KR101721281B1 - 치료제의 미셀 캡슐화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안전한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(젖산)("PEG-b-PLA") 미셀에 의해 캡슐화된 파클리탁셀, 라파마이신, 또는 17-AAG와 같은 활성제를 제공한다. 상기 조성물은 효과적인 본 명세서에 기술되는 기타 다른 조성물은 물론 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 약물 조합의 용해도를 제공한다. 운반체로서의 PEG-b-PLA의 상당한 장점은 PEG-b-PLA가 it is less toxic than 현재까지 알려진 공지의 조성물로 사용되는 크레모포®이엘(Cremophor®EL) 또는 DMSO보다 더 낮은 독성을 갖는다는 점이다. 또한, PEG-b-PLA 미셀은 DMSO보다 취급이 더 용이하며, 현재 임상 실험에서 제제와 관련된 문제점인 악취를 갖지 않는다. 따라서, 본 발명은 독성을 일으킴이 없이 생체 적합성을 개선하는 안정하며 생체 적합한 약물 제제를 제공한다. 비미셀 제제에 비해 미셀 제제 내에서 개별 약물의 더 큰 투여량이 투여될 수 있다는 점이 또한 확인되었다.

Description

치료제의 미셀 캡슐화{MICELLE ENCAPSULATION OF THERAPEUTICAL AGENTS}
관련 출원
본 출원은 2009년 9월 25일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/245,918호 및 2010년 8월 20일자로 출원된 미국 출원 번호 제61/375,681호에 대해 35 미국법 섹션 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 2건의 출원은 그 전체가 본 명세서에 참조되어 본 발명의 일부를 이룬다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 수혜 번호 AI043346 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
암에 대한 연구가 진행되면서, 단일 약물 제제(single drug formulations)는 단지 제한된 성공만을 제공한다는 것이 점점 더 명백해졌다. 따라서 많은 연구자들은 적합한 조합 요법(combination therapies)을 개발하는 것을 목표로 하고 있다. 조합 요법의 가장 중요한 요건 중의 하나는 간단하고 효과적인 약물 전달 시스템이다. 현재 사용 중인 많은 화학요법제(chemotherapeutics)는 물에 잘 용해되지 않으며, 이것은 적합한 전달 시스템의 탐색을 상당히 복잡하게 만든다. 1개의 제제에서 2개 또는 3개 약물을 조합하는 것은 화합성(compatibility) 및 안정성 문제 때문에 임상 실습 시 추가적인 난점(challenges)을 제공한다. 약물 조합의 좀 더 안전하고 좀 더 효과적인 전달은 거친 계면활성제 또는 부형제(excipients)를 사용하지 않고도 약물 조합을 용해(solubilizing)할 수 있는 생체에 적합한 전달 시스템(biocompatible delivery systems)의 개발에 달려 있다. 독성을 일으킴이 없이 생체 이용 가능성을 개선하는 안전하고 생체에 적합한 약물 제제가 암 연구 분야에서 필요하다.
PI3K-AKT-TOR 경로는 암에 이르는 가장 조절되지 않는 경로(deregulated pathway)이다. 그러나, TOR을 표적으로 하는 약물은 아직까지는 암을 치료하는데 효과적이지 않으며, PI3-AKT-TOR 경로는 초기에 믿어졌던 것보다 더 복잡한 것으로 밝혀졌다. TOR 억제제로 한 임상 실험(clinical trials)은 몇 개의 암에 대해 실패했는데, 여기서 TOR 억제제는 ATK로 불리우는 발암성 키나아제(oncogenic kinase)의 의도하지 않은 활성화를 일으켰다.
따라서, mTOR 경로에서 하나 이상의 지점을 표적으로 하는 조합 약물 치료 요법이 필요하다. 안전하고 효과적인 방식으로, 바람직하게는 치료 시 합병증을 일으키는 의약품 부형제(pharmaceutical excipients)를 사용하지 않고도 효과적인 약물 조합을 용해할 수 있는 전달 담체(delivery vehicle)가 또한 필요하다.
본 발명은 안전한 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(젖산)(poly(ethylene glycol)-block-poly(lactic acid)("PEG-PLA") 미셀(micelles)로 캡슐화된 파클리탁셀, 도세탁셀, 17-AAG, 라파마이신, 또는 에토포시드(etoposide), 또는 이들의 조합과 같은 활성제(active agents)를 제공한다. 이러한 활성제의 캡슐화는 활성제의 효과적인 용해를 제공함으로써, 약물 전달 시스템을 형성한다. 운반체(carrier)로서의 PEG-PLA의 중요한 장점은 임상 실험에서 현재까지 알려진 조성물에 사용되는 크레모포® 이엘(Cremophor® EL) 또는 DMSO보다 독성이 적다는 점이다. 또한, PEG-PLA 미셀은 DMSO보다 취급이 더 용이하고, 악취(foul odor)가 나지 않는데, 이러한 악취는 임상 실험에서 현재 사용 중인 많은 조성물이 갖는 문제이다. 미셀 캡슐화는 또한 신체의 표적 영역에 전달될 때까지 활성제를 미셀 내에 유지함으로써 활성제를 함유하는 조성물의 부작용(예를 들어, 간독성(hepatotoxicity), 호중구감소증(neutropenia), 신경병증(neuropathy) 등)의 발생을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 2개 또는 3개의 상이한 약품을 캡슐화하는 미셀을 포함하는 조성물을 제공하되, 상기 미셀은 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(젖산)("PEG-PLA") 중합체를 포함한다. 소수성(hydrophobic) 폴리(젖산) 블록의 중합체는 각각의 미셀의 내부를 향하도록 배향되고, 친수성(hydrophilic) 폴리(젖산) 블록의 중합체는 각각의 미셀의 외부를 향하도록 배향된다. 폴리(에틸렌 글리콜) 블록의 분자량은 대략 1,000 내지 대략 35,000 g/mol이 될 수 있고, 폴리(젖산) 블록의 분자량은 대략 1,000 내지 대략 15,000 g/mol이 될 수 있다. 미셀의 약물 함유량은 미셀의 질량에 대해 대략 1 중량% 내지 대략 50 중량%가 될 수 있다. 2개 또는 3개 약물은 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀, 17-AAG, 라파마이신, 및 에토포시드 중 임의의 2개 이상이 될 수 있다. 이들 약물의 조합을 포함하는 미셀 조성물은 ATK 및 TOR 레벨에서 2개의 지점에서 TOR 경로를 차단할 수 있기 때문에 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여되었을 때 상기 조합이 상기 경로를 효과적으로 폐쇄할 수 있도록 해줌으로써 상당히 유리하다.
상기 조성물은 실질적으로 에탄올, 디메틸 설폭사이드, 피마자유(castor oil), 및 피마자유 유도체가 없는 것이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 에탄올, 디메틸 설폭사이드, 피마자유, 및 피마자유 유도체를 개별적으로 또는 조합하여, 대략 2중량% 미만, 대략 1 중량% 미만, 대략 0.5 중량% 미만, 대략 0.1 중량% 미만으로 포함할 수 있다.
미셀 내의 조합된 약물 함유량은 대략 5 중량% 내지 대략 50 중량%, 또는 대략 10 중량% 내지 대략 25 중량%가 될 수 있다. 2개 약물에 대한 미셀 내의 약물의 비율은 대략 1:20 내지 대략 20:1 또는 대략 1:10 내지 대략 10:1일 수 있다. 3개 약물에 대한 미셀 내의 약물의 비율은 대략 20:1:1 내지 대략 1:20:1에서 대략 1:1:20, 또는 대략 10:1:1 내지 대략 1:10:1에서 대략 1:1:10, 또는 대략 1:1:1일 수 있다. 달리 말하면, 3개 약물 중 어느 하나가 최소량으로 존재하는 약물의 중량%의 대략 10배 내지 20배의 중량%의 양으로 상기 조성물 내에 제공될 수 있다. 제 3의 약물 성분은 최대량으로 존재하는 약물과 동일한 양으로 제공될 수 있거나, 또는 최소량으로 존재하는 약물과 동일한 양으로 제공되거나, 또는 이들 사이의 값, 구체적으로는 상술한 수치 값들 내에서 각각의 정수를 포함하는 사이에에서 제공될 수 있다.
상기 조성물은 수성 담체(aqueous vehicle)를 포함할 수 있으며, 여기서 약물의 농도는 상기 수성 담체의 부피에 대해 대략 0.4 mg/mL 내지 대략 25 mg/mL, 대략 0.6 mg/mL 내지 대략 20 mg/mL, 또는 대략 1 mg/mL 내지 대략 15 mg/mL이다. 캡슐화된 약물은 수성 환경에 접촉될 때 대략 1 mg/mL 내지 대략 10 mg/mL의 수용해도를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 블록의 분자량은 예를 들어 대략 1,500 내지 대략 14,000 g/mol이 될 수 있고, 폴리(젖산) 블록의 분자량은 대략 1,500 내지 대략 7,000 g/mol이 될 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 블록의 분자량은 또한 예를 들어 대략 10,000 내지 대략 14,000 g/mol이 될 수 있고, 폴리(젖산) 블록의 분자량은 대략 5,000 내지 대략 7,000 g/mol이 될 수 있다. 미셀의 평균 직경은 대략 30 nm 내지 대략 50 nm가 되거나 또는 대략 32 nm 내지 대략 45nm가 되거나, 또는 대략 35nm 내지 대략 42 nm가 될 수 있다.
각각의 개별 약물에 대해, 미셀 내의 약물 함유량은 미셀의 중량에 대해 대략 1 중량% 내지 대략 25 중량%가 될 수 있다. 각 약물의 약물 함유량은 또한 미셀의 중량에 대해 대략 4 중량% 내지 대략 24 중량%, 또는 대략 5 중량% 내지 대략 20 중량%, 또는 6 중량% 내지 대략 15 중량%가 될 수 있다.
약물은 개별 PEG-PLA 미셀 내로 함께 일체화될 수 있으며, 그에 따라 다중 약물 미셀(multiple drug micelles: MDM)을 형성한다. 대안적으로, 약물은 개별적으로 PEG-PLA 미셀 내로 일체화될 수 있으며, 그에 따라 단일 약물 미셀(single drug micelles: SDM)을 형성한다. 그 후 상이한 약물을 함유하는 단일 약물 미셀이 단일 약물 미셀 약물 조합(SDMDC) 조성물을 제공하도록 조합될 수 있으며, 미셀은 단일 수성 담체 내로 조합되어 치료적 약물 전달 제제(therapeutic drug delivery formulation)를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같은 조성물을 제공하되, 2개 또는 3개 약물이 (a) 라파마이신 및 팍클리탁셀; (b) 라파마이신 및 17-AAG; (c) 팍클리탁셀 및 17-AAG; 또는 (d) 팍클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신이 될 수 있다. 다양한 실시예에서, 상술한 조합의 팍클리탁셀은 도세탁셀로 교환될 수 있다. 추가적인 실시예에서, 상술한 조합의 17-AAG는 젤다나마이신(geldanamycin), 17-DMAG, 또는 기타 다른 공지의 젤다나마이신 유도체(이들 중 몇 개는 본 명세서에서 기술됨)로 교환될 수 있고, 라파마이신은 데포롤리무스(deforolimus), 템시롤리무스(temsirolimus), 에베롤리무스(everolimus), 에토포시드 또는 테니포시드(teniposide)로 교환될 수 있다. 이들 약물 교환의 임의의 조합은 본 명세서에 기술되는 조성물에서 사용될 수 있다. 따라서, 수많은 2개 또는 3개 조합이 미셀 캡슐화된 약물 전달 제제로서 조제될 수 있다. 제제는 MDM, SDM, 또는 SDMDC 형태의 조성물로 조제될 수 있다. 일부 실시예에서, 에토포시드 및/또는 본 명세서에서 인용된 또 다른 약물이 미셀 제제로부터 배제될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 조성물, 및 수성 운반체를 포함하는 약학 조성물(pharmaceutical composition)을 제공하되, 여기서 상기 조성물은 정맥 투여 또는 복강 내 투여용으로 제조된다. 수성 운반체는 예를 들어 식염수(saline) 또는 수성 탄수화물 용액(aqueous carbohydrate solution)을 포함할 수 있다.
본 발명은 라파마이신, 팍클리탁셀, 및 17-AAG 중 적어도 하나, 또는 본 명세서에 인용되는 또 다른 활성제의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환을 갖거나 갖는 것으로 진단된 환자에게 2개 또는 3개 약물을 동시에 투여하는 방법을 추가적으로 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 인용되는 적어도 하나의 활성제의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환을 갖거나 갖는 것으로 진단된 환자에게 2개 또는 3개 약물을 순차적으로 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 단일 약물 함유 미셀(SDM)이 환자에게 투여되기 전에 조제 및 조합될 수 있다. 이러한 순차적인 투여는 17-AAG 전에 팍클리탁셀을 투여하는 것과 같은 상승효과를 갖는 항암 활동을 허용하거나, 또는 종양 전처치(tumor priming)를 허용함으로써, 첫번째 투여량의 투여가 종양 세포를 죽이고, 종양 세포 밀도를 감소시키며, 및/또는 두번째 투여된 SDM(대안적으로는 2개 약물인 MDM 또는 SDMDC)의 투여량의 더 큰 흡수(uptake)를 허용한다.
상술한 방법들은 본 명세서에서 기술되는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 이렇게 함으로써 질환이 치료된다. 일부 실시예에서, 질환은 암, 예를 들어, 유방암, 대장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 백혈병이다. 미셀 내의 각 약물은 예를 들어 대략 1 mg/m2 내지 대략 1000 mg/m2, 대략 4 mg/m2 내지 대략 4000 mg/m2, 일주일에 대략 100 mg/m2 내지 일주일에 대략 500 mg/m2, 또는 일주일에 대략 300 mg/m2 내지 일주일에 대략 400 mg/m2의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술되는 조성물의 유효 치사량 또는 유효 억제량으로 암세포를 접촉하는 단계를 포함하는, 암세포를 죽이거나 또는 암세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 접촉은 생체 내이거나, 또는 대안적으로 체외에서 이루어질 수 있다. 암세포는 예를 들어 인간 유방암 세포, 인간 대장암 세포, 인간 폐암 세포, 인간 난소암 세포, 인간 췌장암 세포, 인간 전립선암 세포, 또는 백혈병 세포일 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 조성물은 환자에게 투여된 후, 혈류 내에서 미셀의 분열이 이어지고, 그 후 혈류는 접촉을 개시하기 위해 약물을 암세포로 전달한다.
본 발명은 Hsp 90을 본 명세서에 기술되는 조성물의 유효 억제량과 접촉하는 단계를 포함하는 Hsp 90을 억제하는 방법을 추가적으로 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 mTor을 본 명세서에 기술되는 조성물의 유효 억제량과 접촉하는 단계를 포함하는 mTor 경로를 억제하는 방법을 제공하며, 그에 따라 하나 이상의 지점에서 mTor 경로를 억제한다. 접촉은 생체 내이거나, 또는 대안적으로 체외에서 이루어질 수 있다.
본 발명은 포유류의 혈액으로 본 명세서에 기술되는 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유류의 혈액 내에서 약물의 반감기(half-life)를 증가하는 방법을 추가적으로 제공하며, 여기서 약물의 반감기는 본 명세서에 기술되는 바와 같은 미셀을 포함하지 않는 운반체를 갖는 약물의 투여 후에 혈액 내의 약물의 반감기와 비교하여 증가된다.
본 발명은 라파마이신, 팍클리탁셀, 17-AAG, 또는 본 명세서에서 인용되는 기타 다른 약물의 지연된 방출용 조성물을 추가적으로 제공하며, 상기 조성물은 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 조성물을 포함하고, 여기서 30분, 1시간, 또는 대안적으로 2시간 동안 수성 환경 또는 포유류의 체액(body fluid)에 노출된 후, 상기 약물의 대략 20 중량% 미만, 상기 약물의 대략 40 중량% 미만, 상기 약물의 대략 50 중량% 미만, 상기 약물의 대략 60 중량% 미만, 상기 약물의 대략 70 중량% 미만, 상기 약물의 대략 75 중량% 미만, 상기 약물의 대략 80 중량% 미만, 또는 상기 약물의 대략 90 중량% 미만이 미셀로부터 방출된다.
본 발명은 또한 의학적 치료에 사용하기 위해 본 명세서에서 기술되는 상기 조성물의 용도를 제공한다. 의학적 치료는 암, 예를 들어, 뇌종양, 유방암, 대장암, 두경부암(head and neck cancer), 폐암, 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 백혈병을 치료할 수 있다. 본 발명은 또한 상술한 암들을 치료하는 약의 제조하기 위한 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 약은 약학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 운반체를 포함할 수 있다. 본 발명은 인간과 같은 포유류의 암을 치료하기 위한 약을 조제하기 위해 본 명세서에 기술되는 바와 같은 조성물의 용도를 추가적으로 제공한다.
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 이루며, 본 발명의 소정의 실시예 또는 다양한 태양(aspect)을 추가로 예시하도록 포함된다. 일부의 예에서, 본 발명의 실시예들은 본 명세서에서 제시되는 상세한 설명과 결합하여 첨부 도면을 참조하여 가장 잘 이해될 수 있다. 상세한 설명 및 첨부 도면은 본 발명의 소정의 특정 실험예, 또는 소정의 태양을 강조할 수 있지만, 당업자라면 이러한 실험예 또는 태양의 부분들이 본 발명의 기타 다른 실험예 또는 태양과 결합하여 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 SDM 및 MDM(n=3)에서 소정 약물 및 약물 조합의 수용해도를 예시한 도면이다.
도 2는 PTX, PTX/17-AAG MDM, 및 PTX/ETO/17-AAG MDM(n=3, 평균치±SD)를 갖는 SDM의 탁도 측정치를 예시한 도면이다.
도 3은 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, 평균치±SD)로부터 (A) ETO, DCTX 또는 17-AAG를 함유한 SDM, (B) PTX/17-AAG를 구비한 MDM, (C) ETO/17-AAG를 구비한 MDM, (D) DCTX/17-AAG를 구비한 MDM; 및 (E) PTX/ETO/17-AAG를 구비한 MDM의 체외 약물 방출 반응속도(drug release kinetics)를 예시한 도면이다.
도 4는 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, 평균치±SD)에 의해 용해된 팍클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG (PTX/RAP/17-AAG)의 3개 약물 조합의 체외 약물 방출 프로파일을 예시한 도면이다.
도 5는 팍클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신, 17-AAG, 및 물 속의 PEG-b-PLA 미셀(4.2K:1.9K); n=3, 평균에 의한 2개 또는 3개의 조합(화학요법제(chemo)+17-AAG)의 용해도로부터 얻어진 데이터를 예시한 도면이다.
도 6은 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, 평균치±SD)로부터 팍클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신 또는 17-AAG의 체외 방출로부터 얻어진 데이터를 예시한 도면이다.
도 7은 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, 평균치±SD)로부터 라파마이신 및 17-AAG의 체외 조합 방출로부터 얻어진 데이터를 예시한 도면이다.
도 8은 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, 평균치±SD)로부터 라파마이신, 도세탁셀 및 17-AAG의 체외 조합 방출로부터 얻어진 데이터를 예시한 도면이다.
도 9는 PEG-b-PLA 미셀(단일 작용제, 2개의 약물 조합 또는 3개의 약물 조합)으로부터 (A) 체외 라파마이신 방출; 및 (B) 체외 17-AAG 방출에 대한 반감기 파라메터를 예시한 도면이다.
도 10은 레자주린 시험(resazurin assay)을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주(breast cancer cell line)에 대한 라파마이신, 도세탁셀, 17-AAG, 및 이들의 다양한 조합의 체외 유리 약물 세포 독성(free drug cytotoxicity) 결과를 예시한 도면이다.
도 11은 레자주린 시험을 사용하여 SKOV-3 난소암 세포주에 대한 라파마이신, 팍클리탁셀, 17-AAG, 및 이들의 다양한 조합의 체외 유리 약물 세포 독성 결과를 예시한 도면이다.
도 12는 본 발명 개시 내용의 실시예에 따른, 미셀을 조제하고 소수성 약물을 용해하는 방법을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른, MCF-7 유방암 세포에 대한 IC50 데이터를 예시한 도면이다.
도 14는 추 및 탈랄레이(Chou and Talalay) 방법에 기초하여 계산된 도 13의 2개 또는 3개 약물 조합의 조합 지수(CI)를 예시한 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른, 4T1 유방암 세포에 대한 IC50 데이터를 예시한 도면이다.
도 16은 추 및 탈랄레이 방법에 기초하여 계산된 도 15의 2개 또는 3개 약물 조합의 조합 지수(CI)를 예시한 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른, A549 비소세포성(non-small cell) 폐암 세포에 대한 IC50 데이터를 예시한 도면이다.
도 18은 추 및 탈랄레이 방법에 기초하여 계산된 도 17의 2개 또는 3개 약물 조합의 조합 지수(CI)를 예시한 도면이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른, LS180 대장암 세포에 대한 IC50 데이터를 예시한 도면이다.
도 20은 추 및 탈랄레이 방법에 기초하여 계산된 도 19의 2개 또는 3개 약물 조합의 조합 지수(CI)를 예시한 도면이다.
도 21은 (FVB 알비노 암컷 쥐)의 급성 독성 실험(acute toxicity experiments) 결과를 예시한 도면이다.
도 22는 조절제로 식염수 및 미셀 담체만이 사용되는 A549 생쥐 종양 모델에서, 팍클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신(60:60:30 mg/kg)의 3개 약물 조합 대 PTX 단일 약물 함유 미셀(60 mg/kg)의 항종양 효과를 예시한 도면이다.
도 23은 레자주린 시험을 사용하여 MCF-7 유방암 세포주에 대한 라파마이신, 팍클리탁셀, 17-AAG, 및 이들의 다양한 조합의 체외 유리 약물 세포 독성 결과를 예시한 도면이다.
열충격단백질 90(Heat Shock Protein 90: Hsp90)은 종양 세포 증식에 연관된 단백질의 조절에 있어서의 주요한 역할로 인하여 암 치료에 대한 중요한 표적이다. 벤조퀴논 안사마이신계 항생제인 젤다나마이신이 Hsp90의 ATP/ADP 결합 포켓(binding pocket)에 강력하게 결합하여 다양한 패밀리(diverse family)의 종양의 생존 및 성장을 방해할 수 있다는 사실이 발견되었다. 젤다나마이신은 유망한 새로운 항암제이지만, 심각한 간독성(hepatotoxicity) 및 난용성에 의해 그 임상 개발이 방해를 받아 왔다. 이러한 문제점의 일부를 완화하는데 도움을 주기 위해 2가지 유사물질인 17-알릴아미노-17-데메톡시젤다마이신(17-AAG; 타네스피마이신) 및 17-디메틸아미노-에틸아미노-17-데메톡시젤다마이신(17-DMAG)이 개발되었다.
