KR20100057007A - 치료제의 마이셀 캡슐화 - Google Patents

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글렌 에스. 권
엠. 레어드 포레스트
닐 엠. 데이비스
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글렌 에스. 권
닐 엠. 데이비스
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Abstract

본 발명은 마이셀 입자에 캡슐화된 17 AAG를 제공한다. 상기 마이셀은 안전한 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산)(PEG-PLA)으로 이루어질 수 있다. PEG-PLA의 담체로서의 주요 장점은 그것이 크레모포르(Cremophor®) EL 또는 DMSO보다 독성이 적다는 것이다. 뿐만 아니라, PEG-PLA 마이셀은 DMSO보다 취급이 용이하고, 이들은, 임상적 시도에서 현재 17-AAG 제제와 연관된 문제점인, 불쾌한 냄새를 갖지 않는다. 본 발명은 또한 활성 물질이 캡슐화된 마이셀의 제조 방법, 및 상기 마이셀 및 그들의 상응하는 제제를 이용하는, 예를 들면 Hsp 90의 억제를 위한, 및/또는 암의 치료를 위한 치료 방법을 제공한다.

Description

치료제의 마이셀 캡슐화 {Micelle Encapsulation of Therapeutic Agents}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에, 여기에 참고문헌으로 도입되는, 2007년 7월 9일자 출원된 미국 임시 특허 출원 제 60/948,642 호 및 2008년 4월 14일자 출원된 제 61/044,813 호에 대한 우선권을 주장한다.
정부 지원
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 지원되는 계약 번호 AI043346 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부가 본 발명에 일정 권한을 갖는다.
열 충격 단백질 90(Hsp90)은 종양 세포 증식에 수반되는 단백질을 조절하는 그의 주요한 역할로 인하여 암 치료를 위해 중요한 목표이다. 겔다나마이신, 벤조퀴논 안사마이신 항생제는 Hsp90의 ATP/ADP 결합 포켓에 강력하게 결합하여 다양한 종류의 종양의 생존 및 성장을 방해함이 발견되었다. 겔다나마이신은 유망한 신규 항암제이지만, 그 임상적 개발은 심한 간 독성 및 불량한 용해도에 의해 방해되었었다. 2 가지 유사물, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (17-AAG; 타네스피마이신) 및 17-디메틸아미노-에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신(17-DMAG)이 이러한 문제점을 완화시키도록 개발되었다.
임상적 해독을 위한 여러 가지 유망한 핵심들은 더욱 약제학적으로 실제적인 제제로 17-DMAG의 개발을 지향하였는데, 그 이유는 17-DMAG가 17-AAG에 비하여 월등한 수용해도 및 보다 높은 경구 생체적합성을 갖기 때문이다. 그러나, 그의 17-AAG에 비하여 분명한 장점에도 불구하고, 17-DMAG는 동물에 투여 시, 넓은 부피의 분포로 특징된다. 이러한 넓은 분포는 원치 않는 독성을 초래할 수 있는데, 이는 17-DMAG의 최대 허용 투여량이 17-AAG의 것보다 상당히 작기 때문이다 (개에서, 각각 8 mg/m2/일 및 100-200 mg/m2/일).
17-AAG의 전달에 대한 주요 장애는 그의 제한된 수용해도(약 0.1 mg/mL)이며, 이는 주사 투여 이전에 크레모포르® EL (CrEL), DMSO, 및/또는 에탄올을 갖는 복잡한 제제의 사용을 초래하였다. CrEL은 과민 반응 및 아나필랙시스를 유도하는 것으로 알려져 있고, 투여 전 항히스타민제 및 스테로이드로 환자를 처치할 것을 필요로 하기 때문에, 환자 허용성의 관점에서 바람직하지 못하다.
그러므로, 17-AAG의 보다 안전하고 보다 효과적인 전달은 상기 의약을 강력한 계면활성제를 사용하지 않고 가용화할 수 있는 생체적합성 전달 계의 개발에 달려 있다. 따라서, 환자에게 17-AAG를 전달하기 위한 개량된 조성물에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 안전한 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산)("PEG-PLA") 마이셀에 의해 캡슐화된 17-AAG(17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신)과 같은 활성 물질을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 활성 물질의 효과적인 가용화를 제공한다. 담체로서 PEG-PLA의 중요한 장점은 그것이 현재의 공지된 조성으로 사용되는 크레모포르® EL 또는 DMSO보다 독성이 적다는 것이다. 뿐만 아니라, PEG-PLA 마이셀은 DMSO보다 취급이 용이하고, 현재 임상적 시도에서 17-AAG 제제가 갖는 문제점인 불쾌한 냄새가 없다. 마이셀 캡슐화는 또한, 신체의 목표 영역에 전달될 때까지 특정 물질을 마이셀 안에 유지시킴으로써 그 물질의 부작용의 발생(예, 간 독성, 호중성백혈구감소증, 신경병증 등)을 감소시킬 수 있다.
PEG-PLA 마이셀은 17-AAG 및/또는 제2 활성 물질을 캡슐화하여 약제학적 조성물을 제공하는 데 사용될 수 있다. 제2 활성 물질은 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 테니포시드 (teniposide) 또는 에토포시드(etoposide)와 같은 화학치료제일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면 정맥 내 (IV) 주사 또는 주입과 같은 내부 투여의 다양한 형태에 적합하도록 조제될 수 있다. 상기 제제는 약 20 mg/mL에 이르는 17-AAG 농도를 갖는 17-AAG-함유 마이셀을 포함할 수 있다. 상기 제제는 염수 또는 덱스트로오스 용액과 같은 적합한 수성 비히클을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 마이셀 내에 캡슐화된 17-AAG를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에게 17-AAG를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 마이셀은 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(락트산) 블럭을 포함하는 블럭 공중합체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 암 세포를 유효량의 17-AAG-함유 마이셀을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 암 세포를 죽이는 방법을 제공한다. 상기 접촉은 생체 내 또는 시험관내일 수 있다. 17-AAG 함유 마이셀은 또한 종양을 유효량의 17-AAG-함유 마이셀을 포함하는 조성물과 접촉시키거나 그를 투여함으로써, 암 종양의 성장을 방지하거나, 늦추거나 억제하는 데 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한 17-AAG 및 유니머(마이셀 배열이 아닌 블럭 중합체 사슬)를 수-혼화성 용매(예를 들면, 디메틸아세트아미드 (DMAc))에 먼저 용해시키는, 17-AAG-함유 마이셀의 제조 방법을 제공한다. 상기 용액을 그 후 투석 장치(예, 봉지 또는 관)에 가할 수 있다. 투석 장치를 그 후 수조에 넣어, 투석 봉지에 17-AAG-함유 마이셀을 제공할 수 있다. 마이셀을 그 후 예를 들면 원심분리에 의해 분리하여 함입되지 않은 의약을 침전시킬 수 있다. 단리된 17-AAG-함유 마이셀을 제공하기 위해 나노-여과를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 17-AAG 및 PEG-PLA(2000 mw; 50:50)가 아세토니트릴 또는 DMAc와 같은 적합한 용매에 용해되어 있는, 17-AAG-함유 마이셀의 제조 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, PEG-PLA의 블럭은 50:50의 대략 2,000 mw 블럭일 수 있다. 상기 용액을 초음파 처리한 다음 용매 제거에 의해 농축시킬 수 있다. 그 후 온수(50-70℃, 또는 대략 60℃)를 가하고, 상기 혼합물을 상온(~23℃)까지 식힐 수 있다. 다음, 상기 혼합물을 예를 들면 원심분리에 의해 분리하여 침강물을 제거할 수 있다 (예를 들면, 약 13,000 rpm에서 약 1 분 동안). 상청액을 수거하고 예를 들면 0.2 μm PTFE 필터를 통해 여과하여 단리된 17-AAG-함유 마이셀 제제를 수득할 수 있다. 수득되는 마이셀 약제학적 용액을 긴 시간 동안 예를 들면 약 4℃의 낮은 온도에서 보관할 수 있다.
이하의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며, 특정 구현예 또는 본 발명의 여러 국면을 더욱 설명하기 위해 포함된다. 일부 예에서, 본 발명의 구현예는 첨부 도면과 본 명세서에 나타낸 상세한 설명을 조합하여 참고함으로써 가장 잘 이해될 수 있다. 상세한 설명 및 첨부 도면은 특정의 구체적인 예, 또는 본 발명의 특정 국면을 조명할 수 있지만, 당업자는 상기 예 또는 국면의 부분이 본 발명의 다른 예 또는 국면과 조합되어 사용될 수도 있음을 이해할 것이다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따르는 마이셀의 특징을 보여준다; (a) 부하되지 않은 마이셀의 동적 광 산란(DLS)은 242±5 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 나타냈고; (b) PEG-PLA (12:6 kDa)의 임계 마이셀 농도는 350 nM로 측정되었다.
도 2는 하나의 구현예에 따르는, 37℃ 및 pH 7.4에서 ddH2O 중 0.3-mM PEG-PLA 마이셀로부터 17-AAG의 시험관내 방출을 보여준다. 마이셀은 표 1에 나타낸 바와 같이, PEG-PLA 함량을 기준으로 11.4% w/w 17-AAG를 이용하여 제조되었다; PEG-PLA 의약-부하된 마이셀 (●); 의약만 (▽); 그리고 CrEL-EtOH-PEG400 중 조제된 17-AAG (■).
도 3은 하나의 구현예에 따라, (a) 혈청, (b) 소변에 남아있는 17-AAG의 양, (c) 17-AAG의 소변 분비 속도, 및 (d) 소변을 통해 분비된 17-AAG의 총량을 포함하는, 쥐에서의 약동학적 윤곽을 보여준다. 각각의 투여된 제제는 10 mg/kg의 17-AAG(n = 10, 평균±SEM)를 포함하였다.
도 4는 (a) 주사 후 쥐에서 17-AAG의 조직 분포, 투여 후 3 시간 (10 mg/kg; n = 10, 평균±SEM); 및 (b) 쥐에 17-AAG(10 mg/kg)를 정맥 투여한 후 조직 대 혈청 비(Kp), 투여 후 3 시간(n= 10, 평균±SEM)을 보여준다. 별표(*)는 CrEL-EtOH-PEG400의 표준 제제 및 PEG-PLA 마이셀에 캡슐화된 17-AAG 사이의 통계적으로 유의한 차이(p < 0.05)를 나타낸다.
도 5(a) 및 5(b)는 본 발명의 구현예에 따르는 17-AAG 마이셀 제조 과정을 보여준다.
도 6은 하나의 구현예에 따라, 337 nm에서의 UV 측정에 의해 결정된, 17-AAG를 캡슐화하는 PEG-PLA 마이셀의 의약 부하의 특성을 보여준다.
도 7은 하나의 구현예에 따라, 632.8 nm에서의 DLS 측정에 의해 결정된 PEG-PLA 마이셀에서의 입자 크기 분포를 보여준다; (a) 수-중량 가우스 분포, 및 (b) 부피-중량 가우스 분포.
도 8은 PEO-b-PDLA 마이셀(18,000 x)의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진을 보여준다.
도 9는 하나의 구현예에 따르는, 마이셀 부하 및 형성 과정을 보여준다. 나노여과 후, 상기 제제는 UV 및 RI 검출 방식을 갖는 HPLC를 이용하여 분석될 수 있다.
