CN109475498B - 包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验及评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法、包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法以及包含水难溶性药物的聚合物胶束组合物。

Description

包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验及评价 方法

技术领域

本发明涉及包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法、包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法以及包含水难溶性药物的聚合物胶束组合物。

背景技术

水难溶性药物的释放试验方法需要有生物相关性(biorelevant)，并且应以与在体内(in vivo)施用形态的药物释放相同的机制测量体外(in vitro)药物的释放。此外，这种试验方法还应能够区分“好的”批次和“坏的”批次之间的差异，这意味着这种方法应能够检测出可对药物的释放产生影响的产品内部的变化。

对于测量在体外从胶束中释放的合适的装置的开发逐渐受到关注。此时，释放介质的选择及搅拌等附加的考虑事项也不容忽视。与典型的模拟胃肠道的pH的口服施用形态的释放介质相比，用于胶束施用形态的释放介质的选择不仅根据剂型的施用部位而变化，还根据其作用的部位而变化，因此模拟体内条件并不容易。通常，释放介质基于药物的溶解度及稳定性、分析的敏感度及所使用的方法来选择。虽然优选保持漏槽条件(sinkcondition)，但是也有采用非漏槽条件的情况。此外，搅拌(agitation)是在体外释放研究中为了防止分散相的凝集而频繁使用的重要的工序条件。但是，搅拌所产生的动态条件依赖于所使用的装置。并且，采样及缓冲液交替(整体或部分)的技术也取决于所使用的体外方法的类型。

因此，存在如下需求，即，能够再现体内条件的同时，能够检测对药物的释放产生影响的产品质量的差异的从胶束制剂的水难溶性药物的体外释放试验至质量评价的新方法。

发明内容

要解决的技术问题

本发明的目的在于提供包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法，其不仅能够反映体内释放机制，还能够评价药物产品的质量。

但是，本发明所要解决的问题并不受限于以上提及的问题，就未提及的其它问题而言，通常的技术人员可以根据以下的记载明确地理解。

技术方案

本发明的第一方面可以提供包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法，其包括以下步骤：1)在含有白蛋白的水性介质中加入经过依次稀释的水难溶性药物的有机溶液，并从其中去除沉淀的水难溶性药物和白蛋白，从而制备标准溶液；2)在含有白蛋白的水性介质中加入包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的水溶液，从而制备释放溶液，然后从其中去除沉淀的水难溶性药物和白蛋白，从而制备样品溶液；3)用高效液相色谱法(HPLC)分别对步骤1)的标准溶液和步骤2)的样品溶液进行分析；以及4)根据下述数学式1求出水难溶性药物的释放率(％)，所述聚合物胶束制剂为水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中的聚合物胶束制剂。

[数学式1]

水难溶性药物的释放率(％)＝水难溶性药物的沉淀率(％)＝(初期样品溶液的水难溶性药物的浓度-在时间t的样品溶液的水难溶性药物的浓度)/初期样品溶液的水难溶性药物的浓度×100＝(A₀-A_t)/A₀×100

A₀＝初期样品溶液的水难溶性药物的峰面积/标准溶液的水难溶性药物的峰面积×标准溶液的水难溶性药物的浓度×稀释倍数×释放溶液的体积

A_t＝在时间t的样品溶液的水难溶性药物的峰面积/标准溶液的水难溶性药物的峰面积×标准溶液的水难溶性药物的浓度×稀释倍数×释放溶液的体积

本发明的第二方面可以提供包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法，其包括以下步骤：根据本发明的第一方面的方法调查水难溶性药物的释放模式；以所调查的释放模式评价聚合物胶束制剂的质量或功效，所述水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中。

本发明的第三方面可以提供包含水难溶性药物的聚合物胶束组合物，其特征在于，根据本发明的第一方面的方法进行试验时的水难溶性药物的3小时的释放率为90％以上，所述水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中。

上述技术方案只是例示性的，不应以限制本发明的意图进行解释。除了上述的例示性的具体实施方式之外，还可以有记载于附图及发明内容中的附加的具体实施方式及实施例。

发明效果

根据本发明能够提供用于包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的新型释放试验方法。本发明的方法能够用作包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的质量及性能的指标，而且还能够用于再现体内的条件，并用于确立释放机制和体外-体内相关关系(In vitro-in vivo correlation，IVIVC)。

附图说明

图1为示出在多种浓度的mPEG-PLA聚合物溶液中，根据振荡时间的紫杉醇的浓度的图表。

图2为示出在25℃及37℃下的mPEG-PLA聚合物溶液中，根据振荡时间的紫杉醇的浓度的图表。

图3为示出在蒸馏水及4％的白蛋白磷酸缓冲液中，根据聚合物的浓度的紫杉醇的过饱和溶解度(图3a)和固有溶解度(图3b)的图表。

图4为示出紫杉醇过饱和的聚合物胶束的动力学稳定度的图表。

图5为示出在37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的Genexol-PM的紫杉醇沉淀的图表。

图6为示出紫杉醇标准溶液的校准曲线的图表。

图7为示出在利用沉淀法的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中，根据紫杉醇的浓度的Genexol-PM的紫杉醇释放行为的图表。

图8为示出用于确认Genexol-PM释放试验方法的再现性的试验中，在37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫杉醇释放行为的图表。

图9为示出在37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中，根据多种产品编号的Genexol-PM的紫杉醇释放行为的图表。

图10为示出在37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中，Genexol-PM的不良产品(50:500)和正常产品(100:500，GP11511)的紫杉醇释放行为的图表。