임상 전환에 대한 몇 가지 유망한 예가 좀 더 약학적으로 실용적인 제제로서 17-DMAG의 개발로 지향되고 있는데, 그 이유는 17-DMAG가 17-AAG와 비교하여 우수한 수용해도 및 더 큰 경구 생체이용률(oral bioavailability)을 구비하고 있기 때문이다. 그러나, 17-DMAG는 17-AAG에 대한 명백한 장점에도 불구하고 동물에게 투여될 때 높은 분포 용적을 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 광범위한 분포는 17-DMAG의 허용 가능한 최대 투여량이 17-AAG보다 훨씬 더 적기 때문에(개의 경우 각각 매일 8 mg/m2 및 매일 100-200 mg/m2임) 바람직하지 않은 독성을 가져올 수 있다.
17-AAG의 전달에 대한 주요한 장애 요인은 제한된 수용해도(대략 0.1 mg/mL)이다. 이러한 제한된 수용해도는 비경구적 투여 전에 Cremophor® EL(CrEL), DMSO, 및/또는 에탄올과 같은 보조제를 구비하는 복잡한 제제를 사용해야 하는 결과는 낳았다. 이것은 환자의 내약성(tolerability) 관점에서 바람직하지 않은데, 그 이유는 CrEL이 과민반응 및 과민증(anaphylaxis)을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 투여 전에 항히스타민제 및 스테로이드제로 환자를 치료하는 것이 요구되기 때문이다. 따라서, 17-AAG의 더욱 안전하고 좀 더 효과적인 전달은 거친 표면활성제를 사용함이 없이 약물을 용해할 수 있는 생체에 적합한 전달 시스템의 개발에 달려 있다.
조합 약물 요법은 암의 치료에 중요한 방법이 되고 있다. 연구자들은 상이한 신호 전달 억제제는 물론 화학요법제 및 신호 전달 억제제의 조합에 관심이 있다. 생쥐 종양 모델 및 초기 임상 실험에서, 팍클리탁셀(화학요법제)은 신호 전달 억제제인 라파마이신과 상승효과적으로 작용하는 것을 보여주었다. 이러한 모델에서, 팍클리탁셀은 또한 또 다른 신호 전달 억제제인 17-AAG와 상승효과적으로 작용할 수 있다. 또한, 라파마이신 및 17-AAG는 유방암 세포에 대해 상승효과적인 방식으로 작용할 수 있는데, 아마도 라파마이신에 의한 mTOR의 억제 및 17-AAG에 의한 AKT의 억제에 기인한 것으로 추정된다. 이러한 이중 약물 작용(dual drug action)의 중심적인 메커니즘은 암 치료에 대한 라파마이신 및 그 유사물질의 임상 경험 때문에 관심의 대상인데, 여기서 피드백 메커니즘에 의한 AKT의 활성화가 mTOR 억제에 있어서 치료 실패의 주원인이 되는 것처럼 보여진다.
팍클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG 각각은 난용성으로 약물 용해도, 투입, 및 전달을 위해 특별한 담체가 요구된다. 본 명세서에서 기술되며, 생체 적합한 폴리(에릴렌클리콜)-블록-폴리(젖산)(PEG-b-PLA)으로부터 조제된 고분자 미셀은 동일한 나노 사이즈의 수성 담체(예를 들어, PEG-b-PLA 미셀) 내에 함께 들어 있는 팍클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 수용해도를 크게 증가시킬 수 있다. 이러한 나노 제제는 암의 치료에 대한 팍클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 3개 약물 조합의 전달에 대한 새로운 접근 방법을 제공한다.
제제의 조제는 대규모로 수행될 수 있다. 제제는 예를 들어 팍클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 3개 약물 조합에 대해 최초로 실현된, 미셀의 작은 사이즈(∼40 nm)에 기인한 무균화(sterilization)의 용이성, 수성 담체로서의 약물 투여의 용이성, PEG-블록-폴리(젖산)의 입증된 안정성에 기인한 낮은 독성, 개별 약물에 대한 임상에서 요구되는 유해 담체의 회피, 및 미증유의 상승효과적인 항종양 효과를 제공한다.
따라서, 라파마이신, 팍클리탁셀 및 17-AAG의 1개, 2개, 및 3개 약물 조합 제제가 본 명세서에서 개시되며, 여기서 약물은 미셀 내에서 캡슐화되어 있고, 미셀은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 3개 약물은 모두 단일 약물 미셀 제제 내에 함유될 수 있는 것과 동일한 방식으로 미셀과 함께 실질적으로 동일한 레벨로 함유될 수 있다. 이들 미셀은 안정되고 실온(∼23℃)에서 24시간 이상 수용성을 유지하며, MCF-7 유방암 세포주 및 SKOV-3 난소암 세포주와 같은 암 세포주에 대해 적합한 세포 독성을 보여준다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 소정의 용어는 다음의 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 모든 다른 용어 및 구절은 당업자가 이해하는 바와 같은 그들의 원래 의미를 갖는다. 이러한 통상적인 의미는 알.제이. 루이스, 존 윌리 & 선즈사, 뉴욕, 뉴욕, 2001의 홀리의 요약판 화학 사전 14판(Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R. J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001)과 같은 기술용어 사전을 참조하여 얻어질 수 있다.
본 명세서 내에서 "하나의 실시예", "실시예", "실험예 실시예" 등에 대한 참조는 기술된 실시예가 특정한 태양, 특징(feature), 구조, 일부분(moiety), 또는 특성을 포함하지만, 모든 실시예가 필수적으로 이러한 태양, 특징, 구조, 일부분, 또는 특성을 포함하는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 더구나, 이러한 구절은 본 명세서의 다른 부분에서 언급되는 동일한 실시예를 언급할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 또한, 특정 태양, 특징, 구조, 일부분, 또는 특성이 실시예와 관련하여 기술될 때, 명시적으로 기술되어 있든 아니든 다른 실시예들과 관련된 그러한 태양, 특징, 구조, 일부분, 또는 특성을 발생시키는 것은 당업자의 지식 범위 내에 속한다.
용어 "및/또는"은 대상물의 임의의 하나, 대상물의 임의의 조합, 또는 이러한 용어가 연관된 대상물의 전부를 의미한다.
단수형의 부정관사("a" 및 "an")와 정관사("the")는 문맥이 명백히 다르게 암시하는 경우가 아니면 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "화합물"에 대한 참조는 복수의 그러한 화합물을 포함하여, 화합물 X가 복수의 화합물 X를 포함한다. 청구범위가 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 점을 추가로 유의하여야 한다. 그와 마찬가지로, 이러한 진술은 청구범위 구성요소의 언급과 관련하여 "단지" "오직" 등과 같은 배타적인 용어의 사용, 또는 "네거티브" 한정사항의 사용에 대한 선행사로서의 기능을 갖도록 의도되었다.
용어 "대략"은 특정 값의 ±5%, ±10%, ±20%, 또는 ±25%의 가변값을 지칭할 수 있다. 예를 들어, "대략 50" 퍼센트는 일부 실시예에서 45 내지 55 퍼센트의 가변값을 가질 수 있다. 정수 범위에 대해, 용어 "대략"은 언급된 정수보다 더 큰 및/또는 더 작은 1개 또는 2개의 정수를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 달리 표시되어 있지 않은 경우, 용어 "대략"은 개별 구성요소, 조성, 또는 실시예의 기능성 면에서 균등한 언급된 범위에 근접한 값, 예를 들어 중량%를 포함하도록 의도되어 있다. 또한, 본 명세서에서 달리 표시되어 있지 않은 경우, 언급된 범위(예를 들어, 중량% 또는 탄소기(carbon groups)는 해당 범위 내의 각각의 특정값, 정수, 소수(decimal), 또는 동일한 값을 포함한다.
구절 "하나 이상"은 특히 그 용도의 문맥으로 읽을 때 본 발명 기술 분야의 당업자에게 쉽게 이해된다. 예를 들어 페닐 고리가 2치환되는 경우, 예를 들어 페닐 고리 상의 하나 이상의 치환기는 1 내지 5, 또는 1 내지 4까지를 지칭한다.
용어 "접촉"은 예를 들어 용액 내에서, 반응 혼합물 내에서, 체외에서, 또는 생체 내에서 예를 들어 생리적 반응, 화학 반응, 또는 물리적 변화를 일으키는 세포 또는 분자 레벨에서를 포함하여 터치하거나, 접촉하거나, 또는 아주 가깝게 또는 근접하도록 하는 동작을 지칭한다.
단서(provisos)는 임의의 개시된 카테고리 또는 실시예에 적용될 수 있으며, 여기서 임의의 하나 이상의 나머지 다른 상기 개시된 실시예 또는 종(species)은 소정의 카테고리, 구성, 또는 실시예로부터 배제될 수 있다.
고분자 미셀에 대한 활성제/약물
또한 시롤리무스(sirolimus)로 알려진 라파마이신은 면역억제제 약물이고, 공지의 mTor 억제제이다. mTOR 복합체1(mTORC1)은 단백질 합성 및 혈관신생(angiogenesis)을 제어하는 다양한 프로세스를 조절함으로써 세포 성장을 추진한다. mTORC1의 상향 신호 경로는 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) 3-키나아제(PI3K/Akt) 경로를 포함하는데, 이러한 경로는 많은 암들에서 빈번하게 불규칙하다. 예를 들어, 60-70%의 폐암은 PI3K/Akt/mTORC1 경로 활성화를 갖는다. mTORC1의 억제는 단일 요법제나 또는 화학요법제 또는 기타 다른 경로를 표적으로 하는 다른 전략과 함께 매우 매력적인 항종양 표적을 나타낸다.
Figure 112012025570781-pct00001
라파마이신
본 명세서의 제제 내에서 라파마이신과 교환될 수 있는 라파마이신 유도체는 데폴로리무스(deforolimus), 템시롤리무스(temsirolimus), 에베롤리무스(everolimus), 및 CCI-779를 포함한다.
팍클리탁셀은 알려진 화학요법제로, 그 구조가 아래에 예시되어 있다.
Figure 112012025570781-pct00002
파클리탁셀
본 명세서의 제제 내에서 팍클리탁셀과 교환될 수 있는 팍클리탁셀 유도체는 도세탁셀 및 기타 알려진 팍클리탁셀 유도체를 포함한다.
젤다나마이신은 생성 물질(producing organism)인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이종 젤다누스 NRRL 3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL 3602)를 배양하여 얻어지는 잘 알려진 천연물질이다. 화합물 17-AAG는 미국 특허 제4,261,989호(사사키 등)에 기술되어 있는 바와 같이 젤다나마이신을 알릴아민과 반응시켜 젤다나마이신으로부터 반합성적으로(semi-synthetically) 만들어지며, 상기 미국 특허 제4,261,989호의 개시 내용은 본 명세서에 참조되어 본 발명의 일부를 이룬다.
젤다나마이신은 Hsp90의 ATP/ADP 결합 포켓과 강력하게 결합하고, 따라서 HER-2/erbB-2 과도 발현, 팍클리탁셀 저항성 유방암을 포함하는 다양한 패밀리의 종양의 생존 및 증식을 방해한다. 젤다나마이신의 임상 개발은 그 난용성 및 심각한 간독성에 의해 방해를 받아왔다(게 등(Ge et al.)., J. Med. Chem. 49(15) (2006) 4606-4615). 따라서, 젤다나마이신, 또는 17-알릴아미노-17-데메톡시-젤다나마이신(17-AAG, 아래)과 같은 그 유도체를 함유하는 약학적 제제의 조제 시에 상당한 장애물은 이들 친유성 약물의 대단히 빈약한 난용성이다.
Figure 112012025570781-pct00003
17-AAG
적합한 수용해도가 비경구 주입용으로 특히 중요하다. 17-AAG의 경우 중성 pH에서 수용해도는 단지 대략 0.1 mg/mL이어서, 안전하고 효과적인 방식으로 투여하는 것을 어렵게 한다. 용해도 문제를 해결하기 위한 여러 시도들이 이루어져 왔지만, 각각의 제제가 DMSO, 에탄올, 또는 다양한 바람직하지 않은 표면활성제의 사용과 같은 그 자체의 단점이 수반된다.
화합물 17-AAG(17-알릴아미노-17-데메톡시젤다나마이신, 또는 타네스피마이신)는 현재 암의 치료용으로 임상 실험이 진행 중인 유망한 열충격단백질 90 억제제이다. 암세포에 대한 작용의 선택적 메커니즘에도 불구하고, 17-AAG는 그 난용성에 기인한 난제에 직면해 있다. 현재 17-AAG 조성물은 Cremophor®EL (CrEL), DMSO, 및/또는 에탄올을 갖는 제제를 요구한다. 미국 특허 출원 공개 공보 제 2005/0256097 (종 등(Zhong, et al.)) 참조.
Cremophor®EL은 통상적으로 폴리에톡실레이티드 피마자유(CAS 번호 61791-12-6)를 제공하도록 에틸렌 옥사이드 35몰을 피마자유 1몰과 반응시켜 제조되는 피마자유 유도체이다. 비경구용 제제로 Cremophor®EL(예를 들어, KOS-953) 또는 DMSO를 사용하는 것은 잠재적인 부작용으로 인해 환자의 내약성 관점에서 바람직하지 않다. 다양한 역효과는 급성 과민반응, 말초신경독증(peripheral neurotoxicity), 고지혈증(hyperlipidaemia), 및/또는 P-당단백질의 억제제를 포함할 수 있다. 나아가, 17-AAG는 낮은 투여량(20 mg/kg 미만)에서도 높은 분포 용적(high volume of distribution: Vd) 및 상당한 전신독성(systemic toxicity)을 갖는다. 따라서, 개선된 제제는 17-AAG, 파클리탁셀, 및 라파마이신의 조합과 같은 항암 약물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 안전하게 투여하는 것이 요구된다.
본 명세서의 개시 내용은 폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(D,L-젖산)(PEG-b-PLA)으로 구성된 양친성 이중블록 미셀(amphiphilic diblock 미셀)을 사용하여 조제된, CrEL이 없는 단일, 이중 및 삼중 약물 제제를 제공한다. 동적 광산란(DLS)은 임계미셀농도(critical micelle concentration)가 대략 350 nM이며, 일부 실시예에서 대략 257 nm의 평균 직경을 갖는 PEG-PLA(12:6 kDa) 미셀을 보여준다. 미셀은 상당량의 소정의 활성제, 예를 들어 대략 1.5 mg/mL의 17-AAG를 용해시킬 수 있다. PEG-PLA의 곡선하 면적(AUC)은 표준 제제의 곡선하 면적의 1.3배이다. 상기 미셀 제제를 사용하면 CrEL을 사용하는 표준 담체와 비교하여 신장클리어런스(CLrenal)는 증가되고, 간클리어런스(CLhepatic)는 감소되었다. 따라서, 본 명세서에 기술되는 미셀 제제는 현재까지 알려진 조성물에 비해 몇 가지 장점을 갖는 1개 약물, 2개 약물 및 3개 약물 제제용 전달 담체를 제공한다.
미셀 조제용으로 사용되는 중합체
용어 PEG-PLA 또는 PEG-b-PLA는 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(젖산)을 지칭한다. 폴리(젖산) 블록은 (D-젖산), (L-젖산), (D,L-젖산), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 형태의 PEG-PLA는 퀘벡주의 몬트리올 소재 폴리머 소스사(Polymer Source, Inc., Montreal, Quebec)로부터 상업적으로 입수가능하며, 본 발명 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 조제될 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 블록의 분자량은 대략 1,000 내지 대략 35,000 g/mol일 수 있거나, 또는 동일한 범위 내에서 대략 500 g/mol의 임의의 증가분의 분자량을 가질 수 있다. 폴리(젖산)의 적합한 블록은 대략 1,000 내지 대략 15,000 g/mol의 분자량을 가질 수 있거나, 또는 동일한 범위 내에서 대략 500 g/mol의 임의의 증가분의 분자량을 가질 수 있다. PEG 블록은 메틸기(예를 들어, 메톡시 에테르) 또는 임의의 적합한 보호기, 캡핑기, 또는 차단기(blocking group)와 같은 알킬기 내에서 단말기를 가질 수 있다.
본 발명의 개시 내용의 미셀은 다양한 블록 사이즈(예를 들어, 상기 기술한 범위 내의 블록 사이즈) 및 다양한 비율(예를 들어, PEG:PLA가 대략 1:10 내지 대략 10:1의 비율이거나, 또는 상기 범위 내에서의 임의의 정수 비율)의 PEG-PLA 중합체를 사용하여 조제될 수 있다. 예를 들어, PEG-PLA 중합체의 분자량(Mn)은 (PEG-PLA, 각각에 대해) 2K-2K, 3K-5K, 5K-3K, 5K-6K, 6K-5K, 6K-6K, 8K-4K, 4K-8K, 12K-3K, 3K-12K, 12K-6K, 및/또는 6K-12K를 가질 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 약물 대 중합체의 비율은 또한 대략 1:20 내지 대략 10:1이거나, 또는 상기 범위 내에서 임의의 정수 비율이 될 수 있다. 적합한 약물-중합체 비율의 특정 실험예는 대략 1:2.5; 대략 1:5; 대략 1:7.5; 및/또는 대략 1:10을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 적합한 중합체는 대략 50:50 비율에서 대략 1-3 kDa (예를 들어, 대략 2K 달톤)의 블록을 포함하는 PEG-PLA이다. 이러한 절차를 사용하면 미셀 내에 예상하지 못한 높은 레벨의 약물 함유량의 결과를 나타낸다. 예를 들어, (이하에서 기술하게 될) 조제 절차 B가 사용될 때, 대략 5 mg/mL의 17-AAG의 약물 함유량이 달성되었다(대략 9 mM; 대략 17 중량%). PEG-PLA 분자량의 추가적인 특정 실험예는 4.2K-b-1.9K; 5K-b-10K; 12K-b-6K; 2K-b-1.8K, 및 하기 실험예에서 기술되는 분자량을 포함한다. 사용될 수 있는 기타 다른 적합한 양친성 블록 공중합체는 미국 특허 제4,745,160 호(처칠 등) 및 제6,322,805호 (김 등(Kim, et al.))에 기술되어 있다.
PEG-PLA 미셀 조제 방법
중합체 선택. 많은 양친성 블록 공중합체가 미셀을 형성하고 소정 형태의 화물(cargo)을 캡슐화할 수 있지만, 현재까지는 어느 중합체가 다양한 형태의 물질을 캡슐화하기에 가장 적합한지의 여부를 결정하는 표준이 없다. 이러한 결정은 아직까지는 실험적으로 이루어져야만 한다. 약물과의 미셀을 형성하는 몇 가지 중합체가 파클리탁셀-라파마이신-17-AAG 약물 조합을 용해하기 위해 조사되었다. 이 조합은 정확한 세트의 미셀화(micellar properties)가 없이는 용해가 어렵다는 것이 입증되었다. 예를 들어, PEG-PPG-PEG 삼중 블록 중합체인 폴록사머 F68(Poloxamer F68)은 항암 활성을 갖는 것으로 보고된 소수성 유기화합물인 레스베라트롤과 같은 많은 소수성 화합물의 용해에 유용하다. 그러나, 폴록사머 F68은 수용액 내에서 안정된 미셀이 형성되지 않기 때문에 17-AAG 또는 파클리탁셀-라파마이신-17-AAG 약물 조합 중 어느 것도 용해하는 것이 불가능하다.
역으로, PEG-b-PLA는 레스베라트롤과 결합될 때 안정한 미셀을 형성하지 못하지만, 17-AAG 및 파클리탁셀-라파마이신-17-AAG 약물 조합 양자와는 매우 안정한 미셀을 형성한다. 삼중 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀은 또한 거의 추가적인 형태로 약물을 용해함으로써 현저한 특성을 보여준다. 따라서, 각각의 약물 및 약물 조합을 용해하기 위한 적합한 중합체는 현재까지는 신뢰할만한 예측 경향성이 존재하지 않기 때문에 실험적으로 결정되어야 한다.
미셀 조제. 양친성 중합체의 단일 사슬은 임계 미셀 농도(CMC)보다 많은 양의 용매 내에서 응집제(aggregate)를 미셀, 소수성 내면을 갖는 코어-코로나 구조, 및 친수성 외면 또는 쉘(shell) 내로 제공한다.
약물 함유 PEG-b-PLA 미셀의 양성자 NMR 분광기 연구는 미셀이 수성 환경에서는 용이하게 형성되지만, DMSO와 같은 유기 용매 내에서 분해된다는 것을 보여준다. 이러한 연구는 또한 약물이 코로나 근처가 아니라 미셀의 코어에 위치된다는 것을 입증한다.
PEG-b-PLA 미셀은 이하의 실험예는 물론 이 섹션의 이하에서 기술되는 바와 같이 조제될 수 있다. 예를 들어, 조제 절차 B는 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG 미셀 제제를 조제하는 하나의 특정한 방법을 제공한다. 이러한 절차는 단순히 하나의 실시예를 예시한 것이다. 이것은 본 발명 기술 분야의 당업자에게 쉽게 인식되는 바와 같이 원하는 조제의 규모에 따라 가변적일 수 있다. 조제 절차 A 및 B의 하나의 장점은 이들이 조제 절차 C에서와 같이 미셀 용액의 투석(dialysis)을 요구하지 않는다는 점이다.
조제 절차 A: 단순 평형. 하나의 실시예에서, 미셀 조제가 다음과 같이 수행될 수 있다. PEG-b-PLA 및 관심 있는 1개, 2개 또는 3개의 항암 약물이 아세토니트릴 또는 디메틸 아세트아미드와 같은 적합한 수혼화성 용매(suitable water miscible solvent) 내에 용해되어 있으며, 선택적으로 혼합 및/또는 초음파 분해될 수 있다. 그 후 용매는 예를 들어 감압하에서 제거되어, 중합체-약물 박막을 제공한다. 온수(대략 50℃ 내지 대략 70℃)가 중합체-약물 박막에 첨가되고, 그 혼합물은 냉각된다. 온수가 첨가되면 약물 캡슐화 고분자 미셀이 형성되고 그 후 예를 들어 여과(filtration)에 의해 분리될 수 있다. 도 12 참조.