도 10은 PEG-PLA 마이셀 중 파클리탁셀과 17-AAG가 함께 가용화되는 것을 보여준다.
도 11은 17-AAG/파클리탁셀 PEG-PLA 마이셀의 경우 물리적 안정성 결과를 보여준다.
도 12는 (a) 파클리탁셀 (PTX) 및 17-AAG 이중 물질 마이셀(초기)의 용해도; (b) 파클리탁셀 및 17-AAG 이중 물질 마이셀의 24 시간 후 용해도; (c) 0 시간 및 24 시간에 PTX/17-AAG 이중 물질 마이셀 중 파클리탁셀 농도의 비교; 및 (d) 0 시간 및 24 시간에 파클리탁셀-단독 마이셀 중 파클리탁셀 농도의 비교를 보여준다.
도 13은 (a) 에토포시드 (ETO) 및 17-AAG 이중 물질 마이셀(초기)의 용해도; (b) 에토포시드 및 17-AAG 이중 물질 마이셀의 24 시간 후 용해도; (c) 0 시간 및 24 시간에 ETO/17-AAG 이중 물질 마이셀 중 에토포시드 농도의 비교; 및 (d) 0 시간 및 24 시간에 에토포시드-단독 마이셀 중 에토포시드 농도의 비교를 보여준다.
도 14는 (a) 도세탁셀 (DCTX) 및 17-AAG 이중 물질 마이셀(초기)의 용해도; (b) 도세탁셀 및 17-AAG 이중 물질 마이셀의 24 시간 후 용해도; (c) 0 시간 및 24 시간에 DCTX/17-AAG 이중 물질 마이셀 중 도세탁셀 농도의 비교; 및 (d) 0 시간 및 24 시간에 도세탁셀-단독 마이셀 중 도세탁셀 농도의 비교를 보여준다.
도 15는 (a) 광학 밀도 (OD) 변화에 의해 분석한, 시간 경과에 따르는 파클리탁셀 (PTX) 단일 물질 마이셀의 물리적 안정성; 및 (b) 광학 밀도 (OD) 변화에 의해 분석한, 시간 경과에 따르는 파클리탁셀/17-AAG 이중 물질 마이셀의 물리적 안정성을 보여준다.
겔다나마이신은 생산 유기체인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) 변종 겔다누스 NRRL 3602를 배양함으로써 수득될 수 있는, 잘 알려진 천연 생성물이다. 화합물 17-AAG는 미국 특허 제 4,261,989 호(Sasaki 등)에 기재된 바와 같이 겔다나마이신과 알릴아민의 반응에 의해 겔다나마이신으로부터 반-합성적으로 제조되며, 위 특허의 개시는 여기에 참고문헌으로 도입된다.
겔다나마이신은 Hsp90의 ATP/ADP 결합 포켓에 강력하게 결합되며, 따라서 HER-2/erbB-2 과발현, 파클리탁셀 내성 유방암을 포함하는 다양한 류의 종양의 생존 및 증식을 방해한다. 겔다나마이신의 임상적 개발은 그의 불량한 용해도 및 심한 간 독성(Ge 등, J. Med . Chem . 49(15) (2006) 4606-4615)에 의해 방해되었었다. 즉, 겔다나마이신, 또는 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신(17-AAG, 하기 화학식 1)과 같은 그의 유도체의 제조에서 심각한 장애는 이들 친유성 의약의 매우 불량한 수용해도이다.
Figure pct00001
적합한 수용해도는 주사 투여의 경우 특히 중요하다. 17-AAG의 수용해도는 중성 pH에서 단지 약 0.1 mg/mL로, 안전하고 효과적인 방식으로 투여하기 어렵다. 용해도 문제를 조처하기 위해 시도된 바 있었으나, 각각의 제제는, DMSO, 에탄올 또는 각종 바람직하지 못한 계면활성제의 사용과 같은, 그 자체의 단점을 수반하였다.
화합물 17-AAG(17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나아미신, 또는 타네스피마이신)는 암의 치료를 위해 현재 진행되고 있는 임상적 시도로서, 유망한 열 충격 단백질 90 억제제이다. 그의 암 세포에 대한 선택적인 작용 메카니즘에도 불구하고, 17-AAG는 그 불량한 수용해도로 인하여 도발적인 문제점에 직면한다. 현재의 17-AAG 조성물은 크레모포르® EL (CrEL), DMSO 및/또는 에탄올과의 조제를 필요로 한다. 미국 출원 공고 제 2005/0256097 호(Zhong 등) 참조.
크레모포르® EL은 피마자유 각 몰 당 35 몰의 에틸렌 옥시드를 반응시켜 폴리에톡실화 피마자유(CAS 번호 61791-12-6)를 수득함으로써 전형적으로 제조되는 피마자유 유도체이다. 주사용 제제를 위해 크레모포르® EL(예, KOS-953) 또는 DMSO를 사용하는 것은 그의 잠재적인 부작용으로 인하여 환자 허용성의 관점에서 바람직하지 못하다. 다양한 부작용은 급성 과민 반응, 말초 신경독증, 고지혈증, 및/또는 P-당단백질의 억제를 포함할 수 있다. 또한, 17-AAG는 낮은 투여량(20 mg/kg 미만)에서 높은 부피의 분포(Vd) 및 상당한 전신 독성을 갖는다. 따라서, 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 17-AAG를 안전하게 투여하기 위해 개선된 제제가 요구된다.
본 명세서의 개시는 폴리(에틸렌 옥시드)-b-폴리(D,L-락트산)(PEG-PLA)으로 이루어진 양쪽성 디블럭 마이셀을 이용하여 제조된, 17-AAG의 CrEL-비함유 제제를 제공한다. 동적 광 산란(DLS)은 약 257 nm의 평균 직경 및 약 350 nM의 임계 마이셀 농도를 갖는 PEG-PLA(12:6 kDa)를 나타냈다. 상기 마이셀은 예를 들면 약 1.5 mg/mL의 17-AAG와 같은 특정 활성 물질의 상당한 양을 가용화할 수 있다. PEG-PLA 마이셀의 곡선 아래 면적(AUC)은 표준 제제의 것의 1.3배였다. 상기 마이셀 제제의 사용으로, CrEL을 사용하는 표준 비히클에 비하여, 신장 청정(CL신장)은 증가하였고 간 청정(CL간)은 감소하였다. 따라서, 여기에 기재된 마이셀 제제는 현재 알려진 조성물에 비하여 여러가지 장점을 갖는 17-AAG용 전달 비히클을 제공한다.
뿐만 아니라, 17-AAG 마이셀 제제는 혈청에서 의약의 반감기(t1/2) 의 2.7 배 증가 및 소변에서 t1 /2의 1.3 배 증가를 나타냈다. 예상한 대로, 17-AAG는 혈액에서 더 긴 시간 동안 순환하므로, 더 빨리 청정되는 표준 제제에 비하여 비-특이성(비 목표화 잔기)으로 인하여 분포의 부피(Vd)에 있어서 1.7 배의 증가가 또한 상기 마이셀 제제에서 관찰되었다. PEG-PLA (12:6 kDa) 마이셀 중 17-AAG의 신규 제제는 17-AAG 단독으로 사용한 것에 비하여 바람직하게도 150 배의 용해도 증가를 초래하였다. 상기 데이터는 본 발명의 나노담체 계가 CrEL 및 EtOH과 같은 독성 물질을 필요로 하지 않고 17-AAG의 약동학적 경향을 유지할 수 있음을 보여준다.
PEG-PLA라는 용어는 폴리(에틸렌 옥시드)-블럭-폴리(락트산)을 의미한다. 폴리(락트산) 블럭은 (D-락트산), (L-락트산), (D,L-락트산), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. PEG-PLA의 다양한 형태가 폴리머 소스 사(Polymer Source, Inc., Montreal, Quebec)의 제품 등과 같이 상업적으로 입수가능하거나, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭의 분자량은 약 1,000 내지 약 35,000 g/mol이거나, 상기 범위 내에서 약 500 g/mol의 임의 증분일 수 있다. 폴리(락트산)의 적합한 블럭은 약 1,000 내지 약 15,000 g/mol의 분자량, 또는 상기 범위 내에서 약 500 g/mol의 임의 증분을 가질 수 있다. PEG 블럭은 메틸 기와 같은 알킬 기(예, 메톡시 에테르) 또는 임의의 적합한 보호, 캡핑 또는 차단 기로 종결될 수 있다.
본 명세서에서 "하나의 구현예", "한 구현예", "하나의 예시적 구현예" 등의 언급은 기재된 구현예가 특정의 형태, 구조 또는 특징을 포함하지만, 각각의 구현예가 그 특정의 형태, 구조 또는 특징을 반드시 포함하지 않을 수도 있음을 의미하는 것임에 주목해야 한다. 더욱이, 그러한 어구들은 동일한 구현예를 반드시 의미하지는 않는다. 또한, 특정의 형태, 구조 또는 특징이 하나의 구현예와 연관하여 기재될 경우, 이는 그것이 분명하게 기재되었건 기재되었지 않건, 다른 구현예와 연관하여 상기 형태, 구조 또는 특징에 영향을 주는 당업자의 지식의 범위 내에 있음을 제시한다.
PEG-PLA 마이셀의 제조 방법
용매 중에 임계 마이셀 농도(CMC)를 초과하는 양으로 존재하는 양쪽성 유니머(단일 사슬)는, 소수성 내부 및 친수성 외부 또는 외피를 갖는 코어-환의 구조인 마이셀로 응집된다. PEG-PLA 마이셀은 실시예 1에 기재되고, 도 5(a)에 개략적으로 도시된 것과 같이 제조될 수 있다. 도 5(b)는 17-AAG 마이셀 제제를 제조하기 위한 하나의 구체적인 과정을 제공한다. 상기 방법은 단지 하나의 구현예에 대한 예시이고, 상기 과정은 당업자에 의해 쉽게 인지되는 바와 같이, 원하는 제조의 규모에 따라 변할 수 있다. 도 5에 도시된 과정의 하나의 장점은 그것이 마이셀 용액의 투석을 필요로 하지 않는다는 것이다.
상기 개시된 마이셀은 다양한 블럭 크기(예, 전술한 범위 내의 블럭 크기) 및 다양한 비(예, 약 1:10 내지 약 10:1의 PEG:PLA, 또는 상기 범위 내 임의의 정수 비)의 PEG-PLA 중합체를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, PEG-PLA 중합체의 분자량(Mn)은 2K-2K, 3K-5K, 5K-3K, 5K-6K, 6K-5K, 6K-6K, 8K-4K, 4K-8K, 12K-3K, 3K-12K, 12K-6K, 및/또는 6K-12K를 포함할 수 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 의약-대-중합체의 비는 또한 약 1:20 내지 약 10:1, 또는 상기 범위 내 임의의 정수 비일 수 있다. 적합한 의약-중합체 비의 구체적인 예는 약 1:2.5; 약 1:5; 약 1:7.5; 및/또는 약 1:10을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 하나의 적합한 중합체는 대략 50:50 비로 약 1-3 kDa(예, 약 2K 돌턴)의 블럭을 포함하는 PEG-PLA이다. 상기 과정을 사용하는 것은 예상치못한 높은 수준의 마이셀 내 의약 부하를 초래한다. 예를 들어, 도 5의 과정을 사용한 경우, 약 5 mg/mL의 의약 부하가 얻어졌다 (약 9 mM; 약 17 중량%)(도 6 참조).