图11为示出Genexol-PM在体内的紫杉醇释放机制的图表。

具体实施方式

下面，参考具体实施方式及实施例和附图，对本发明的包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法、包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法以及包含水难溶性药物的聚合物胶束组合物进行具体的说明。但是，本发明并不受限于这些具体实施方式及实施例和附图。

本发明的第一方面可以提供包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法，其包括以下步骤：1)在含有白蛋白的水性介质中加入经过依次稀释的水难溶性药物的有机溶液，并从其中去除沉淀的水难溶性药物和白蛋白，从而制备标准溶液；2)在含有白蛋白的水性介质中加入包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的水溶液，从而制备释放溶液，然后从其中去除沉淀的水难溶性药物和白蛋白，从而制备样品溶液；3)用高效液相色谱法(HPLC)分别对步骤1)的标准溶液和步骤2)的样品溶液进行分析；以及4)根据下述数学式1求出水难溶性药物的释放率(％)，所述聚合物胶束制剂为水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中的聚合物胶束制剂。

[数学式1]

水难溶性药物的释放率(％)＝水难溶性药物的沉淀率(％)＝(初期样品溶液的水难溶性药物的浓度-在时间t的样品溶液的水难溶性药物的浓度)/初期样品溶液的水难溶性药物的浓度×100＝(A₀-A_t)/A₀×100

A₀＝初期样品溶液的水难溶性药物的峰面积/标准溶液的水难溶性药物的峰面积×标准溶液的水难溶性药物的浓度×稀释倍数×释放溶液的体积

A_t＝在时间t的样品溶液的水难溶性药物的峰面积/标准溶液的水难溶性药物的峰面积×标准溶液的水难溶性药物的浓度×稀释倍数×释放溶液的体积

例如，以共聚物的总重量为基准，所述两亲性嵌段共聚物的亲水性嵌段的含量可以为约20～95重量％，或者可以为约40～95重量％，但可以不限定于此。此外，以共聚物的总重量为基准，两亲性嵌段共聚物的疏水性嵌段的含量可以为约5～80重量％，或者可以为约5～60重量％，但可以不限定于此。

例如，所述两亲性嵌段共聚物的数均分子量可以为1,000～50,000道尔顿，更加具体地，可以为1,500～20,000道尔顿，但可以不受限于此。所述聚合物胶束可以通过本发明所属技术领域中通常使用的方法来形成。

例如，所述有机溶液可以包含水混溶性有机溶剂，例如，可以包含选自醇、丙酮、四氢呋喃、乙酸、乙腈及二恶烷以及它们的组合中的有机溶剂，但可以不受限于此。此外，所述水溶液可以包含选自通常的水、蒸馏水、注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液(例如，5％的葡萄糖溶液)、缓冲液及它们的组合中的物质，但可以不受限于此。

例如，所述水难溶性药物可以选自对水的溶解度(25℃)为100mg/mL以下的药物，例如，可以选自抗癌剂(antineoplastic agents)、抗真菌剂(antifungal agents)、免疫抑制剂(immunosuppressants)、麻醉剂(analgesics)、消炎镇痛剂(anti-inflammatoryagents)、抗病毒剂(antiviral agents)、镇静剂(anxiolytic sedatives)、造影剂(contrasting agents)、皮质类固醇(corticosteroids)、诊断剂(diagnostic agents)、诊断造影剂(diagnostic imaging agents)、利尿剂(diuretics)、前列腺素(prostaglandins)、放射性药剂(radiopharmaceuticals)、包含类固醇(steroid)的性激素(sex hormones)及它们的组合，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤1)及步骤2)的含有白蛋白的水性介质可以为以约超过0％且20％以下的浓度含有白蛋白的蒸馏水或缓冲液，但可以不受限于此。例如，所述含有白蛋白的水性介质可以为含有约1～10％(w/v)、约1～5％(w/v)或约4％(w/v)的白蛋白的水性介质，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，在步骤1)及步骤2)中沉淀的水难溶性药物可以通过过滤来去除，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，过滤可以使用孔径尺寸为约0.8μm以下的过滤器来进行，但可以不受限于此。例如，过滤可以使用孔径尺寸为约0.1μm以上且小于0.8μm、约0.2μm以上且小于0.8μm、或者约0.2μm以上且小于0.5μm的过滤器来进行，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，在步骤1)及步骤2)中可以加入有机溶剂以使白蛋白沉淀并通过离心分离去除白蛋白，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤2)的释放溶液中初期水难溶性药物的浓度可以为约0.5mg/ml以上，例如，可以为0.5mg/ml以上且30mg/ml以下，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤3)的高效液相色谱法优选可以利用下述(a)及(b)的条件：(a)具有4μm以下的颗粒尺寸的五氟苯基多孔性颗粒的固定相；以及(b)具有5mm以下的内径及50mm以上的长度的色谱柱。本发明中，步骤3)的分析可以根据韩国公开专利第2017-0014057号的公开内容来进行，在这种情况下，本说明书中引用韩国公开专利第2017-0014057号的整体作为参考。

