CN114712312B - 一种控制微球活性成分释放的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种控制微球活性成分释放的方法，包括以下步骤：(1)取共聚物粉末制备供试溶液，另取共聚物粉末加入四氢呋喃溶解，作为对照溶液；(2)供试溶液和对照溶液上高效液相色谱进行检测，并计算获得共聚物中低聚体的含量；(3)若共聚物中低聚体的含量大于10％，则对共聚物进行一次或多次精制，直至共聚物中低聚体的含量≤10％；(4)以获得的低聚体含量≤10％的共聚物粉末作为载体制备微球。本发明简单实用，通过采用对共聚物特定的精制方法，从而有效控制共聚物种的低聚体含量在一个特定的范围，从而实现对微球中的活性成分的释放控制；同时低聚体检测方法重现性良好。
Description
技术领域
本发明涉及药物生产技术领域，特别涉及一种控制微球活性成分释放的方法。
背景技术
丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)和聚乳酸(PLA)是国内外得到广泛研究和应用的新型生物可降解材料，由于该类共聚物在体内可通过聚酯水解，降解为乳酸和羟基乙酸，然后通过体内三羧酸循环最终降解为二氧化碳和水，不会对人体产生不良反应，因此可以作为缝合线、骨钉、骨栓及各种支架等临床医用材料，也可作为缓控释给药系统的载体，现已被FDA批准为药用辅料。PLGA是由乙交酯和丙交酯在无水无氧条件下加热开环聚合而成，PLA则是由丙交酯在无水无氧条件下内部自身加热开环聚合而成。这种聚合反应分子之间的结合通常都较为随机，最后形成的聚合物往往呈现分子量非均一分布状态，即同时含有低分子量的聚合物和高分子量的聚合物。
而微球是一种药物分散或被吸附在高分子聚合物基质中形成的1μm～300μm的固体颗粒分散体系。由于其独特的缓释性能，微球在注射给药后可在人体内保持可控的释放速度，缓慢释放出包载在其内部的药物有效成分从而可减少对患者的给药次数，改善患者顺应性并实现长期治疗效果；同时微球可被特定组织器官的网状内皮系统吞噬，实现靶向治疗。由上述较传统制剂所具有的显而易见的优势，缓释微球制剂已经成为一种前景广阔的药物剂型。但是微球制剂在临床上的释药周期往往长达数周，甚至数月，如果产品质量出现瑕疵，很容易诱发毒副作用甚至威胁患者的生命。这些产品质量瑕疵，包括但不限于突释过高、释放周期难以控制以及载体材料安全性不能保证等，特别的，对于微球制剂需要严格关注其释放度的质量要求。
PLGA共聚物是目前制备微球制剂常用的载体材料。但如上所述，受限于现有合成工艺难以克服的缺陷，成品PLGA总是会含有不同程度的低聚体(分子量低于3000以下的聚合物)残留，由于低聚体在体内更容易水解，因此当这些残留的低聚体随PLGA进入微球后，它们在微球内部发生水解，降低了微球内部的pH值，增强了微球内部的亲水性，加剧微球对水分的摄取，从而导致微球内药物活性成分的溶解发生变化，影响药物在体内的释放行为，进而影响其对疾病的治疗效果。
因此控制PLGA共聚物中的低聚体含量对微球制剂的开发具有重要意义，目前药剂行业尚无对PLGA共聚物中低聚体含量进行准确定量分析的方法，更未有如何控制PLGA共聚物中低聚体含量的方法。如何通过控制PLGA共聚物中低聚体含量，以实现对微球中的活性成分的释放控制成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种控制微球活性成分释放的方法，对微球制备的关键辅料共聚物进行精制，检测其中低聚体含量，通过控制低聚体含量，从而调节微球中活性成分的释放。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种控制微球活性成分释放的方法，包括以下步骤：
(1)取共聚物粉末分别依次加入丙酮、甲醇溶液，离心，取出上清；沉淀加入甲醇，涡旋后离心，取上清；合并上清溶液，气体吹干，加甲醇，涡旋1分钟后，离心，取上清，气体吹干，加入四氢呋喃溶解，即得供试溶液，另取共聚物粉末加入四氢呋喃溶解，作为对照溶液；(2)供试溶液和对照溶液上高效液相色谱进行检测，并计算获得共聚物中低聚体的含量；
(3)若共聚物中低聚体的含量大于10％，则对共聚物进行一次或多次精制，直至共聚物中低聚体的含量≤10％；
(4)以获得的低聚体含量≤10％的共聚物粉末作为载体制备微球。
发明人在研究中发现，通过控制微球载体材料共聚物中低聚体的含量在10％以下，可以达到控制微球活性成分较好释放的效果。
作为优选，步骤(3)中，所述精制具体为：取共聚物粉末溶于丙酮溶液，溶解后，缓慢加入混合溶液中，析出沉淀，弃去上清，再加水洗涤沉淀，于下层置干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥，得精制共聚物。