마이셀-캡슐화된 활성 물질 제제는 또한 투석 방법에 의해 제조될 수도 있다. 상기 물질 및 PEG-PLA를 디메틸아세트아미드(DMAc)와 같은 적합한 수 혼화성 유기 용매에 용해시킬 수 있다. 그 후 상기 용액을 투석 봉지로 옮긴다. 투석 매질은 0.9% 염수와 같은 수용액을 함유한다. 투석 봉지는 예를 들면 3500 MWCO 관형 (SpectraPor®) 투석 봉지일 수 있다. 용해된 물질과 중합체를 수성 혼합물에 가하면, 마이셀이 형성되어 활성 물질이 함입된다. 마이셀-캡슐화된 의약은 그 후 단리될 수 있다. 예를 들면, 함입되지 않은 의약은 원심분리에 의해 침전될 수 있다. 수득되는 상청액을 나노여과하여 단리된 마이셀-캡슐화된 활성 물질 제제를 수득한다. 도 9 참조. 마이셀은 UV 및 RI 검출 방식이 구비된 HPLC를 이용하여 측정 및 분석될 수 있다 (문헌 Yasugi 등, J. Control. Release, 1999, 62, 99-100에 의해 기재된 기술 참조). 제조 방법은 또한 수-중-유 에멀션, 용액 캐스팅, 및/또는 냉동-건조(동결건조)의 사용을 포함할 수 있다. 문헌 [Gaucher 등, J. Controlled Release, 109 (2005) 169-188] 참조
일단 제조되면, 마이셀-의약 조성물은 냉장 하에, 바람직하게는 약 -20℃ 내지 약 4℃ 사이의 온도에서, 오랜 시간 동안 보관될 수 있다. 빛으로부터 마이셀-의약 조성물을 보호하기 위해 갈색 유리 바이얼 또는 다른 적합한 용기를 사용하는 것이 그들의 유효 수명을 연장시킬 수 있다. 마이셀-의약 조성물은 고체 제제로 냉동-건조될 수 있는데, 이는 의약 투여에 앞서 수성 비히클로 재구성될 수 있다.
제제
17-AAG를 PEG-PLA 마이셀 내로 함입시킴으로써, 약제학적 담체 또는 피나 사이질 액 같은 체액 등 주어진 양의 유체에, 마이셀을 사용하지 않고 용해될 수 있는 것보다 많은 양의 의약이 용해될 수 있다. 즉, 마이셀은 달리 가능한 것보다 높은 정도로 17-AAG를 효과적으로 가용화한다. 마이셀이 필터를 통과할 수 있도록 마이셀을 용해시키는 약제학적 담체는 약제학적 "용액"으로 용해되어, 본 발명의 구현예에 따르는 제제를 제공하는 것으로 생각된다.
하나의 구현예에서, 마이셀은 약 15 mg/mL에 이르는 17-AAG, 또는 약 20 mg/mL에 이르는 17-AAG를 가용화할 수 있다. 일부 구현예에서, 마이셀은 약 3 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 또는 약 25 mg/mL의 활성 물질을 가용화할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 마이셀의 부피, 또는 바람직하게는 수성 담체의 부피에 대하여 약 0.5 내지 약 5 mg/mL의 17-AAG, 약 0.75 내지 약 3 mg/mL의 17-AAG, 약 1 내지 약 2 mg/mL의 17-AAG, 또는 약 1.5 mg/mL의 농도를 가질 수 있다. 유사한 양의 여타 활성 물질이 특정의 여타 구현예의 마이셀에 포함될 수 있다.
하나의 구현예에서, 17-AAG 캡슐화된 마이셀은 염수 또는 덱스트로오스 등과 같은 수성 담체를 포함하는 혼합물에 조제된다. 예를 들면, 적합한 담체는 0.9% NaCl 용액, 또는 덱스트로오스 또는 포도당 용액과 같은 5% 사카라이드 수용액일 수 있다. 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, D.B. Troy, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (21st Ed., 2005) pp803-849] 참조.
예를 들면 주사 투여와 같은 투여의 목적을 위해, 수용성 염(예, NaCl)의 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 추가의 또는 대체하는 담체는 참기름 또는 낙화생유, 뿐만 아니라 수성 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 수용액은 필요하다면 적합하게 완충될 수 있고, 액체 담체는 충분한 염수 또는 포도당으로 먼저 등장성이 부여될 수 있다. 상기 수용액은 특히, 정맥내, 근육내, 피하, 복막내 및 종양내 (IT) 주사의 경우 특히 적합하다. 종양내 주사는 전립샘 암을 포함하는 암의 치료와 같은 특정 유형의 치료에 특히 도움이 될 수 있다. 적절한 멸균의 수성 매질은 구입하거나 (예, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 에탄올, 디메틸 술폭시드, 또는 여타 유기 용매, 인지질, 피마자유, 및 피마자유 유도체 중 1종 이상과 같은 첨가제를 전혀 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 성분을 실질적으로 함유하지 않는다. 여기에서 사용되는, 실질적으로 함유하지 않는다는 것은 상기 조성물이 약 2.5 중량% 미만, 약 2 중량% 미만, 약 1.5 중량% 미만, 약 1 중량% 미만, 약 0.5 중량% 미만, 또는 약 0.25 중량% 미만을 함유함을 의미한다. 일부 구현예에서, 특정 첨가제가 마이셀의 안정성을 증가시킬 수 있다. 하나의 구현예에서는, 계면활성제가 마이셀에 포함될 수 있다 (예, 약 0.25 중량% 내지 약 2.5 중량%의 양으로). 예를 들면, 적합한 계면활성제는, 폴리에틸렌 글리콜 컨쥬게이트 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE)와 같은, 음의 전하를 지닌 인지질일 수 있다.
마이셀 제제를 이용한 치료법
마이셀은 약제학적 용액으로 조제되어 환자에게 투여될 수 있다. 약제학적 용액 제제는 허용되는 시간 내에, 예를 들면 약 10 분 내지 약 3 시간, 전형적으로 약 1 내지 약 2 시간, 예를 들면 약 90 분 내에 신체에 필요량의 17-AAG를 전달하도록 할 수 있다.
투여는 예를 들면 주입, 주사, 또는 IV에 의해 주사될 수 있고, 환자는 예를 들면 사람과 같은 포유류일 수 있다. 투여 시, 마이셀은 그대로 순환되고, 개개의 중합체 사슬로 해체되고, 활성 물질을 방출하고 (확산 또는 마이셀 해체에 의해), 조직 내로 분포되고 (예, 종양), 및/또는 신장 청정이 진행될 수 있다. 이러한 상황의 스케쥴은 구체적으로 예측될 수는 없으며, 이러한 상황들은 17-AAG와 같은 활성 물질의 항-종양 활성에 중대한 영향을 준다. 일부 구현예에서, 의약-부하된 마이셀은 종양 사이질 내로 관외유출될 수 있다. 활성 물질-함유 마이셀은 가수분해되어 17-AAG를 방출할 수 있으며, 이는 그 후 마이셀로부터 활성 물질을 방출할 수 있다. 활성 물질은 그 후 종양 세포 내로 확산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 국면은 누출성 혈관계를 가로지르며 종양 세포 내로 세포내 이입되며, 종양 세포 성장을 억제하고/하거나 종양 세포를 죽이는 마이셀을 포함한다.
질병, 이상 또는 상태는 17-AAG를 함유하는 마이셀의 약제학적 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 여기에 기재된 조성물의 투여는 환자에서 암 성장의 크기 및/또는 수의 감소, 및/또는 하나 이상의 상응하는 관련 증후의 경감을 초래할 수 있다. 여기에 기재된 방법에 의해 유효량으로 투여될 경우, 본 발명의 조성물은 암 세포 증식의 억제, 암 또는 종양의 크기 감소, 더이상의 전이의 방지, 종양 혈관신생의 억제, 및/또는 암 세포의 죽음과 같은 병리학적 관련 반응을 생성할 수 있다. 후술하는 이러한 질병 및 상태의 치료 방법은 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 필요하다면, 예를 들어, 매일, 매주, 또는 매달, 또는 그의 배수로 반복될 수 있다.
치료될 수 있는 상태는, 두부, 목, 비강, 부비동, 코인두, 구강, 입인두, 후두, 아래인두, 침샘 및 견신경절종의 종양을 포함하는, 두부 및 목의 암; 간 및 담도계의 암, 특히 간세포암종; 장암, 특히 직장결장암; 난소암; 소세포 및 비-소세포 폐암; 전립선 암; 췌장암; 유방암 육종, 예를 들면 섬유육종, 악성 섬유조직구종, 배아 횡문근육종, 평활근육종, 신경섬유육종, 뼈육종, 윤활막 육종, 지방육종, 및 이틀 연질부 육종; 중추 신경계의 신생물, 특히 뇌 암; 및/또는 홋킨(Hodgkin's) 림프종, 림프형질세포성 림프종, 소포 림프종, 점막연관림프조직 림프종, 외투 세포 림프종, B-직계성 대세포 림프종, 버킷(Burkitt's) 림프종, 또는 T-세포 역형성 대세포 림프종을 포함하는 과증식 질병을 비제한적으로 포함한다.
세포의 과증식으로 특징되는 암이 아닌 상태도 여기에 기재된 방법을 이용하여 치료될 수 있다. 예를 들면, 17-AAG가 세포의 과증식으로 특징되는 상태를 치료하기 위해 여기에 기재된 방법에 따라 투여될 수 있다.
그러한 암이 아닌 상태, 이상, 또는 질병의 예시적인 예는 위축 위염, 염증성 용혈 빈혈, 이식편 거부, 염증성 호중성백혈구감소증, 수포성 유천포창, 복강 질환, 탈수초 신경병증, 피부근육염, 염증성 창자병 (궤양성 대장염 및/또는 크론(Crohn's) 병), 다발 경화증, 심근염, 근육염, 코폴립, 만성 굴염, 보통천포창, 원발성 토리콩팥염, 건선, 외과적 유착, 협착 또는 재협착, 공막염, 공피증, 습진 (아토피성 피부염, 자극성 피부염, 알러지성 피부염 포함), 치주병 (즉, 치아주위조직염), 뭇주머니 콩팥병 및 I형 당뇨병을 비제한적으로 포함한다. 다른 예는 혈관염, 예를 들면 거세포 동맥염 (관자 동맥염, 타카야스 (Takayasu's) 동맥염), 결절다발 동맥염, 알러지 혈관염 및 육아종증 (척-스트라우스 (Churg-Strauss) 병), 다중맥관염 (polyangitis) 중첩 증후군, 과민성 혈관염 (헤노흐-쇤라인 (Henoch-Schonlein) 자색반), 혈청병, 약물-유발 혈관염, 감염성 혈관염, 종양성 혈관염, 연결 조직 이상과 관련된 혈관염, 도움체 계통의 선천성 결핍과 관련된 혈관염, 베게너 (Wegener's) 육아종증, 가와사키 (Kawasaki's) 병, 중추 신경계의 혈관염, 버거 (Buerger's) 병 및 전신성 경화증; 위장관 병, 예를 들면 췌장염, 크론(Crohn's) 병, 궤양성 대장염, 궤양성 직장염, 원발성 경화 쓸개관염, 특발성을 포함하는 임의의 원인의 양성 협착 (예, 담관, 식도, 십이지장, 소장 또는 결장의 협착); 호흡관 병 (예, 천식, 과민성 폐렴, 석면증, 규폐증 및 다른 형태의 진폐증, 만성 기관지염 및 만성 폐쇄기도병); 코눈물관병 (예, 특발성을 포함하는 모든 원인의 협착); 유스타키오관 병(예, 특발성을 포함하는 모든 원인의 협착); 뿐만 아니라 신경계 병, 진균성 병, 바이러스 감염, 및/또는 말라리아를 포함한다.