根据本发明的一个具体实施方式，步骤2)的包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的水溶液可以用水溶液将冷冻干燥制剂进行重建而成，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，亲水性嵌段(A)可以选自聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇及聚丙烯酰胺，疏水性嵌段(B)可以选自聚交酯、聚乙交酯、聚二恶烷-2-酮、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolide)、聚乳酸-己内酯共聚物(polylactic-co-caprolactone)、聚乳酸-二恶烷-2-酮共聚物(polylactic-co-dioxan-2-one)及聚乙醇酸-己内酯共聚物(polyglycolic-co-caprolactone)，以及其羧酸末端被脂肪酸基团取代的它们的衍生物，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，水难溶性药物可以为抗癌剂，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，抗癌剂可以为紫杉烷抗癌剂，但可以不受限于此。例如，所述紫杉烷抗癌剂可以为选自紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、7-表紫杉醇(7-epipaclitaxel)、t-乙酰基紫杉醇(t-acetylpaclitaxel)、10-脱乙酰基紫杉醇(10-desacetylpaclitaxel)、10-脱乙酰基-7-表紫杉醇(10-desacetyl-7-epipaclitaxel)、7-木糖基紫杉醇(7-xylosylpaclitaxel)、10-脱乙酰基-7-戊二酰紫杉醇(10-desacetyl-7-glutarylpaclitaxel)、7-N,N-二甲基甘氨酰紫杉醇(7-N,N-dimethylglycylpaclitaxel)、7-L-丙氨酰紫杉醇(7-L-alanylpaclitaxel)及卡巴他赛中的一种以上，更具体地可以为紫杉醇，但可以不受限于此。

本发明的第二方面可以提供包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法，其包括以下步骤：根据本发明的第一方面的方法调查水难溶性药物的释放模式；以所调查的释放模式评价聚合物胶束制剂的质量或功效，水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中。

例如，所述包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法可以包括：水难溶性药物的1小时的释放率为10％以上，并且3小时的释放率为90％以上时，评价为具有优选的质量，但可以不受限于此。例如，当水难溶性药物的1小时的释放率为10％以上且30％以下，并且3小时的释放率为90％以上时，可以评价水难溶性药物聚合物胶束制剂具有优选的质量，或者，当水难溶性药物的1小时的释放率为10％以上且30％以下，1.25小时的释放率为超过30％且70％以下，并且3小时的释放率为90％以上时，可以评价水难溶性药物聚合物胶束制剂具有优选的质量，但可以不受限于此。

本发明的第三方面可以提供包含水难溶性药物的聚合物胶束组合物，其特征在于，根据本发明的第一方面的方法进行试验时的水难溶性药物的3小时的释放率为90％以上，水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中。

根据本发明的一个具体实施方式，所述组合物的水难溶性药物的1小时的释放率可以为10％以上，3小时的释放率可以为90％以上，例如可以为90％以上且99.5％以下，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，所述组合物的水难溶性药物的1小时的释放率可以为10％以上且30％以下，3小时的释放率可以为90％以上，例如可以为90％以上且99.5％以下，但可以不受限于此。

根据本发明的一个具体实施方式，所述组合物的水难溶性药物的1小时的释放率可以为10％以上且30％以下，1.25小时的释放率可以为超过30％且70％以下，3小时的释放率可以为90％以上，例如可以为90％以上且99.5％以下，但可以不受限于此。

下面通过实施例对本发明进行更加详细的说明，但下述实施例的目的仅在于说明，并不在于限定本发明的范围。

[实施例]

药物产品

用于注射施用的Genexol-PM是利用用于形成溶解紫杉醇的聚合物胶束的低分子量、两亲性二嵌段共聚物的剂型。用于注射施用的100mg的Genexol-PM小瓶分别含有下述表1所示的组成成分。

[表1]

*制备工序中被去除

体外(in vitro)释放试验方法

1.试剂及材料

紫杉醇标准产品：产品编号(Lot)为G479(三养生物制药公司)

-mPEG-PDLLA：产品编号(lot)为PM1403(三养生物制药公司)

-Genexol-PM：产品编号(Lot)为GP11511、GP114A1、GP114B1、GP114C1(三养生物制药公司)

-100mL的20％人血清白蛋白：产品编号(Lot)为161D14240(绿十字公司)

-0.9％的生理盐水(CJ第一制糖公司)

-乙腈(Burdick&Jackson公司，ACS/HPLC等级)

2.仪器及设备

-振荡恒温水槽：Maxturdy 30，大韩科学公司(DAIHAN Scientific)

-振荡培养器：Vision Sci.公司-高效液相色谱仪(HPLC)：HP 1200系列，安捷伦科技公司(Agilent Technologies)

-离心分离机：Mini spin plus，艾本德公司(Eppendorf)

3.共聚物溶液中的紫杉醇溶解度的测量

1)含有mPEG-PDLLA共聚物的蒸馏水中的紫彬醇的溶解度

-仪器：振荡培养器，Vision Sci.公司

-介质：蒸馏水

-共聚物溶液的准备

在50mL的蒸馏水中加入5g的mPEG-PDLLA共聚物进行溶解(100.0mg/mL)。用蒸馏水将该共聚物水溶液依次稀释，制备为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL的浓度。

-在共聚物溶液中添加紫杉醇

在20mL的mPEG-PDLLA共聚物水溶液中加入100mg的无定形紫杉醇。将紫杉醇和聚合物悬浮液放入振荡恒温水槽中，并在25℃和37℃下，以200rpm进行搅拌。

-采集样品

在各个样品采集时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时)，采集1mL的悬浮液，用0.45μm的薄膜过滤器进行过滤。将0.6mL的滤液和0.6mL的乙腈进行混合，并用高效液相色谱仪(HPLC)对该溶液进行分析。

-分析

为了分析紫杉醇的浓度，使用高效液相色谱仪(HPLC)。利用下述式来计算紫杉醇的浓度：a＝(紫杉醇的峰面积-y截距)/斜率×100(mg)，用标准溶液的校准曲线计算斜率(2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)。

