CN101653414B - 多西他赛长循环固体脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多西他赛长循环固体脂质纳米粒及其制备方法。其包括治疗有效量的多西他赛、脂质材料、长循环辅料和乳化剂。本发明的多西他赛长循环固体脂质纳米粒粒径较小、包封率高、稳定性好；不仅提高多西他赛溶解度及稳定性，降低其毒性，而且延长药物在血液中的循环时间，提高药物的治疗指数，使本制剂在临床应用上具有低毒性、低过敏性、高效性、靶向性的特点。

Description

多西他赛长循环固体脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药剂学领域，具体涉及含有抗肿瘤活性成分多西他赛的长循环固体脂质纳米粒及其制备方法。

背景技术

多西他赛(DOCETAXEL)商品名为泰素帝，为紫杉类药物，通过促进微管双聚体装配成微管，同时通过防止去多聚化过程而使微管稳定，阻滞细胞于G2和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。多西他赛的药理作用比紫杉醇强，在细胞内浓度比紫杉醇高3倍，并在细胞内滞留时间长，其对微管亲和力是紫杉醇的2倍；作为微管稳定剂和装配促进剂，活性比紫杉醇大2倍；作为微管解聚抑制剂，活性比紫杉醇大2倍。在体外抗瘤活性试验中，已证实多西他赛的抗瘤活性是紫杉醇的1.3-12倍。对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。

由于多西他赛水溶性差，目前市售的多西他赛注射剂(40g·L^-1)是采用吐温-80(tween-80)作溶剂，同时配有含13％(

)乙醇的稀释液。由于吐温-80具有溶血性，用于静脉内注射，会引起过敏反应，包括休克、呼吸困难、低血压、血管性水肿、风疹等过敏样反应症状，这些不良反应在人的临床实验可以十分严重，且有死亡报道。故临床用药常规实施预处理：从多西他赛治疗前1天开始口服地塞米松8mg，每天2次，连服3～5天，用多西他赛前30～60分钟肌注苯海拉明40mg、静注西咪替丁300mg。一些病人(2.2％)尽管在药物预防之后，仍然会过敏。5％的病人会因为过敏而不得不停止使用泰素帝，6.5％的病人会产生过敏水肿。为了提醒医生和病人该药的毒副反应的严重性，在美国泰素帝的药物产品说明书中有对该产品的过敏休克副反应加有严重警告术语。另外，吐温-80粘性大，给临床用药带来不便。另外，多西他赛自身有骨髓抑制、白血球减少、血小板减少等毒性，因此，迫切需要改变多西他赛的剂型，以增加多西他赛的水溶性，避免由于溶媒吐温-80引起的过敏反应和多西他赛自身的毒副作用。

为避免因吐温-80及多西他赛自身带来的不良反应，提高多西他赛的抗肿瘤效果，国内外学者现已对之做了多种尝试，其中包括对多西他赛的衍生物及制剂进行广泛研究。中国专利文献CN1283643将聚乙二醇与多西他赛键接起来构成多西他赛的前药，增加了多西他赛的水溶性；中国专利文献CN1421201公开了采用透明质酸、葡萄糖或甘露醇、乙醇、丙二醇、非离子表面活性剂制备了多西他赛的注射剂；中国专利文献CN101019832将多西他赛包裹于脂肪乳粒中，该制剂安全性高、稳定性和疗效均较好；中国专利文献CN10106629公开了多西他赛固体脂质纳米粒，该制剂有效抑制了药物的降解，增加了药物的稳定性，提高疗效；中国专利文献CN101011376将多西他赛溶于油中，再加入乳化剂、助乳化剂制成多西他赛自乳化胶囊，该制剂稳定性好、口服生物利用度高；中国专利文献CN1965820公开了一种高载药量的多西他赛脂微球制剂，具有高包封率、稳定性好、毒性小等特点，保证了临床用药的安全性；中国专利文献CN1868459利用乙醇、吐温-80、甘油、聚乙二醇400、丙二醇等辅料制备了多西他赛冻干粉针，增加了稳定性；中国专利文献CN101002761通过在处方中加入抗氧剂改善了多西他赛注射液的稳定性；中国专利文献CN1660073利用生物可降解聚合物制备多西他赛纳米粒，具有疗效好、毒副作用低等优点；中国专利文献CN1823732公开了一种多西他赛自组装前体脂质体，该制剂临用前加入水合介质可形成粒径均匀、包封率高的脂质体制剂；中国专利文献CN1846692以磷脂、胆固醇为膜材，用长循环辅料进行表面修饰制备多西他赛长循环脂质体，显著提高了多西他赛在体内循环时间及药效；中国专利文献CN1931369利用环糊精对多西他赛进行包合，提高了多西他赛的溶解度；MariaLaura Immordino等人采用卵磷脂、磷脂甘油、胆固醇作膜材将多西他赛制备成稳定而毒性低的脂质体，既保持了多西他赛的抗肿瘤效果，又降低了毒性(控制释放杂志(J.Control.Release)91(3).417-429.2003)；据报道，以橄榄油作载体携带的多西他赛微滴经纤维蛋白原包裹后，提高了多西他赛的抗肿瘤活性(cancer research.2003.63(21).7314-7320)。Le Garrec D等利用两亲性聚合物如PVP-PLA在水中可自发行成聚合物胶束的原理，制备了多西他赛-聚合物胶束，此胶束对多西他赛具有极好的增溶效果，体外抗肿瘤效果与市售制剂均等，但不良反应少于市售制剂(控制释放杂志(J.Control.Release.2004.99(1)83-101)。尽管对多西他赛的衍生物及制剂的研究取得了明显的进展。但大都尚不符合用药的安全性和工业化生产的要求，至今未见上临床、上市的报道。本专利申请在目前条件下成功地解决了这方面地问题。