"처리하다(treat)" 및 "처치(treatment)"라는 용어는, 인간을 포함하는 포유류가 그 포유류의 상태를 직접 또는 간접으로 개선할 목적으로 의학적 도움을 받는, 임의의 방법, 작용, 적용, 요법 등을 의미한다. 치료는 전형적으로 여기에 기재된 유효량의 마이셀 조성물의 투여를 의미한다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는, 1) 암 세포 수의 감소; 2) 종양 크기의 감소; 3) 암 세포의 주변 기관으로의 침투를 억제 (즉, 어느 정도 늦춤, 바람직하게는 중지); 3) 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 늦춤, 바람직하게는 중지); 4) 종양 성장을 어느 정도 억제함; 5) 이상과 관련된 증후의 하나 이상을 어느 정도 완화 또는 감소; 및/또는 6) 활성 물질의 투여와 관련된 부작용의 완화 또는 감소를 비제한적으로 포함하여, 상태, 질병 또는 이상의 증후 중 하나 이상을 어느 정도 완화시키는 데 필요한 치료제의 양을 규정하고자 하는 것이다.
종양 형성, 종양 성장 또는 종양 세포 성장의 맥락에서 "억제"라는 용어는 다른 것들 중에서도 원발 또는 속발 종양의 지연된 출현, 원발 또는 속발 종양의 지연된 진전, 원발 또는 속발 종양의 감소된 출현, 질병의 2차적 효과의 지연되거나 감소된 정도, 종양 성장의 저지 및 종양의 퇴화에 의해 평가될 수 있다. 극도의 완전한 억제는 예방 또는 화학예방이라 할 수 있다. 상기 억제는 치료가 없이 일어날 진행에 대하여 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 90% 억제일 수 있다.
본 발명의 약제학적 용액 제제를 이용하여, 17-AAG 및/또는 항암 또는 세포독성 물질과 같은 활성 물질은 투여의 빈도수에 따라 약 4 mg/m2 내지 약 4000 mg/m2 범위의 투여량으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 17-AAG를 위한 투약법은 1주 당 약 400 내지 500 mg/m2, 또는 1주 당 약 450 mg/m2일 수 있다. 문헌 [Banerji 등, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22, 199 (2003, 요약 797)] 참조. 그렇지 않으면, 1주 당 약 300 mg/m2 내지 약 325 mg/m2, 또는 약 308 mg/m2의 투여량이 환자에 투여될 수 있다. 문헌 [Goetz 등, Eur. J. Cancer, 38 (Supp. 7), S54-S55 (2002)] 참조. 또 다른 투약법은 약 200 mg/m2 내지 약 360 mg/m2 (예를 들면, 환자의 상태 및 건강의 정도에 따라 약 200 mg/m2, 약 220 mg/m2, 약 240 mg/m2, 약 250 mg/m2, 약 260 mg/m2, 약 280 mg/m2, 약 300 mg/m2, 약 325 mg/m2, 340 mg/m2, 약 350 mg/m2, 또는 약 360 mg/m2) 범위의 투여량으로 주 2회 주사를 포함한다. 도세탁셀과 같은 여타 의약과 조합 치료를 위해 사용될 수 있는 투약법은 3주 마다 2종의 의약을 각각의 투여 시 약 500 mg/m2 내지 약 700 mg/m2, 또는 약 650 mg/m2 이하의 17-AAG 투여량으로 투여하는 것일 수 있다.
PEG-PLA 마이셀에서의 의약 조합
17-AAG 외에, 다른 활성 물질이 동일한 제조 과정에 의해 여기에 기재된 마이셀 내에 캡슐화될 수 있다. 예를 들면, 파클리탁셀-함유 마이셀이 17-AAG-함유 마이셀과 함께 제제에 사용될 수 있다 (각각의 마이셀이 상이한 활성 물질을 함유하는, "단순 혼합된" 마이셀 제제). 즉, 본 발명은 17-AAG 및 제2 활성 물질을 모두 포함하며, 17-AAG 및 제2 활성 물질이 모두 PEG-PLA 마이셀 내 캡슐화에 의해 수용액으로 가용화된 조성물을 제공한다. 예를 들면, 상기 조성물은 파클리탁셀 및 17-AAG의 양자를 단순 혼합된 마이셀 제제의 마이셀 중에 포함할 수 있다. 제제는 또한 17-AAG 및 제2 활성 물질의 양자를 마이셀 제조 과정으로 용해시켜 17-AAG 및 제2 활성 물질의 양자를 함유하는 개개의 마이셀을 형성하고, 따라서 "물리적으로 혼합된" 마이셀을 제공하며, 상기 마이셀의 하나 이상이 2종의 상이한 활성 물질을 함유하는 방법으로 제조될 수도 있다.
따라서, 17-AAG는 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항대사약, DNA 절단제, DNA 가교제, DNA 삽입제, DNA 작은 홈 결합제, 열 충격 단백질 90 (Hsp 90) 억제제, 히스톤 데아세틸라아제 억제제, 미세관 안정화제, 뉴클레오시드 (퓨린 또는 피리미딘) 유사체, 프로테아좀 억제제, 토포아이소머라아제 (I 또는 II) 억제제, 티로신 키나아제 억제제를 포함하는 다른 활성 물질(예, 항암제 또는 세포독성 물질)과 조합되어 투여될 수 있다 (예, 여기에 기재된 마이셀 중). 구체적인 활성 물질은 β-라파콘 (β-lapachone), 17-DMAG, 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin), 보르테조밉 (bortezomib), 부술판 (busulfan), 칼리케아마이신 (calicheamycin), 칼리스타틴 (callistatin) A, 캄프토테신 (camptothecin), 카페시타빈 (capecitabine), 카르젤레신 (carzelesin), CC-1065, 시스플라틴 (cisplatin), 클란페누르 (clanfenur), 크립토피신 (cryptophycins), 시클로스포린 (cyclosporine) A, 다우노루비신 (daunorubicin), 다아제팜 (diazepam), 디스코더몰리드 (discodermolide), 도세탁셀, 독소루비신 (doxorubicin), 두오카마이신 (duocarmycin), 다이네마이신 (dynemycin) A, 에포틸론 (epothilone), 에토포시드 (etoposide), 플록수리딘 (floxuridine), 플루다라빈 (fludarabine), 플루오로우라실, 게피티닙 (gefitinib), 겔다나마이신, 겜시타빈 (gemcitabine), 히드록시우레아, 이마티닙 (imatinib), 인터페론, 인터류킨, 이트라코나졸 (itraconazole), 이리노테칸 (irinotecan), 렙토마이신 (leptomycin) B, 메토트렉세이트 (methotrexate), 미토마이신 (mitomycin) C, 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 파클리탁셀, 스폰지스타틴 (spongistatins), 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 테니포시드 (teniposide), 티오테파 (thiotepa), 토포테칸 (topotecan), 트리코스타틴 (trichostatin) A, 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈데신(vindesine)을 포함한다. 함께 투여되는 항암제 또는 세포독성 물질은 단백질 키나아제 억제제일 수도 있다. 단백질 키나아제 억제제의 예는 라파마이신 (rapamycin); 퀴나졸린, 특히 이레사 (Iressa, AstraZeneca; N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민) 또는 타세바 (Tarceva, Roche/Genentech; N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-m-에톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 모노히드로클로라이드)와 같은 4-아닐리노퀴나졸린; 글리벡(Gleevec, Novartis; 4-[(4-메틸-1-피페라지닐)-메틸]-N-[4-메틸-3-[[4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]페닐]-벤즈아미드)와 같은 페닐아미노-피리미딘; BIBX 1382와 같은 피롤로- 또는 피라졸로피리미딘 (Boehringer Ingelheim; N8-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N-2-(1-메틸-4-피페리디닐)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민); 세막시닙(Semaxinib, Pharmacia; 3-[(3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌]-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온)과 같은 인돌 또는 옥스인돌; 벤질리덴 말로노니트릴; 플라보피리돌(Avetis; 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온)과 같은 플라본; CEP-701(Cephalon)과 같은 스타우로스포린(staurosporines); 헤르셉틴(Herceptin, Genentech)과 같은 항체; 및/또는 안지오자임(Angiozyme, Ribozyme Pharmaceuticals)과 같은 리보자임을 포함한다.
17-AAG와 특정의 다른 활성 물질의 조합은 상승의 항암 작용을 갖는다. 예를 들면, 상승작용은 17-AAG가 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 뿐만 아니라 상기 언급된 것 외의 여러 다른 물질과 조합되어 투여될 경우 관찰될 수 있다. 다양한 구현예에서, 이들 두 물질은 동일한 마이셀에 조합되거나 (물리적으로 혼합된 제제), 파클리탁셀 및 17-AAG를 별도의 마이셀에 개별적으로 포함하는 마이셀이 환자에 투여하기 위한 하나의 치료 제제로 조합될 수 있다 (단순 혼합된 제제), 다른 구현예에서, 17-AAG 마이셀은 17-AAG 외의 의약의 투여 이전, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 17-AAG 외의 의약은 여기에 기재된 마이셀 캡슐화에 의한 투여를 포함하여, 임의의 효과적인 수단에 의해 투여될 수 있다. 17-AAG는 환자를 민감하게 만들기 때문에, 효과적인 치료를 위해 보다 적은 양의 다른 의약이 필요하다.
뿐만 아니라, 의약 부하가 단일-물질 마이셀의 경우 수득가능한 최대 부하의 약 20% 이내가 되도록 2중-물질 마이셀을 제조할 수 있음이 예기치 않게 발견되었다. 이와 같은 경이적인 결과에 더하여, 그 코어에 두 활성 물질을 모두 함유하는 PEG-PLA 마이셀은 활성 물질 중 하나의 손실에 있어서 더욱 안정함이 밝혀졌다. 따라서, 2종의 활성 물질을 함유하는 마이셀에서, 활성 물질은 활성 물질의 방출에 있어서, 마이셀의 안정성을 증가시키는 방식으로 상호작용할 수 있음이 발견되었다. 즉, 17-AAG, 및 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에토포시드와 같은 제2 활성 물질을 함유하는 마이셀은 1종의 활성 물질만을 포함하는 마이셀보다 더 안정한 것으로 밝혀졌다.
이러한 발견은 치료 제제에서 상당한 양의 유기 용매 또는 계면활성제의 사용에 의지하지 않고 Hsp 90 억제제(예, 17-AAG) 및 화학치료제(다른 것들 중에서도 예를 들면, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에토포시드)의 투여를 가능하게 한다. 임상적 시도에서, 17-AAG 및 파클리탁셀의 조합은 DMSO 및 크레모포르® EL을 필요로 하여, 4 성분 혼합물이 된다. 그러한 제제의 성분들은 일부 환자에서 심각한 부작용을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 2종의 의약은 함께 혼합 및 주입될 수 없으며, 의약의 동시 투여에 의해 어떠한 의약 상승작용이 얻어질 수 없다 (Solit 등, Cancer Res., 2003;63:2139-2144). 파클리탁셀/PEG-PLA는 환자에게 안전하게 투여될 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 제넥솔(Genexol)-PM이 현재 단계 (phase) II 임상 시도에 있다. 또한, 17-AAG는 마이셀의 수의 실질적인 증가를 필요로 하지 않고 PEG-PLA 마이셀 내로 함께-부하될 수 있다. 상기 제제는 또한 유기 용매 또는 다른 계면활성제의 사용을 피할 수 있다.