조제 절차 B: 단순 평형. 특정 실시예에서, PEG-b-PLA 25 mg, 및 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG 각각 10 mg이 아세토니트릴 2.5-5 mL에 용해되어 있다. 혼합물이 혼합되고 5분 동안 초음파 분해된다. 그 후 용매는 대략 60℃에서 로토증발(rotoevaporation)에 의해 제거되어 필름을 제공한다. 뜨거운(∼60℃) 순수(deionized water)가 오일에 첨가되고 용액은 ∼23℃까지 냉각된다. 그 후, 용액은 침전물을 제거하기 위해 1.5 mL 마이크로튜브 내에서 ∼13,200 rpm으로 1분간 원심분리된다. 상청액(supernatant)이 수집되고 0.2 ㎛ PTFE 필터를 통해 필터링된다. 그 후, 분리된 미셀은 4℃에서 연장된 시간 주기 동안 저장될 수 있다.
조제 절차 C: 투석. 또 다른 실시예에서, 미셀이 다음의 투석 절차에 의해 함유 및 형성될 수 있다. PEG-b-PLA 및 원하는 비율(예를 들어, 1:1:20에서 1:20:1 내지 20:1:1까지의 가변적인 비율)의 2개 또는 3개의 약물이 디메틸아세트아미드와 같은 수혼화성 용매 내에 용해되어 있다. 그 후 혼합물은 3500 MWCO 튜빙 (Spectra/Por®) 투석용 백 내에서, 0.9% 식염수와 같은 수용액에 첨가되며, 이렇게 함으로써 미셀이 형성되어 약물과 일체화된다. 그 후 미셀 혼합물은 임의의 미일체화된 약물을 침전시키기 위해 (예를 들어, 15분 동안 16,000 rpm에서) 원심분리된다. 그 후 상청액이 나노필터링되고, 예를 들어 자외선 및 굴절률(UV and RI) 검출 모드(J. Control. Release, 1999, 62, 99-100의 야수기 등(Yasugi, et al.)에 의해 기술된 기법 참조)를 갖는 HPLC를 이용하여 분석이 수행될 수 있다.
조제 방법은 또한 이하에서 실험예 3에서 기술되는 수중유 에멀젼(oil in water emulsion), 용액 캐스팅(solution casting), 및/또는 동결건조(얼림건조)의 사용을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 기타 다른 절차는 J. Controlled Release, 109 (2005) 169-188에서 가우처 등(Gaucher et al.)에 의해 기술된 절차를 포함한다.
일단 조제되면, 미셀-약물 조성물은 냉동하에서 바람직하게는 대략 5℃ 이하의 온도에서 연장된 시간 주기 동안 저장될 수 있다. 대략 -20℃ 및 대략 4℃ 사이의 온도가 대부분의 미셀-약물 조성물의 저장에 적합한 조건인 것으로 밝혀졌다. 미셀-약물 조성물을 광으로부터 보호하기 위해 갈색 유리병 또는 기타 다른 불투명 용기를 사용하는 것은 해당 조성물의 유효 수명을 추가로 연장할 수 있다. 미셀-약물 조성물은 또한 고체 제제로 냉동 건조될 수 있으며, 그 후 고체 제제는 투여 전에 수성 담체로 재구성될 수 있다.
PEG-PLA 미셀 내에서의 약물 조합.
파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신은 모두 난용성이기 때문에 현재 기존 담체 내에서 별개의 제제를 요구한다. 현재 이들 약물 담체는 또한 투입 시간을 증가시키는 하나의 카테터선 내에서 순차적인 약물 투여를 통하거나, 또는 감염 및 부정적인 약물 상호작용의 위험을 증가시키는 다중 카테터선 내에서 동시 약물 주입을 통해 환자 내로 개별적으로 주입되어야 한다. 약물 용해를 위한 기존 담체는 또한 종종 독성을 갖는데, 예를 들어 이들 기존 담체는 CrEL을 포함한다. 예를 들어 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 조합과 같은 3개 약물 혼합(cocktails)에 대해 독성 위험이 증가한다.
WO 2009/009067에서 권 등(Kwon et al.)은 PEG-b-PLA 미셀 내에서 17-AAG 및 파클리탁셀은 물론 17-AAG의 용해를 기술하고 있다. 권 및 공동 작업자들은 또한 17-AAG, 파클리탁셀, 및 에토포시드를 포함하는 3개 약물 조합을 운반하는 PEG-b-PLA 미셀을 기술한 바 있다(J. Control Release (2009년 5월 3일)). 다른 사람들에 의해 파클리탁셀-라파마이신 조합 및 파클리탁셀-17-AAG 조합은 상승효과적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. TOR 억제제, 허셉틴(herceptin), 및 파클리탁셀을 구비한 3방향 요법(three-way therapy)이 또한 기술된 바 있다. 그러나, 이들 연구는 개별적으로 투여된 약물로 행해진 것이다.
안전하고, 효과적이며, 무독성, 및 안정한 전달 시스템으로 인하여 이전의 연구와는 차별화되는 단일 조합 제제가 본 명세서에서 기술된다. 순차적으로 투여된 미셀 약물-캡슐화된 제제에 대한 접근 방법은 이제 유사한 장점을 제공할 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명은 다중 항암 약물을 운반하는 단일 무독성 제제를 제공한다. 이러한 제제는 Cremophor EL, DMSO, 및 에탄올과 같은 독성 부형제를 사용하는 현재 사용되는 제제에 비해 중요한 개선을 이룬다. 부형제의 독성은 2개 및 3개 약물 혼합이 환자에게 투여될 때 훨씬 더 치명적이다.
미셀 내에서의 약물 용해도는 표준 업무화되지 못하고 있다. 연구자들은 아직까지 약물이 어느 정도까지 용해될 수 있는지의 여부, 및 약물-미셀 조합이 안정한지의 여부를 결정하는 널리 받아들여지는 절차를 개발하지 못하고 있다. 이러한 결과는 실험적으로 결정되어야만 한다. 다중 약물을 예측 가능한 방식으로 용해하는 능력은 또한 최신 연구자들의 이해범위를 벗어나 있다. 따라서, 단일 약물 미셀 뿐만 아니라 본 명세서에서 기술되는 다중 약물 미셀이 함유된다는 점이 주목할만하다.
본 명세서에서 기술되는 다양한 약물 및 약물 조합이 PEG-PLA 미셀 내에서 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 약물의 유효량이 예를 들어 암을 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 약물 조합은 파라마이신 및 파클리탁셀; 또는 파라마이신, 파클리탁셀, 및 17-AAG, 또는 이들의 적합한 유도체, 에토포시트 또는 테니포시드, 또는 본 명세서에서 인용되는 기타 다른 활성제의 임의의 2개 또는 3개를 포함한다. 예를 들어, 소정의 실시예에서는, 파클리탁셀이 동일한 양의 도세탁셀로 대체될 수 있다. 일부 실시예에서는, 라파마이신이 동일한 양의 데폴로리무스, 템시롤리무스, 또는 에베로리무스, 또는 대안적으로 에토포시드 또는 테니포시드로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 17-AAG는 동일한 양의 17-DMAG, 젤다나마이신, 또는 이들의 유도체로 대체될 수 있다(본 명세서에 참조되어 본 발명의 일부를 이루는 미국 특허 제4,261,989호 (사사키 등) 참조).
하나의 실시예에서, 본 발명은 파클리탁셀 및 라파마이신으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 17-AAG 및 라파마이신으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀을 제공한다. 추가적인 실시예에서, 본 발명은 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀을 제공한다. 미셀 제제가 투여되면, 파클리탁셀 및 라파마이신의 미셀 제제는 항암 활성에 상승효과적으로 작용하고, 17-AAG 및 라파마이신의 미셀 제제도 항암 활성에 상승효과적으로 작용하며, 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 미셀 제제도 또한 항암 활성에 상승효과적으로 작용할 수 있다. 하나 이상의 지점에서 mTor 경로를 억제하는 이들의 능력으로 인해, 본 명세서에 기술되는 상기 약물 조합 미셀 제제는 각각 암을 치료하거나 억제하기 위한 상승효과적인 활성을 제공한다.
따라서, PEG-PLA 미셀을 사용하여 투여될 수 있는 몇 가지 특정한 2개의 약물 조합은 파클리탁셀 및 17-AAG; 도세탁셀 및 17-AAG; 에토포시드 및 17-AAG; 파클리탁셀 및 라파마이신; 17-AAG 및 라파마이신; 및 도세탁셀 및 라파마이신을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. PEG-PLA 미셀을 사용하여 투여될 수 있는 특정한 3개의 약물 조합은 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신; 도세탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신; 및 파클리탁셀, 에토포시드, 및 17-AAG를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물의 각각은 또한 본 명세서에서 인용되는 기타 다른 약물로 대체될 수 있다.
PEG-PLA 미셀 내의 약물의 장점
다중 약물 조합은 적은 양의 하나의 약물이 균등한 또는 향상된 효과(예를 들어, 도 10-11, 도 13-20, 및 도 23 참조)를 갖도록 투여되면서, 또한 표적으로 정해진 효소의 효소 경로의 다른 지점들을 억제할 수 있기 때문에 다른 치료에 비해 상당한 장점을 제공한다. 이러한 약물 조합 제제는 단순히 혼합 미셀 제제(이 경우 각각의 단일 미셀은 오직 한가지 형태의 활성제를 함유하고, 상이한 활성제를 함유하는 미셀들은 하나의 제제 내에서 결합된다) 또는 공동 캡슐화된(co-encapsulated) 미셀 제제(이 경우 미셀은 2개 또는 3개의 상이한 활성제를 함유한다)를 조제함으로써 제공될 수 있다.
파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 조합은 상승효과적인 항암 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 상승효과는 17-AAG가 파클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신, 에토포시드, 또는 공지의 이들의 유도체와 결합하여 투여될 때 달성될 수 있다. 도 13-20 및 이하의 실험예 참조.
이중 작용제 미셀(dual-agent micelles)이 전체 약물 함유량이 단일 작용제 미셀에 대해 얻어질 수 있는 최대 함유량보다 더 많아지도록 조제될 수 있다는 점이 예상치 못하게 밝혀졌다. 또한, 약물 함유량에 대한 이러한 가산 효과는 미셀의 최종 직경에 실질적인 변화를 가져오는 것은 아니다(테이블 3-1 참조). 이러한 가산 함유량 효과에 이어 3개의 상이한 약물을 캡슐화하는 다중 약물 미셀이 또한 발견되었는데, 이러한 다중 약물 미셀은 동적 광산란(DLS) 기법에 의해 결정되는 바와 같이 평균 미셀 직경에 변화가 거의 없거나 전혀 없다. 주목할 점은, 파클리탁셀, 에토포시드, 및 17-AAG의 조합을 캡슐화한 미셀들의 평균 미셀 직경이 파클리탁셀만 또는 17-AAG만을 갖도록 함유된 미셀의 평균 직경에 비해 실제로 더 작다는 점이다. 기타 다른 실시예에서, 다중 약물 미셀은 약물 함유량이 단일 작용제 미셀에 대해 얻어질 수 있는 최대 함유량의 대략 20% 범위 내에 존재하며, (예를 들어, 함유된 약물의 최소 질량에 대해) 단일 작용제 미셀에 대해 얻어질 수 있는 최대 함유량의 대략 120%까지 존재하도록 조제될 수 있다.
코어 내에 2개 이상의 활성제(예를 들어, 17-AAG 및 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 제 2 작용제)를 함유하는 PEG-b-PLA 미셀이 상기 활성제 중의 하나의 손실과 관련하여 더욱 안정하다는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서, 2개의 활성제를 함유하는 미셀 내에서, 활성제는 활성제의 방출에 대해 미셀의 안정성을 증가시키는 방식으로 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 17-AAG와 파클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신, 또는 에토포시드와 같은 제 2 작용제를 함유하는 미셀이 상기 활성제 중의 단지 하나만을 일체로 포함하는 미셀보다 좀 더 안정적인 것으로 밝혀졌다.
임상 실험에서, 17-AAG 및 파클리탁셀의 조합은 충분한 전달을 위한 4가지 성분 혼합으로 DMSO 및 Cremophor®EL을 요구하고 있다. 이러한 제제의 성분은 일부 환자에게서 상당히 부정적인 부작용을 일으키는 것으로 밝혀졌으며, 2개의 약물은 혼합될 수 없으며 또한 함께 주입될 수 없다. 또한, CrEL 및 트윈 80(Tween 80)은 과민반응, 말초신경독증, P-당단백질의 억제, 바람직하지 않은 약동학적 상호작용(pharmacokinetic interactions)을 일으킬 수 있으며, 불량한 종양 국소화를 제공한다(티제 등(Tije et al.), Clin. Pharmacokinet. 42 (2003), 665; 스트리클리(Strickley), Pharm. Res. 21 (2004), 201). 약물 상승효과는 동시 약물 투여에 의해 최대화되지만, 순차적인 투여도 또한 상승효과적으로 작용할 수 있다(솔리트 등(Solit et al.), Cancer Res., 2003; 63:2139-2144). 제넥솔-PM(Genexol-PM)은 현재 제 2상 임상 실험 단계에 있으며, 따라서 파클리탁셀/PEG-PLA는 환자에게 안전하게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 이러한 조성물의 장점은 17-AAG가 미셀의 수 또는 PEG-PLA 중합체 질량의 상당한 증가를 요구함이 없이 파클리탁셀 함유 PEG-PLA 미셀 내로 공동 함유될 수 있다는 점이다. 이러한 제제는 그에 따라 환자를 치료할 때 유기 용매 또는 기타 다른 표면활성제의 사용을 회피할 수 있다.
따라서 본 명세서에서 기술되는 양친성 블록 공중합체(ABC) 미셀 시스템을 사용하여 다양한 질환이 치료될 수 있다. 약물 상승효과는 미셀의 사용에 의해 달성될 수 있으며, 이것은 미셀 전달 담체 내에서의 약물 캡슐화로 인하여 치료 식이요법의 독성을 감소시킬 수 있다. 활성제의 조합은 개별적인 미셀 내에서 또는 각각이 집합 내에서 단일 형태의 약물을 갖는 미셀들의 집합으로 사용될 수 있다. 단순히 혼합되고 공동 캡슐화된 제제는 예를 들어 정맥(IV) 주입과 같이 한 번의 투여로 2가지 상이한 활성제의 투여를 가능하게 한다. 소정의 유용한 조합 및 기법이 미국 특허 제7,221,562호(로젠 등(Rosen et al.))에 기술되어 있다. 기타 다른 실시예에서, SDM은 약물 조합 치료요법의 장점을 제공하도록 순차적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 기술되는 미셀 조성물은 약물 및 약물 조합에 대한 예상치 못한 높은 함유 능력을 갖는 고도로 효과적인 제제를 제공하며, 제제는 조절된 방출 약물 전달 시스템으로 사용될 수 있다. 약물 함유 이중 작용제 미셀이 단일 작용제 미셀의 약물 함유 능력에 접근하거나 동일하다는 것이 발견되었다. 또한, 이중 작용제 미셀 내의 작용제들 간의 상호작용이 이러한 미셀의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 17-AAG는 단순히 혼합된 제제 및 또한 공동 캡슐화된 제제 양자에 대해 이중 작용제 미셀 제제에 대한 안정제로서 작용할 수 있다.
미셀의 약물 제제
17-AAG와 같은 소수성 약물을 PEG-PLA 미셀 내로 일체화시킴으로써, 약학적인 운반체와 같은 주어진 양의 액체, 또는 혈액 또는 간질액(interstitial fluids)과 같은 주어진 양의 체액 내에서, 미셀을 사용하지 않고 용해될 수 있는 것보다 많은 양의 약물이 용해될 수 있다. 따라서, 미셀은 그렇지 않은 경우 가능했던 것 보다 더 높은 정도까지 17-AAG를 효과적으로 용해한다. 미셀이 필터를 통해 통과할 수 있도록 미셀을 용해하는 약학적 운반체는 약학적 "용액" 내에 용해되는 것으로 여겨져, 본 발명의 실시예에 따른 제제를 제공한다.
파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG와 같은 대부분의 소수성 약물은 mL 당 마이크로그램(㎍) 정도의 수용해도를 갖는다. PEG-b-PLA 미셀 내에서 캡슐화된, 본 명세서에서 기술되는 약물의 고유한 조합은 해당 약물을 놀라울 정도의 높은 레벨인 4 mg/mL 내지 9 mg/mL 이상으로 용해시켰다. PEG-b-PLA 미셀 내의 단일 소수성 약물의 용해도에 비해, 소수성 약물의 조합은 단순한 가산 효과 이상을 보여주며, 이것은 소수성 약물 용해도의 일반적인 추정에 대한 직관에 반하는 것이다(counterintuitive).
하나의 실시예에서, 미셀은 대략 파클리탁셀, 라파마이신, 17-AAG, 또는 이들의 조합의 대략 15 mg/mL까지, 또는 결합된 약물의 대략 20 mg/mL까지 용해할 수 있다. 일부 실시예에서, 미셀은 약물의 대략 3 mg/mL, 대략 5 mg/mL, 대략 10 mg/mL, 대략 15 mg/mL, 대략 20 mg/mL, 또는 대략 25 mg/mL를 용해할 수 있다. 일부 실시예에서, 제제는 미셀 부피에 대해 또는 바람직하게는 수성 운반체의 부피에 대해, 약물의 대략 0.5 내지 대략 5 mg/mL, 약물의 대략 0.75 내지 대략 3 mg/mL, 약물의 대략 1 내지 대략 2 mg/mL, 또는 대략 1.5 mg/mL의 농도를 가질 수 있다. 약물의 기타 다른 조합의 유사한 양이 소정의 기타 다른 실시예의 미셀 내에 포함될 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 약물 캡슐화된 미셀은 식염수 또는 덱스트로스 등과 같은 수성 운반체를 포함하는 혼합물로 제조된다. 예를 들어, 적합한 운반체는 0.9% 소금물(NaCl 용액), 또는 덱스트로스 또는 글루코스 용액과 같은 5% 수성 당용액(aqueous saccharide solution)일 수 있다. 레밍턴(Remington): The Science and Practice of Pharmacy, D. B. Troy, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (21.sup.st Ed., 2005) 803-849 페이지 참조.
예를 들어, 비경구 투여와 같은 투여 목적을 위해, 수용성 염(예를 들어, NaCl)의 무균 수용액이 사용될 수 있다. 수용액은 등장성(isotonic)을 가질 수 있다. 추가적인 또는 대안적인 운반체는 수성 프로필렌 글리콜 뿐만이 아니라 참기름 또는 땅콩 기름을 포함할 수 있다. 수용액은 필요한 경우 적절하게 버퍼링될 수 있으며, 액상 희석제가 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 이루어질 수 있다.
이들 수용액은 특히 정맥 주사, 근육 내 주사, 피하 주사, 복강 내 주사, 및 종양 내(IT) 주사에 적합하다. 종양 내 주사는 전립선암을 포함하는 암의 치료와 같은 특히 소정 형태의 치료요법에 대해 도움이 된다. 적절한 무균 수성 배지는 구입가능하거나(예를 들어, 시그마-알드리치사, 세인트루이스, 미조리주) 또는 본 발명 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 기법에 의해 조제될 수 있다.
일부 실시예에서, 조성물은 하나 이상의 에탄올, 디메틸 설폭사이드, 또는 기타 다른 유기 용매, 인지질, 피마자유, 및 피마자유 유도체와 같은 첨가제가 전혀 없다. 다른 실시예에서, 조성물은 상술한 성분들이 실질적으로 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 실질적으로 없다는 것은 조성물이 대략 2.5 중량% 미만, 대략 2 중량% 미만, 대략 1.5 중량% 미만, 대략 1 중량% 미만, 대략 0.5 중량% 미만, 또는 대략 0.25 중량% 미만을 함유하는 것을 의미한다. 일부 실시예에서, 소정의 첨가제는 미셀의 안정성을 증가시킬 수 있다. 하나의 실시예에서, 표면활성제가 (예를 들어, 대략 0.25 중량% 내지 대략 2.5 중량%로) 미셀 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 적합한 표면활성제는 폴리에틸렌글리콜 결합 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민(PEG-DSPE)과 같은 음으로 하전된 인지질일 수 있다.
미셀 제제를 이용한 치료 요법.
적합한 제제의 부재는 17-AAG의 임상 실험으로의 진입을 방해한다. 17-DMAG (알베스피마이신)와 같은 더 새로운 유도체는 수용해도와 관련된 몇 가지 문제점을 극복하였다. 그러나, 간(liver)에 의한 이들 유도체의 우선적이고 신속한 클리어런스는 종양 내로의 약물 분산을 제한함으로써, 약물의 효과를 심각하게 제한한다. 유기 공용매 또는 거친 계면활성제를 요구하지 않는 17-AAG의 제제가 조제되었다. 제제는 PEG-PLA(12:6 kDa) 미셀 내에서 1.5 mg/mL의 17-AAG를 용해할 수 있다. 유기 공용매 또는 계면활성제를 요구하지 않는 17-AAG의 제 2 제제가 제조되었다. 이러한 제제는 PEG-PLA(2:2 kDa) 미셀 내에서 대략 5 mg/mL의 17-AAG를 용해할 수 있다. PEG-PLA 미셀 내로 파클리탁셀을 캡슐화하는 유사한 작업은 이러한 더 안전한 미셀형 제제가 환자에게 약물의 투여에 따른 CrEL과 관련된 부정적인 부작용을 최소화할 수 있음을 입증하였다. 또한, 나노크기의 치수는 심지어 표적 리간드가 없는 경우에도 EPR 효과를 통해 약물의 종양 특이성(tumor specificity)에 추가적인 이득을 준다.