作为优选，所述混合溶液为丙酮：甲醇：水＝2:3:5的体积比的混合而成。
作为优选，所述共聚物为丙交酯乙交酯共聚物或聚乳酸。
作为优选，步骤(2)中，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：分子排阻色谱柱；流动相为四氢呋喃，采用等度洗脱，检测器为示差检测器；柱温：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：50ul，检测器温度：40℃。
作为优选，步骤(3)中，共聚物进行一次或多次精制后，采用步骤(1)-(2)的方法检测共聚物中低聚体的含量。
作为优选，步骤(1)中，离心为9500rpm离心10-20分钟。
本发明的有益效果是：本发明简单实用，通过采用对共聚物特定的精制方法，从而有效控制共聚物种的低聚体含量在一个特定的范围，从而实现对微球中的活性成分的释放控制；同时低聚体检测方法重现性良好。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
(1)精制共聚物的制备：称取丙交酯乙交酯共聚物(7525)(批号：L00020601311)20g(已经检测低聚体含量大于10％)，加20ml丙酮搅拌溶解，待溶液澄清后，缓慢倒入2L混合溶液中(20％丙酮：30％甲醇：50％水)，静置，弃去上清，沉淀加水洗涤2次，沉淀置于下层置五氧化二磷干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥48小时。即得精制共聚物7g，精制共聚物中低聚体含量应控制在10％以下，大于10％重复步骤(1)再次精制，直至其中低聚体低于10％。
(2)共聚物中低聚体检测：精密称取精制后的丙交酯乙交酯共聚物(7525)(批号：L00020601311-01)60.11mg，加入2ml丙酮溶解，再加入2ml甲醇，9500rpm离心10分钟，吸取上清，沉淀加入2ml甲醇，涡旋后9500rpm离心10分钟，取上清，合并上清，气体吹干，加2mL甲醇涡旋1分钟后，于9500rpm离心10分钟，取上清气体吹干，加入2ml四氢呋喃溶解，即得供试溶液。
对照溶液配制：另取丙交酯乙交酯共聚物(7525)(批号：L00020601311-01)60.11mg，加入2ml四氢呋喃溶解，进样检测。
(3)将上述步骤(2)制备的供试溶液和对照溶液分别上样进行液相色谱分析，液相色谱条件如下：色谱柱：Plgel 5μm，Guard,7.5*50mm-预柱；Plgel 5μm，MIXED-C柱,7.5*300mm 2根；Waters Styragel HR-2柱，5μm 7.8*300mm 1根；依次串联；流动相：四氢呋喃；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测器：示差检测器；检测器温度：40℃；进样量：50ul；检测结果见表1；
计算供试：f＝A对/C对
低聚体含量％＝A样/f*V样/M样*100％
注：f：校正因子；
A对：对照溶液峰面积；
C对：对照溶液浓度；
A样：供试溶液峰面积；
V样：供试溶液体积；
M样：供试品称样量；
表1检测结果
| 样品 | 低聚体含量％ |
| 精制PLGA | 7.2 |
(4)将上述步骤(1)制备的精制共聚物，分别称取6.5g，加入10ml二氯甲烷中形成油相，精密称取醋酸亮丙瑞林3.75g溶于10ml水中形成水相，将油相加入水相中涡旋15000rpm混合20分钟形成初乳，3000rpm搅拌下将初乳注入0.25％聚乙烯醇溶于中形成复乳。继续搅拌5小时除去二氯甲烷，离心收集微球，加入甘露醇，冷冻干燥48小时，收集微球。
(5)微球释放度检查：分别取本品0.1g，精密称定，分别置于内容量为120ml的6个玻璃容器中，精密加入(使用经校正后的分注器)预先加热至48℃的溶出介质(取聚乙烯醇20g，加入800ml热水中，加热并搅拌使聚乙烯醇溶解后，加水至1000ml，作为溶液A。取聚山梨酯80 10g，加水溶解使成1000ml，作为溶液B。取乳酸9g，加水溶解使成1000ml，作为溶液C。量取溶液A 200ml、溶液B 100ml和溶液C 200ml，充分混匀后，加水至1000ml，摇匀。)100ml，用胶栓密塞，用铝盖封盖，立即振摇使混悬，各容器以横倒状态固定，将其置于48℃±1℃的水浴中，水平方向的振荡幅度约4cm，以每分钟125次振荡速度进行振荡，在水浴开始升温振荡后的1小时、9小时及48小时时，用附有注射针(0.65×25mm)的注射器通过胶栓由各容器抽取混悬液1ml(如混悬液中的内容物沉降时，振荡均匀分散后抽取。)