따라서, 여기에 기재된 양쪽성 블럭 공중합체 (ABC) 마이셀 계를 이용하여 다양한 상태가 치료될 수 있다. 의약 상승작용이 마이셀의 사용에 의해 수득될 수 있으며, 이는 마이셀 전달 비히클 내 의약 캡슐화로 인하여 처리 투약법의 독성을 감소시킬 수 있다. 활성 물질의 조합이 마이셀에 사용될 수 있다. 단순 혼합된 및 물리적으로 혼합된 제제는 한 번의 투여, 예를 들면 IV 주입으로 2종의 상이한 활성 물질의 투여를 가능하게 한다. 특정의 유용한 조합 및 기술은 미국 특허 제 7,221,562 호(Rosen 등)에 기재되어 있다. 본 발명의 구현예에 사용될 수 있는 다른 양쪽성 공중합체는 미국 특허 제 4,745,160 호(Churchill 등)에 기재된 것들을 포함한다.
여기에 개시된 마이셀 조성물은 17-AAG에 대하여 예기치 못한 높은 부하 용량을 갖는 개선된 제제를 제공하며, 조절된 방출 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 의약 부하 2중-활성 마이셀은 단일 물질 마이셀의 의약 부하 용량에 접근하거나 이와 동일할 수 있음이 또한 발견되었다. 뿐만 아니라, 상기 2중-활성 마이셀에서 활성 성분들 사이의 상호 작용은 상기 마이셀의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 17-AAG는 단순 혼합된 제제 및 또한 물리적으로 혼합된 제제 모두에 있어서, 2중 물질 마이셀 제제를 위한 안정화제로 작용할 수 있다.
이하의 실시예는 상기 발명을 예시하고자 함이며 그 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 아니된다. 당업자는 이들 실시예가 본 발명이 실시될 수 있는 많은 다른 방법을 시사함을 쉽게 인식할 것이다. 본 발명의 범위 내에 있으면서 다수의 변화 및 수정이 가해질 수 있음이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1. PEG-PLA 마이셀 중 17-AAG 캡슐화
17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신의 제조. 겔다나마이신(GA)(LC Laboratories, Woburn, MA)으로부터 실험실에서 (17-AAG)를 합성하였다. 요약하면, 100 mg의 GA(0.2 mmol)를 2 mL의 무수 CH2Cl2에 용해시켰다. 다음, 5 당량의 알릴아민(57.1 g/mol, d = 0.763 g/mL)을 상기 플라스크에 적가하였다. TLC 분석에서 완료될 때까지 (약 2 일)(95:5 CHCl3:MeOH, Rf 0.21) 낮은 광선 하에 반응물을 실온(RT; ~23℃)에서 교반하고, 헥산(3x)으로 침전시키고, 2000 g's에서 15 분 동안 원심분리한 다음, 증발건고하였다.
Figure pct00002
의약 부하된 PEG - PLA 마이셀의 제조 및 특성화.
17-AAG를 PEG-PLA(12:6 kDa)(Polymer Source, Montreal, Canada)와 함께 디메틸아세트아미드(DMAc)에 용해시키고, 카타오카(Kataoka)와 공동연구자(J. Control. Release 62 (1-2) (1999) 89-100)에 의한 과정에 따라 H2O에 대하여 투석하였다. 예를 들면, 5 mg의 17-AAG 및 45 mg의 PEG-PLA(10:90 w/w)를 10 mL의 DMAc에 용해시켰다. 수득되는 용액을 3500 MWCO 관(SpectraPor)에서 H2O에 대하여 투석하였다. 수득되는 마이셀을 5000 g's에서 10 분 동안 원심분리하여 함입되지 않은 의약을 침전시켰다. 마이셀 내로의 함입은 마이셀에 대한 굴절율 및 17-AAG의 흡광도(UV λ332)에 근거하여 해당 체류 시간을 확인함으로써 수성 GPC(Shodex SB-806M)를 이용하여 검증되었다. 마이셀 용액을 실온에서 감압 하에 회전식 증발에 의해 농축시킨 다음, 원심분리(5000 g's에서 10 분)하였다. 도 8은 단리된 PEG-PLA 마이셀(18,000 x)의 투과 전자 현미경(TEM) 사진을 보여준다.
마이셀에서 정량적인 의약 부하는 역상 HPLC(Shodex C18 컬럼, 65-82.5 : 35-17.5 MeOH에서 55% MeOH + 0.2% 포름산 구배, 40℃, 332 nm 검출)를 통하여 17-AAG에 대한 곡선 아래의 면적(AUC)(17-AAG 보정 곡선 기준)을 모니터링함으로써 측정되었다. 의약을 포함하거나 포함하지 않는 PEG-PLA 마이셀의 유효 직경은 가우스 강도 맞춤으로 브룩하벤 (Brookhaven) 동적 광 산란 장치(100 mW, 532 nm 레이저)를 이용하여 측정하였다. 이들 PEO-b-PDLLA 마이셀에 대한 임계 마이셀 농도(CMC)는 다양한 농도의 PEG-PLA(3x10-5 mg·mL-1 내지 1 mg·mL-1)의 존재 하에 피렌의 339/334-nm 여기 비를 측정함으로써 결정되었다.
요약하면, PEO-b-PDLLA 마이셀을 일련의 희석으로 전술한 바와 같이 제조하고, 80℃에서 1 시간 동안 0.6 μM 피렌과 함께 항온처리한 다음, RT에서 15 시간 동안 어두운 데 놓아두었으며, 피렌의 형광 방출을 390 nm(RF-5301 PC 분광형광계, Shimadzu)에서 측정하였다. 피렌은 그 미세환경 극성에 반응하여 잘 알려진 광물리적 변화를 일으킨다 (Colloids Surf., A Physiochem. Eng. Asp. 118 (1996) 1-39). 피렌이 주로 PEO-b-PDLLA 마이셀의 소수성 코어로 분배되면서 339 / 334 nm 여기의 비로 급격한 증가가 CMC에서 일어난다 (J. Control. Release 77(1-2) (2001) 155-160).
실시예 2. PEG-PLA 마이셀을 이용하는 17-AAG를 위한 크레모포르 ® -비함유 제제: 쥐에서의 특성화 및 약동학
17-AAG를 가용화하기 위한 나노담체로서 폴리(에틸렌 옥시드)-블럭-폴리(D,L-락티드)(PEG-PLA)로 이루어진 분해가능한 양쪽성 디블럭 중합체와 같은 양쪽성 블럭 공중합체 (ABC) 마이셀의 제조는 실시예 1에서 위에 기재하였다. 상기 나노담체의 약동학적 성질을 본 실시예에서 CrEL-EtOH-PEG400 중 17-AAG의 현재 제제와 비교한다.
PEG-PLA 마이셀 의약 방출 연구. 방출 실험은, 아이젠베르크 및 공동연구자(Soo 등, Langmuir 18 (2002) 9996-10004)의 방법을 기초로 하여, 온도 및 pH 조절을 위한 종래에 보고된 수정법을 이용하였다 (Forrest 등, J. Control. Release 116(2) (2006) 139-149). 마이셀 의약 용액을 전술한 바와 같이 10% w/w 의약을 갖는 0.3 mM PEG-PLA 중합체로 제조하고, 2.0 mL의 마이셀 용액을 10,000 MWCO 투석 카세트(Pierce, Rockford, IL)(n = 3) 내에 주입하였다. 투석 카세트를 37℃의 잘-혼합된 온도-조절된 수조에 넣고, 15 내지 20 분마다 조의 부피를 새롭게 해주었다. 컴퓨터 제어되는 연동 펌프가 2염기성 및 단염기성 인산염의 50 g/L 용액을 별도로 주입하여 pH를 7.4 ± 0.1로 유지시켰다 (사내 구축된 장치). 고정된 시점에, 투석 카세트 부피를 ddH2O로 2 mL가 되게 하고, 필요하다면, 100 μL의 분액을 취하였다. 이를 100 μL의 MeOH와 혼합하고, 그 혼합물 40 μL를 역상 HPLC로 분석하였다 (Shodex C18 컬럼; 65-82.5 : 35-17.5의 A:B, 여기에서 A: MeOH 및 B: 55% MeOH + 0.2% 포름산; 40℃; 332 nm 검출).
시험관내 세포독성 연구. PC-3 인체 전립선 세포(ATCC CRL-1435)를 RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT)에서 배양하고, MCF-7 인체 유방암 세포(ATCC HTB-22)를 DMEM(Hyclone)에서 배양하였으며, 둘 다 10% 소 태아 혈청(Hyclone), 100 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신(Cambrex Biosciences, Baltimore, MD), 및 2 mM L-글루타민(Cambrex Biosciences)을 보충하였다. 세포 주를 3000 세포/웰의 초기 밀도로 96-웰 플레이트에서 90 μL의 적절한 배지 중 평판배양하고, 5% CO2 대기 하 37℃에서 유지하였다. 24 시간 후, DMSO 중 17-AAG를 성장 배지로 10-배 희석하고 10-μL 분액으로 웰(3 웰 반복, n = 6)에 가하였다 (1% v/v 최종 DMSO 농도). 의약-부하된 마이셀 또는 마이셀 만을 밀리큐(MilliQ) 물에서 조제하였다 (이어서 DMSO 투석하여 마이셀을 형성). 웰에 가하기 전 시료를 더 희석할 필요는 없었다. 세포를 모든 시험 화합물과 함께 72 시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 레사주린(resazurin) 염료(Sigma-Aldrich)를 이용하여 세포의 대사 속도를 측정하였다. 데이터를 힐-슬로프(Hill-Slope) 곡선(Sigma Plot 9.0, Systat Software, Inc.)에 맞추어, 세포 성장을 대조예에 비하여 50%만큼 억제하는 농도(IC50)를 결정하고, 각 측정치의 평균 ± 표준 편차로 보고한다.
약동학 연구. 17-AAG에 대한 표준 비히클은 쯔홍(Zhong) 등에 따라 조제하였는데 (미국 출원 공보 제 2005/0256097 호), 2:1:1 EtOH:CrEL:PEG400 중 15 mg/mL의 17-AAG를 주입 직전 3 mg/mL로 희석하였다. 이들 마이셀에 대한 함입 방법 및 의약 방출은 약간의 수정을 가하여 문헌에 기재된 대로 수행하였다 (Forrest 등, J. Control. Release 110(2) (2006) 370-377). 수컷 스프라그 돌리 쥐의 우측 경정맥에 캐뉼라를 꽂고, 신규 제제 (PEG-PLA 중 1.5 mg/mL 17-AAG) 또는 CrEL-EtOH-PEG400의 표준 제제를 각각 10 mg/kg(각 처리군에 대하여 n = 5)으로 정맥내 투여하였다. 투여 후, 일련의 혈액 시료(~0.30 mL) 및 소변 시료를 24 시간까지 수거하였다.