[高效液相色谱仪(HPLC)]

-色谱柱：Poroshell 120PFP色谱柱(2.7μm，4.6×150mm，安捷伦(Agilent)公司，美国)

-检测器：紫外线(UV)(λ＝227nm)

-流速：0.6mL/分钟

-注入量：10μl

-色谱柱温度：25℃

-流动相：

0～25分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)45/55(v/v)

25～28分钟：水/乙腈＝45/55(v/v)

25～30分钟：水/乙腈＝45/55(v/v))65/35(v/v)

30～35分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)

2)含有mPEG-PDLLA共聚物的4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫彬醇的溶解度

-仪器：振荡培养器：Vision Sci.公司

-介质：4％的白蛋白磷酸缓冲液

-共聚物溶液的准备

在50mL的4％的白蛋白缓冲液中加入5g的mPEG-PDLLA共聚物进行溶解(100.0mg/mL)。用4％的白蛋白磷酸缓冲液将该共聚物溶液依次稀释，制备为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL的浓度。

-在共聚物溶液中添加紫杉醇

在20mL的mPEG-PDLLA共聚物溶液中加入100mg的无定形紫杉醇。将紫杉醇和聚合物悬浮液放入振荡恒温水槽中，并在25℃和37℃下，以200rpm进行搅拌。

-采集样品

在各个样品采集时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时)，采集1mL的悬浮液，用0.45μm的薄膜过滤器进行过滤。混合0.2mL的滤液和0.8mL的乙腈以使白蛋白沉淀。以14,000rpm将该溶液进行离心分离5分钟，并将0.5mL的上清液和0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合后将其作为样品溶液。

-标准溶液的制备

精确称量12.5mg的紫杉醇加入到100mL的容量瓶中，并加入乙腈进行溶解(125μg/mL)。用乙腈将该溶液依次稀释，制备为62.5μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准原液。分别取0.8mL的各个标准原液，并加入0.2mL的4％的白蛋白磷酸缓冲液以使白蛋白沉淀，然后以14,000rpm将该混合液进行离心分离5分钟。取0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合并将该溶液作为标准溶液(100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL)。

[表2]

<紫杉醇标准溶液的制备>

-分析

为了分析紫杉醇的浓度，使用高效液相色谱仪(HPLC)。利用下述式来计算紫杉醇的浓度：a＝(紫杉醇的峰面积-y截距)/斜率×100(mg)，用标准溶液的校准曲线计算斜率(2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)。

4.白蛋白溶液中的Genexol-PM的紫杉醇的释放试验

-仪器：振荡恒温水槽：Maxturdy 30，大韩科学公司(DAIHAN Scientific)

-介质：4％的白蛋白磷酸缓冲液

-药物浓度：1.0mg/mL

-4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫彬醇的释放

在100mg的Genexol-PM小瓶中加入20mL的生理盐水进行重建，从而制备5.0mg/mL的溶液。取4mL的上述溶液加入到16mL的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中。在37℃下，以200rpm将该溶液进行搅拌。

-采集样品

取1mL的上述溶液，在各个样品采集时间(0小时、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、24小时)用0.45μm的PVDF注射器过滤器进行过滤。然后取0.2mL的滤液与0.8mL的乙腈进行混合。以14,000rpm将该混合液进行离心分离5分钟，并取0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合。将该溶液作为用于高效液相色谱仪(HPLC)分析的样品溶液。

-标准溶液的制备

通过与3.2)相同的方法进行准备。

-分析

通过与3.1)相同的方法，利用高效液相色谱仪(HPLC)分析紫杉醇的浓度。

5.Genexol-PM的释放实验

-释放溶液的准备

在100mg的Genexol-PM小瓶中加入20mL的生理盐水进行重建，从而制备5.0mg/mL的溶液。取4mL的该溶液加入到16mL的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中。在37℃下，以200rpm将该溶液进行搅拌，并将其作为释放溶液。

-释放

在37℃下，以200rpm将释放溶液在振荡恒温水槽中进行搅拌。

-采集样品

取1mL的上述溶液，在各个样品采集时间(0小时、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、24小时)用0.45μm的PVDF注射器过滤器进行过滤。然后取0.2mL的滤液与0.8mL的乙腈进行混合。以14,000rpm将该混合液进行离心分离5分钟，并取0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合。将该溶液作为用于高效液相色谱仪(HPLC)分析的样品溶液。

-高效液相色谱仪(HPLC)

1)标准溶液的准备

精确称量12.5mg的紫杉醇加入到100mL的容量瓶中，并加入乙腈进行溶解(125μg/mL)。用乙腈将该溶液依次稀释，制备为62.5μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准原液。取0.8mL的该标准原液，并加入0.2mL的4％的白蛋白磷酸缓冲液以使白蛋白沉淀，然后以14,000rpm将该混合液进行离心分离5分钟。取0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合并将该溶液作为标准溶液(100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL)。

2)初期样品溶液的制备

在100mg的Genexol-PM小瓶中加入20mL的生理盐水进行重建。取4mL加入到16mL的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中。取1mL的溶液，用0.45μm的PVDF过滤器进行过滤。取0.2mL的滤液，并加入0.8mL的乙腈以使白蛋白沉淀。以14,000rpm将该溶液进行离心分离5分钟，并取0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合，并将该溶液用作初期样品溶液。