，将混悬液立即离心(转速为3000转/分)10分钟，取上清液作为供试品溶液；另取对照品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，用水稀释至50ml，摇匀，作为对照品溶液。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以三乙胺溶液(取三乙胺15.2g，加水800ml溶解，用磷酸调节pH至3.0，加水至1000ml，摇匀)-[乙腈-正丙醇(3:2)](17:3)为流动相，检测波长为220nm。，流速：1.0～1.5ml/min(调整流速，使亮丙瑞林出峰时间在41至49min)，取20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算释放量，检测结果见表2。
表2检测结果
| 取样时间点 | 累计释放度％ |
| 1小时 | 9.8％ |
| 9小时 | 53.5％ |
| 48小时 | 89.5％ |
实施例2共聚物精制前后释放度比较：
为了验证实施例1所述方法的可行性，进行下述验证。分别依次制备如下(1)-(4)所列的4种样品：
(1)未精制共聚物。
(2)一次精制共聚物：称取丙交酯乙交酯共聚物(7525)(批号：L00020601312)100g，加20ml丙酮搅拌溶解，待溶液澄清后，缓慢倒入5L混合溶液中(20％丙酮：30％甲醇：50％水)，静置，弃去上清，沉淀加水洗涤2次，沉淀置于下层置五氧化二磷干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥48小时。即得精制共聚物60g。
(3)二次精制共聚物：称取一次精制共聚物(7525)30g，加20ml丙酮搅拌溶解，待溶液澄清后，缓慢倒入2.5L混合溶液中(20％丙酮：30％甲醇：50％水)，静置，弃去上清，沉淀加水洗涤2次，沉淀置于下层置五氧化二磷干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥48小时。即得精制共聚物16g。
(4)三次精制共聚物：称取二次精制共聚物(7525)12g，加20ml丙酮搅拌溶解，待溶液澄清后，缓慢倒入2L混合溶液中(20％丙酮：30％甲醇：50％水)，静置，弃去上清，沉淀加水洗涤2次，沉淀置于下层置五氧化二磷干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥48小时。即得精制共聚物5.2g。
(5)将上述4种样品分别检测低聚体含量，检测结果如下表3所示：
表3检测结果
| 样品 | 低聚体含量％ |
| 未精制共聚物 | 18.74％ |
| 第一次精制共聚物 | 9.89％ |
| 第二次精制共聚物 | 5.12％ |
| 第三次精制共聚物 | 4.55％ |
结果分析：表3表明第一次精制后低聚体含量由未精制的18.74％下降至9.89％(下降至10％以下)，随着精制次数增加，低聚体含量逐渐下降，精制方法可有效去除低聚体。
(6)将上述实施例2步骤(1)-(4)制备的共聚物制备微球，分别称取5g，加入10ml二氯甲烷中形成油相，精密称取醋酸亮丙瑞林3.75g溶于10ml水中形成水相，将油相加入水相中涡旋15000rpm混合20分钟形成初乳，3000rpm搅拌下将初乳注入0.25％聚乙烯醇溶于中形成复乳。继续搅拌5小时除去二氯甲烷，离心收集微球，加入甘露醇，冷冻干燥48小时，收集微球。
(7)微球释放度检查：分别取本品0.1g，精密称定，分别置于内容量为120ml的6个玻璃容器中，精密加入(使用经校正后的分注器)预先加热至48℃的溶出介质(取聚乙烯醇20g，加入800ml热水中，加热并搅拌使聚乙烯醇溶解后，加水至1000ml，作为溶液A。取聚山梨酯80 10g，加水溶解使成1000ml，作为溶液B。取乳酸9g，加水溶解使成1000ml，作为溶液C。量取溶液A 200ml、溶液B 100ml和溶液C 200ml，充分混匀后，加水至1000ml，摇匀。)100ml，用胶栓密塞，用铝盖封盖，立即振摇使混悬，各容器以横倒状态固定，将其置于48℃±1℃的水浴中，水平方向的振荡幅度约4cm，以每分钟125次振荡速度进行振荡，在水浴开始升温振荡后的1小时、9小时及48小时时，用附有注射针(0.65×25mm)的注射器通过胶栓由各容器抽取混悬液1ml(如混悬液中的内容物沉降时，振荡均匀分散后抽取。)