미셀은 약학적 용액으로 제조되어 환자에게 투여될 수 있다. 약학적 용액 제제는 예를 들어 대략 10 분, 대략 3 시간까지, 통상적으로 대략 1 내지 대략 2 시간, 예를 들어, 대략 90 분의 허용 가능한 시간 내에 몸체로 필수량의 약물 전달을 허용할 수 있다. 투여는 예를 들어, 주입, 주사, 또는 정맥(IV)에 의한 비경구이 될 수 있으며, 환자는 예를 들어 인간과 같은 포유류일 수 있다. 투여가 이루어지면, 미셀은 손실 없이 순환되고, 개별 중합체 사슬 내로 분리되며, (확산 또는 미셀 분리 중 어느 하나에 의해) 활성제를 방출하고, 조직(예를 들어, 종양) 내로 분산되며, 및/또는 신장클리어런스를 겪을 수 있다. 이들 사건의 스케줄은 특이성으로 인해 예측이 불가능하며, 이들 사건은 파클리탁셀, 라파마이신, 또는 17-AAG와 같은 활성제의 항종양 활성에 심각한 영향을 미친다.
일부 실시예에서, 약물 함유 미셀은 종양 간극 내로 스며나오게 할 수 있으며, 이러한 지점에서 활성제 함유 미셀은 세포 내 상태(intracellular conditions)로 인해 미셀로부터 약물을 방출한다. 그 후, 활성제는 종양 세포 내로 확산될 수 있다. 본 발명의 또 다른 태양은 새는 맥관구조(leaky vasculature)를 가로질러 종양 세포 내로 흡수되며, 종양 세포 성장을 억제하고, 및/또는 종양 세포를 사멸시키는 미셀을 포함한다.
질병, 장애, 또는 질환은 본 명세서에서 기술되는 약물 조합을 함유하는 미셀의 약학적 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 조성물의 투여는 환자의 암성장의 사이즈 및/또는 수의 감소, 및/또는 하나 이상의 대응되는 관련 증상의 감소 결과를 가져올 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 방법에 의해 유효량으로 투여될 때, 본 발명의 조성물은 암세포 증식의 억제, 암 또는 종양의 사이즈 감소, 추가 전이의 방지, 종양 혈관신생의 억제, 및/또는 암세포의 사멸과 같은 병리학적으로 관련이 있는 응답을 생성할 수 있다. 이하에서 기술하는 이러한 질병 및 질환을 치료하는 방법은 본 발명의 치료적인 유효량의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 예를 들어, 일 단위로, 주 단위로, 또는 월 단위로, 또는 이들의 복수배 단위로, 필요에 따라 반복될 수 있다.
치료될 수 있는 질환은 두부, 경부, 비강(nasal cavity), 부비강, 비인강, 구강, 중인후, 후두, 하인두, 침샘, 및 부신경절종(paragangliomas)의 종양을 포함하는 두경부암; 간 및 담도(biliary tree)의 암, 특히 간암; 장암(intestinal cancers), 특히 대장암; 난소암; 소세포성 및 비소세포성 폐암; 전립선암; 췌장암; 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 배아암종, 연조직육종(leiomysosarcoma), 신경섬유육종, 골육종, 활막육종, 지방육종, 및 폐포성 연부(alveolar soft part sarcoma)와 같은 유방암 육종; 중추신경계의 종양, 특히 뇌암; 및/또는 호지킨 림프종, 림프형질세포성 림프종, 여포성 림프종, 점막관련 림프조직 림프종, 외투세포 림프종, 거대 B 세포 림프종, 버키트 림프종, 또는 T-세포 미분화 대세포 림프종과 같은 림프종을 포함하는 과다증식성 질병을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
세포 과다증식에 의한 특징을 갖는 비암성 질환(non-cancer conditions)도 또한 본 명세서에서 기술되는 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 예를 들어, 약물은 본 명세서에서 기술되는 방법에 따라 투여되어 세포 과다증식에 의한 특징을 갖는질환을 치료할 수 있다. 비암성 질환, 장애, 또는 질병과 같은 예시적인 실험예는 위축성 위염(atrophic gastritis), 염증성 용혈성 빈혈, 이식 거부, 염증성 호중구 감소증, 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 소아지방변증(coeliac disease), 탈수초성 신경변증(demyelinating neuropathies), 피부근염, 염증성 장질환(궤양성 대장염 및/또는 크론병), 다발성 경화증, 심근염, 근염, 비용종, 만성 부비동염, 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 원발성 사구체신염, 건선, 외과적 유착, 협착증 또는 재협착증, 공막염, 경피증, (아토피성 피부염, 자극성 피부염, 알레르기성 피부염을 포함하는) 습진, 치주질환(즉, 치주염), 다낭성 신장질환, 및 일형당뇨병을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 실험예는 혈관염, 예를 들어 거대 세포 동맥염(측두동맥염, 다카야수 동맥염), 결절성다발성동맥염, 알레르기성 혈관염 및 육아종증(척-스트라우스 질병), 다발성 혈관염 중첩 신드롬(polyangitis overlap syndrome), 과민성 혈관염 (헤느흐 쉰라인 자반증), 혈청병, 약물-유발성 혈관염, 감염성 혈관염, 종양성 혈관염, 결합 조직 장애 관련 혈관염, 보체계의 선천성 결핍층 관련 열관염, 베게너 육아종증, 카와사키병, 중추신경계의 열관염, 버거씨병 및 전신경화증; 위장관 질환, 예를 들어 췌장염, 크론병, 궤양성 대장염, 궤양성 직장염, 원발성 경화성 담관염, 임의의 특발성 원인의 양성협착증(예를 들어, 담관, 식도, 십이지장, 소장 및 결장의 협착증);호흡기 질환(예를 들어, 천식, 과민성 폐렴, 석면증, 규폐증 및 기타 다른 형태의 진폐증, 만성 기관지염 및 만성 폐쇄성 기도 질환); 비로관 질병(예를 들어, 특발성을 포함한 모든 원인의 협착증); 유스타키오관 질병(예를 들어, 특발성을 포함한 모든 원인의 협착증); 신경질환, 진균성 질환, 바이러스 감염, 및/또는 말라리아를 포함한다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 인간을 포함한 포유류가 직접적으로 또는 간접적으로 포유류의 질환을 개선하기 위한 목적으로 의료지원의 대상이 되는 임의의 프로세스, 동작, 적용, 치료요법 등을 지칭한다. 치료는 본 명세서에서 기술되는 바와 같은, 통상적으로 유효량의 미셀 조성물의 투여를 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료학적으로 유효량"은 1) 암세포 수의 감소; 2) 종양 사이즈의 감소; 3) 암세포의 말초 기관 내로의 침투의 억제(즉, 어느 정도의 지연, 바람직하게는 중단); 4) 종양 전이의 억제(즉, 어느 정도의 지연, 바람직하게는 중단); 5) 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 6) 어느 정도까지 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 해소 또는 감소; 및/또는 7) 활성제의 투입과 관련된 부작용의 해소 또는 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 질환, 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 해소하는데 요구되는 치료학적 작용제의 양으로 적합하도록 의도된 것이다.
용어 "억제"는 종양 형성, 종양 성장 또는 종양 세포 성장의 맥락에서 1차 및 2차 종양의 지연 발현, 1차 및 2차 종양의 지연 발달, 1차 및 2차 종양의 감소 발생; 질병의 2차 효과의 지연된 또는 감소된 중증도; 저지된 종양 성장 및 종양의 퇴보 등에 의해 평가될 수 있다. 극단적으로, 완전 억제는 방지 및 화학적 예방법으로 지칭될 수 있다. 억제는 치료가 없는 경우 발생할 수 있는 진행에 대해 대략 10%, 대략 25%, 대략 50%, 대략 75%, 또는 대략 90%의 억제가 될 수 있다.
본 발명의 약학적 용액 제제를 사용하여, 파클리탁셀, 라파마이신, 17-AAG 및/또는 항암제 또는 세포독성제와 같은 활성제가 투입 빈도 수에 따라, 대략 4 mg/m2에서 대략 4000 mg/m2까지의 투여량으로 투입될 수 있다. 하나의 실시예에서, 약물 조합용 투여량 요법은 매주당 대략 400-500 mg/m2, 또는 매주당 대략 450 mg/m2이 될 수 있다. 바너지 등(Banerji, et al.), Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22, 199 (2003, 초록 797) 참조. 대안적으로, 매주당 대략 300 mg/m2 내지 대략 325 mg/m2, 또는 대략 308 mg/m2의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 굇츠 등(Goetz et al.), Eur. J. Cancer, 38 (Supp. 7), S54-S55 (2002) 참조. 또 다른 복용 요법은 매주당 2회의 주사를 포함하는데. 투여량은 환자의 질환 또는 건강의 중증도에 따라 대략 200 mg/m2에서 대략 360 mg/m2까지의 범위(예를 들어, 대략 200 mg/m2, 대략 220 mg/m2, 대략 240 mg/m2, 대략 250 mg/m2, 대략 260 mg/m2, 대략 280 mg/m2, 대략 300 mg/m2, 대략 325 mg/m2, 340 mg/m2, 대략 350 mg/m2, 또는 대략 360 mg/m2)를 갖는다. 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 또 다른 약물과 함께 조합 치료용으로 사용될 수 있는 투여량 요법은 매 3주마다 2개의 약물을 투여할 수 있으며, 이 때 17-AAG의 투여량은 매번 투여할 때마다 대략 500 mg/m2 내지 대략 700 mg/m2, 또는 대략 650 mg/m2까지이다. 사용될 수 있는 기타 다른 동시 복용 스케줄은 훵 등(Fung et al.), Clin. Cancer Res. 2009; 15(17), 5389-5395에 기술되어 있다.
이하의 실험예들은 상술한 본 발명을 예시하도록 의도된 것으로, 그 범위를 좁히는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명 기술 분야의 당업자라면 실험예가 본 발명이 실시될 수 있는 많은 기타 다른 방법을 제안한다는 것이 쉽게 이해될 수 있을 것이다. 본 발명의 범위 내에서 유지되면서 무수한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
실험예
실험예 1. PEG -b- PLA 미셀 내에서의 17- AAG 캡슐화
17-( 알릴아미노 )-17- 데메톡시젤다나마이신의 조제. 17-AAG는 젤다나마이신 (GA)로부터 실험실(LC 연구소, 워번, 메사추세츠주) 내에서 합성되었다. 개략적으로, 100 mg의 GA(0.2 mmol)가 2 mL의 건조 CH2Cl2 내에 용해되었다. 그 다음, 5 당량의 알릴아민(57.1 g/mol, d=0.763 g/mL)이 한 방울씩 플라스크로 첨가되었다. 반응이 실온(RT: 대략 23℃)에서 낮은 조명하에 TLC 분석 (대략 2일)(95:5 CHCl3:MeOH, Rf0.21)에 의해 완료될 때까지 교반되었고, 헥산(3x)으로 침전되었으며, 15분 동안 2000 g로 원심분리되었고, 건조될 때까지 증발되었다. 수율: 95 mg, 95%; MS m/z 584(M-); 1H NMR(CDCl3)δ0.99(m, 6H, 10-Me, 14-Me), 1.25(t, 1H, H-13), 1.60-1.85(br m, 6H, H-13, H-14, 8-Me), 2.05(s, 3H, 2-Me), 2.46(br m, 2H, H-15), 2.83-2.90(br m, 3H, H-10), 3.27(s, 3H, OMe), 3.36(s, 3H, OMe), 3.40(t, 1H, H-12), 3.58-3.68(br m, 2H, H-11, H-23), 4.31(d, 1H, H-7), 5.10(br s, 1H), 5.21-5.55(br m, 3H, H-9, H-24), 5.86-5.99(br t, 2H, H-5, H-23), 6.59(t, 1H, H-4), 6.94(d, 1H, H-3), 7.28(br s, 1H, H-19).
약물 함유 PEG - PLA 미셀의 조제 및 특성화. 카타오카 및 공동 작업자들에 의한 절차에 따라 17-AAG를 디메틸아세트아미드(DMAc) 내에서 PEG-PLA (12:6 kDa)( 폴리머소스, 몬트리올, 캐나다)로 용해하고, 물(H2O)에 대해 투석함으로써 17-AAG가 제조되었다(J. Control. Release 62(1-2) (1999) 89-100). 예를 들어, 5 mg의 17-AAG 및 45 mg의 PEG-PLA(10:90 w/w)가 10 mL의 DMAc 내에 용해되었다. 그 결과 얻어진 용액이 3500 MWCO 튜빙 (SpectraPor) 내에서 물(H2O)에 대해 투석되었다. 그 결과 얻어진 미셀이 일체화되지 않은 약물을 침전시키기 위해 10분 동안 5000 g에서 원심분리되었다. 미셀 내로의 일체화는 수성 GPC(Shodex SB-806M)를 사용하여 미셀에 대한 굴절률 및 17-AAG의 흡수 (자외선 λ332)에 기초한 대응 체류 시간을 확인함으로써 확인되었다. 미셀 용액은 실온에서 감압 하에 로터리 증발법에 의해 농축된 후 (10분 동안 5000 g로) 원심분리되었다.
미셀 내의 양적인 약물 함유량은 역상 HPLC(Shodex C18 칼럼, 65-82.5:35-17.5 MeOH 내지 55% MeOH+0.2% 포름산 구배, 40℃, 332 nm 검출)를 통해 (17-AAG 보정 곡선에 기초한) 17-AAG에 대한 곡선하 면적(AUC)을 모니터링함으로써 결정되었다. 약물이 있는 경우와 없는 경우의 PEG-PLA 미셀의 유효 직경이 가우시안 세기 적합화(Gaussian intensity fitting)를 갖는 브룩헤븐 동적 광산란 장치 (100 mW, 532 nm 레이저)를 사용하여 측정되었다. 이들 PEG-b-PDLLA 미셀에 대한 임계 미셀 농도(CMC)가 PEG-PLA (3x10-5 mg·mL-1 내지 1 mg·mL-1)의 다양한 농도의 존재 하에서 피렌(pyrene)의 339/334-nm 여기 비율을 측정함으로써 결정되었다.
간략하게, PEG-b-PDLLA 미셀이 상술한 바와 같이 연속 희석 및 0.6마이크로몰 피렌으로 80℃에서 1 시간 동안 배양되었고, 실온에서 15 시간 동안 어둠속에서 방치되도록 하여 조제되었으며, 피렌의 형광 방출이 390 nm(RF-5301 PC 형광광도계, 시마츠)에서 측정되었다. 피렌은 그 미세환경 극성에 응답하여, 잘 알려진 광물리학적 변화를 겪는다(Colloids Surf., A Physiochem. Eng. Asp. 118 (1996) 1-39). 피렌이 우선적으로 EO-b-PDLLA 미셀의 소수성 코어 내로 분할됨에 따라 339/334 nm 여기의 비율에서의 급격한 증가가 CMC에서 발생한다(J. Control. Release 77(1-2) (2001) 155-160).
예를 들어 실험예 2 및 3에서 기술되는 절차와 유사하게, WO 2009/009067(권 등)에 기술되어 있는 바와 같이, 미셀 제제가 조제되고, 특성화되어, 평가될 수 있다.
실험예 2. 약물 용해도; 참조 실험예들
약물과 함께 미셀을 형성하는 몇 가지 중합체가 파클리탁셀-라파마이신-17-AAG 약물 조합을 용해시키기 위해 조사되었다. 상기 조합은 정확한 세트의 미셀화 가 없이는 용해가 어렵다는 것이 입증되었다. 예를 들어, PEG-PPG-PEG 삼중 블록 중합체인 폴록사머 F68(Poloxamer F68)은 항암 활성을 갖는 것으로 보고된 소수성 유기화합물인 레스베라트롤과 같은 많은 소수성 화합물의 용해에 유용하다. 그러나, 폴록사머 F68은 파클리탁셀, 라파마이신, 또는 17-AAG를 개별적으로 용해하는 것이 불가능하거나, 또는 파클리탁셀, 라파마이신 및 17-AAG의 조합을 용해하는 것이 불가능하다. 이러한 시도 중에, 미셀이 수용액 내에서 응고되어 더 나빠졌다.
역으로, PEG-b-PLA는 레스베라트롤과 결합될 때 안정한 미셀을 형성하지 못하지만, 17-AAG 및 파클리탁셀-라파마이신-17-AAG 약물 조합 양자와는 매우 안정한 미셀을 형성한다. 또한, 삼중 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀은 거의 추가적인 형태로 약물을 용해함으로써 현저한 특성을 보여준다. 따라서, 각각의 약물 및 약물 조합을 용해하기 위한 적합한 중합체는 현재까지는 신뢰할만한 예측 경향성이 존재하지 않기 때문에 실험적으로 결정되어야 한다.
폴록사머 F68을 갖는 파클리탁셀-라파마이신-17-AAG 조합의 미셀을 형성하기 위한 결과는:
(1) 폴록사머 F68을 갖는 라파마이신(rap) 자체: 함유 효율이 저조하다. 재구성 후의 라파마이신 = 0.09 mg/mL(초기 농도 = 2.4 mg/mL); 미셀 내로 단지 4% 함유 및 물의 추가 시에 흰색 침전물이 형성됨.
(2) 폴록사머 F68을 갖는 라파마이신, 파클리탁셀 및 17-AAG: 함유 효율이 또한 저조하다.
rap의 최종 농도 = 0.35 mg/mL(초기 농도 = 2.4 mg/mL): 15% 함유.
파클리탁셀의 최종 농도 = 0.80 mg/mL(초기 농도 = 4.1 mg/mL): 15% 함유.
17-AAG의 최종 농도 = 0.67 mg/mL(초기 농도 = 4.1 mg/mL): 16% 함유.
실험예 3. 난용성 항암 약물의 동시 전달용 다중 약물 함유 고분자 미셀
양친성 블록 공중합체인 PEG-b-PLA는 물 내에서 쉽게 미셀 내로 응집된다. 이것은 파클리탁셀(PTX)의 용해도가 대략 1 ㎍/mL에서 10 mg/mL으로 상승한 것을 보여준다. PEG-b-PLA는 CrEL보다 훨씬 더 적은 독성을 갖는다. 그러나, 전이성 유방암 환자들에 있어서의 최근 2상 임상 실험은 PEG-b-PLA 미셀의 일부로 투여된 PTX가 코르티코스테로이드 및 히스타민 길항제로 마취전 투약(premedication)이 없으면 비록 CrEL보다는 덜 심각하지만 과민성 반응을 유도하는 것으로 나타났다. PEG-b-PLA 미셀은 CrEL과 비교해 인간에게 최대로 견딜 수 있는 PTX의 투여량을 증가시켜서 그 항종양 효과를 향상시킨다. 또한, PEG-b-PLA 미셀이 PTX에 대한 선형 PK를 부여하는 증거가 존재하는데, 이는 PTX에 대한 비선형 PK를 유도하는, 즉 투여량의 증가에 따라 클리어런스가 낮아지는, CrEL와는 강한 대조를 이룬다. 다양한 항암제의 용해도를 높이기 위해 이들 PEG-b-PLA 미셀을 사용하는 것은 암 분야에서 임상 실험으로의 용이한 진입을 촉진하는 전달에 대한 잠재적인 선택사항이다.
그러나, 획득된 약물 저항은 물론 암세포의 이질성으로 인하여, 단일 작용제 요법은 제한되며, 조합 화학요법이 암 환자를 치료하는 표준 요법이 되었다. 구체적으로 말하자면, 약물 조합은 저항 세포주의 발생 지연 및 다중 세포주에 대한 광범위한 보호범위의 관점에서 유익하며, 그 결과 허용 가능한 독성 내에서 최대 세포 사멸 효과를 갖는다.
상승효과적 약물 조합은 각각의 약물이 최적의 투여량으로 단독으로 사용되는 경우에 가능한 것보다 더 큰 응답 속도 또는 생존 시간을 생성한다. 예를 들어, 원형 Hsp90 억제제인 17-AAG는 상이한 종양 세포주에서 광범위한 항암제의 상승효과를 갖는다. 17-AAG는 암 발생 및 생존 경로의 차단의 원인이 되는, 예를 들어 Akt, ErbB-2, 및 Hif-1α(알파)와 같은 다발성 암유발성 단백질(multiple oncogenic proteins)의 현저한 조합적 감소의 원인이 되며, 화학요법 및 17-AAG의 조합에 대단한 관심이 존재한다.
PTX 및 17-AAG 또는 라파마이신의 경우, 약물이 함께 주어지거나 또는 PTX가 라파마이신과 함께 주어지거나 또는 라파마이신에 노출된 후에 PTX 치료가 이루어질 때, PTX가 항종양성 활성을 갖는 유사분열억제제인 17-AAG에 의해 유도된 고사에 이르도록 암세포를 자극하는 것으로 나타났다. 이들 2개의 약물 조합은 다양한 암세포주 및 생쥐에서 상승효과를 갖는다. 추가적으로, H358 인간 비소세포성 폐암 이종이식을 가진 생쥐에서, 17-AAG와 조합될 때 PTX 세포 독성이 5-22배까지 향상되었다. PTX 및 17-AAG의 조합은 또한 인간에게서 평가되었으며, PTX 단독으로 사용될 때와 비교하여 향상된 효과 및 더 양호한 내약성 프로파일을 보여주었다. 또 다른 경우, 17-AAG는 또한 체외 및 생체 내에서 토포이소머라제 II 억제제인 ETO의 활성을 향상시켰다. 17-AAG 및 ETO의 조합은 백혈병 세포 내에서 상승작용을 보여주었다. 또 다른 연구는 17-AAG 및 ETO의 조합이 4가지 상이한 소아의 급성 림프구성 백혈병 세포주에서 ETO의 IC50을 10 배까지 감소시켰음을 입증하였다.
그러나, 조합 화학요법의 장점에도 불구하고, 임상적 사용과 관련된 주요한 문제점 중의 하나는 환자에게 투여되어야만 하는 복잡한 요법이다. 대부분의 항암 약물은 난용성이며 용해도를 향상시키기 위해 유독성 부형제를 사용하기 때문에, 2개 또는 3개의 약물을 조합하는 것은 화합성 및 안정성 문제 때문에 임상 실습에서의 난점이 될 수 있다. 따라서, 단일 항암제 대신에 화학 치료요법을 합리적으로 설계하고 전달하기 위한 PEG-b-PLA 미셀을 사용하는 것은 관련된 이들 제제와 임상적 난점을 극복하는데 더 양호한 접근 방법이 될 수 있다. 이전의 작업에서, 17-AAG는 PEG-b-PLA 미셀 내에서 용해되었다(시옹 등(Xiong et al.), J. of Pharm. Sci. 98 (2009) 1577-1586). 이들 미셀 내에서의 17-AAG의 PK 프로파일은 생쥐에서는 CrEL 제제에서 관찰된 부수적인 독성이 없어(CrEL에 대한 치사율 35% 대비 사망 없음), CrEL과 유사하였다. 따라서, PTX, DCTX, 또는 ETO와 같은 다수의 항암제를 17-AAG로 공동으로 용해함으로써 잠재적으로 상승효과적인 조합 화학요법에 대한 더욱 안전하고 좀 더 안정한 제제를 생성하도록 동시에 전달할 수 있는 PEG-b-PLA 미셀 시스템이 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 개발되었다.