在下述条件的高效液相色谱仪(HPLC)中注入标准溶液和样品溶液。利用样品溶液和标准溶液的紫杉醇的峰面积来计算紫杉醇的释放量。

[高效液相色谱仪(HPLC)]

-色谱柱：Poroshell 120PFP色谱柱(2.7μm，4.6×150mm，安捷伦公司，美国)

-检测器：紫外线(UV)(λ＝227nm)

-流速：0.6mL/分钟

-注入量：10μl

-色谱柱温度：25℃

-流动相：

0～25分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)45/55(v/v)

25～28分钟：水/乙腈＝45/55(v/v)

25～30分钟：水/乙腈＝45/55(v/v))65/35(v/v)

30～35分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)

-计算

紫杉醇的释放(％)＝沉淀的紫杉醇(％)＝(初期样品溶液的紫杉醇的浓度-在各样品采集时间(t)的样品溶液的紫杉醇的浓度)/初期样品溶液的紫杉醇的浓度×100＝(A₀-A_t)/A₀×100

-A₀＝初期样品溶液的紫杉醇的峰面积/标准溶液的紫杉醇的峰面积×标准溶液的紫杉醇的浓度×10×20

-A_t＝在时间t的样品溶液的紫杉醇的峰面积/标准溶液的紫杉醇的峰面积×标准溶液的紫杉醇的浓度×10×20

样品溶液(A_t)中的紫杉醇的浓度与4％的白蛋白磷酸缓冲液中的固有溶解度和未从胶束中释放的紫杉醇的量的和相同。

结果及探讨

1.聚合物溶液中的紫彬醇的溶解度

1)多种浓度的聚合物溶液中的根据时间的紫杉醇的浓度

在蒸馏水和4％的白蛋白磷酸缓冲液中进行紫杉醇溶解度的实验。将过量的无定形紫杉醇加入到多种浓度的聚合物溶液中时，无定形紫杉醇会自发溶解于聚合物胶束中，并在聚合物溶液中过饱和一定时间。图1及表3示出多种浓度的mPEG-PLA聚合物溶液中的根据时间的紫杉醇的浓度。如同图1及表3所示，在维持过饱和的状态之后，紫杉醇的浓度从过饱和溶解度降低至固有溶解度。紫杉醇的浓度从过饱和溶解度降低至固有溶解度的理由在于，暂时被聚合物胶束捕获的无定形紫杉醇会变成溶解度低的二水合物的形态。

[表3]

根据时间的紫杉醇的浓度随温度发生变化。图2及表4示出在25℃和37℃下的mPEG-PDLLA聚合物中的根据时间的紫杉醇的浓度。如同图2及表4所示，在37℃下的紫杉醇的过饱和溶解度高于在25℃下的紫杉醇的过饱和溶解度，在37℃下的固有溶解度低于在25℃下的固有溶解度。

此外，在37℃下的过饱和持续时间比在25℃下的过饱和持续时间短。这是因为在更高的温度下无定形紫杉醇可以快速溶解于聚合物胶束中，但可以更快地结晶化为二水合物形态。

[表4]

2)根据聚合物浓度的紫杉醇的溶解度

在蒸馏水和4％的白蛋白磷酸缓冲液中，根据聚合物浓度的紫杉醇的过饱和溶解度和固有溶解度(mPEG-PLA为25mg/mL，37℃)示于图3a、图3b及表5中。紫杉醇的过饱和溶解度及固有溶解度随着聚合物浓度的增加而线性增加。mPEG-PLA聚合物的浓度为25mg/mL以上时，蒸馏水和4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫杉醇的过饱和溶解度和固有溶解度没有显著的差异(图3a)，但是mPEG-PLA聚合物的浓度为25mg/mL以下时，4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫杉醇的过饱和溶解度和固有溶解度更高(图3b)。

[表5]

*24小时后的紫杉醇的浓度**在25℃下4小时后或在37℃下1小时后的紫杉醇的浓度

2.Genexol-PM水溶液的紫杉醇的沉淀

由于在动力学上mPEG-PLA聚合物胶束比低分子量表面活性剂胶束更稳定，因此可以含有过量的疏水性药物。就低分子量表面活性剂胶束而言，过量的药物与水接触时容易沉淀，因此不适于需要长时间包含过量的药物的注射剂。

图4为示出紫杉醇过饱和的聚合物胶束的动力学稳定度的图表。Genexol-PM在聚合物胶束中含有过量的紫杉醇，并且水相的胶束溶液在常温下长时间稳定，因此临床上可以方便地使用。但是，在诸如体温的高温下，在动力学上变得不稳定，这意味着在高温下紫彬醇容易从聚合物胶束中游离出来。在限定量的水溶液中，Genexol-PM的紫杉醇会从胶束以结晶性紫杉醇二水合物的形态沉淀。与此相关地，图5及表6为示出在37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的Genexol-PM的紫杉醇沉淀的图表。利用Genexol-PM的这种特征，能够开发作为体外释放试验方法的沉淀法。在体温下，在蒸馏水和4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫彬醇的固有溶解度接近于0(表6)。因此，可以将该释放试验方法中紫杉醇的沉淀的量视为从Genexol-PM中释放出来的紫杉醇的浓度。实际上，4％的白蛋白磷酸缓冲液中所包含的0.9mg/mL的Genexol-PM经过2小时后会降低至0.08mg/mL的浓度。实际上，2小时和6小时后，胶束中的90％以上和97％以上的紫杉醇得到释放并沉淀。

[表6]

