活性成分0.1%~0.7%、固体脂质2%~6%、液体脂质0.2%~5%、乳化剂1%~10%以及等渗调节剂0.5%~3%,余量为注射用水;
所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与增敏剂1:10~10:1的混合物;所述增敏剂为姜黄素;
所述固体脂质和液体脂质在乳化剂的作用下形成纳米颗粒,将所述含阿霉素的活性成分包裹在内;
所述固体脂质为饱和脂肪酸、饱和脂肪酸的单、双、三甘油酯、胆固醇、鲸蜡醇十六酸酯、鲸蜡醇棕榈酸酯和/或微晶石蜡;
所述液体脂质为肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯、丙二醇单辛酸酯、油酸、大豆油或液体石蜡;
所述乳化剂中含有不超过乳化剂总质量25%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯;还含有聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、磷脂、短链醇中的一种或二种;
所述等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘油、果糖或木糖醇。
3.根据权利要求1或2所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,所述含阿霉素的活性成分为阿霉素与姜黄素1:2~2:1的混合物。
4.根据权利要求1或2所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,所述固体脂质为单硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯或山嵛酸甘油酯;所述饱和脂肪酸为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或山嵛酸中的一种或两种。
5.根据权利要求1或2所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,所述液体脂质为辛酸/癸酸三甘油酯、亚油酸甘油酯或丙二醇单辛酸酯。
6.根据权利要求1或2所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,所述的乳化剂中含有不超过乳化剂总质量25%的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯;还含有聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或聚山梨醇酯。
7.如权利要求1所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,所述纳米颗粒粒径在10nm至1000nm之间,多分散指数PDI≤0.50,含阿霉素的活性成分包封率≥60%。
8.如权利要求7所述的阿霉素纳米载药系统,其特征在于,所述纳米颗粒粒径在50nm至400nm之间,多分散指数PDI≤0.30,含阿霉素的活性成分包封率≥90%。
9.如权利要求1~8任意一项所述的阿霉素纳米载药系统的制备方法,包括以下步骤:
(1)将配方比例的含阿霉素的活性成分、固体脂质、液体脂质及乳化剂均匀分散于有机溶剂,65℃至80℃蒸干有机溶剂,获得油相,维持温度;
(2)将配方比例的其他乳化剂及等渗调节剂均匀分散于超纯水中,65℃至80℃保温,获得水相;
(3)65℃至80℃下,将水相逐滴添加到油相中,均匀混合后乳化,获得初乳;
(4)65℃至80℃下,将初乳高压均质,获得纳米乳;
(5)将纳米乳冷却,除菌后获得所述纳米载药系统。
10.如权利要求1~8任意一项所述的阿霉素纳米载药系统或者权利要求9所述的制备方法制备得到的阿霉素纳米载药系统,应用于制备抗原发性肝癌药物。
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