固体脂质纳米粒是近年来实验研究的一种新型纳米级给药系统，以天然或合成的类脂如磷脂等为载体，将疏水性药物包裹于类脂核中制成粒径约10-1000nm的胶体给药体系。由于其纳米级的特性，因此它不同于普通的混悬性注射剂，兼具下述脂质体、乳剂以及高分子聚合物纳米粒的优点：(1)使用的脂质毒性低，生物相容性高，在体内可降解，不会产生蓄积；(2)药物包裹于类脂核中使固体脂质纳米粒具有控释、避免药物降解及泄漏、良好的靶向性等优点；另外，固体脂质纳米粒可采用高压均质法或微乳法进行工业化生产；其水分散系统可以经高压灭菌或辐射灭菌，具有长期的物理化学稳定性，也可通过冻干或喷雾干燥制成固体制剂。目前，已有喜树碱、齐多夫定脂化物等药物作模型药物被研制成固体脂质纳米粒，研究表明，这些药物的固体脂质纳米粒制剂具有控释、长效、靶向等特性。

传统固体脂质纳米粒在血液中蛋白、调理素的作用下，易发生破裂及药物渗漏，易被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬而迅速在血液循环中清除，药物在体内滞留时间短。在传统固体脂质纳米粒的基础上，加入聚乙二醇衍生化的材料进行修饰制得长循环或隐形固体脂质纳米粒。长循环固体脂质纳米粒表面暴露的亲水基团所产生的空间位阻，可以减少与血浆中调理成分的结合，避免了被巨噬细胞摄取，显著延长了其在血液中的循环时间，从而增加了被包裹药物向病变部位的蓄积，提高了药物的疗效。因此，将长循环固体脂质纳米粒作为药物载体，结合多西他赛研制一种含有多西他赛的长循环固体脂质纳米粒，具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种性质稳定且可采用现有技术工业化生产的多西他赛长循环固体脂质纳米粒，该制剂增加了多西他赛的水溶性和稳定性，消除现有制剂的过敏反应，并可避免网状内皮系统的吞噬，从而达到对肿瘤部位被动靶向、提高生物利用度及治疗指数、降低毒性的目的；

本发明的另一目的是提供上述多西他赛长循环固体脂质纳米粒的制备方法，而且制备方法灵活多样，均采用常规的工艺设备，可工业规模、高效率生产，产品质量保持稳定，可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

本发明的又一目的是提供一种多西他赛长循环固体脂质纳米粒的固体制剂，该固体制剂是上述多西他赛长循环固体脂质纳米粒加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

本发明的再一目的是提供一种多西他赛注射剂或口服制剂，其是由上述的多西他赛长循环固体脂质纳米粒制备而成的。

本发明的特点在于运用PEG化的辅料来修饰固体脂质纳米粒，一方面可以解决普通固体脂质纳米粒稳定性差、药物易泄漏等问题，另一方面可以使纳米粒表面被PEG修饰，形成一种立体稳定的构象云，阻止血液中血浆蛋白的吸附和调理素的识别，减少纳米粒被内皮网状系统吞噬，从而减慢纳米粒的清除速度，延长其在血液中的驻留时间，有利于其进入肿瘤组织，增强对肿瘤部位的渗透和滞留作用(EPR效应)，从而达到肿瘤靶向和增效减毒作用。