3.Genexol-PM的体外释放试验方法的设定

1)生物体相似介质

使用Genexol-PM的生物学介质为血液、血浆及血清，但是无法容易获得充分量的这种生物学介质以进行体外释放试验，并且难以在这种介质中进行药物分析。因此，一直以来使用磷酸缓冲液(PBS，pH为7.4)作为生物体相似介质，本实施例的Genexol-PM的体外释放试验方法中使用含有白蛋白的磷酸缓冲液。

2)生物体相似介质中的紫杉醇沉淀物的分离

具有从生物体相似介质中分离紫杉醇沉淀物的方法。一种是离心分离法，另一种是过滤法。

离心分离法中难以选择适当的离心力和时间。表7示出根据离心分离时间的37℃、4％的白蛋白缓冲液中的24小时后从Genexol-PM中释放的紫杉醇的量。根据表7，随着离心分离时间的增加，所释放的紫杉醇的量增加。进行离心分离的过程中(5分钟以上)，紫杉醇会持续沉淀，因此所释放的紫杉醇的量可能会被高估。

但是，使用过滤法时，过滤的时间小于1分钟，因此过滤时间并不会影响实验结果。过滤法中，在各个采样时间取含有Genexol-PM的释放介质，用PVDF注射器过滤器进行过滤。过滤器会去除沉淀的紫杉醇(结晶化的紫杉醇)，但是会使胶束中的紫杉醇和与白蛋白结合的紫杉醇留在滤液中。滤液会包含溶解在纯水中的紫杉醇，但其量极少而可以忽略。因此，过滤法比离心分离法更有信赖性。

过滤中可以使用多种孔径尺寸的过滤器，因此，对根据过滤器的孔径尺寸的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的24小时后从Genexol-PM中释放的紫杉醇的量进行评价(表8)。与使用0.45μm的过滤器时相比，使用0.22μm的过滤器时，滤液(未释放的紫杉醇及可忽略的与白蛋白结合的紫杉醇)中紫杉醇的量略微少。但是，由表8可以知道其差异是可以忽略的水平。

但是，与0.45μm、0.22μm的过滤器相比，由于0.8μm的过滤器会使较大尺寸的沉淀的紫杉醇通过过滤器的孔，因此所测量的结果显著高。因此，在Genexol-PM的体外释放试验方法中使用0.45μm的过滤器。

[表7]

[表8]

3)生物体相似介质中的紫杉醇的分析

利用经过验证的高效液相色谱(HPLC)分析法，对生物体相似介质中的紫杉醇的释放进行定量。在进行高效液相色谱(HPLC)分析之前，为了去除Genexol-PM的释放介质中的白蛋白需要进行预处理。在进行高效液相色谱(HPLC)分析时，如果没有去除白蛋白，则会损伤高效液相色谱仪(HPLC)及色谱柱，因此去除白蛋白的步骤是进行高效液相色谱(HPLC)分析时所必要的预处理过程。据报道，可以添加诸如乙腈及甲醇的有机溶剂以使蛋白质改性(沉淀)。沉淀的白蛋白可以通过离心分离或过滤来去除，本实施例中使用离心分离方法。80％的乙腈会溶解紫杉醇和mPEG-PLA聚合物，因此不会存在聚合物胶束，去除白蛋白的80％的乙腈溶液中仅包含紫杉醇和聚合物。

经过验证的高效液相色谱(HPLC)分析法

[高效液相色谱仪(HPLC)]

-色谱柱：Poroshell 120PFP色谱柱(2.7μm，4.6×150mm，安捷伦公司，美国)

-检测器：紫外线(UV)(λ＝227nm)

-流速：0.6mL/分钟

-注入量：10μl

-色谱柱温度：25℃

-流动相：

0～25分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)45/55(v/v)

25～28分钟：水/乙腈＝45/55(v/v)

25～30分钟：水/乙腈＝45/55(v/v))65/35(v/v)

30～35分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)

紫杉醇标准溶液的校准曲线和结果示于图6及表9中。

[表9]

*白蛋白中 **峰面积/紫杉醇的浓度 ***与平均响应系数的偏差(％)

4)释放介质中的紫杉醇的初期浓度

为了测量释放介质中的初期紫杉醇的浓度，使用沉淀法评价释放介质中的紫杉醇的浓度对Genexol-PM的释放行为产生的影响。图7为示出37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中，Genexol-PM的紫杉醇释放行为的图表。由图7可以确认，紫杉醇的浓度越低，释放速度越快。这是因为聚合物的浓度越低，会越快达到临界胶束浓度。这结果意味着Genexol-PM容易在血液中解离，从而紫杉醇能够容易在血液中释放。因此，可以看出Genexol-PM在注射到体内后会立即释放。

并且，初期的低的紫杉醇的浓度示出慢速的静脉注射的情况。但是，在该沉淀法中释放的紫杉醇包含没有与白蛋白结合的沉淀的紫杉醇，而且如表5所示，37℃、4％的白蛋白溶液中的浓度为约8μg/mL，是可以忽略的低浓度。但是，降低Genexol-PM的浓度(1.0mg/mL->0.1mg/mL)时，与白蛋白结合的紫杉醇的比率会达到无法忽略的程度。因此，将释放介质的初期紫杉醇的浓度选为1.0mg/mL。

3.4.生物体相似介质中Genexol-PM的紫杉醇的释放

1)释放试验的再现性

为了使用相同产品编号的Genexol-PM(产品编号(Lot)为GP11511)来评价沉淀法的再现性，进行3次反复试验。再现性试验结果示于图8及表10中，该方法的再现性很高。