재료. (Mn PEG 및 PLA가 각각 4.2 K 및 1.9 K이고, PDI=1.05인) PEG-b-PLA 가 어드벤스드 폴리머 머티리얼즈사(몬트리올, 캐나다)로부터 구입되었다. 파클리탁셀은 LKT 라보라토리즈사(세인트폴, 미네소타주)에서 얻어졌다. 도세탁셀 및 17-AAG는 LC 연구소(워번, 메사츠세츠주)로부터 구입되었다. 에토포시드, DMSO-d6 및 D2O는 시그마-알드리치사(세인트루이스, 미조리주)로부터 구입되었다. 모든 기타 다른 재료들은 피셔 사이언티픽사 (페어론, 뉴저지주)로부터 얻어졌다. 모든 시약은 HPLC 등급이었다.
약물 함유 PEG -b- PLA 미셀의 조제 및 특성화. 단일 약물 미셀(SDMs)은 2.0 mg의 PTX, DCTX, ETO 또는 17-AAG 및 15 mg의 PEG-b-PLA를 5.0 mL의 둥근바닥 플라스크 내에서 첨가하여 조제되었다. 이러한 약물-중합체 혼합물은 0.50 mL 아세토니트릴(ACN) 내에서 용해되었다. ACN은 감압하의 60℃에서 로터리 증발식으로 제거되어 그 결과 균질의 필름이 제조되었다. 약물-중합체 필름은 60℃에서 0.50 mL의 DD H2O로 서서히 교반하여 다시 수화되었으며, 그 결과 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀의 청정 수용액이 얻어졌다. 미셀 용액은 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 필터링되었으며, 미셀은 동적 광산란(DLS) 및 HPLC 각각에 의해 사이즈 및 함유량과 관련하여 특성화되었다.
PEG-b-PLA는 또한 PTX/17-AAG, DCTX/17-AAG, ETO/17-AAG 및 PTX/ETO/17-AAG의 상이한 약물 조합으로 다중 약물 미셀(MDMs)을 조제하는데 사용되었다. MDMs는 2.0 mg의 각각의 약물을 15 mg의 중합체와 혼합함으로써 SDMs와 유사하게 조제되었다. 이들 미셀의 조제 및 특성화의 절차는 SDMs과 동일하다.
SDM 및 MDM에 대해 약물 대 중합체의 w/w 퍼센트가 계산되었다. PEG-b-PLA 미셀은 동결건조되고, 무게가 측정되었으며, 동결건조 샘플에서 약물의 양이 HPLC에 의해 수량화되었다. 약물의 질량 대 냉동건조 샘플의 중합체 질량에 100을 곱하여 약물의 w/w 퍼센트가 계산되었다.
역상 HPLC 에 의한 SDM 및 MDM 에서의 약물 함유량의 수량화. PEG-b-PLA 미셀 내에 함유된 약물의 양이 역상 HPLC에 의해 수량화되었다. 수량화에 사용된 HPLC 시스템은 LC-20AT 펌프, SIL-20AC HT 자동샘플러, CTO-20AC 칼럼형 오븐 및 SPD-M20A 다이오드 어레이 검출기로 구성된 시마츠 프로미넌스 HPLC 시스템(시마츠, 일본)이었다. 10 ㎕의 샘플이 조르박스(Zorbax) SB-C8 신속 해상도 카트리지 (4.6x75 mm, 3.5 미크론, 어질런트) 내로 주입되었다. 칼럼 온도는 가동되는 내내 40℃에서 유지되었다. PEG-b-PLA 미셀 내에 함유된 약물의 양을 수량화하도록 2가지 HPLC 방법이 개발되었다.
첫번째 방법은 SDM 또는 MDM 내의 PTX, DCTX 및 17-AAG를 수량화하도록 개발되었다. 이동상(mobile phase)은 DD H2O 내에서 0.1% 인산 및 1% 메탄올을 함유한 45% ACN 및 54% 수상(aqueous phase)의 균등 혼합물(isocratic mixture)이었다. 가동 시간은 10분이고, 흐름 속도는 1.0 mL/분이며, 검출은 PTX 및 DCTX에 대해서는 227 nm에서, 17-AAG에 대해서는 333 nm에서 검출되었다. 17-AAG, PTX, 및 DCTX의 체류 시간은 각각 5.6, 6.8 및 8.1 분이었고, 이 방법에 의한 3개 약물의 검출 한계(LODs)는 각각 1.00, 0.52, 및 0.43 ㎍/mL였다.
두번째 방법은 SDM 또는 MDM 내의 PTX, ETO 및 17-AAG를 수량화하도록 개발되었다. 이동상은 DD H2O 내에서 0.1% 인산 및 1% 메탄올을 함유한 ACN 및 수상의 구배 혼합물(gradient mixture)이었다. 가동 시간은 15분이고, 흐름 속도는 1.0 mL/분이며, 검출은 PTX 및 ETO에 대해서는 227 nm에서, 17-AAG에 대해서는 333 nm에서 검출되었다. ETO, PTX, 및 17-AAG의 체류 시간은 각각 3.3, 8.0 및 8.5 분이었고, 3개 약물의 검출 한계(LODs)는 각각 0.55, 0.47, 및 0.43 ㎍/mL였다. 2가지 HPLC 방법에 따라, 샘플들은 두 차례 그리고 재생가능하게 주입되었으며, 약물의 신속한 분리가 달성되었다.
SDM 및 MDM 의 동적 광산란 ( DLS ) 측정. 미셀의 사이즈가 헬륨-네온(He-Ne) 레이저(4 mW, 633 nm) 광원 및 90°각도 산란된 광 수집 구조가 장착된 ZETASIZER Nano-ZS (맬버른 인스트루먼츠사, 영국)을 사용하여 DLS에 의해 결정되었다, 약물 함유 미셀 용액이 DD H2O로 20배 희석되었고, 샘플들은 측정 전에 25℃에서 2분 동안 평형을 유지하였다. 최종 PEG-b-PLA 농도는 대략 1.5 mg/mL였다. PEG-b-PLA 미셀의 수력학적 직경(hydrodynamic diameter)은 스토우크스-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)에 기초하여 계산되었다. 보정 함수는 평균 사이즈 및 복합분산 지수(polydispersion index: PDI)를 계산하기 위해 누적율법에 의해 적합화된 곡선이었다. 모든 측정은 3번 반복되었으며, 부피 가중(volume-weighted) 입자 사이즈가 표준편차를 갖는 평균 직경으로 제시되었다.
SDM 및 MDM 의 탁도 측정. 탁도 측정이 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀의 물리적 안정성을 평가하기 위해 사용되었다. 담지 프로브(dip probe)가 장착된 CARY 50 BIO UV-Visible 분광광도계가 탁도를 측정하기 위해 사용되었다. 5 mg/mL의 PEG-b-PLA의 최종 농도에 대해 미셀 용액이 DD H2O로 6배로 희석되었고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 필터링되었다. 각 샘플의 흡수는 650 nm에서 기록되어, 주변 온도 -23℃에서 24 시간에 걸쳐 수집되었다. 각 측정은 3번씩 수행되었다.
SSDM 및 MDM 의 1 H NMR 분광법. PEG-b-PLA 미셀 내로의 약물의 일체화를 확인하기 위해 1H NMR 분광법이 사용되었다. PEG-b-PLA 중합체 필름 내에 개별 약물 또는 다중 약물이 상술한 바와 같이 조제되었다. 형성된 필름은 0.70 mL의 DMSO-d6 내에 또는 60℃로 가열된 0.70 mL D2O 내에서 용해되었으며, 각 샘플에 대해 1H NMR 스펙트럼이 기록되었다. 1H NMR 측정은 400 MHz 표준 양성자 주파수에서 동작하는 UNITYINOVA NMR 분광기 (바리안, 미국) 모델로 수행되었다. 모든 측정에 대해 샘플 온도가 조절되었으며, 25℃로 설정되었다. 분광기에는 (냉동 유닛, 내부 온도 제어기, 및 내포물 이송 라인으로 구성된) FTS 시스템즈 사전 조건 형성 장치(preconditioning device)가 설치되었다. 온도 제어 매체로 압축 및 건조 공기의 사전 냉각 또는 사전 가열을 제어하기 위해, 샘플의 최조 온도 조절이 최종 NMR 프로브 내에서 이루어졌다. 획득 파라메터들이 적합한 신호대 잡음비 및 스펙트럼 해상도를 제공하기 위해 케이스 별로(case-by-case basis) 조정되었으며, 후자(스펙트럼 해상도)는 통상적으로 1D 고해상도 양성자에 대해 0.5 ppB/포인트에서 적합한 스펙트럼 해상도를 제공한다. 좀 더 구체적으로, 양성자는 단일 반파장(π/2) 펄스에 의해 여기된 후 양성자 신호가 검출된다.
DM 및 MDM 로부터 약물의 체외 방출 프로파일. PEG-b-PLA 미셀로부터 PTX, DCTX, ETO 및 17-AAG의 방출 프로파일이 투석 방법에 의해 평가되었다. SDMs 또는 MDMs가 조제되어 상술한 바와 같이 특성화되었다. 미셀 조제 후 각 샘플은 DD H2O로 희석되어 대략 0.10 mg/mL의 각각의 약물을 생성하였다. 조제된 샘플의 2.5 mL 부피가 20,000 g/mol의 MWCO를 갖는 3 mL의 Slide-A-Lyzer®(서모 사이언티픽사) 투석 카세트 내로 함유되었다. 각 실험에서 4개의 카세트가 사용되었다. 카세트들은 2.0 L의 버퍼 내에 위치되었으며, 버퍼는 약물 및 중합체에 대한 싱크 조건(sink conditions)을 보장하기 위해 매 3시간 마다 교체되었다. 100 ㎕의 샘플이 다양한 샘플링 시간 인터벌에서 각 카세트로부터 추출된 후 100 ㎕의 새로운 버퍼로 교체되었다. 샘플링 시간 인터벌은 0, 0.5, 2, 3, 6, 9, 12 및 24 시간이었다. 각 샘플 내의 약물의 양은 상술한 바와 같이 HPLC에 의해 수량화되었다.
데이터 분석. 5% 신뢰도에서 투키의 다중 비교 테스트(Tukey's Multiple Comparison Test) 또는 t-테스트와 결합된 5% 신뢰도에서 일방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석이 수행되었다. 일상 지수 연관(one phase exponential association)을 사용하는 곡선 적합 분석이 체외 약물 방출 실험에서 약물의 반감기(t1 /2)를 계산하기 위해 사용되었다. 윈도우즈용 프리즘(Prism) 버전 5.00, Graph-Pad Software, 미국 캘리포니아 샌디에고, www.graphpad.com.를 이용하여 2가지 분석이 수행되었다.
약물 함유 PEG -b- PLA 미셀의 조제 및 특성화. PEG-b-PLA를 갖는 PTX, DCTX, ETO 또는 17-AAG에 대한 SDMs가 조제되었다. 미셀 내의 모든 약물의 용해도는 그들의 물속에서의 고유 용해도와 비교하여 완전히 현저하게 높았다(테이블 3-1 및 도 1 참조). PTX 용해도가 0.0003 mg/mL에서 3.50 mg/mL로 증가되었고, DCTX 용해도는 0.0055 mg/mL에서 4.27 mg/mL로 증가되었으며. ETO 용해도는 또한 0.0580 mg/mL에서 3.17 mg/mL로 증가되었고. 17-AAG 용해도는 0.1000 mg/mL에서 4.21 mg/mL로 증가되었다.
테이블 3-1. PEG-b-PLA 미셀에 대한 약물 조합 용해도 결과: SDM 및 MDM의 물리적 특성화(n=3±SD).
항암제 물속에서의 약물 레벨(mg/mL) % 약물 함유량(중량 물/중량 중합체) PEG-b-PLA 미셀 직경(nm ± SD)
파클리탁셀 3.54 ± 0.32 11.8 ± 1.1 38.8 ± 0.6
도세탁셀 4.27 ± 0.44 14.2 ± 1.5 37.3 ± 1.7
에토포시드 3.31 ± 0.15 11.0 ± 0.5 32.6 ± 1.0
17-AAG 3.90 ± 0.28 13.0 ± 0.9 39.3 ± 2.9
파클리탁셀+
17-AAG 		3.92 ± 0.17
3.88 ± 0.29		 26.0 ± 1.4 38.9 ± 1.1
도세탁셀+
17-AAG 		4.62 ± 0.44
4.01 ± 0.08 		28.8 ± 0.2 39.0 ± 0.8
에토포시드+
17-AAG 		3.49 ± 0.24
4.21 ± 0.38 		25.6 ± 1.3 35.3 ± 1.2
에토포시드+
파클리탁셀+
17-AAG 		3.17 ± 0.04
3.50 ± 0.20
3.61 ± 0.33
34.3 ± 1.6
36.5 ± 0.5
(n=3, 평균치±SD)
PTX/17-AAG, DCTX/17-AAG, ETO/17-AAG 및 PTX/ETO/17-AGG의 상이한 약물 조합을 갖는 MDM을 제조하기 위해 PEG-b-PLA가 사용되었다. MDM 미셀 내의 모든 약물에 대한 용해도 향상의 크기는 SDMs와 유사하였다. PEG-b-PLA 미셀 내에서의 다중 약물의 존재는 통계적으로 중요한 방식에 있어서 개별 약물의 겉보기 용해도 향상에 악영향을 미치지 않았다(테이블 3-1 및 도 1). SDM 및 MDM의 약물 대 중합체의 중량/중량(w/w) 퍼센트가 테이블 3-1에 열거되어 있다. SDM, PTX, DCTX, ETO 및 17-AAG w/w 퍼센트는 각각 10.3, 11.5, 9.6 및 11.3%였다. MDM 내에서 모든 약물에 대한 w/w 퍼센트는 통계적으로 SDM과 동일하다. 모든 SDMs 및 MDMs에 대해, 약물 및 중합체의 초기의 양의 대략 100%가 함유된 PEG-b-PLA 미셀로 회복되었다. 약물을 일체화하기 위한 이들 PEG-b-PLA 미셀의 능력은 수용되는 약물의 수가 증가함에 따라 증가되었다. SDM의 경우는 수용 능력 % w/w가 대략 10%였고, 2개 약물 MDM의 경우는 미셀의 수용 능력은 대략 25% w/w로 증가하였으며, 3개 약물 MDM의 경우는 수용 능력이 대략 35% w/w였다.
SDM 및 MDM 의 DLS 측정. DLS에 의해 측정된 미수용된 PEG-b-PLA 미셀, SDMs 및 MDMs의 사이즈가 테이블 3-1에 열거되어 있다. 모든 미셀은 30-40 nm의 사이즈 범위를 갖는 단일모드 분산을 보여주고 있다. 모든 SDMs 및 MDMs의 PDIs는 0.2 이하이고, 이것은 좁은 입자 사이즈 분산을 나타낸다.
SDM 및 MDM 의 탁도 측정. SDM 및 MDM의 물리적 안정성이 탁도 측정에 의해 평가되었다. 시간 경과에 따라 650 nm에서 흡수의 변화에 의해 측정되는 바와 같이 탁도의 증가는 PEG-b-PLA 미셀로부터의 방출에 따른 약물 침전과 상관 관계를 갖는다. 탁도 측정은 HPLC 및 DLS 측정에 의해 추가적으로 지지된다. 17-AAG를 갖는 SDM는 입자 사이즈의 변화 없이 또는 약물 손실 없이 24시간 동안 물리적으로 안정하다(테이블 3-2).
테이블 3-2. 24 시간 후 PEG-b-PLA 미셀로부터의 약물 손실: 역상 HPLC에 의해 평가된 SDM 및 MDM 내에서의 약물의 초기 용해도 및 24 시간에서의 용해도(n=3±SD).
항암제 물속에서의 초기 약물 레벨(mg/mL) 물속 24 시간에서 약물 레벨(mg/mL) 24시간에서 남은 % w/w 약물
파클리탁셀 3.54 ± 0.32 0.57 ± 0.07 16.2 ± 1.0
도세탁셀 4.27 ± 0.44 1.14 ± 0.03 26.8 ± 3.3
에토포시드 3.31 ± 0.15 1.07 ± 0.16 32.3 ± 3.4
17-AAG 3.90 ± 0.28 3.84 ± 0.18 98.6 ± 2.4
파클리탁셀+
17-AAG 		3.92 ± 0.17
3.88 ± 0.29		 3.86 ± 0.15
3.77 ± 0.28		 98.5 ± 0.3
96.9 ± 0.2
도세탁셀+
17-AAG 		4.62 ± 0.44
4.01 ± 0.08 		4.45 ± 0.13
3.83 ± 0.17		 96.3 ± 1.8
95.5 ± 2.7
에토포시드+
17-AAG 		3.49 ± 0.24
4.21 ± 0.38 		3.28 ± 0.19
3.95 ± 0.39		 94.1 ± 1.5
93.9 ± 1.1
에토포시드+
파클리탁셀+
17-AAG 		3.17 ± 0.04
3.50 ± 0.20
3.61 ± 0.33 		3.11 ± 0.06
3.46 ± 0.18
3.52 ± 0.33		 98.2 ± 1.1
98.7 ± 1.3
97.5 ± 1.4
PTX(도 2), DCTX 및 ETO를 갖는 SDM는 대략 6 시간 동안 안정하였다. HPLC 데이터는 24 시간에서 PTX, DCTX 및 ETO의 대략 84%, 73% 및 68%가 각각 침전되었음을 보여준다. SDM 용액은 24 시간 후에 약물 침전을 나타내는 구름같은 흰색 외관을 보여주고 있다. DLS 데이터는 또한 응집 형성(데이터는 미도시)을 보여주고 있다. PTX 및 17-AAG를 갖는 MDMs는 24 시간 기간 동안 PTX만을 갖는 SDM보다 침전에 대해 좀 더 안정하며(도 2), 이것은 대략 97%의 약물 체류를 알려준다(테이블 3-2). DCTX/17-AAG 및 ETO/17-AAG는 안정성에 대해 유사한 결과를 가지며, 미셀 내에서의 약물 체류가 각각 대략 96% 및 94%이다(테이블 3-2). 24 시간에서 이들 MDM 용액은 시각적으로 투명해졌으며 DLS 데이터는 입자 사이즈가 30 내지 40 nm 사이(데이터 미도시)에서 유지되고 있음을 확인하였다. 3개 약물 조합에서, PTX/ETO/17-AAG의 MDM은 24 시간 동안 안정하였다(도 2). 약물 함유량 데이터는 모든 약물이 24 시간에서 초기 함유량 값의 대략 97%로 체류되었음을 나타내고 있다. MDM 용액은 시각적으로 투명해졌으며, 입자 사이즈는 24 시간에서 크게 변화하지 않았다(데이터 미도시).
SDM 및 MDM 의 1 H NMR 분광법. PEG-b-PLA 미셀 내로의 약물의 일체화를 확인하기 위해 1H NMR 측정이 사용되었다. 개별 약물 및 약물 조합에 대한 DMSO-d6에서의 1H NMR 스펙트럼은 약물을 나타내는 모든 현저한 공명 피크 및 PLA 및 PEG 블록의 공명 피크를 보여주고 있다. 이와는 대조적으로, D2O에서는 PEG 공명 피크만이 검출되었지만, PLA 및 약물의 공명 피크는 미셀의 코어 내에 PLA 및 약물 분자의 제한된 이동도로 인해 존재하지 않았는데, 이는 약물이 PEG-b-PLA 미셀 내로 일체화되었음을 나타낸다.
PEG-b-PLA는 PEG기(PEG group)의 에틸렌 옥사이드로부터 3.4-3.6 ppm에서의 양성자 공명 및 젖산기(lactic acid group)에 대해 5.0-5.1 ppm에서의 양성자 공명에 의해 식별되었다. 17-AAG은 메틸기에 대한 0.7 ppm에서의 양성자 공명에 의해 식별되었다. PTX는 C16 및 C17에서 메틸기에 대한 1.0 ppm에서의 양성자 공명에 의해 식별되었다. 마지막으로, ETO는 벤젠고리의 방향족 양성자(aromatic protons)에 대한 6 및 7 ppm 사이의 양성자 공명에 의해 식별되었다.
SDM 및 MDM 로부터 약물의 체외 방출 프로파일. 17-AAG, ETO를 함유하는 SDM으로부터의 약물 방출 데이터는 6 시간 경과 후 PEG-b-PLA 미셀로부터 약물의 90% 이상이 방출되었음을 보여주고 있다(도 3a). 9 시간 경과 후에는 SDM으로부터 DCTX의 90% 이상이 방출되었음을 보여주고 있다(도 3a). 투석 실험이 이루어지는 동안 SDM으로부터 PTX의 신속한 침전은 임의의 의미있는 데이터의 획득을 불가능하게 하였다. PTX 및 17-AAG를 함유하는 MDM은 24 시간 경과 후 PTX의 72% 이상이 방출되고 9 시간 경과 후 17-AAG의 90% 이상이 방출되었음을 보여주고 있다(도 3b). ETO 및 17-AAG를 함유한 MDM은 각각 6 시간 및 9 시간 경과 후 90% 이상의 약물 방출을 보여주고 있다(도 3c). DCTX 및 17-AAG를 함유한 MDM은 각각 12 시간 및 9 시간 경과 후 90% 이상의 방출을 보여주고 있다(도 3d).
PTX/ETO/17-AAG의 3개 약물 조합을 함유한 MDM은 24 시간 경과 후 대략 80%의 PTX 방출, 및 각각 6 시간 및 9 시간 경과 후 ETO 및 17-AAG에 대해 90% 이상의 방출을 보여주고 있다(도 3e). 체외 약물 방출 데이터는 일상 지수 연관(GraphPad Prism)을 사용하여 적합화된 곡선이다. 곡선 적합화로부터 얻어진 1차 속도 상수(first-order rate constant)가 PEG-b-PLA 미셀로부터의 약물 방출의 반감기(t1 /2)를 계산하는데 사용되었다. SDM 및 MDM에 대한 데이터가 모든 약물에 대한 적합 양호성 및 로그로 표시된 수중유적(oil-in water) 분배 상수값이 테이블 3-3에 제공된다. 테이블 3-3의 데이터는 PTX를 갖는 SDM을 제외한 모든 SDM 및 MDM에 대한 1차 속도 상수 및 반감기(t1 /2)의 값을 열거하고 있다. 이것은 역시 약물 방출 테스트가 이루어지는 동안 PTX가 신속하게 침전된 것에 기인한 것으로, 임의의 의미있는 데이터의 획득을 불가능하게 하였다.