本发明的多西他赛长循环固体脂质纳米粒由包含以下重量份的原料制备而成：

多西他赛：  1份

脂质材料：  4-80份

长循环辅料：0.1-40份

乳化剂：    0.1-60份。

优选地，本发明的多西他赛长循环固体脂质纳米粒由包含以下重量份的原料制备而成：

多西他赛：  1份

脂质材料：  10-50份

长循环辅料：0.5-20份

乳化剂：    1-30份。

所述的脂质材料为十八醇、甘油脂、磷脂、脂肪酸、类固醇、蜡脂或其混合物，其中所述的甘油脂为单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单山嵛酸甘油酯、双山嵛酸甘油酯、三山嵛酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三油酸甘油脂、三辛酸/癸酸甘油酯或其混合物；所述的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂、氢化卵磷脂或其混合物；所述的脂肪酸为硬脂酸、豆蔻酸、棕榈酸、山嵛酸、辛酸、癸酸或其混合物；所述的类固醇为胆固醇；所述的蜡脂为鲸蜡醇棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡或其混合物。

所述的长循环辅料为聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-磷脂酰甘油、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯或其混合物，其中，聚乙二醇分子量为200-20000，优选分子量为1000-5000。上述长循环辅料共同特征是一端为亲水性的聚乙二醇，由于PEG具有较好的亲水性和柔韧性，目前被证实是最佳的表面修饰材料；另一端则为亲油的疏水端，可以很好的与脂质材料将药物包裹形成长循环固体脂质纳米粒。

所述的乳化剂为胆酸盐、脱氧胆酸盐、短链醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯或其混合物。其中胆酸盐为胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠或其混合物；脱氧胆酸盐为脱氧胆酸钠、脱氧牛磺胆酸钠或其混合物；短链醇为甘油、丙二醇或其混合物；泊洛沙姆为Poloxamer-108、Poloxamer-188或其混合物；聚山梨醇酯为吐温-80；聚氧乙烯脂肪醇醚为Brij 78，Brij 35、Brij 30或其混合物；聚氧乙烯脂肪酸酯为Myrj 53、Myrj 59或其混合物。

所述的多西他赛长循环固体脂质纳米粒的粒径小于1000nm，优选粒径小于500nm，包封率大于80％。

本发明提供多西他赛长循环固体脂质纳米粒的制备方法。该制备方法可以使用以下几种方法中的任意一种：

方法一：乳化-沉淀法制备，称取配方量的多西他赛、脂质材料、长循环辅料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，然后减压蒸发除去有机溶剂，然后进行超声或高压均质处理，即可得到长循环固体脂质纳米粒。或

方法二：乳化挥发-低温固化法制备，即将多西他赛、脂质材料、长循环辅料、脂溶性乳化剂按比例溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，减压蒸发除去有机溶剂，并使体系浓缩，将浓缩液迅速混于2-50倍体积的0-4℃低温水中，搅拌降温，然后可进行超声或高压均质处理得到多西他赛长循环固体脂质纳米粒。或

方法三：薄膜-分散法制备，称取配方量的多西他赛、脂质材料、长循环辅料、脂溶性乳化剂溶于一定量的有机溶剂中，在20-60℃水浴中减压蒸干成膜，加入一定量含水溶性乳化剂的水溶液，超声或高压均质处理即得到多西他赛长循环固体脂质纳米粒。或

方法四：热熔分散法制备，称取配方量多西他赛、脂质材料、长循环辅料、脂溶性乳化剂在60-90℃下加热至熔融，作为油相。将水溶性乳化剂溶于水中加热至相同温度作为水相。在搅拌下将油相、水相混合，经超声或高压均质处理，即可制得多西他赛长循环固体脂质纳米粒。

上述制备方法中，方法一和方法二中所述的有机相和水相的相同温度在20-80℃之间，优选相同温度在30-60℃之间；所述的有机溶剂为氯仿、乙醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或其混合溶剂；为减小长循环固体脂质纳米粒的粒径，可采用超声或高压均质工艺。其中，超声功率为100-1000W，超声时间为10-40min；高压均质压力为10000-25000psi，高压均质次数为3次-10次。

为延长多西他赛长循环固体脂质纳米粒的存放时间，便于运输，可将本发明的多西他赛长循环固体脂质纳米粒通过喷雾干燥或冷冻干燥工艺制成固体制剂；为防止干燥工艺中长循环固体脂质纳米粒的聚集需加入支架剂，可以选择的支架剂为氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖或其混合物，其用量为1-40％(w/v)。