[表10]

<在确认Genexol-PM释放试验方法的再现性的试验时，根据时间的所释放的紫杉醇的百分数>

<在确认Genexol-PM释放试验方法的再现性的试验时，根据时间的所释放的紫杉醇的浓度>

2)根据多种产品编号的Genexol-PM的释放

利用沉淀法评价四种产品编号的Genexol-PM的释放行为的结果示于图9及表11中。

[表11]

<根据多种产品编号的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的Genexol-PM的紫杉醇释放百分数>

<根据多种产品编号的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的Genexol-PM的紫杉醇的释放浓度>

3)不良产品的评价

体外释放试验应能够鉴别不良产品，因此，为了使用沉淀法来评价不良批次的行为，生产2个不良产品。不良批次的组成示于表12中。用生理盐水将紫杉醇和mPEG-PLA的比例为100:300的不良产品进行重建时，呈现出不透明的形态，因此无法实施释放试验。50:500的比例和100:500(GP11511)的释放行为示于图10及表13中。

[表12]

*用生理盐重建时，紫杉醇沉淀

[表13]

<Genexol–PM的不良产品(50:500、100:300)和正常产品(100:500，GP11511)的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫杉醇的释放百分数>

<Genexol–PM的不良产品(50:500、100:300)和正常产品(100:500，GP11511)的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中的紫杉醇的释放浓度>

4.释放试验方法和基准

4.1.释放试验方法

1)标准溶液的准备

精确称量12.5mg的紫杉醇加入到100mL的容量瓶中，并加入乙腈进行溶解(125μg/mL)。用乙腈将该溶液依次稀释，制备为62.5μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的标准原液。取0.8mL的该标准原液，并加入0.2mL的4％的白蛋白磷酸缓冲液以使白蛋白沉淀，然后以14,000rpm将该混合液进行离心分离5分钟。取0.5mL的该上清液与0.5mL的80％的乙腈水溶液进行混合并将该溶液作为标准溶液(100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL)。

2)样品溶液的准备

在100mg的GenexolPM小瓶中加入20mL的生理盐水并使其完全溶解(5.0mg/mL)。取4mL的该溶液并加入到16mL的37℃、4％的白蛋白磷酸缓冲液中，并将该溶液用作释放溶液。取1mL的该释放溶液，并使用0.45μm的PVDF注射器过滤器进行过滤。取0.2mL的该滤液并加入0.8mL的乙腈，以使白蛋白沉淀。以14,000rpm将该溶液进行离心分离5分钟，并取0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈进行混合。将该溶液用作初期释放溶液。之后，根据释放条件，在37℃下，以200rpm将释放溶液进行搅拌(沉淀)特定时间，然后取1mL的该溶液，并使用0.45μm的注射器过滤器进行过滤。取0.2mL的该滤液加入到0.8mL的乙腈中，以使白蛋白沉淀。以14,000rpm将该溶液进行离心分离5分钟，并将0.5mL的上清液与0.5mL的80％的乙腈进行混合。将此时的溶液作为在时间t的释放溶液。

3)释放和分析

使用在37℃下，以200rpm搅拌释放溶液的水槽。

[释放条件]

-释放方法：沉淀法

-释放介质：4％的人白蛋白磷酸缓冲液(pH为7.4)

-容量：20mL

-搅拌速度：200rpm

-释放温度：37.0±0.5℃

将标准溶液和样品溶液注入高效液相色谱仪(HPLC)中，并根据如下条件，使用紫杉醇的峰面积计算释放的紫杉醇。

[高效液相色谱仪(HPLC)]

-色谱柱：Poroshell 120PFP色谱柱(2.7μm，4.6×150mm，安捷伦公司，美国)

-检测器：紫外线(UV)(λ＝227nm)

-流速：0.6mL/分钟

-注入量：10μl

-色谱柱温度：25℃

-流动相：

0～25分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)45/55(v/v)

25～28分钟：水/乙腈＝45/55(v/v)

25～30分钟：水/乙腈＝45/55(v/v))65/35(v/v)

30～35分钟：水/乙腈＝65/35(v/v)

-计算

紫杉醇的释放(％)＝沉淀的紫杉醇(％)＝(初期样品溶液的紫杉醇的浓度-在各样品采集时间(t)的样品溶液的紫杉醇的浓度)/初期样品溶液的紫杉醇的浓度×100＝(A₀-A_t)/A₀×100

-A₀＝初期样品溶液的紫杉醇的峰面积/标准溶液的紫杉醇的峰面积×标准溶液的紫杉醇的浓度×10×20

-A_t＝在时间t的样品溶液的紫杉醇的峰面积/标准溶液的紫杉醇的峰面积×标准溶液的紫杉醇的浓度×10×20

5.紫杉醇在体内释放的可能的机制

由于Genexol-PM注入到体内时很快被稀释，因此没有结晶化并沉淀的可能性。但是会快速地与其他蛋白质结合，从而不仅分布于血液中，还分布于整个身体。但是，以沉淀法不易再现无限稀释的体内的条件。因此，将在体外的紫杉醇的沉淀视为在体内的与蛋白质的结合。即，可以将在体外的聚合物胶束中的紫杉醇的结晶化视为由于许多蛋白质和血液成分的存在以及快速的稀释而引起的在体内的紫杉醇和蛋白质的结合。由利用沉淀法的体外释放试验结果得到的从Genexol-PM释放紫杉醇的可能的释放机制为如图11所示。