100 μL의 혈청 또는 소변에, 100 μL의 내부 표준을 가하였다 (25 μg/mL 겔다나마이신). 시료를 1 mL의 EtOAc로 추출하고 유기 분획을 건조 및 농축시켰다. 잔류물을 400 μL의 초기 이동 상에서 재구성하고, 원심분리하고, 150 μL를 RP-HPLC 내로 주입하였다. 17-AAG를 제네시스 (Genesis) 3 μm C18 33 mm x 4.6 mm 컬럼 상에서 1 mL/분으로 A: 50 mM 아세트산 + 10 mM TEA 및 B: MeOH + 10 mM TEA (0-3 분 40% B, 3.01-11 분 80% B, 11.01-18 분 40% B) 중 305 nm에서의 내부 표준을 이용하여 332 nm에서 분석하였다. 약동학적 변수는 윈논린(WinNonlin®) 소프트웨어 (ver. 5.01) 및 비-구획 모델링을 이용하여 계산하였다. 모든 동물 연구는 문헌["Principles of laboratory animal care" (NIH publication No. 85-23, 개정 1985)]에 준하여 수행하였다.
생체분포 연구. 상기 제제의 17-AAG의 조직 분포에 대한 효과를 평가하기 위해, 쥐(각 군 n = 5, 200-240 g)에 캐뉼라를 꽂고 CrEL-EtOH-PEG400 중 17-AAG 또는 PEG-PLA 마이셀 중 17-AAG를 정맥 내 투여하였으며, 모든 것은 전술한 약동학 연구와 동등하였다. 제제 주사 후 3 시간에, 각 동물(각 시점의 경우 n = 5)을 마취하고 심장 천공에 의해 채혈하였다. 뇌, 폐, 심장, 간, 비장, 신장, 방광, 근육 및 뼈, 뿐만 아니라 전체 혈액 및 혈청의 시료를 수거하였다. 조직 시료를 종이 타올로 빨아들이고, 빙냉의 염수로 세척하고, 병에 담아 과도한 체액을 제거하고, 칭량하고, 액체 질소에서 급속 냉동한 다음, 막자와 공이를 이용하여 액체 질소 하에 미세한 분말로 분쇄하여, HPLC 분석에 의해 의약 농도에 대하여 평가할 때까지 -70℃에 보관하였다.
데이터 분석. 수집된 데이터는 달리 명시되지 않는 경우 평균 및 평균의 표준 오차 (평균 ± SEM) 또는 평균 및 표준 편차(평균 ± SD)로 나타낸다. 가능한 경우, 데이터를 NCSS 통계 및 세력 분석 소프트웨어(NCSS, Kaysville, UT)를 이용하여 통계적 유의성에 대하여 분석하였다. 짝을 이루지 않은 시료의 경우 스튜던트의 t-시험을 이용하여 p < 0.05인 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과 및 토의
겔다나마이신 (GA)는 수용해성이 불량하다. 전형적인 약제학적 담체 중 GA 제제는 간이 1차적 제거 경로이므로 간 독성이 심하다. 17-DMAG 및 17-AAG와 같은 유사물은 GA보다 낮은 간독성을 나타내지만, 부분적으로 그들의 넓은 분포로 인하여 증가된 비특이적 독성으로 특징될 수 있다. 따라서, 나노담체 제제가 매우 필요하다. 이 실험들은 PEG-PLA 마이셀의 생체적합성, 제조 용이성, 동력학 및 열역학적 안정성 및 다량의 친수성 의약을 가용화할 수 있는 능력이 본 발명의 마이셀 제제와 함께 사용될 수 있는 나노담체 계를 제공할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 것이다. 다양한 양의 17-AAG를 PEG-PLA 마이셀에 가용화하였다 (표 1).
Figure pct00003
향상된 용해도 및 17-AAG를 전달하기 위한 강력한 계면활성제를 함유하지 않는 것은 본 마이셀 제제가 CrEL을 함유하는 현재의 전달 비히클보다 훨씬 우수하다는 것을 보여준다.
마이셀의 물리적 특징. 동적 광 산란(Brookhaven Instruments Corporation)은 의약이 없는 경우 242±5 nm의 평균 크기를 갖는 PEG-PLA (12:6 kDa) 마이셀을 나타냈고, 의약으로 부하된 경우 1.5 mg/mL 이하의 17-AAG를 가용화하는, 257±2 nm를 나타냈다. PEG-PLA(12:6 kDa)는 350 nM(도 1(b))의 낮은 임계 마이셀 농도(CMC)를 갖는 것으로 밝혀졌고, 이는 마이셀이 마이셀 형성의 깁스 자유 에너지에 의해 주어지는 높은 열역학적 안정성을 가짐을 의미한다:
Figure pct00004
PEG-PLA (12:6 kDa) 마이셀에 대하여 여기에서 보고된 크기 및 CMC는 카타오카 등에 의해 종전에 보고된 것(J. Control . Release 62(1-2) (1999) 89-100)보다 상당히 더 크다. 마이셀 중 17-AAG의 캡슐화는 유기 용매로 DMSO를 사용하여 수행되었지만, DMAc의 사용은 투석 방법을 이용하여 마이셀을 형성할 경우 유리하였다. 부하 실험은 17-AAG를 가용화하기 위한 PEG-PLA 마이셀의 적합성을 평가하기 위해 10% w/w에서 연구되었다.
표 1에서 17-AAG 부하의 보고된 값은 PEG-PLA를 기준으로 17-AAG의 10% w/w 부하를 나타낸다. 마이셀 내로 의약의 함입은 굴절율(마이셀) 및 17-AAG (UV λ332)에서 동등한 체류 시간을 모니터링함으로써 수성 GPC(Shodex SB-806M)를 이용하여 검증되었다. 17-AAG 대 PEG-PLA의 몰비는 0.73 ± 0.09 대 1의 범위였고, 17-AAG 부하 효율은 19 ± 3% w/w였다. 회전식 증발에 의한 농축 후, 17-AAG의 0.3-mM PEO6000-b-PDLLA12000 중 최대 용해도는 약 1.5 ± 0.2 mg/mL로, 17-AAG(National Cancer Institute에 의하면 ~10 μg/mL)에 비하여 약 150 배의 향상이었다. 의약에 1:1 비의 알파-토코페롤을 도입하는 것이 라파마이신의 경우 종래에 보고된 바와 같이 부하를 개선하기 위해 시도되었으나 (J. Control. Release 110(2) (2006) 370-377), 수득되는 마이셀은 크고 (> 500 nm) 불안정하였다. 상기 의약은 심지어 4℃에서도 4-5 시간 후 용액으로부터 침전된다. PEG-PLA (12:12 kDa) 마이셀 중 의약 부하는 PEG-PLA (12:6 kDa) 마이셀(1.5 mg/mL)에 비하여 매우 불량하였으며 (<0.5 mg/mL), 알파-토코페롤의 존재 및 부재 하에도 그러하였다.
17-AAG 방출 연구. 명목상의 체온에서 PEG-PLA 마이셀로부터 17-AAG의 시험관내 방출 동력학을 37℃ 물에 대한 의약-부하된 마이셀의 투석에 의해 연구하였다. 17-AAG의 낮은 용해도로 인하여, 조의 연속적인 정화 없이 방출 매질이 급속히 포화되었다. 그러므로, 방출 데이터의 분석에서 제약은 PEG-PLA 마이셀로부터 직접 17-AAG 의 방출을 측정할 수 없다는 것이었다. 일단 의약이 PEG-PLA 마이셀로부터 방출되면, 이는 투석 막을 가로질러 확산되어야 하므로, 제2 확산 장벽을 도입하고 분석을 복잡하게 한다. 투석 막이 전체 방출 속도에 중대하게 기여하는지를 결정하기 위해, 카세트에 유리 17-AAG(물로 희석되기 이전, 먼저 최소량의 MeOH에 용해된)를 부하시키고, 방출 동력학을 측정하였다. PEG-PLA 마이셀은 대략 4 시간의 반감기로 방출을 나타냈고 (도 2), 의약 만의 것에 비하여 2 배의 향상을 나타냈다.
시험관내 세포독성 연구. 마이셀-캡슐화된 17-AAG의 MCF-7 인체 유방암 및 PC-3 전립선암 세포에 대한 성장 억제 활성을 레사주린 염료를 이용하여 시험관내에서 측정하여 대사 활성을 분석하였다. 17-AAG는 MCF-7에서 22±14 nM의 IC50 및 PC-3 세포에서 IC50 74±14 nM로, 마이크로몰 이하 농도에서 활성이었으며; 모든 값은 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 의해 보고된 범위 내였고: 각각 MCF-7의 경우 12.6 nM의 IC50 및 PC-3의 경우 50.1 nM이었다. 비교하면, 의약-캡슐화된 마이셀은 MCF-7에서 160±56 nM 및 PC-3 세포에서 536±13 nM의 IC50을 가졌다 (표 2).
Figure pct00005
IC50 값에서 이러한 차이는 마이셀로부터 의약의 지속된 방출, 뿐만 아니라 폐쇄된 계에서 방출과 다시 마이셀 코어 내로의 의약 분배 사이에 도달되는 궁극적인 평형으로 인한 것일 수 있다. 마이셀 단독물질은 조사된 세포주에서 분명한 독성을 나타내지 않았다 (IC50 > 10,000 nM). 캡슐화된 의약은 17-AAG보다 낮은 활성을 가진 것으로 나타났으나, 나노캡슐화는 향상된 종양 축적으로 인하여 생체 내에서 17-AAG 전달의 전체적인 효능을 증가시키는 것으로 생각된다. 유사하게, 리(Li) 등은 폴리-(L-글루탐산)-파클리탁셀 결합물이 시험관내에서 파클리탁셀보다 실질적으로 약하지만, 종양에서의 향상된 축적으로 인해 생체 내에서는 더 나은 활성을 나타내었음을 보고하였다 (Cancer Res. 58 (1998) 2404-2409).
약동학 연구. CrEL-EtOH-PEG400를 갖는 표준 제제와 비교한 PEG-PLA(12:6 kDa) 마이셀 제제의 약동학적 윤곽에서의 차이를 도 3에 나타낸다. 마이셀 제제는 대조 제제에 비하여 24 시간 까지 마이셀 제제로부터 17-AAG의 유효 정량에 의해 관찰된 바와 같이 주사 24 시간 후 증가된 혈청 AUC를 나타냈다 (도 3a) (정량 한계 아래로 되기 전 12 시간까지만 유효 정량). 상기 마이셀 제제는 또한 24 시간 후 소변에 17-AAG의 증가된 존재(도 3b), 36 시간에 걸쳐 보다 높은 신장 청정 속도 (도 3c), 및 주사 48 시간 후 소변에서 보다 높은 수준의 의약(도 3d)을 나타냈다. PEG-PLA 마이셀의 곡선 아래의 혈청 면적(AUC)은 표준 제제의 1.3 배였다. 10 mg/kg에서 (표 3), 총 청정(CL 총)은 표준 비히클에 비하여 마이셀 제제에 있어서 1.3 배 감소하였고, 의약의 신장 청정(CL 신장)은, 보다 높은 (1.5 배) 간 청정(CL 간)을 나타낸 표준 비히클에 비하여, 마이셀 제제에 있어서 증가되었다 (4.3 배).