本发明以脂质材料为载体材料，并以长循环辅料进行表面修饰，采用多种制备方法，使多西他赛包载于长循环固体脂质纳米粒中。所得多西他赛长循环固体脂质纳米粒粒径小(＜1000nm)，包封率高(＞80％)，稳定性佳，且可以以注射或口服方式给药，其中注射方式可以为静脉输注、静脉注射，优选静脉输注方式给予患者。

本发明的多西他赛长循环固体脂质纳米粒以及由其制备成的固体制剂具有以下优点：

1、与多西他赛注射液相比，该长循环固体脂质纳米粒消除了过敏反应，提高了多西他赛的水溶性和稳定性，降低了毒性，保证了用药的安全性，提高了机体耐受性。

2、与多西他赛乳剂、脂质体、固体脂质纳米粒相比，本发明的制剂通过PEG对固体脂质纳米粒进行表面修饰，有助于避免体内内皮网状系统的吞噬，延长药物在体内的循环时间，使药物更有效地靶向于肿瘤部位，从而提高药物的生物利用度及其治疗指数。

3、该长循环固体脂质纳米粒可经冷冻干燥和喷雾干燥制成固体产品，保证制品在贮藏及运输过程中的稳定性，延长了产品的有效期，提高了药品的质量。

4、该长循环固体脂质纳米粒制备工艺成熟，方法简便易行，材料来源广，产品质量稳定，便于工业化生产。

附图说明

图1为本发明多西他赛长循环固体脂质纳米粒的体外释药曲线图。

具体实施方式：

下面再以实施例对本发明作进一步说明，给出本发明的实施细节。

实施例1：

称取100mg多西他赛、800mg硬脂酸、400mg卵磷脂、100mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)溶于20ml的二氯甲烷中，在50℃下减压蒸干，形成脂质膜，加入25ml的吐温-80(0.5％)，超声分散30min(超声功率600W)，即得长循环固体脂质纳米粒混悬液，2℃保存备用。其平均粒径为245nm，90％粒子均在500nm以下，粒径分布狭窄，表明长循环固体脂质纳米粒大小较为均一。

实施例2：

称取100mg多西他赛、2000mg大豆磷脂、200mg氢化卵磷脂、400mg聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG₅₀₀₀-DPPE)加入50ml具塞锥形瓶中，加10ml乙醇∶丙酮(1∶10)混合溶剂，超声使其充分溶解并加热至75℃，构成有机相。另取150mg Poloxamer-188溶于30ml重蒸水中，构成水相。用注射器将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的75℃水相中，继续搅拌至形成半透明体系。40℃下减压蒸发除去有机溶剂并使体系浓缩至25ml，降至室温，得到长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例3：

取100mg多西他赛、1000mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、100mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、100mg聚乙二醇(分子量为3350)-聚己内酯溶解于氯仿∶甲醇(v/v，1∶1)10ml，超声溶解并加热至(50±2)℃构成有机相。另取200mg Myrj 53加入30ml双蒸水中，超声使其充分溶解，构成水相。将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的(50±2)℃的恒温水相中形成初乳，继续搅拌约2～3h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明乳剂快速混于另一0～2℃的1000r/min搅拌的20ml冰水中，继续搅拌2小时，然后于高压均质机中乳匀5次(均质压力为15000psi)，即得长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例4

取100mg多西他赛、1000mg二月桂酰磷脂酰胆碱、120mg二硬脂酰磷脂酰甘油、500mg聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-PE)置于25ml梨形瓶中，于(60±2)℃的恒温水浴上加热使其充分熔融，构成油相；另取100mg胆酸钠溶于10ml水中，水浴加热至与有机相相同的温度，构成水相。将油相在1000r/min搅拌下注入水相中，搅拌4h，温度保持在(60±2)℃，形成O/W型初乳。将所得乳剂在搅拌(1000r/min)下快速混于0～2℃15ml水中，继续搅拌2h，然后于800W功率下超声处理30min，即得长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例5

称取100mg多西他赛、2000mg二油酰磷脂酰胆碱、100mg二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、1000mg聚乙二醇(分子量为5000)-聚乙交酯丙交酯混合均匀，85℃加热使熔融，作为油相。将250mg脱氧胆酸钠、500mg甘油加注射用水25ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，20000rpm下高速搅拌30min后改用超声分散，室温，功率600W，超声时间10min，即制得多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例6

称取100mg多西他赛、200mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、1000mg二月桂酰磷脂酰胆碱、200mg聚乙二醇(分子量为4000)-聚乳酸混合均匀，85℃加热使熔融，作为油相。将500mg脱氧牛磺胆酸钠、100mg丙二醇加注射用水25ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，继续搅拌1h后，转至高压均质机中，经20000psi压力乳匀10次，即可制得多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例7