第一阶段：

聚合物胶束中的过饱和的紫杉醇从聚合物胶束中释放出来，立刻与血浆蛋白质结合。该阶段占整体释放的95％以上。

第二阶段：

通过聚合物胶束在CMC以下解离或者被血液中的酶分解，聚合物胶束中剩余的紫杉醇缓慢释放。该阶段占整体释放的小于5％。

6.对于含有现有及精制聚合物的聚合物胶束制剂的释放试验

将150g的单甲氧基聚乙二醇(mPEG，数均分子量＝2,000)加入到装有搅拌机的500ml的圆底烧瓶中，然后在120℃及真空条件下，搅拌2小时以去除水分。向反应烧瓶中添加0.15g的溶解于200μl的甲苯中的辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)，然后再次在真空条件下搅拌1小时，蒸馏去除甲苯。之后添加150g的D,L-丙交酯，在氮气气氛下搅拌使其溶解。待D,L-丙交酯完全溶解后，密封反应器，在120℃下进行聚合反应10小时。

将获得的30g的mPEG-PDLLA加入到单口烧瓶中，在120℃下使其熔化。用磁棒搅拌的同时，与真空泵连接，在1托(torr)以下，通过升华法去除丙交酯7小时(现有聚合物)。

另外，将获得的20g的mPEG-PDLLA加入到单口烧瓶中，添加120ml的乙醇，并在50℃下搅拌2小时使其溶解。将聚合物溶液移至分液漏斗，并在25℃下进行层分离2小时。待层分离结束后，将下层的聚合物溶液装入单口烧瓶中。利用真空蒸馏器，将残留在聚合物溶液中的乙醇进行真空蒸馏来去除(精制聚合物)。

利用如上所述获得的现有聚合物和精制聚合物来制备紫杉醇聚合物胶束制剂，并以所制备的制剂为对象，根据本发明进行释放试验。将其结果示于表14中。

[表14]

上述对于本发明的说明仅用于例示，本发明所属技术领域的具有常规知识的人员能够理解在不改变本发明的技术思想或必要特征的情况下，可以容易地变形为其他具体的方式。因此，上述的实施例在所有方面都应理解为只是例示性的而并非是限定性的。例如，以单一类型说明的各组成要素可以分散实施，同样地，分散说明的组成要素可以以结合的方式实施。

本发明的范围应理解为由权利要求书来表示，而并非由上述详细的说明来表示，并且权利要求书的意义及范围和由其等价概念推导出的所有变更或变形的方式均包含在本发明的范围中。

Claims (10)

1.包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的体外释放试验方法，其包括以下步骤：

1)在含有白蛋白的水性介质中加入经过依次稀释的水难溶性药物的有机溶液，并从其中去除沉淀的水难溶性药物和白蛋白，从而制备标准溶液；

2)在含有白蛋白的水性介质中加入包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的水溶液，从而制备释放溶液，然后从其中去除沉淀的水难溶性药物和白蛋白，从而制备样品溶液；

3)用高效液相色谱法(HPLC)分别对步骤1)的标准溶液和步骤2)的样品溶液进行分析；以及

4)根据下述数学式1求出水难溶性药物的释放率(％)，

所述聚合物胶束制剂为水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中的聚合物胶束制剂，

[数学式1]

水难溶性药物的释放率(％)＝水难溶性药物的沉淀率(％)＝(初期样品溶液的水难溶性药物的浓度-在时间t的样品溶液的水难溶性药物的浓度)/初期样品溶液的水难溶性药物的浓度×100＝(A₀-A_t)/A₀×100

A₀＝初期样品溶液的水难溶性药物的峰面积/标准溶液的水难溶性药物的峰面积×标准溶液的水难溶性药物的浓度×稀释倍数×释放溶液的体积

A_t＝在时间t的样品溶液的水难溶性药物的峰面积/标准溶液的水难溶性药物的峰面积×标准溶液的水难溶性药物的浓度×稀释倍数×释放溶液的体积，

其中通过使用孔径为0.5μm以下的过滤器过滤去除步骤1)和步骤2)中沉淀的水难溶性药物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤1)及步骤2)的含有白蛋白的水性介质为以超过0％且20％以下的浓度含有白蛋白的蒸馏水或缓冲液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤1)及步骤2)中加入有机溶剂以使白蛋白沉淀并通过离心分离去除白蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)的释放溶液中初期水难溶性药物的浓度为0.5mg/ml以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤3)的高效液相色谱法利用下述(a)及(b)的条件：

(a)具有4μm以下的颗粒尺寸的五氟苯基多孔性颗粒的固定相；以及

(b)具有5mm以下的内径及50mm以上的长度的色谱柱。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)的包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的水溶液是用水溶液将冷冻干燥制剂进行重建而成。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲水性嵌段(A)选自聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇及聚丙烯酰胺，所述疏水性嵌段(B)选自聚交酯、聚乙交酯、聚二恶烷-2-酮、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚乳酸-二恶烷-2-酮共聚物及聚乙醇酸-己内酯共聚物，以及其羧酸末端被脂肪酸基团取代的它们的衍生物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水难溶性药物为抗癌剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述抗癌剂为紫杉烷抗癌剂。

10.包含水难溶性药物的聚合物胶束制剂的评价方法，其包括以下步骤：

根据权利要求1至9中任一项所述的方法调查水难溶性药物的释放模式；

以所调查的释放模式评价聚合物胶束制剂的质量或功效，

所述水难溶性药物封装在由包含亲水性嵌段(A)和疏水性嵌段(B)的两亲性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中。

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