，将混悬液立即离心(转速为3000转/分)10分钟，取上清液作为供试品溶液；另取对照品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，用水稀释至50ml，摇匀，作为对照品溶液。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以三乙胺溶液(取三乙胺15.2g，加水800ml溶解，用磷酸调节pH至3.0，加水至1000ml，摇匀)-[乙腈-正丙醇(3:2)](17:3)为流动相，检测波长为220nm。，流速：1.0～1.5ml/min(调整流速，使亮丙瑞林出峰时间在41至49min)，取20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算释放量，结果见表4。
表4检测结果
。
表4表明采用不同低聚体含量的共聚物，制备的微球在释放过程中1小时的累计释放度明显下降，可有效控制微球的释放行为。
实施例3
(1)精制共聚物的制备：称取聚乳酸(批号：0002064569)20g，加20ml丙酮搅拌溶解，待溶液澄清后，缓慢倒入2L混合溶液中(20％丙酮：30％甲醇：50％水)，静置，弃去上清，沉淀加水洗涤2次，沉淀置于下层置五氧化二磷干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥48小时。即得精制共聚物7g，精制共聚物中低聚体含量应控制在5％～10％之间，大于10％重复步骤(1)再次精制，直至其中低聚体在5％～10％之间。
(2)共聚物中低聚体检测：精密称取精制后的聚乳酸60.24mg，加入2ml丙酮溶解，再加入2ml甲醇，9500rpm离心10分钟，吸取上清，沉淀加入2ml甲醇，涡旋后9500rpm离心10分钟，取上清，合并上清，气体吹干，加2ml甲醇涡旋1分钟后，于9500rpm离心10分钟，取上清气体吹干，加入2ml四氢呋喃溶解，即得供试溶液。
对照溶液配制：另取聚乳酸60.5mg，加入2ml四氢呋喃溶解，进样检测。
(3)将上述步骤(2)制备的供试溶液和对照溶液分别上样进行液相色谱分析，液相色谱条件如下：色谱柱：Plgel 5μm，Guard,7.5*50mm-预柱；Plgel 5μm，MIXED-C柱,7.5*300mm 2根；Waters Styragel HR-2柱，5μm 7.8*300mm 1根；依次串联；流动相：四氢呋喃；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测器：示差检测器；检测器温度：40℃；进样量：50ul；检测结果见表5；
计算公式：f＝A对/C对
低聚体含量％＝A样/f*V样/M样*100％
注：f：校正因子；
A对：对照溶液峰面积；
C对：对照溶液浓度；
A样：供试溶液峰面积；
V样：供试溶液体积；
M样：供试品称样量；
表5检测结果
| 样品 | 低聚体含量％ |
| 精制聚乳酸 | 5.8 |
(4)将上述步骤(1)制备的共聚物，分别称取6.5g，加入10ml二氯甲烷中形成油相，精密称取醋酸亮丙瑞林3.75g溶于10ml水中形成水相，将油相加入水相中涡旋15000rpm混合20分钟形成初乳，3000rpm搅拌下将初乳注入0.25％聚乙烯醇溶于中形成复乳。继续搅拌5小时除去二氯甲烷，离心收集微球，加入甘露醇，冷冻干燥48小时，收集微球。
(5)微球释放度检查：分别取本品0.1g，精密称定，分别置于内容量为120ml的6个玻璃容器中，精密加入(使用经校正后的分注器)预先加热至37的溶出介质(取聚乙烯醇20g，加入800ml热水中，加热并搅拌使聚乙烯醇溶解后，加水至1000ml，作为溶液A。取聚山梨酯80 10g，加水溶解使成1000ml，作为溶液B。取乳酸9g，加水溶解使成1000ml，作为溶液C。量取溶液A 200ml、溶液B 100ml和溶液C 200ml，充分混匀后，加水至1000ml，摇匀。)100ml，用胶栓密塞，用铝盖封盖，立即振摇使混悬，各容器以横倒状态固定，将其置于37℃±0.5℃的水浴中，水平方向的振荡幅度约4cm，以每分钟125次振荡速度进行振荡，在释放度试验的过程中，将水浴温度以每小时0.5℃的速率从37℃升温至61℃，在水浴开始升温振荡后的1小时、9小时及48小时时，用附有注射针(0.65×25mm)的注射器通过胶栓由各容器抽取混悬液1ml(如混悬液中的内容物沉降时，振荡均匀分散后抽取。)，将混悬液立即离心(转速为3000转/分)10分钟，取上清液作为供试品溶液；另取对照品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，用水稀释至50ml，摇匀，作为对照品溶液。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以三乙胺溶液(取三乙胺15.2g，加水800ml溶解，用磷酸调节pH至3.0，加水至1000ml，摇匀)-[乙腈-正丙醇(3:2)](17:3)为流动相，检测波长为220nm。，流速：1.0～1.5ml/min(调整流速，使亮丙瑞林出峰时间在41至49min)，取20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算释放量，检测结果见表6。