Figure pct00006
PEG-PLA (12:6 kDa) 마이셀 제제는 의약의 혈청 반감기(t1/2)를 2.7 배 증가시켰다. 대조 표준 비히클 제제에 비하여 낮은 총 청정(1.3 배 감소), 높은 혈청 (2.7 배 증가) 및 소변 중 반감기 (1.2 배 증가)에 의해 관찰되는 바와 같이, 마이셀 제제의 경우 분배 부피(Vd)의 증가(1.7 배)가 혈액 중 그의 지속된 존재로 인하여 관찰되었다. 의약의 신장 청정(CL 신장)은 표준 비히클에 비하여 마이셀 제제의 경우 증가되었고 (4.3 배), 이는 보다 높은(1.5 배)의 간 청정(CL 간)을 나타냈다. 마지막으로, 두 제제들 사이에 평균 체류 시간(MRT)에 있어서는 유의한 차이가 발견되지 않았다.
두 제제들 사이에 전체적인 약동학적 변수는 많이 다르지 않지만, 여기에 나타난 결과는 17-AAG PEG-PLA 마이셀 나노담체 제제에 의해 부정적인 부작용의 상당한 감소가 얻어질 수 있음을 보여준다. 표준 제제는 환자에게 과민증을 일으키는 것으로 알려진 유해 계면활성제인 CrEL을 포함한다. CrEL 제제의 사용은 항-히스타민제 및 스테로이드의 사전 처치를 필요로 한다 (Sydor 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2006; 103 (46), 17408-13). 본 발명에 따르는 마이셀 제제는 그러한 사전 처치를 필요로 하지 않을 것이다.
PEG-PLA 마이셀 중 17-AAG는 쥐에서 잘 허용된다. 연구 기간에 걸쳐 독성의 급성 징후가 관찰되지 않았다. 또한, CrEL-EtOH-PEG400의 표준 제제의 경우 관찰된 24 시간 내 35%의 사망율에 비하여, 나노담체 제제의 경우 사망율이 관찰되지 않았다. 즉, PEG-PLA 마이셀 나노담체 제제 중 17-AAG는 EtOH 및 CrEL과 같은 독성 물질이 필요없이 17-AAG의 약동학적 성질을 유지할 수 있다. 따라서, 상기 제제는 유망한 화학치료제인 17-AAG를 암 치료에 사용하기 위한 새로운 방법을 제공한다.
생체분포 연구. 모든 분석된 조직에서 정량가능한 양의 17-AAG가 관찰되었다 (도 4(a)). 조직 수거는 다양한 제제를 10 mg/kg으로 IV 투여한 후 3 시간에 수행되었다. 대조 제제의 경우 17-AAG 농도의 가장 높은 것부터 가장 낮은 것까지의 순서는 폐 > 신장 > 간 > 비장 > 심장 > 뇌 > 방광 > 뼈 > 근육 > 혈청 > 전체 혈액이었다. 마이셀 제제의 경우, 가장 높은 농도부터 가장 낮은 것까지의 순서는 폐 > 신장 > 간 > 비장 > 뇌 > 뼈 > 방광 > 심장 > 근육 > 혈청 > 전체 혈액이었다. 마이셀 계는 17-AAG의 뇌, 심장 및 방광 내로의 조직 분포에서 약간의 차이를 제공한 한편, 분석된 다른 조직에서는 표준 제제와 유사한 농도가 발견되었다. 마이셀 제제의 경우 모든 조직에서 조직 대 혈청 비(Kp) 값은 (도 4(b)) 대조보다 낮았다. 표준 제제(CrEL-EtOH-PEG400) 및 마이셀 제제에 캡슐화된 17-AAG의 경우 투여에 따르는 Kp 값은 (도 4 아래 패널) 뇌, 심장, 방광 및 전체 혈액에서 통계적으로 차이가 있었으며, 조직 간에 어느 정도 분배 우위를 나타낸다 (도 4(b)). 일부 조직들 사이에서 제제들 간의 Kp 값의 차이는 대조 및 본 발명에 따르는 마이셀 제제 사이에 담체의 배치, 분배, 청정 및 17-AAG의 분배된 부피의 차이를 포함하는 여러 가지 요인에 기인할 수 있다.
결론
적합한 제제의 부족이 17-AAG의 임상적 시도로의 진입을 억제하였다. 17-DMAG(알베스피마이신)과 같은 보다 새로운 유도체가 수용해도와 관련된 일부 문제점을 극복하였다. 그러나, 간에 의한 이들 유도체의 우세하고 신속한 청정이 의약의 종양 내로의 분배를 제한하고, 그에 의해 의약의 효능을 심각하게 제한한다. 유기 보조-용매 또는 강력한 계면활성제를 필요로 하지 않는 17-AAG의 제제가 제조되었다. 상기 제제는 PEG-PLA (12:6 kDa) 마이셀에 1.5 mg/mL의 17-AAG를 가용화할 수 있다. 유기 보조-용매 또는 계면활성제를 필요로 하지 않는 17-AAG 의 두 번째 제제가 제조되었다. 상기 제제는 PEG-PLA (2:2 kDa) 마이셀에 약 5 mg/mL의 17-AAG를 가용화할 수 있다. PEG-PLA 마이셀 내에 파클리탁셀 캡슐화를 이용한 유사한 연구는 상기 보다 안전한 마이셀 제제는 상기 의약을 환자에게 투여한 후 CrEL과 관련된 나쁜 부작용을 최소화할 수 있음을 나타냈다. 뿐만 아니라, 나노규모의 치수는 목표화 리간드가 없이도 EPR 효과를 통해 의약의 종양 특이성에 더 유익을 줄 것이다.
실시예 3. 중합체 조성물 및 의약 부하
본 발명에 따르는 특정의 구체적인 마이셀을 표 4 및 5의 데이터에 의해 예시된 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00007
표 4에서 제조된 마이셀의 각 시료에 대하여, 의약 및 중합체를 (~60℃에서) 용해시키기 위해 0.5 mL의 아세토니트릴(AcCN)을 사용하였고, 그 후 용액을 농축시키고 0.5 mL의 탈이온수(DW)를 가하여 마이셀을 형성하였다. 마이셀을 0.45 μm 세공 필터를 이용하여 여과하여 단리하였다. 파클리탁셀/17-AAG 2중 물질 마이셀(PAX + AAG)의 경우, 의약 대 중합체 비는 각 의약의 질량에 의해 계산되었다. 예를 들어, 1:2.5 의약:중합체 비의 마이셀의 경우 2 mg의 파클리탁셀 및 2 mg의 17-AAG를 5 mg의 PEG-PLA 중합체(2K-2K)를 이용하여 가용화하였다 (즉, 상기 비는 의약의 총량이 아니라, 1종의 의약 질량에 의해 계산되었다).
Figure pct00008
표 5는 파클리탁셀 (PAX), 17-AAG, 또는 함께 부하된 두 의약을 캡슐화하는 다양한 PEG-PLA 마이셀의 물리적 안정성을 보여준다. 표의 값들은 실온에서 증류수 보관 24 시간 후 마이셀에 의해 남아있는 활성 물질의 양을 나타낸다. 17-AAG를 단독으로 또는 파클리탁셀과 조합하여 캡슐화하는 마이셀은 파클리탁셀 단일 물질 마이셀보다 상당히 더 안정하였다. 17-AAG/도세탁셀 또는 17-AAG/에토포시드의 조합을 함유하는 마이셀의 경우 유사한 안정성 결과가 수득되었다 (도 12-15 참조). 도 10은 탈이온수에 용해될 수 있는 의약 제제의 양을 보여준다 (mg/mL).
5K:6K(각각 PEG:PLA)의 블럭 크기를 갖는 PEG-PLA 마이셀은 파클리탁셀 단독 물질 또는 17-AAG 단독 물질을 약 5 mg/mL로 적합하게 가용화한다. 그러나 상기 파클리탁셀 마이셀은 마이셀로부터 파클리탁셀의 침전에 의해 17-AAG 마이셀보다 (24 시간에 걸쳐) 더 빨리 마이셀 코어로부터 의약을 상실한다 (예를 들면, 파클리탁셀 수용해도의 상실). 17-AAG 마이셀은 특정의 다른 활성 물질 만을 (예, 파클리탁셀) 함유하는 마이셀보다 상당히 더 안정하고 용해성인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 17-AAG는 마이셀 안정화제로 간주될 수 있다.
파클리탁셀 및 17-AAG의 양자가 PEG-PLA 마이셀 내에 동시에 부하될 경우 예기치 못한 결과가 발견되었다. 이들 마이셀에서, 각 의약의 가용화는 각각의 의약이 스스로 PEG-PLA 마이셀에 의해 부하될 경우 수득되는 수준에 접근하였다. 예를 들면, 5K:6K 마이셀에서,두 의약 각각에 대하여 약 4-5 mg/mL 부하가 수득되었다 (의약 단독의 경우 약 5 mg/mL에 비교).
이러한 전례가 없는 결과에 더하여, 두 의약을 모두 그 코어에 함유하는 PEG-PLA 마이셀은 비-17-AAG 활성 물질의 손실에 있어서 더 안정한 것으로 나타났다 (도 11 참조). PEG-PLA 마이셀의 코어에서 활성 물질들, 예를 들면 17-AAG 및 파클리탁셀 사이의 상호작용이 마이셀 안정성을 증가시켰음이 발견되었다. 5K-6K 및 12K-6K PEG-PLA를 갖는 중합체성 마이셀은 마이셀의 1:7.5 의약:중합체 비에서 추가의 안정성을 나타냈다. 도세탁셀 또는 에토포시드와 함께 17-AAG를 포함하는 마이셀의 경우에 동일한 결과가 나타났다. 따라서, 17-AAG(Hsp90 억제제) 및 화학치료제(예, 파클리탁셀, 도세탁셀, 테니포시드, 및/또는 에토포시드)의 조합이 유기 용매, 계면활성제 등에 의지하지 않고 투여될 수 있다.
이들 결과를 또한 도 10 및 11에 나타내는데, 이는 17-AAG 및 에토포시드, 도세탁셀 및 파클리탁셀의 PEG-PLA 마이셀(PEG-PLA 5K6K, 의약:중합체 비 = 1:7.5)에 의한 공-가용화의 결과를 보여준다. 구체적으로, 도 10은 PEG-PLA 마이셀에서 파클리탁셀 및 17-AAG가 함께 가용화됨을 보여준다. 2K-2K 및 12K-3K PEG-PLA로부터 제조된 마이셀들은 1:5 미만의 의약:중합체 비에서 보다 낮은 의약 가용화 결과를 제공하였다. 5K-3K, 5K-6K, 및 12K-6K PEG-PLA로부터 제조된 마이셀은 1:7.5 의약:중합체 비에서 가장 높은 가용화를 제공하였다.
에토포시드 및 도세탁셀은 파클리탁셀 및 17-AAG와 동일한 방식으로 17-AAG로 공-가용화될 수 있다. 또한, 17-AAG 의 존재 하에 24 시간에 걸쳐 더 많은 에토포시드가 용액 중에 머무른다. 도 12 내지 15는, 물에서 PEG-PLA 마이셀로부터의 의약 방출을 포함하여, 일정 량의 분해로 인해, 제2 활성 성분(파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에토포시드)의 침전 시 광학 밀도 변화를 보여준다. 17-AAG를 함유하는 마이셀은 이러한 분해가 일어나는 것을 방지하고/하거나 억제한다.