테이블 3-3. PEG-B-PLA 미셀(단일 작용제, 2개 또는 3개 약물 조합)으로부터 체외 약물 방출에 대한 파라메터: SDM 및 MDM으로부터 체외 약물 방출의 곡선 적합화(n=4, 평균치±SD).
항암제 1차 속도 상수(시간-1) t1 /2(시간) 적합 양호성(r2) log P (1)
파클리탁셀 - - - 3.0
도세탁셀 0.379 1.83 0.993 2.4
17-AAG 0.525 1.32 0.999 1.3
에토포시드 0.636 1.09 0.999 1.0
파클리탁셀
17-AAG 		0.138
0.398 		5.01
1.74		 0.938
0.996		 3.0
1.3
도세탁셀
17-AAG 		0.288
0.375 		2.41
1.85		 0.996
0.996		 2.4
1.3
17-AAG
에토포시드 		0.414
0.657 		1.67
1.06		 0.997
0.997		 1.3
1.0
파클리탁셀
17-AAG
에토포시드		 0.136
0.386
0.785 		5.10
1.80
0.88		 0.973
0.995
0.992		 3.0
1.3
1.0
1 XLog P 버전 2.0에서 계산됨(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). (Graphic Prism 버전 4.03으로 적합화된 곡선)
논의. PEG-b-PLA 미셀은 단독 또는 다른 약물과 조합된 모든 화학요법 치료제를 임상 관련 레벨에서 성공적으로 용해할 수 있었다. 몇 가지만 거명하자면 CrEL, 에탄올, DMSO 및 트윈 80(Tween 80)과 같은 사용된 공통 제제 담체와 연관된 독성이 주어진 상태에서, 이러한 제제는 좀 더 안전하고 독성이 덜한 대체물을 제공한다. 또한, 동일 미셀 내의 다중 약물의 존재는 개별 약물에 의해 달성되는 용해도 향상에 악영향을 주지 않았다. 이것은 PEG-b-PLA 미셀의 형성에 있어서 약물의 % w/w 기여를 증가시킴으로써 알 수 있는 바와 같이 PEG-b-PLA 미셀의 높은 함유 능력에 기인한다. 이것은 용해도 및 안정성 문제로 인하여 이전에는 시도된 적이 없었던, 하나의 운반체 시스템 내에서 조합 화학요법을 가능하게 한다.
초기 용해도 연구는 PEG-b-PLA 미셀이 다중 약물을 용해하는 능력을 갖는다는 것을 보여주고 있는데, 이것은 다중 약물 요법을 사용하면서도 현재까지 알려져 있는 부수적인 임상적인 문제 없이, 잠재적으로 상승효과를 갖는 화학요법 조합의 동반 전달을 허용한다. 이들 제제의 안정성은 또한 HPLC 및 DLS와 결합된 광학 밀도 측정(optical density measurements)을 이용하여 평가되었다. PEG-b-PLA 미셀의 안정성 평가는 제제가 취급 및 투여에 대해 충분히 오랫동안 안정한지의 여부를 결정하는데 중요하다. 데이터가 보여주는 바와 같이, SDMs은 적어도 6 시간 동안 안정하며, 17-AAG 미셀은 24 시간 동안 안정하다. 2개의 약물 MDM 조합은 더 큰 안정성을 보여주었다. 이들 미셀 내에서의 17-AAG의 존재는 제제를 안정화하는데 도움을 주며, SDM에서 보여진 바와 같은 동일한 용해도 레벨에서 화학요법 치료제의 더 큰 안정성을 부여한다.
모든 2개 약물 MDM 조합은 24 시간에서 약물 함유량의 94% 이상을 유지하였다. 3개 약물 조합 MDM은 수용된 약물의 97% 이상이 유지된 상태로 24 시간에서 용해도의 최상 등급을 보여주고 있다. 24 시간에서 안정한 모든 PEG-b-PLA 미셀에 대해, DLS에 의해 결정되는 바와 같이 사이즈의 상당한 이동(shift)은 없었다. 안정성 데이터는 극히 좋은 전망을 보여주는 것으로 이들 MDM 제제가 임상 관련 시간 프레임 내에서 화학요법 치료제의 임상 관련 투여량을 전달할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
미셀의 제제 및 미셀 코어 내에서의 약물의 국소화가 1H NMR 분광법을 이용하여 확인되었다. 1H NMR 스펙트럼은 DMSO-d6에서 모든 약물 및 PEG-b-PLA에 대한 양성자 공명을 명확하게 보여주고 있다.이와 대조적으로,1H NMR 스펙트럼은 PLA 블록 및 약물에 대한 양성자 공명을 억제하였으며, PEG 블록 피크만을 명확히 볼 수 있었다. 미셀 코어 내의 약물의 존재는 약물 분자의 이동도를 제한하여 결과적으로 약물 양성자 공명의 손실을 가져온다.
개별 약물 및 PEG-b-PLA 미셀에 대한 조합의 화학요법의 체내 방출 반응속도의 특성은 싱크 조건 하에서 미셀로부터 약물의 안정성 및 방출 패턴을 평가하는데 중요하다. PEG-b-PLA 미셀로부터 17-AAG의 체외 방출은 상당히 신속하며(몇 시간의 규모로), 이것은 생쥐에 있어서 17-AAG의 PK에 대한 PEG-b-PLA 미셀의 영향이 낮다는 것과 일치한다. PEG-b-PLA 미셀로부터 DCTX, ETO, 또는 17-AAG의 체외 방출은 몇 시간 지속되었는데, 반감기(t1 /2)는 ETO에 대해서는 1.09 시간, 17-AAG에 대해서는 1.32 시간, 및 DCTX에 대해서는 1.83 시간의 범위를 갖는데(도 3), 이것은 항암제의 수중유적(oil/water) 분배 상수와 잘 대응된다(테이블 3-3). PEG-b-PLA 미셀로부터 방출이 이루어지는 동안 PTX가 침전되어, 반감기(t1 /2)의 측정을 방해한다.
2개 약물 조합에 대해, 17-AAG의 방출은 PTX 및 DCTX보다는 더 빠르고, ETO보다는 더 느리며, 이것은 가장 작은 log P를 갖는다(도 3 및 테이블 3-3). 3개 약물 조합에 대해, PEG-b-PLA 미셀에 대한 ETO, 17-AAG, 및 PTX의 반감기(t1 /2) 값은 각각 0.88, 1.80, 및 5.10 시간으로(도 3e), 이들 항암제의 수중유적(oil/water) 분배 상수와 잘 대응된다.
모든 2개 약물 및 이들 3개 조합에서 보여지는 놀라운 현상은 PEG-b-PLA 미셀을 안정화시키는 17-AAG의 능력이다. 이러한 현상은 PTX 자체는 SDM 제제 내에서 쉽게 침전되지만, 2개 약물 및 3개 약물 조합 내의 PTX의 안정성에 의해 완전히 입증된다. 적어도 24 시간 동안 PEG-b-PLA 미셀 내의 PTX 및 기타 다른 소수성 약물의 안정성을 유지하는 17-AAG의 능력의 새로운 발견은 이들 제제가 조합 화학요법 운반체에 있어서 정맥(IV) 또는 주입에 의해 인간에게 투여하기에 적합하도록 허용할 것이다.
체외 방출 반응속도의 또 다른 측면은 미셀로부터 항암제들의 방출 간의 변화가 분산 제어적이며 또한 PEG-b-PLA 미셀의 손상에 기인하지 않는 것을 나타내는 것으로, 여기서 약물 방출 반응속도는 2개 또는 3개 약물 조합에 대해 유사할 것으로 예상된다. 그러나, PEG-b-PLA 미셀의 반감기(t1 /2) 값은 약물 방출이 상당히 신속하며, 혈청단백질, 구체적으로는 α(알파)- 및 β(베타)-글로뷸린의 존재 하에서 PEG-b-PLA 미셀의 더 낮은 안정성으로 인하여 생체 내에서와 비슷하다는 것을 나타낸다.
한 쌍의 형광프로브인 DiIC18 및 DiOC18로 충전된 PEG-b-PLA 미셀은 정맥 주사(IV injection) 후 15분 내에 형광 공명 에너지 전이를 손실하는데, 이것은 생체 내에서 DiIC18 및 DiOC18의 신속한 방출을 나타낸다. 밝혀지게 되는 바와 같이, α(알파)- 및 β(베타)-글로뷸린은 잠재적으로 PEG-b-PLA 미셀의 붕괴로 인하여 또한 생체 내에서도 PEG-b-PLA 미셀에 대한 DiIC18 및 DiOC18의 형광 에너지 전이의 신속한 손실을 유도한다. 이러한 결과는 비록 희석 및 혈액 내의 다른 성분의 효과가 또한 고려되어야 하지만, PEG-b-PLA 미셀이 α(알파)- 및 β(베타)-글로뷸린에 의해 야기된 일체성의 손실로 인하여 생체 내에서 1 시간 내에 화학요법 및 17-AAG의 쌍을 방출하는 것을 보여준다. 이들 조합에 대한 세포 독성 농도를 결정하기 위해 이들 결과의 특성이 암세포주 내에서 테스트된다. 이것은 임의의 부가적인 및/또는 상승효과적인 효과가 이들 조합에서 발견될 수 있는지의 여부에 대한 추가적인 결정을 허용한다. 생쥐 종양 모델은 PEG-b-PLA 미셀로부터 조합 약물의 동시 방출이 DMSO/지질 및 CrEL과 비교하여 주어진 더 높은 최대 내약성 투여량에서 PTX 및 17-AAG에 대한 선형(linear) PKs 및 항종양 효과를 제공하는지의 여부를 결정한다.
요약하면, 임상 및 임상 전 상황에서의 현재 화학요법 치료제는 심각한 제제 관련 부작용을 일으킬 수 있는 거친 부형제를 갖는 투여량을 필요로 한다. 안정성에 대한 우려는 조합 화학요법을 동시에 투여하는 것에 대한 문제를 발생시킨다. 본 명세서에서 기술되는 PEG-PLA를 사용하는 제제는 현재의 시판 중인 제제에 대한 새로운 대안을 제공한다. 이러한 실험예는 24 시간의 안정성을 갖는, 임상 관련 농도에서 하나의 운반체 시스템 내에 3개 화학요법 치료제까지의 성공적인 조합을 보여주고 있다. 또 다른 중요한 발견은 운반체 시스템 내에서 상이한 소수성 약물의 안정성을 24 시간 동안 유지하는 17-AAG의 능력이다.
실험예 4. 나조 -조합 약물 전달용 고분자 미셀
PEG-b-PLA 미셀은 간단하고, 안전하며, 상승효과적인 조합 암 치료를 제공하기 위해, 2개 이상의 난수용성 항암제의 전달을 위한 플랫폼 나노기술로서의 역할을 수행할 수 있다. 고분자 미셀은, 특히 예를 들어 파클리탁셀(Taxol®)과 같은 난수용성 화학요법에 사용될 때 독성을 끼치는 공통적으로 사용된 표면활성제인 크레모포 이엘(Cremophor EL: CrEL)에 비해, 입증된 안정성 및 약물 용해도 면에서의 진전으로 인하여 관심을 얻은 나노 크기의 암 약물 전달용 담체이다. CrEL-유발성 과민반응은 스테로이드의 전투약(pre-medication)에도 불구하고 약물 치료의 중단 및 사망의 원인이 된다. CrEL 미셀은 약물 봉입(drug entrapment)에 기인한 난수용성 항암제에 대한 약동학적(PK) 상호작용의 원인이 되며, 이것은 항암제의 비선형성 PK 및 감소된 종양 축적의 위험성을 증가시킨다.
PEG-b-PLA는 파클리탁셀(Genexol®)의 수용해도를 1.0 mg/L에서 5.0 mg/mL까지 증가시키는 나노 크기 미셀 내로 응집된다. PEG-b-PLA는 CrEL보다 휠씬 더 낮은 독성을 가지며, 파클리탁셀의 최대 내약성 투여량(MTD)을 증가시키고, 증가된 투여량 및 명백한 선형 PK 프로파일에 기인하여 생쥐 종양 모델에서 종양 국소화를 증가시킨다. 그 결과, PEG-b-PLA 미셀은 제 1상/제 2상 임상 실험에서 파클리탁셀의 항종양 효과를 향상시킨다. 이러한 약물 전달 나노기술은 개발, 규모 확대, 및 안전성 제한과 직면한 많은 장애를 겪어왔다.
PEG-b-PLA 미셀이 화학요법 및 신호 전달 억제제의 조합을 포함하여 상승효과적인 항종양 효과를 제공하기 위해, 조합 암 치료에 대한 새롭고 간단한 접근 방법을 제공하는 다중 항암제를 흡수하여 용해할 수 있다는 사실이 발견되었다. 이러한 실험예는 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-알릴아미노-17AAG의 새로운 3개 약물 항암 조합을 제공한다. 임상 전 데이터는 파클리탁셀이 라파마이신 또는 17-AAG를 갖는 생쥐 종양 모델에서 상승효과적인 항종양 활성에 영향을 미치는 것을 보여준다. 라파마이신 및 17-AAG는 모두 상이한 작용 메커니즘을 통해 상이한 표적에 작용하는 동안, 암 생존 경로 상에 작용하는, 잠재적인 혈관신생 억제제이다. 원형 열충격단백질90 (Hsp90) 억제제인 17-AAG는, 피드백 메커니즘에 의해 라파마이신(mTOR)의 표유류 표적의 억제에 의해서 활성화되는 카나아제를 조절하여(AKT, Raf), 제 1 mTOR 억제제인 라파마이신의 활성을 향상시키는 기초를 제공한다는 점이 주목할만하다.
이러한 실험예에서, PEG-b-PLA 미셀은 나노조합으로서의 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG를 용해하여, CrEL 및 용해보조제(cosolvent)에 대한 안전성, 약물 침전에 대한 안정성, 생산 및 규모 확대의 용이성, 및 PK 상호작용에 대한 낮은 전망을 제공한다. 이러한 특징들 각각은 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 3개 약물 조합에 대한 임상 실험으로의 진입을 촉진한다.
실험적 방법. 파클리탁셀, 라파마이신, 17-AAG(2.0 mg), 및 PEG-b-PLA(15 mg)이 둥근바닥 플라스크 내에서 아세토니트릴(ACN)(0.50 mL)에 용해되었다. PEG-b-PLA의 PEG 및 PLA의 Mn은 각각 4,200 g/mol 및 1,900 g/mol이었다(APC사, 영국). ACN은 60℃ 및 감압 하에서 가열되어 제거되었다. 항암제를 함유한 최종 건조 중합체 필름이 60℃에서 물(0.50 mL)을 첨가하고 서서히 교반하여 용해되었다. 파클리탁셀, 라파마이신, 17-AAG 또는 이들의 조합으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀을 함유하는 수용액이 원심분리되고, 필터링되어(0.45㎛), 역상 HPLC 및 동적 광산란(DLS) 사이즈 분석(제타사이저, 맬버른, 영국: Zetasizer, Malvern, UK)이 행해졌다. PEG-b-PLA 미셀 및 관련 2개 또는 3개 약물 조합에 대한 체외 약물 방출 실험이 상술한 실험예 3에 기술되어 있다.
결과 및 논의. 예를 들어 17-AAG와 같은 임상 전 개발 중인 항암제 및 예를 들어 파클리탁셀, 라파마이신과 같은 임상 실험 중인 많은 항암제는 난수용성으로 약물 용해도 및 정맥(IV) 주입에 대한 안전한 담체를 필요로 한다. 그러나, 정맥(IV) 약물 주입용 담체는 종종 예를 들어 CrEL과 같이 유독하며, 최근 임상 실험에서 예를 들어 Taxol® 내의 파클리탁셀에 대한 CrEL 및 17-AAG에 대한 DMSO/지질과 같이 약물 용해도에 대한 2개 이상의 담체에 의해 야기되는 침전 및 부가적인/상승효과적인 독성의 위험성에 기인하여 다중 난수용성 항암제를 포함한 치료에 있어서의 진전을 방해한다.
PEG-b-PLA가 CrEL 또는 예를 들어 DMSO/지질과 같은 용해보조제 없이 mg/mL 레벨에서 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG를 용해하는 미셀 내로 응집된다(테이블 4-1). 항암제는 암 치료용 정맥(IV) 주입용 수성 담체 내에서 mg/mL 레벨을 필요로 한다. PEG-b-PLA 미셀에 대한 퍼센트 약물 함유량(중량/중량)(wt/wt)은 입자 사이즈의 주요한 변화 없이 1개 약물에서 2개 내지 3개 약물 조합으로 갈수록 증가하는데, 이러한 약물 용해도 실험에서 PEG-b-PLA의 일정 레벨을 주목하여야 한다.
테이블 4-1. PEG-b-PLA 미셀에 의한 1개, 2개, 및 3개 약물 용해도(n=3, 평균치±SD).
항암제 물속에서의 약물 레벨(mg/mL) % 약물 함유량(중량 약물/중량 중합체) PEG-b-PLA 미셀 직경(nm±SD)
파클리탁셀 3.54 ± 0.32 10.3 ± 0.9 38.8 ± 0.6
라파마이신 1.84 ± 0.26 6.6 ± 1.3 36.9 ± 1.3
17-AAG 3.90 ± 0.28 11.3 ± 0.3 39.3 ± 2.9
파클리탁셀+
라파마이신		 3.49 ± 0.14
0.76 ± 0.31		 22.6 ± 0.9 43.0 ± 2.4
파클리탁셀+
17-AAG 		3.92 ± 0.17
3.88 ± 0.29 		25.9 ± 1.6 38.9 ± 1.1
라파마이신+
17-AAG 		1.83 ± 0.25
4.02 ± 0.14 		22.6 ± 1.6 39.4 ± 1.9
파클리탁셀+
라파마이신+
17-AAG 		3.36 ± 0.46
2.05 ± 0.08
3.86 ± 0.46
40.2 ± 1.2
43.8 ± 1.3
2개 약물 조합(파클리탁셀/라파마이신, 파클리탁셀/17-AAG, 라파마이신/17-AAG)으로서의 PEG-b-PLA 미셀은 대략 20%에서의 퍼센트 약물 함유량을 갖는다. 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 3개 약물 조합으로서의 PEG-b-PLA 미셀은 PEG-b-PLA 미셀이 없는 경우(38 nm)에 비해 대략 44 nm로 사이즈가 약간 증가한 상태에서, 40%의 과도하게 높은 퍼센트 약물 함유량을 갖는다.
약물 침전에 대한 안정성과 관련하여, PEG-b-PLA 미셀에 대한 광산란 연구는 2개 및 3개 약물 조합이 PEG-b-PLA 미셀의 코어 내에서 약물 상호작용으로 인하여 파클리탁셀이 단독으로 사용되는 경우보다 24 시간에 걸쳐서 물 속에서 좀 더 안정적이라는 것을 보여주고 있다.
PEG-b-PLA 미셀로부터 1개, 2개, 및 3개 약물의 체외 방출에 대한 결과가 테이블 4-2에 수집되었다. PEG-b-PLA 미셀로부터 항암제의 방출은 대략 하루에 걸쳐 발생하며, 항암제의 오일/수분(수중유적) 분배 상수의 로그값과 상관 관계를 갖는 것으로 보인다(log P). PEG-b-PLA 미셀에 대한 2개 및 3개 약물 조합의 약물 방출은 단일 항암제 방출의 반응속도를 잘 보여준다(테이블 4-2 및 도 4). 그러나, PEG-b-PLA 미셀 내에 공통 함유된 라파마이신은 특히 3개 약물 조합에서 파클리탁셀 및 17-AAG의 방출을 느리게 한다. 파클리탁셀 및 17-AAG의 반감기(t1 /2)는 각각 10.1 및 2.86 시간이다. 이 경우, 라파마이신은 18.6 시간의 매우 긴 반감기(t1 /2)를 갖는다.
테이블 4-2. PEG-b-PLA 미셀로부터의 1개, 2개, 및 3개 약물 방출(n=4, 평균치±SD).
항암제 1차 속도 상수(시간-1) t1 /2(시간) log P
파클리탁셀 -* -* 3.0
라파마이신 0.100 6.93 5.8
17-AAG 0.525 1.32 1.3
파클리탁셀+
라파마이신 		0.116
0.070 		5.98
10.04		 3.0
5.8
파클리탁셀+
17-AAG 		0.138
0.398 		5.01
1.74		 3.0
1.3
라파마이신+
17-AAG		 0.068
0.330 		9.99
2.10		 5.8
1.3
파클리탁셀+
라파마이신+
17-AAG		 0.068
0.037
0.242 		10.13
18.59
2.86		 3.0
5.8
1.3
* 1차 속도 상수 및 t1 /2의 계산을 방해하는, 약물 방출이 이루어지는 동안 투석용 백 내의 파클리탁셀 침전.
PEG-b-PLA 미셀용 항암제들 간에 그리고 관련된 2개 및 3개 약물 조합들 간에 약물 방출 프로파일의 차이가 체외에서 나타나지만, 이들 차이는 PEG-b-PLA 미셀의 완전성에 대한 혈청단백질, 특히 α(알파)- 및 β(베타)-글로뷸린의 불안정화 효과로 인하여 생체 내에서 낮아질 것이다. 그 결과, PEG-b-PLA 미셀에 대한 생체 내 약물 방출은 2개 및 3개 약물 조합에 대해서는 신속하여, 미셀 내의 약물 봉입에 기인하여 약물 PK 상호작용에 대한 위험성을 최소화하는데, 이는 CrEL 및 수용성 항암제에 대해 주목된 바 있다.
요약하면, PEG-b-PLA 미셀은 CrEL 또는 DMSO/지질과 같은 용해보조제의 요구조건 없이 정맥(IV) 주입에 대한 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 조합을 효과적으로 용해한다. 이 실험예에서, 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 상승효과적인 2개 및 3개 약물 조합은 PEG-b-PLA 미셀을 통해 용이하게 얻어진다. 전례가 없는 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 3개 약물 조합은 암 치료에 있어서 현재까지의 임상학적 문제점에 대한 유용한 해결책을 제공한다.