表6检测结果
| 取样时间点 | 累计释放度％ |
| 1小时 | 15.3％ |
| 9小时 | 58.1％ |
| 48小时 | 92.3％ |
实施例4低聚体检测方法的重现性验证：
(1)供试品溶液的制备：精密称取丙交酯乙交酯共聚物(批号：0002061311-06)60mg，至离心管加2ml丙酮，涡旋溶解，加入2ml甲醇，混匀于9500rpm离心20分钟，收集上清，沉淀再次添加2ml甲醇，涡旋，离心，合并上清，氮气吹干，加4ml甲醇，涡旋混匀，离心，上清挥干，加四氢呋喃定容至刻度，摇匀作为供试溶液，平行配制6份，分别标记为供试品溶液-1、供试品溶液-2、供试品溶液-3、供试品溶液-4、供试品溶液-5、供试品溶液-6。
(2)对照溶液制备：精密称取丙交酯乙交酯共聚物29.54mg置10ml容量瓶，加四氢呋喃溶解，并定容至刻度，摇匀。
(3)将上述步骤(1)制备的供试品溶液和步骤(2)制备的对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，液相色谱条件如下：色谱柱：Plgel 5μm，Guard,7.5*50mm-预柱；Plgel 5μm，MIXED-C柱,7.5*300mm 2根；Waters Styragel HR-2柱，5μm 7.8*300mm 1根；依次串联；流动相：四氢呋喃；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测器：示差检测器；检测器温度：40℃；进样量：50ul；
计算供试：f＝A对/C对
低聚体含量％＝A样/f*V样/M样*100％
注：f：校正因子；
A对：对照溶液峰面积；
C对：对照溶液浓度；
A样：供试溶液峰面积；
V样：供试溶液体积；
M样：供试品称样量；
表7检测结果
结果分析：六份样品检测结果重现性良好。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (3)
1.一种控制微球活性成分释放的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取共聚物粉末分别依次加入丙酮、甲醇溶液，离心，取出上清；沉淀加入甲醇，涡旋后离心，取上清；合并上清溶液，气体吹干，加甲醇，涡旋1分钟后，离心，取上清，气体吹干，加入四氢呋喃溶解，即得供试溶液，另取共聚物粉末加入四氢呋喃溶解，作为对照溶液；
（2）供试溶液和对照溶液上高效液相色谱进行检测，并计算获得共聚物中低聚体的含量；
（3）若共聚物中低聚体的含量大于10%，则对共聚物进行一次或多次精制，直至共聚物中低聚体的含量≤10%；
（4）以获得的低聚体含量≤10%的共聚物粉末作为载体制备微球；
步骤（3）中，所述精制具体为：取共聚物粉末溶于丙酮溶液，溶解后，缓慢加入混合溶液中，析出沉淀，弃去上清，再加水洗涤沉淀，于下层置干燥剂的真空干燥器中抽真空干燥，得精制共聚物；所述混合溶液为丙酮：甲醇：水=2:3:5的体积比的混合而成；
所述共聚物为丙交酯乙交酯共聚物或聚乳酸；
步骤（2）中，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：分子排阻色谱柱；流动相为四氢呋喃，采用等度洗脱，检测器为示差检测器；柱温：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：50ul，检测器温度：40℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，共聚物进行一次或多次精制后，采用步骤（1）-（2）的方法检测共聚物中低聚体的含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，离心为9500rpm离心10-20分钟。
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| GR01 | Patent grant | ||
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