도 12(a)-(d)는 파클리탁셀/17-AAG 마이셀의 용해도 및 그의 24 시간 후 안정성을 보여준다 (PEG-PLA 5K:6K, 의약:중합체 비 = 1:7.5). 입자 크기 데이터를 생성하기 위해 맬번 제타사이저(Malvern Zetasizer)를 사용하였다. 도 12(c)는 98%를 초과하는 PAX 및 97%를 초과하는 17-AAG가 24 시간 후 마이셀 내에 남아 있었음을 보여준다. 도 12(d)는 24 시간 후 PAX-단독 마이셀에 단 8%의 PAX만이 남아 있어, 17-AAG의 존재가 물리적으로 혼합된 마이셀에 상당한 안정성을 제공함을 보여준다.
에토포시드(ETO) 및 에토포시드/17-AAG 마이셀(도 13(a)-(d)) 및 도세탁셀 (DCTX) 및 도세탁셀/17-AAG 마이셀(도 14(a)-(d))의 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다. PEG-PLA 5K:6K로부터 제조된 마이셀을 사용하여, 1:7.5 (w/w)의 의약:중합체 비로, 도 13 및 14에 대한 데이터를 제조하였다. 도 13(c)는 24 시간 후 마이셀에 거의 100%의 에토포시드 및 17-AAG가 남아 있음을 보여주는 한편, 에토포시드-단독 마이셀에서는 에토포시드의 상당한 손실이 관찰되었다 (도 13(d): 70% 이상의 평균 손실율 (n=3)). 에토포시드-단독 마이셀로부터는 단 1-2 시간 후 에토포시드가 침전되기 시작한다.
도 14(c)는 도세탁셀-단독 마이셀에 비하여 도세탁셀을 갖는 마이셀 중 17-AAG의 포함이 안정성의 상당한 증가를 제공하였음을 보여준다. 도세탁셀 및 17-AAG 모두 95% 이상이 24 시간 후 마이셀에 남은 한편, 도세탁셀-단독 마이셀에서는 도세탁셀의 상당한 손실이 관찰되었다 (도 14(d): 73.2% 이상의 평균 손실율 (n=3)). 도세탁셀은 단지 2 시간 후에 도세탁셀-단독 마이셀로부터 침전되기 시작하였다.
도 15(a) 및 16(b)는 또한, 파클리탁셀에 더하여, 17-AAG가 마이셀 내에 함입된 경우 마이셀에 제공된 추가의 안정성을 보여준다. 의약-마이셀에서 광학 밀도(OD) 변화의 측정은 담금 탐침을 갖는 배리언(Varian® Cary) 50을 이용하여 650 nm(RT)에서 수행되었다 (0 내지 1440 분; 15분 마다; 포착: 0.1 초). 5K:6K PEG-PLA 마이셀과 함께 1:7.5 의약:중합체 비를 사용하였다. 파클리탁셀 캡슐화된 마이셀은 13.4% 파클리탁셀(w/w)로 부하되었고, 파클리탁셀/17-AAG 2중-물질 마이셀은 26.8%의 의약 부하로 부하되었다 (합쳐서; 각 의약 13.4%). 도 15(a)는 상당한 양의 파클리탁셀이 상기 파클리탁셀 캡슐화된 마이셀로부터 손실된 반면, 파클리탁셀/17-AAG 마이셀은 24 시간에 걸쳐 실질적으로 안정함였음을 보여준다 (도 15(b)).
단순 혼합된 마이셀 조성물을 제조하였을 때 또 하나의 예기치 못한 결과가 관찰되었다. 예를 들면, PEG-PLA 마이셀을 제조하였는데, 마이셀의 하나의 시료는 파클리탁셀을 캡슐화하였고, 마이셀의 두 번째 시료는 17-AAG를 캡슐화하였다. 마이셀의 두 시료를 단일의 수성 제제로 조합하였을 때, 파클리탁셀 단일 물질 마이셀이 PEG-PLA 마이셀의 순수한 파클리탁셀 단일 물질 제제보다 침전에 대하여 더 안정하였다. 즉, 17-AAG 마이셀을 갖는 제제에서 파클리탁셀 캡슐화된 마이셀은 오직 파클리탁셀만 함입된 PEG-PLA 마이셀로 만들어진 제제에 비하여 증가된 안정성을 가졌다. 일부 구현예에서, 활성 물질의 평형이 제제 내 마이셀들 사이에 일어날 수 있다. 17-AAG 캡슐화된 PEG-PLA 마이셀을 갖는 단순 혼합된 제제를 형성함으로써 다른 단일 물질 마이셀도 유사하게 안정화될 수 있다.
모든 공보, 특허 및 특허 문헌은 참고문헌으로 개별적으로 도입된 것처럼 여기에 참고문헌으로 도입된다. 본 발명은 다양한 구체적이고 바람직한 구현예 및 기술에 관하여 기재되었다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위를 유지하면서 다수의 변화 및 수정이 가해질 수 있음이 이해되어야 한다.

Claims (31)

  1. 마이셀이 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산) 중합체를 포함하고;
    상기 중합체의 소수성 폴리(락트산) 블럭이 각 마이셀의 내부를 향하고, 상기 중합체의 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭이 각 마이셀의 외부를 향하며;
    상기 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭의 분자량이 약 1,000 내지 약 35,000 g/mol이고 상기 폴리(락트산) 블럭의 분자량이 약 1,000 내지 약 15,000 g/mol이며;
    마이셀 중 17-AAG의 의약 부하가 마이셀의 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 25 중량%이고;
    조성물이 에탄올, 디메틸 술폭시드, 피마자유 및 피마자유 유도체를 실질적으로 함유하지 않는, 17-AAG-캡슐화된 마이셀을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 마이셀 중 17-AAG의 의약 부하가 10 중량% 내지 약 20 중량%인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 수성 비히클을 더 포함하고, 17-AAG의 농도가 상기 수성 비히클의 부피에 대하여 약 0.6 mg/mL 내지 약 20 mg/mL인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 17-AAG의 농도가 상기 수성 비히클의 부피에 대하여 약 1 mg/mL 내지 약 6 mg/mL인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 약 2 중량% 미만의 에탄올, 디메틸 술폭시드, 피마자유 및 피마자유 유도체를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭의 분자량이 약 10,000 내지 약 14,000 g/mol이고 폴리(락트산) 블럭의 분자량이 약 5,000 내지 약 7,000 g/mol이며, 마이셀의 평균 직경이 약 250 nm 내지 약 270 nm인 조성물.
  7. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭의 분자량이 약 1,500 내지 약 2,500 g/mol이고 폴리(락트산) 블럭의 분자량이 약 1,500 내지 약 2,500 g/mol이며, 마이셀의 평균 직경이 약 40 nm 내지 약 60 nm인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 1종 이상의 PEG-PLA 마이셀에 캡슐화된 제2 활성 물질을 더 포함하고, 마이셀 중 상기 제2 활성 물질의 의약 부하가 상기 마이셀의 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 25 중량%인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 17-AAG 및 제2 활성 물질이 하나 이상의 PEG-PLA 마이셀 내에 함께 함입된 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 17-AAG 및 제2 활성 물질이 PEG-PLA 마이셀 내에 개별적으로 함입되고, 상기 마이셀이 단일 수성 비히클에서 조합된 조성물.
  11. 제8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 활성 물질이 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드 또는 테니포시드인 조성물.
  12. 제1항 또는 8항의 조성물 및 수성 비히클을 포함하고, 정맥내 또는 복막 내 투여를 위해 조제되며, 상기 수성 비히클이 염수 또는 탄수화물을 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 마이셀이 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산) 중합체를 포함하고;
    상기 중합체의 소수성 폴리(락트산) 블럭이 각 마이셀의 내부를 향하고, 상기 중합체의 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭이 각 마이셀의 외부를 향하며;
    상기 폴리(에틸렌 글리콜) 블럭의 분자량이 약 1,000 내지 약 35,000 g/mol이고 상기 폴리(락트산) 블럭의 분자량이 약 1,000 내지 약 15,000 g/mol이며;
    마이셀 중 17-AAG의 의약 부하가 마이셀의 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 25 중량%이고;
    에탄올, 디메틸 술폭시드, 피마자유 및 피마자유 유도체를 실질적으로 함유하지 않는, 17-AAG-캡슐화된 마이셀을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 17-AAG의 투여에 의해 치료될 수 있는 상태를 갖거나 그렇게 진단된 환자에게 17-AAG를 투여하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 마이셀 중 17-AAG가 약 4 mg/m2 내지 약 4000 mg/m2의 양으로 투여되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 마이셀 중 17-AAG가 1주 당 약 100 mg/m2 내지 1주 당 약 500 mg/m2의 양으로 투여되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 마이셀 중 17-AAG가 1주 당 약 300 mg/m2 내지 1주 당 약 400 mg/m2의 양으로 투여되는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 17-AAG를 함유하는 마이셀 내에 제2 활성 물질을 더 포함하는 방법.
  18. 세포를 제1항 또는 8항의 조성물의 유효적 억제 또는 치사량과 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포를 억제하거나 죽이는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 접촉이 생체 내에서 일어나는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 접촉이 시험관내에서 일어나는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 암 세포가 인체 유방암 세포, 인체 전립선암 세포, 또는 백혈병 세포인 방법.
  22. Hsp 90을 유효 억제량의 제1항 또는 8항에 따르는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, Hsp 90의 억제 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 생체 내에서 일어나는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 시험관내에서 일어나는 방법.
  25. 제1항 또는 8항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산) 중합체로부터 형성된 마이셀을 포함하지 않는 담체를 이용하여 17-AAG를 투여한 후 혈액 중 17-AAG의 반감기에 비하여, 포유류의 혈액에서 17-AAG의 반감기를 증가시키는 방법.
  26. 17-AAG 및 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산) 중합체성 단위를 수혼화성 용매에 용해시키고, 상기 용액을 투석 봉지에 가하고, 상기 투석 봉지를 수-함유 조에 가하여 상기 투석 봉지 내에 17-AAG-캡슐화된 마이셀을 수득하고, 그 마이셀을 단리하는 것을 포함하는, 17-AAG-캡슐화된 마이셀의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 17-AAG-캡슐화된 마이셀을 원심분리하여 함입되지 않은 17-AAG를 침전시키고, 함입되지 않은 17-AAG를 여과에 의해 제거하는 것을 더 포함하여, 단리된 17-AAG-캡슐화 마이셀을 수득하는 방법.
  28. 제26항 또는 27항에 있어서, 상기 수-함유 조가 용해된 고체를 함유하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 용해된 고체가 1종 이상의 염화 나트륨, 덱스트로오스 및 완충제를 포함하는 방법.
  30. 제26항 또는 27항에 있어서, 상기 수혼화성 용매가 아세토니트릴, 디메틸 술폭시드 또는 디메틸 아세트아미드인 방법.
  31. 17-AAG 및 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(락트산) 중합체 사슬을 수혼화성 용매에 용해시켜 용액을 수득하고, 상기 수혼화성 용매를 제거하여 상기 중합체 및 17-AAG를 포함하는 고체 또는 오일-상 조성물을 수득하고, 상기 조성물에 물을 가하여 수성 혼합물을 수득하고, 상기 혼합물을 원심분리하여 17-AAG-캡슐화된 마이셀을 함유하는 상청액 및 침강물을 수득하고, 상기 침강물을 제거하여 단리된 17-AAG-캡슐화된 마이셀을 수득하는 것을 포함하는, 17-AAG-캡슐화된 마이셀의 제조 방법.
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