실험예 5. 약물 전달의 나노-조합용 고분자 미셀의 추가 데이터
PEG-b-PLA 약물 함유 미셀은 임상 관련 투여량에서 난수용성 약물인 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG를 함유하여 전달할 수 있으며, 이는 테이블 5-1 내지 5-5의 데이터 및 도 3 및 도 5 내지 9에 의해 나타나 있다.
소정의 소수성 약물과 결합된 PEG-b-PLA는 상당한 용해 특성 및 안정 특성을 갖는다. 도 5는 n=3, 평균치를 갖는, 물속에서의 PEG-b-PLA 미셀(4.2K:1.9K)에 의한 파클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신, 17-AAG, 및 2개 또는 3개 조합(화학요법 치료제+17-AAG)의 용해도로부터의 데이터를 예시한다. 이들 미셀 제제에 대한 추가 데이터가 테이블 5-1, 5-2, 5-3, 및 5-4에 나타나 있다.
테이블 5-1. PEG-PLA 미셀에 대한 약물 용해도 결과(n=3, 평균치±SD).
항암제 물속에서의 약물 레벨(mg/mL) % 약물 함유량(중량 약물/중량 중합체) PEG-b-PLA 미셀 직경(nm±SD)
라파마이신 1.84±0.26 6.6±1.3 36.9±1.3
파클리탁셀 3.54±0.32 10.3±0.9 38.8±0.6
도세탁셀 4.27±0.44 11.5±0.5 37.3±1.7
17-AAG 3.90±0.28 11.3±0.3 39.3±2.9
파클리탁셀+
17-AAG 		3.92±0.17
3.88±0.29 		25.9±1.6 38.9±1.1
도세탁셀+
17-AAG 		4.62±0.44
4.01±0.08 		25.8±2.2 39.0±0.8
테이블 5-2. PEG-b-PLA 미셀에 대한 조합 약물 용해도 결과(n=3, 평균치±SD).
항암제 물속에서의 약물 레벨(mg/mL) % 약물 함유량(중량 약물/중량 중합체) PEG-b-PLA 미셀 직경(nm±SD)
라파마이신
파클리탁셀		 1.06±0.07
3.59±0.09		 13.3±0.3 41.0±1.5
라파마이신
도세탁셀		 2.43±0.11
3.01±0.26		 16.6±1.0 38.1±0.9
라파마이신
17-AAG		 1.83±0.25
4.02±0.14 		22.6±1.6 39.4±1.9
라파마이신
파클리탁셀
17-AAG		 2.09±0.08
3.36±0.46
3.86±0.46
40.4±1.2
43.8±1.3
라파마이신
도세탁셀
17-AAG 		2.34±0.19
2.71±0.07
4.06±0.17
33.3±1.3
42.5±1.3
테이블 5-3. 24 시간 후 PEG-b-PLA 미셀로부터의 약물 손실(역상-HPLC).
항암제 물속에서의 초기 약물 레벨(mg/mL) 물속 24 시간에서 약물 레벨(mg/mL) 24시간에서 남은 % w/w 약물
라파마이신 1.84±0.26 1.68±0.23 91.5±0.2
파클리탁셀 3.54±0.32 0.57±0.07 16.2±1.0
도세탁셀 4.27±0.44 1.14±0.03 26.8±3.3
17-AAG 3.90±0.28 3.84±0.18 98.6±2.4
파클리탁셀
17-AAG 		3.92±0.17
3.88±0.29		 3.86±0.15
3.77±0.28		 98.5±0.3
96.9±0.2
도세탁셀
17-AAG 		4.62±0.44
4.01±0.08 		4.45±0.13
3.83±0.17		 96.3±1.8
95.5±2.7
테이블 5-4. 24 시간 후 PEG-b-PLA 미셀로부터의 약물 손실(역상-HPLC).
항암제 물속에서의 초기 약물 레벨(mg/mL) 물속 24 시간에서 약물 레벨(mg/mL) 24시간에서 남은 % w/w 약물
라파마이신
파클리탁셀		 1.06±0.07
3.59±0.09		 1.02±0.06
3.44±0.04		 96.0±0.4
95.9±2.0
라파마이신
도세탁셀		 2.43±0.11
3.01±0.26		 2.28±0.10
2.83±0.24		 93.8±0.8
94.0±0.3
라파마이신
17-AAG		 1.83±0.25
4.02±0.14		 1.71±0.29
3.77±0.17		 93.0±3.9
93.8±4.1
라파마이신
파클리탁셀
17-AAG 		2.09±0.11
3.36±0.46
3.86±0.36		 2.05±0.08
3.29±0.47
3.74±0.44		 97.8±2.1
97.9±2.3
96.7±2.5
라파마이신
도세탁셀
17-AAG 		2.34±0.19
2.71±0.07
4.06±0.17		 2.32±0.17
2.67±0.03
4.03±0.25		 99.5±2.3
98.6±2.6
99.3±2.2
PEG-b-PLA 미셀(단일 작용제, 2개 또는 3개 약물 조합)으로부터의 체외 약물 방출에 대한 파라메터 및 데이터가 테이블 5-5 및 도 3 및 도 6 내지 도 9에 나타나 있다. 도 6은 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃); (n=4, 평균치±SD)로부터 파클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신 또는 17-AAG로부터 얻어진 데이터를 예시한다. 파클리탁셀의 낮은 방출은 이들 미셀을 조제하는데 사용된, 조제 절차 C에 사용된 투석용 백으로부터 붕괴하는 약물의 결과이다.
도 3b는 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, Mean±SD)로부터 파클리탁셀 및 17-AAG의 체외 조합 방출로부터 얻어진 데이터를 예시한다. 도 8은 PEG-b-PLA 미셀(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃; n=4, 평균치±SD)로부터 파클리탁셀, 도세탁셀, 및 17-AAG의 체외 조합 방출로부터 얻어진 데이터를 예시한다. 도 9는 PEG-b-PLA 미셀(단일 작용제, 2개 또는 3개 약물 조합)으로부터 (A) 체외 라파마이신 방출; 및 (B) 체외 17-AAG 방출에 대한 반감기 파라메터를 예시한다. X log P 버전 2.0 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/); Prism 버전4.03으로 곡선 적합화됨.
테이블 5-5. PEG-b-PLA 미셀로부터의 체외 약물 방출에 대한 파라메터(단일작용제, 2개 또는 3개 조합).
항암제 1차 속도 상수(시간-1) t1 /2(시간) 적합 양호성(r2) log P (1)
파클리탁셀 - - - 3.0
17-AAG 0.525 1.32 0.999 1.3
라파마이신 0.081 8.52 0.990 5.8
파클리탁셀
17-AAG 		0.138
0.398 		5.01
1.74		 0.938
0.996		 3.0
1.3
라파마이신
파클리탁셀 		0.069
0.116 		10.05
6.00		 0.991
0.993		 5.8
3.0
라파마이신
도세탁셀 		0.085
0.317 		8.12
2.19		 0.993
0.999		 5.8
2.4
라파마이신
17-AAG		 0.079
0.385 		8.73
1.80		 0.983
0.999		 5.8
1.3
라파마이신
파클리탁셀
17-AAG		 0.050
0.075
0.275		 13.93
9.20
2.52		 0.979
0.984
0.996		 5.8
3.0
1.3
라파마이신
도세탁셀
17-AAG		 0.069
0.306
0.363		 10.00
2.26
1.91		 0.982
0.993
0.995		 5.8
2.4
1.3
1 XLog P 버전 2.0에서 계산됨(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/); Graphic Prism 버전4.03으로 곡선 적합화됨.
결론. PEG-b-PLA 미셀은 물속에서 mg/mL 수준으로 파클리탁셀, 도세탁셀, 17-AAG, 또는 라파마이신을 용해한다. PEG-b-PLA 미셀은 2개 약물 조합(파클리탁셀/17-AAG, 파클리탁셀/라파마이신, 또는 17-AAG/라파마이신)을 용해하여, PEG-b-PLA 미셀 내에서 각각이 단독으로 사용되는 단일 항암제에 대해 얻어지는 수준에 도달한다. PEG-b-PLA 미셀은 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 3개 약물 조합을 용해하여, PEG-b-PLA 미셀 내에서 각각이 단독으로 사용되는 단일 항암제에 대해 얻어지는 수준에 도달한다. 1개 약물 또는 2개 약물 조합 또는 3개 약물 조합으로서 m PEG-b-PLA 미셀로부터 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신에 대한 반감기(t1 /2) 값은 수 시간 규모로, log P 값으로 증가한다.
실험예 6. 다중 약물 전달용 고분자 미셀
고분자 미셀이 특히 암 치료 분야에서 입증된 안전성 및 약물 용해도의 신속한 진행으로 인해 약물 전달 분야에서 관심을 끌고 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(젖산)(PEG-b-PLA) 미셀은 미국에서 임상 실험의 제 2상에 진입하였으며, 파클리탁셀(Genexol-PM®)에 대한 담체로 한국에서 승인을 받았는데, 이는 Cremophor EL(Taxol®)에 비해 이러한 난수용성 암 약물에 대한 더욱 안전한 담체를 제공한다. Cremophor EL은 전투약(pre-medication)에도 불구하고 급성 과민 반응을 포함한 심각한 독성을 발생시킨다(스페어붐 등(Sparreboom et al.), J. Clin. Oncol. 2005, 23, 7765). 제 1상의 임상 실험에서 Genexol-PM®의 최대 내약성 투여량(MTD)은 300 mg/m2이었고, 반면에 Taxol®에 대한 MTD는 단지 135 내지 200 mg/m2이다(김 등(Kim et al.), Clin. Cancer Res. 2004, 10, 3708).
17-AAG는 많은 수가 암 유발형 및 생존 경로 내에 포함되는 "클라이언트 단백질"에 대한 샤프론(chaperone)으로서 작용하는 열충격단백질 90(Hsp90)을 억제한다(바너지(Banerji), Clin. Cancer Res. 2009, 15, 9). 세포 성장, 증식, 생존 및 혈관신생에서 주요 역할을 하는 세린-트레오닌 키나아제인 라파마이신은 mTOR을 억제한다(로피콜로 등(Lopiccolo et al.), Drug Resist. 업데이트 2008, 11, 32). 파클리탁셀+17-AAG 및 파클리탁셀+라파마이신의 약수용성 유사물질(CCI-779)의 2개 약물 조합은 임상 실험 중에 있지만, 약물 용해를 위한 담체로 Cremophor EL, DMSO/지질 및/또는 에탄올을 필요로 한다.
실험예는 PEG-b-PLA 미셀이 수용액 내에서 다중 암 약물을 캡슐화하여 용해할 수 있다는 것을 입증한다. PEG-b-PLA 미셀은 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 라파마이신, 및 17-알릴아미노-17-데메톡시젤다나마이신(17-AAG)을 효과적으로 용해하는 것을 보여주고 있다. 이하의 개시내용은 다중 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀의 조제, 세포 독성 실험, 조합 지수 분석, 및 그 결과의 논의에 대한 방법론을 기술한다.
시약. PEG-b-PLA(PEG 및 PLA의 Mn이 각각 4,200 및 1,900 g/mol임; PDI=1.05)가 어드벤스드 폴리머 머티어리얼사(몬트리올, 캐나다)로부터 구입되었다. 파클리탁셀은 LKT 라보라토리사(세인트폴, 미네소타주)로부터 구입되었다. 17-AAG는 LC 연구소(워번, 메사추세츠주)로부터 구입되었다. 모든 다른 시약들은 피셔 사이언티픽사(페어론, 뉴저지주)로부터 얻어졌다.
다중 약물이 수용된 PEG -b- PLA 미셀의 조제. 파클리탁셀(2.0 mg), 17-AAG(2.0 mg), 라파마이신(1.5 mg) 및 PEG-b-PLA(15 mg)이 둥근바닥 플라스크 내에서 아세토니트릴(0.50 mL)에 용해되었으며, 아세토니트릴은 로터리 증발기를 통해 감압하 60℃에서 가열에 의해 제거되었다. 약물을 함유한 최종 건조 PEG-b-PLA 필름이 60℃에서 물(0.50 mL)을 첨가하고 서서히 교반하여 용해되었다. 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀의 수용액이 원심분리되고, 필터링되어(0.45㎛), 역상 HPLC(시마츠, 일본) 및 동적 광산란 분석(제타사이저, 맬버른, 영국)이 행해졌다. 도 12 참조.
체외 세포 독성 실험. MCF-7 인간 유방암 세포가 DMEM 배지 내에서 배양되었고, 4T1 생쥐 유방암 세포, A549 인간 비소세포성 폐암 세포, 및 LS180 인간 대장암 세포가 RPMI1640 배지 내에서 배양되었다. 이들 2가지 배지에는 인큐베이터 내의 5% CO2 및 37℃ 하에서 항생제를 갖는 10%의 우태아 혈청(FBS)이 첨가되었다. 세포(3-5 x 103)가 96개의 웰 플레이트(well plates) 내로 씨딩되어(seeded), 약물에 노출되기 전에 24 시간 동안 배양되었다. 유리 약물(free drugs)이 DMSO 내에서 용해되었고, 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀이 탈이온수(deionized water) 내에 존재하였다. 샘플들은 희석되어, 세포 배양 배지가 96개의 웰 플레이트에서 0.10, 1.0, 10, 100 및 1000 nM을 만들었다. 72 시간 동안 배양한 후, 세포 배양 배지는 새로운 배지로 대체되었고, 20 ㎕의 레자주린 염료 용액(알라마블루®(AlamarBlue®), 인비트로젠, 미국)이 웰 내로 첨가되었다. 각각의 생존 가능한 암세포에 의한 레자주린 염료의 대사 전환(metabolic conversion)이 형광 세포 플레이트 판독기(스펙트라맥스 M2(SpectraMax M2) 몰레큘라 디바이시즈, 미국)를 사용하여 수량화되어, 세포 생존성을 측정하였다. 파클리탁셀, 17-AAG, 라파마이신 및 이들의 조합에 대한 약물 농도에 대한 생존 가능 세포의 비율을 기록하여 성장 억제 곡선이 얻어졌다. 유리 약물 및 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀의 IC50 값들이 컴퓨신 소프트웨어(버전 1.0)(Compusyn software (ver. 1.0))를 사용하여 배지 효과 방정식에 기초하여 계산되었다.
조합 지수 분석. 2개 또는 3개 약물 조합의 조합 지수(CI)가 컴퓨신 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 추 및 탈랄레이 방법에 기초하여 계산되었다. CI 값은 2개 또는 3개 약물 조합에 대한 IC50 값에서 얻어졌다. 2개 또는 3개 약물 조합이 각각 상승효과적인가, 부가적인가, 그리고 길항적인가(antagonistic)의 여부를 결정하기 위한 기준으로 CI<1, CI=1, 및 CI>1이 사용되었다(도 13-20).
논의. PEG-b-PLA 미셀은 파클리탁셀, 17-AAG, 라파마이신 및 이들의 2개 및 3개 약물 조합의 수용해도에 대해 현저한 효과를 가진다(테이블 6-1). 각각의 경우, PEG-b-PLA 미셀은 대략 mg/L 레벨로부터 mg/mL 레벨까지 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 수용해도를 상승시킨다. 주목할만한 것은, 2개 및 3개 약물 조합이 결합되었을 때의 개별 약물 레벨이 각각의 약물이 PEG-b-PLA 미셀 내에 단독으로 일체화되었을 때의 레벨과 동일한 것을 보여준다(테이블 6-1). 달리 말하자면, % 약물 함유량(중량 약물/중량 중합체)이 단일 약물 용해도 실험에 사용된 양을 넘어서는 추가 PEG-b-PLA 없이 1개 약물 조합에서 2개 약물 조합 및 3개 약물 조합으로 가면서 증가한다. 따라서, PEG-b-PLA 미셀은 각각 3.36, 3.86 및 2.09 mg/mL에서, 입자 사이즈는 약간 증가한 상태로, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 3개 약물 조합을 전달하기 위해 사용될 수 있다.
테이블 6-1. PEG-b-PLA 미셀에 의한 조합적 약물 용해도 (n=3, 평균치±SD).
항암제 물속에서의 약물 레벨(mg/mL) % 약물 함유량(중량 약물/중량 중합체) PEG-b-PLA 미셀 직경(nm±SD)
파클리탁셀 3.54±0.32 10.3±0.9 38.8±0.6
17-AAG 3.90±0.28 11.3±0.3 39.3±2.9
라파마이신 1.84±0.26 6.6±1.3 36.9±1.3
파클리탁셀+
17-AAG		 3.92±0.17
3.88±0.29		 25.9±1.6 38.9±1.1
파클리탁셀+라파마이신 3.59±0.09
1.06±0.07		 13.3±0.3 41.0±1.5
파클리탁셀+
17-AAG+
라파마이신 		3.36±0.08
3.86±0.46
2.09±0.08
40.4±1.2
43.8±1.3
몇 가지 미셀 약물 전달 제제에 대한 추가 특성화 데이터가 이하의 테이블 6-2에 제공된다.
테이블 6-2. PEG-b-PLA 미셀에 의한 조합적 약물 용해도 결과(n=3, 평균치±SD).
항암제 물속에서의 약물 레벨(mg/mL) % 약물 함유량(중량 약물/중량 중합체) PEG-b-PLA 미셀 직경(nm±SD)
라파마이신 1.84±0.26 6.6±1.3 36.9±1.3
파클리탁셀 3.54±0.32 10.3±0.9 38.8±0.6
도세탁셀 4.27±0.44 11.5±0.5 37.3±1.7
17-AAG 3.90±0.28 11.3±0.3 39.3±2.9
파클리탁셀
17-AAG		 3.92±0.17
3.88±0.29		 25.9±1.6 38.9±1.1
도세탁셀
17-AAG		 4.62±0.44
4.01±0.08		 25.8±2.2 39.0±0.8
라파마이신
파클리탁셀		 1.06±0.07
3.59±0.09		 13.3±0.3 41.0±1.5
라파마이신
도세탁셀 		2.43±0.11
3.01±0.26		 16.6±1.0 38.1±0.9
라파마이신
17-AAG		 1.83±0.25
4.02±0.14		 22.6±1.6 39.4±1.9
라파마이신
파클리탁셀
17-AAG		 2.09±0.08
3.36±0.46
3.86±0.46
0.4±1.2
3.8±1.3
라파마이신
도세탁셀
17-AAG		 2.34±0.19
2.71±0.07
4.06±0.17
3.3±1.3
2.5±1.3
(n=3, 평균치±SD)
함유 능력에 있어서의 이러한 증가는 약물 용해도 분야에서는 드문 놀라운 결과이다. PEG-b-PLA 미셀 내에서 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신에 대한 40%의 약물 함유량은 특히 언급할 만하다. PEG-b-PLA 미셀이 인간의 경우 뛰어난 안전성 프로파일을 가지기 때문에, 다중 약물 전달용 정맥 루트에 의해 다중 약물 전달을 위한 용해용 담체로서 Cremophor EL, DMSO/지질 및/또는 에탄올 없이 PEG-b-PLA 미셀을 통한 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 2개 및 3개 약물 조합의 투여는 암 치료에 가치있는 진전이 될 것이다.
파클리탁셀+17-AAG 및 파클리탁셀+라파마이신의 2개 약물 조합은 세포 배양에서 그리고 유방 및 폐의 종양 모델에서 상승효과적인 암 활성화에 영향을 미친다는 것이 입증되었으며, 이것은 현재 임상 실험에 대한 확고한 근거로서의 역할을 한다(솔리트 등(Solit et al.), Cancer Res. 2003, 63, 2139; 몬데지어 등(Mondesire et al.), Clin. Cancer Res. 2004, 10, 7031). 좀 더 최근에는, 17-AAG+라파마이신의 조합이 AKT 활성화의 감소 및 미토겐-활성화 단백질 키나아제 신호 경로의 17-AAG 유발형 억제에 기인하여(RAS/RAF/MEK/ERK), MCF-7 및 MDA-MB-231 유방암 세포 양자에서 향상된 항증식성(anti-proliferative) 활성화에 영향을 미치는 것으로 입증되었다(로포스 및 탄(Roforth and Tan), 항암 약물 2008, 19, 681). 음성 되먹임 고리(negative feedback loop)에 의한 mTOR 억제에 기인한 AKT 활성화는 mTOR 억제제가 암에 있어서 PI3K/AKT/mTOR 경로의 핵심적인 중요성에도 불구하고(예를 들어 폐암의 60-70%에서 활성화됨) 임상 실험에서 성공적이지 못했던 주요한 이유인 것으로 믿어진다(가버(Garber), JNCI 2009, 101, 288).
본 명세서에서 기술되는 상기 실험에서, 고분자 미셀로 용해된 파클리탁셀+17-AAG, 파클리탁셀+라파마이신 및 17-AAG+라파마이신은, CI 분석에 따르면, MCF-7 유방암 세포, 4T1 유방암 세포, A549 비소세포성 폐암, 및 LS180 대장암에 대한 추가적인 또는 상승효과적인 암 활성화에 영향을 미친다(도 14, 16, 18, 및 20, 및 테이블 6-4 및 6-5). 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신(5:1:1)의 3개 약물 조합은 MCF-7 유방암 세포 내에서 단독으로 사용된 파클리탁셀에 대해 114±10 nM 대 226±32 nM의 매우 낮은 IC50 값을 갖는다. 이러한 3개 약물 조합은 IC50에서 0.49±0.04의 CI를 가지며, 이것은 MCF-7 유방암 세포에서 상승효과를 나타낸다. 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 3개 약물 조합의 CI는 4T1 세포, A549 세포, 및 LS180 세포에 대해 각각 0.04±0.001, 0.21±0.03, 및 0.33±0.02였다. PI3K/AKT/mTOR 및 RAS/RAF/MEK/ERK 신호 경로가 많은 암 내에서 비정상적으로 활성화되며, 이들 신호 경로가 암 세포 생존을 촉진하는데 협력한다는 증거가 존재한다는 점에 유의하여야 한다(Grant, J. Clin. Invest. 2008, 118, 3003). 따라서, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 상승효과적인 세포 독성은 17-AAG 및 라파마이신에 의해 상보적인 신호 경로의 공통 표적을 나타낼 가능성이 있으며, MCF-7 유방암 세포에 대한 파클리탁셀의 세포 독성을 향상시킨다.
PEG-b-PLA 미셀 내로 물리적으로 일체화된 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 세포 독성은 세포 배지 내의 유리 약물의 세포 독성에 비해 더 낮다. 그럼에도 불구하고, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 상승효과, 즉 CI<1의 증거가 특히 3개 약물 조합에 대해 고무적이다. PEG-b-PLA 미셀의 일부로서의 파클리탁셀(Genexol-PM®)에 대한 IC50은 226±32 nM인 반면, 이것은 Taxol®보다 더 높은 MTD로 인하여 생쥐 종양 모델 및 임상 실험에서 잠재적인 항암 활성화에 영향을 미친다는 점에 유의하여야 한다(김 등(Kim et al.), Clin. Cancer Res. 2004, 10, 3708).
테이블 6-3. PEG-b-PLA 미셀에 의해 용해된 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신에 대한 IC50(n=3, 평균치±SD).
SDM 및 MDM 내의 약물 MCF-7 4T1 A549 몰비
PTX 226±32 11160±4164 397±59 N.A
17-AAG 266±48 118±10 771±163 N.A
RAP 255±37 > 100000 590±110 N.A
PTX/17-AAG 162±17 92±19 187±25 3.2;1(4.7:1)1
RAP/17-AAG 177±3 147±11 222±20 1:1
RAP/PTX 167±6 4031±3612 400±37 1:1
RAP/PTX/17-AAG 114±10 25±1 94±17 1.5:1
1 PTX 및 17-AAG의 3.2:1 몰비가 MCF-7 세포에 대해 사용되었고, PTX 및 17-AAG의 4.7:1 몰비가 4T1 및 A549 세포 양자에 대해 사용되었다.
테이블 6-4. MCF-7 유방암 세포주, 4T1 생취 유방암 세포주, A549 폐암 세포주, 및 LS180 대장암 세포주에서의 MDM의 CI.
MDM 내의 약물 몰비 MCF-7 4T1 A549 LS180
PTX/17-AAG 3.2:1 (4.7:1) 0.69±0.07 0.14±0.03 0.43±0.06 1.44±0.09
RAP/17-AAG 1:1 0.68±0.01 0.62±0.05 0.33±0.03 0.88±0.20
RAP/PTX 1:1 0.69±0.02 0.19±0.17 0.84±0.08 0.04±0.01
RAP/PTX/17-AAG 1.5:1 0.49±0.04 0.04±0.001 0.21±0.03 0.33±0.02
PEG-b-PLA 미셀에 대한 최근의 회스터 에너지 전달 실험(Foester energy transfer experiments)은 PEG-b-PLA 미셀이 혈청단백질로 인해 정맥 주사 후 혈액 내에서 쉽게 분해되어 결과적으로 약물이 방출된다는 것을 암시하고 있다(첸 등(Chen et al.), Langmuir 2008, 24, 5213). 따라서, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀이 혈액 내에서 쉽게 분해되어, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 약물동력학 면에서 작은 변화를 일으킬 것으로 예상된다. 그러나, Cremophor EL, DMSO/지질 및/또는 에탄올에 비해 PEG-b-PLA 미셀에 의해 가능하게 된 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 더 높은 MTD는 암 약물의 더 높은 종양 축적 및 더 큰 항암 효과를 제공할 것이다.
SDM 및 MDM 으로부터의 약물의 체외 방출 프로파일. PEG-b-PLA 미셀로부터 PTX, DCTX, 라파마이신 및 17-AAG의 방출 프로파일이 투석 방법에 의해 평가되었다. SDMs 및 MDMs은 상술한 바와 같이 제조되어 특성화되었다. 미셀 조제 후에, 각 약물의 대략 0.10 mg/mL의 샘플을 만들드록 각 샘플이 DD H2O로 희석되었다. 2.5 mL 부피의 조제된 샘플이 20,000 g/mol의 MWCO를 갖는 3 mL의 Slide-A-Lyzer®(서모 사이언티픽사(Thermo Scientific Inc.)) 투석 카세트 내로 함유되었다. 각 실험에서 4개의 카세트가 사용되었다. 카세트는 약물 및 중합체에 대한 싱크 조건을 보장하기 위해 매 3 시간마다 교체되는 2.0 L의 버퍼 내에 위치되었다. 100 ㎕의 샘플이 다양한 샘플링 시간 인터벌에서 각 카세트로부터 인출된 후 100 ㎕의 새로운 버퍼로 교체되었다. 샘플링 시간 인터벌은 0, 0.5, 2, 3, 6, 9, 12 및 24 시간이었다. 각 샘플 내의 약물의 양은 역상 HPLC에 의해 수량화되었다.
도 3-4 및 도 6-8은 단일 작용제, 및 2개 및 3개 약물 조합(12.5 mM PBS, pH=7.4, 37℃)으로서 PEG-b-PLA 미셀로부터의 체외 약물 방출의 결과를 예시하고 있다. 이들 도면들은 PEG-b-PLA 미셀 내에 함께 일체화된 단일 약물 또는 2개 또는 3개 약물 조합으로서의 파클리탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 방출 프로파일이 가장 느린 방출을 보여주고, 그 뒤로 파클리탁셀, 도세탁셀, 그리고 17-AAG가 이어졌다(단일 작용제로서의 파클리탁셀 방출은 약물 침전으로 인하여 미완성이었다). 다중 약물 함유 PEG-b-PLA 미셀의 방출 프로파일은 PEG-b-PLA 미셀에 의해 방출된 개별 항암제에 대한 방출 프로파일과 상당히 유사하였으며, 수중유적 분배 상수와 잘 대응되었다: log P 값은 PEG-b-PLA 미셀에 대한 약물 방출의 반감기를 따라 증가하였다(테이블 6-5).
테이블 6-5. PEG-b-PLA 미셀로부터의 체외 약물 방출에 대한 파라메터(단일 작용제, 2개 또는 3개 약물 조합).
항암제 1차 속도 상수(시간-1) t1 /2(시간) 적합 양호성(r2) log P (1)
파클리탁셀 - - - 3.0
17-AAG 0.525 1.32 0.999 1.3
라파마이신
파클리탁셀
17-AAG 		0.081
0.138
0.398 		8.52
5.01
1.74		 0.990
0.938
0.996		 5.8
3.0
1.3
라파마이신
파클리탁셀 		0.069
0.116 		10.05
6.00		 0.991
0.993		 5.8
3.0
라파마이신
도세탁셀 		0.085
0.317 		8.12
2.19		 0.993
0.999		 5.8
2.4
라파마이신
17-AAG		 0.079
0.385 		8.73
1.80		 0.983
0.999		 5.8
1.3
라파마이신
파클리탁셀
17-AAG		 0.050
0.075
0.275		 13.93
9.20
2.52		 0.979
0.984
0.996		 5.8
3.0
1.3
라파마이신
도세탁셀
17-AAG		 0.069
0.306
0.363		 10.00
2.26
1.91		 0.982
0.993
0.995		 5.8
2.4
1.3
1 XLog P 버전 2.0에서 계산됨(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/); Graphic Prism 버전4.03으로 곡선 적합화.
PEG-b-PLA 미셀에 대한 약물 방출의 반감기는 1 내지 14 시간으로, 어느 정도 서방성 방출(sustained release)을 나타내었다. 그러나, 생체 내에서는, PEG-b-PLA 미셀이 α(알파)- 및 β(베타)-글로뷸린의 작용 및 CMC 이하의 희석으로 인해 분리되어, 결과적으로 약물 방출의 가능한 대안적인 메커니즘으로 약물 방출 미셀 분해에 기인한 약물 방출이 이루어질 것으로 예상된다. 이러한 상황에서, PEG-b-PLA 미셀이 PEG-b-PLA 미셀 내로 함께 일체화된 파클리탁셀, 도세탁셀, 라파마이신, 및 17-AAG의 PK에 대한 중요한 영향을 갖지 않을 것으로 예상된다. 흰쥐 모델을 입증하기 위해 흰쥐 모델에서의 PK 실험이 행해질 것이다.
약물 조합은 또한 체중 및 사망의 변화에 기초하여 생쥐에서 바람직한 급성 독성 결과를 나타내었다(도 21-22). 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 3개 약물 조합은 A549 비소세포형 폐암 이종이식 모델에서 뛰어난 항종양 효과의 결과를 제공하였다. 이들 결과는 3개 약물 조합이 생쥐에 있어서 상대적으로 낮은 독성 및 A549 이종이식 모델에서 잠재적인 항암 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
요약하면, FVB 알비노 암컷 쥐에서 0, 4, 및 8일에 3회 정맥(IV) 주사하여 12일에 걸쳐 체중 측정 및 생존의 모니터링하는 급성 독성 실험이 수행되었다(도 21). 당연히, 파클리탁셀 함유 PEG-b-PLA 미셀의 급성 독성은 60 mg/kg의 투여량(Genexol-PM®에 대한 MTD)에서 낮았다. PEG-b-PLA 미셀 내의 파클리탁셀(60 mg/kg)에 17-AAG 또는 라파마이신(2개 약물 조합)의 추가는 각각 60 또는 30 mg/kg에서 급성 독성의 상당한 변화를 가져오지는 않았다(100% 생존 및 15% 미만의 체중 변화). 놀랍게도, PEG-b-PLA 미셀 내에서 용해될 수 있는 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 3개 약물 조합(nPAR)은 60, 60, 및 30 mg/kg에서 생쥐 내로 안전하게 주사될 수 있다. 따라서, 인간 종양 이종이식 내에서의 조합 치료 실험은 파클리탁셀의 투여량의 감소 없이 시작될 수 있다. CrEL 및 에탄올을 갖는 파클리탁셀 제제의 경우, 파클리탁셀의 12 mg/kg 이상의 투여량은 급성 독성의 결과를 가져오며, 이것은 CrEL/에탄올 제제를 사용하는 투여량 증가 분석을 방해한다.
항암 효과 연구가 A549 비소세포형 폐 이종이식 모델에서 행해졌다(도 22 참조). 5 x 106 A549 세포가 6주일 된 무흉선 암컷 쥐(female athymic mice)의 옆구리 부분에서 피하주사되었다. 대략 2 주일 후, 종양이 감지되었으며(200 mm3), 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 3개 약물 조합(nPAR)(60:60:30 mg/kg)이 미정맥(tail vein)을 통해 0, 4, 및 8일에 주사되었다(도 22의 화살표). 종양 부피가 캘리퍼로 측정되었다. PEG-b-PLA 미셀에 의해 용해될 수 있는 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 3개 약물 조합은 잠재적인 항암 활성을 갖는다. 단지 3회의 주사 후 28일에 걸쳐 종양이 축소된 반면, 특히 14-26일에 걸쳐 제어 쥐의 종양 부피는 증가되었다. 쥐의 체중 변화는 10% 미만이었고 죽은 쥐는 없었다.
본 명세서에서 기술되는 미셀에 의해 용해될 수 있는 약물 조합의 장점을 추가로 예시하기 위해, 도 10, 11 및 23은 몇 가지 2개 및 3개 약물 조합의 체외 유리 약물 세포 독성의 결과를 보여주고 있다. 도 23은 레자주린 시험을 사용하는 MCF-7 유방암 세포주에 대한 라파마이신, 파클리탁셀 및 17-AAG의 체외 유리 약물 세포 독성의 결과를 예시하고 있다. 데이터는 라파마이신, 파클리탁셀 및 17-AAG의 3개 약물 조합이 임의의 단독 약물, 또는 임의의 2개 약물 조합보다 상당히 더 효과적임을 나타내고 있다. 라파마이신, 파클리탁셀 및 17-AAG의 5:1:1 비율이 사용될 때, IC50 값은 50% 이상까지 더욱 감소되어, 이러한 약물 조합의 더 높은 효과 상의 특성을 추가로 입증한다.
도 10은 레자주린 시험을 사용하는 MCF-7 유방암 세포주에 대한 라파마이신, 도세탁셀 및 17-AAG의 체외 유리 약물 세포 독성 결과를 예시한다. 라파마이신 및 도세탁셀의 2개 약물 조합, 및 라파마이신, 도세탁셀 및 17-AAG의 3개 약물 조합은 임의의 단일 약물보다 상당히 낮은 IC50 값을 보여준다.
도 11은 레자주린 시험을 사용하는 SKOV-3 난소암 세포주에 대한 라파마이신, 파클리탁셀 및 17-AAG의 체외 유리 약물 세포 독성 결과를 예시한다. 다시, 데이터는 라파마이신, 파클리탁셀 및 17-AAG의 3개 약물 조합이 임의의 단독 약물보다 좀 더 효과적임을 나타내고 있다. 따라서, 상이한 세포주에서의 체외 세포 독성 결과는 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 3개 약물 조합이 상승효과적이라는 것(폐암 및 유방암)을 나타낸다.
요약하면, PEG-b-PLA 미셀은 암치료에 상승효과를 가지면서, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 다중 약물 전달에 대한 간단하며, 안전하고, 용해가능하며, 무균 특성의 선택 사항을 제공한다. 놀랍게도, PEG-b-PLA 미셀은 생체 내 연구를 위해 충분한 수용해도를 얻는, 다수의 난수용성 암치료제에 대한 나노-수용체로서 작용한다. 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 2개 및 3개 약물 조합은 MCF-7 유방암 세포에 대해 상승효과적인 세포 독성에 영향을 미쳐, 생쥐 종양 모델에서의 효과 실험에 대한 강력한 암시를 제공한다. 예비 실험에서, 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신으로 충전된 PEG-b-PLA 미셀은 각각 60, 60 및 30 mg/kg에서(0, 4, 8일에) FVB 알비노 쥐 내로 주사되었으며, 체중 변화는 10% 이하였고 죽은 쥐는 없었다. 누드 마우스 내에서의 Genexol-PM® 및 Taxol®의 MTD은 동일한 스케줄에서 각각 60 및 20 mg/kg이다(김 등(Kim et al.), J. Controlled Release 2001, 72, 191). 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 2개 또는 3개 약물의 임상 실험으로의 신속한 전환이 기대된다. Genexol-PM®에 대한 임상적 진보가 이루어지면, 생쥐 종양 모델에서 PEG-b-PLA 미셀을 통한 파클리탁셀, 17-AAG 및 라파마이신의 바람직한 독성 프로파일 및 높은 종양 효과의 성취가 예상된다.
PEG-b-PLA 미셀은 한국에서 인간에게 파클리탁셀의 비경구적 사용에 대해 승인되었으며, Cremophor EL® 및 아브락산®(Abraxane®)에 대한 대안으로 미국에서 제 2상의 임상 실험 중에 있다. 본 명세서에서 기술되는 PEG-b-PLA 미셀은 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신(PAR)의 2개 및 3개 약물 조합을 고유하게 용해시킬 수 있다. PAR을 갖는 PEG-b-PLA 미셀은 MCF-7 및 4T1 유방암 세포 및 A549 비소세포성 폐암 세포에 대해 상승효과적인 항암 활동성에 영향을 미친다. PAR을 함유하는 PEG-b-PLA 미셀은 쥐 내에서 0, 4, 및 8일에 60, 60, 및 30 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 0, 4, 및 8일에 60, 60, 및 30 mg/kg의 양으로 투여된 PAR을 갖는 PEG-b-PLA 미셀은 A549 NSCLC 이종이식 모델에서 종양 감퇴(tumor regression)를 유도한다. 따라서, 본 명세서에서 기술되는 조성물은 다양한 암에 대한 새로운 치료법을 제공하기 위해 상승효과적인 방식으로 작용하는 무수히 많은 항암 약물을 용해시키기 위한 간단하고 안전한 방법을 제공한다.
실험예 7. 약학적 투여량 양식
이하의 제제는 본 명세서에서 기술되는 미셀 제제(이하에서는 '조성물 X'라고 지칭하기로 함)의 치료적 투여에 대해 사용될 수 있는 대표적인 약학적 투여량 양식을 예시한다:
(i) 주사 1 (1 mg / mL) mg/mL
'조성물 X' 1.0
이가산 인산 나트륨(Dibasic sodium phosphate) 12.0
일가산 인산 나트륨(Monobasic sodium phosphate) 0.7
염화나트륨 4.5
1.0N 수산화나트륨 용액 적정량(q.s.)
(7.0-7.5까지 pH 조정)
주사용 물 적정량에 1 mL 추가
(ii) 주사 2 (10 mg / mL ) mg/mL
'조성물 X' 10.0
일가산 인산 나트륨 0.3
이가산 인산 나트륨 1.1
폴리에틸렌 글리콜 400 200.0
01N 수산화나트륨 용액 적정량
(7.0-7.5까지 pH 조정)
주사용 물 적정량에 1 mL 추가
(iii) 에어졸 mg/캔(can)
'조성물 X' 20
올레산 10
트리클로로모노플루우로메탄 5,000
디클로로모노플루우로메탄 10,000
디클로로테트라플루우로에탄 5,000
이들 제제는 약학 기술 분야에서 잘 알려진 공지의 절차에 의해 조제될 수 있다. 상기 약학 조성물이 활성 성분 '조성물 X'의 상이한 양 및 형태를 수용하기 위해 잘 알려진 약학 기법에 따라 가변될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
에어졸 제제 (iii)은 표준의 계량된 투여량 에어졸 디스펜서와 함께 사용될 수 있다. 또한, 구체적인 성분 및 비율은 예시 목적으로 기술된 것이다. 관심있는 투여량 양식의 원하는 특성에 따라, 성분은 적합한 균등물로 교환될 수 있으며 비율은 가변적일 수 있다.
모든 간행물, 특허, 특허 문헌은 비록 개별적으로 본 명세서에 참조되었지만 본 명세서에 참조되어 본 발명의 일부를 이룬다. 개시된 실시예 및 실험예를 참조하여 구체적인 실시예가 기술되었지만, 이들 실시예 및 실험예는 단지 예시적인 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 후술하는 청구범위에서 한정되는 더 넓은 특징에서 본 발명을 벗어남이 없이 본 발명 기술 분야의 당업자에 따라 변경 및 개변이 이루어질 수 있다.

Claims (20)

  1. 3개 약물을 캡슐화하는 미셀을 포함하는 조성물에 있어서,
    상기 미셀은 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(젖산)(poly(ethylene glycol)-block-poly(lactic acid) 중합체를 포함하고;
    상기 중합체의 소수성 폴리(젖산) 블록은 각 미셀의 내부를 향해 배향하고, 상기 중합체의 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록은 각 미셀의 외부를 향해 배향하며;
    상기 폴리(에틸렌 글리콜) 블록의 분자량은 1,000 내지 35,000 g/mol이고, 상기 폴리(젖산) 블록의 분자량은 1,000 내지 15,000 g/mol이며;
    상기 미셀의 약물 함유량은 상기 미셀의 질량에 대해 1 중량% 내지 50 중량%이고;
    상기 미셀 내에 캡슐화된 상기 3개 약물의 제 1 약물은 17-AAG이며; 상기 미셀 내에 캡슐화된 상기 3개 약물의 제 2 약물은 파클리탁셀 또는 도세탁셀이고; 상기 미셀 내에 캡슐화된 상기 3개 약물의 제 3 약물은 라파마이신이거나; 또는
    상기 미셀 내에 캡슐화된 상기 3개 약물의 제 1 약물은 17-AAG이며; 상기 미셀 내에 캡슐화된 상기 3개 약물의 제 2 약물은 파클리탁셀이고; 상기 미셀 내에 캡슐화된 상기 3개 약물의 제 3 약물은 에토포시드이며;
    상기 조성물은 에탄올, 디메틸 설폭사이드, 피마자유(castor oil), 및 피마자유 유도체를 2% 미만으로 함유하는
    조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 미셀 내의 조합된 약물 함유량은 10 중량% 내지 40 중량%인 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 조성물은 수성 담체를 추가로 포함하되, 상기 약물의 농도는 상기 수성 담체의 부피에 대해 0.6 mg/mL 내지 40 mg/mL인 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 캡슐화된 약물은 수성 환경과 접촉될 때 1.0 mg/mL 내지 20 mg/mL의 수용해도를 갖는 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 조성물은 1 중량% 미만의 에탄올, 디메틸 설폭사이드, 피마자유(castor oil), 및 피마자유 유도체를 포함하는 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 폴리(에틸렌 글리콜) 블록의 분자량은 1,500 내지 14,000 g/mol이고, 상기 폴리(젖산) 블록의 분자량은 1,500 내지 7,000 g/mol이며, 상기 미셀의 평균 직경은 30 nm 내지 50 nm인 조성물.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 약물은 각각 상기 개별 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(젖산) 내로 함께 일체화되는 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 1항 또는 제 2항의 상기 조성물 및 수성 운반체를 포함하는 약학 조성물에 있어서,
    상기 약학 조성물은 정맥 투여 또는 복강내 투여용으로 제조되고, 상기 수성 운반체는 식염수 또는 수성 탄수화물 용액을 포함하는
    약학 조성물.
  10. 약제에 있어서,
    제 1항 또는 제 2항의 상기 조성물의 유효량의 투여에 의해 3개 약물을 동시에 투여하는데 사용되는 약제.
  11. 삭제
  12. 암세포를 억제 또는 죽이는데 사용하는 약제에 있어서,
    상기 약제는 제 1항 또는 제 2항의 상기 조성물의 유효 억제량 또는 유효 치사량을 포함하는 약제.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 억제 또는 죽이는 것이 생체 내인 약제.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 억제 또는 죽이는 것이 체외인 약제.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 암세포는 뇌종양 세포, 유방암 세포, 대장암 세포, 두경부 암세포, 폐암 세포, 림프종 세포, 흑색종 세포, 신경모세포종 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 또는 백혈병 세포인 약제.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 약제는 mTor 경로를 억제하는 약제.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 억제가 생체 내인 약제.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 억제가 체외인 약제.
  19. 파클리탁셀, 에토포시드, 및 17-AAG; 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신; 또는 도세탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신의 지연 방출용 조성물에 있어서,
    제 1항 또는 제 2항의 조성물 및 수성 운반체
    를 포함하고,
    상기 약물의 50 중량% 미만이 수성 환경 또는 포유류의 체액에 2 시간 동안 노출된 후 상기 미셀로부터 방출되는
    조성물.
  20. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 미셀은 상승효과적인 3개 약물 조합을 캡슐화하고,
    상기 3개 약물은 파클리탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신; 또는 도세탁셀, 17-AAG, 및 라파마이신인
    조성물.
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