精密称取多西他赛100mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱1300mg、磷脂酰甘油300mg、聚乙二醇-磷脂酰甘油(PEG₂₀₀₀-PG)300mg于1000ml圆底烧瓶中，加入50ml氯仿溶解，40℃下旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜。加入0.5％甘胆酸钠溶液25ml，600W功率下水浴超声20min，即得多西他赛长循环固体脂质纳米粒。

实施例8

称取多西他赛100mg、磷脂酰胆碱2000mg、磷脂酸200mg、聚乙二醇(分子量为2000)-聚十六烷基氰基丙烯酸酯400mg，在通氮气条件下加热至(80±5)℃熔融，然后在搅拌条件下加入相同温度含2.5％甘油和0.5％牛磺胆酸钠的水溶液25ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机上25000psi压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成长循环固体脂质纳米粒混悬液。在4℃密封保存，供试验用。

实施例9

称取二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱1g、二油酰磷脂酰乙醇胺0.2g、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG₄₀₀₀-PE)0.5g和多西他赛0.1g加入10ml乙醚超声使之溶解完全，然后在磁力搅拌下用6号针头注入30ml 2.5％Brij 78溶液中。2000rpm搅拌30min后，转移至旋转蒸发仪中，40℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，加入山梨醇3g、甘氨酸3g经超声处理(超声功率600W)20min，药液于喷雾干燥机中干燥，喷雾干燥条件为：进风温度120℃，进料速度50ml/min，旋风分离器压差50mm水，雾化盘转速2500r/min，收集得到多西他赛长循环固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例10

精密称取Poloxamer-1080.25g、甘油0.5g，在高速磁力搅拌条件下，加入到已加热至(60±5)℃的25ml蒸馏水中，待完全溶解作为水相；另称磷脂酰丝氨酸0.1g、大豆磷脂5g、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG4000-DSPE)0.2g、多西他赛0.1g加热熔融作为油相；将油相缓慢滴加至水相中，高速剪切(Fluko，12000rpm)5min，制成O/W型乳剂后，改用水浴式超声仪超声分散(室温，功率600W，超声时间20min)，即得乳光明显的澄明的长循环固体脂质纳米粒混悬液。加入2.5g甘露醇、1.25g葡萄糖、1.25g海藻糖超声溶解，于-40℃预冻6h后，以-40℃，8h；-30℃，8h；-20℃，8h；-10℃，6h；10℃，8h的程序冷冻干燥，即得多西他赛长循环固体脂质纳米粒冻干制剂。

实施例11

精密称取蛋黄卵磷脂1000mg、二棕榈酰磷脂酰甘油100mg、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₅₀₀₀-DSPE)300mg、多西他赛60mg，加入乙酸乙脂10ml，超声使完全溶解。将所得的混合物溶液加入到含1％Brij 35溶液15ml中，高速搅拌(20000rpm)5min，得长循环固体脂质纳米粒混悬液。加入1500mg乳糖、750mg甘露醇、750mg海藻糖超声溶解后，于微型喷雾干燥器中喷雾干燥(进口温度130-140℃，出口温度50-60℃，空气压力1.2Atm，加料速度60ml/min)，即得多西他赛长循环固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例12

取多西他赛100mg、氢化卵磷脂4000mg、二棕榈酰磷脂酸200mg和甲醇∶丙酮(1∶1)20ml加入25ml梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入200mg聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DPPE)，微热使溶成有机相。另取500mg Mrij 59溶于水25ml中构成水相。将有机相在(1000r/min)搅拌下注入(75±2)℃的水相中，继续搅拌4h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明体系搅拌下(1000r/min)快速混于另一0～2℃的20ml水中，继续搅拌2h，即得多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液。该混悬液加入2500mg阿拉伯胶、1250mg麦芽糖、1250mg甘露醇、2500mg蔗糖超声溶解后，于-40℃预冻6小时，于冷冻干燥机中冻干，冻干程序为-40℃，8小时；-30℃，6小时；-20℃，6小时；-10℃，5小时；0℃，5小时；15℃，5小时。

实施例13

称取多西他赛100mg、大豆磷脂3000mg、磷脂酰肌醇100mg、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-PE)200mg，在通氮气条件下加热至(80±5)℃，然后在搅拌条件下加入相同温度含2.5％甘油和0.5％吐温-80的水溶液25ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机(Avestin，C5)上15000psi压力下乳匀5次，形成长循环固体脂质纳米粒混悬液。该混悬液加入1250mg木糖醇、1250mg果糖、2500mg甘露醇于-40℃预冻10小时，于冷冻干燥机(labconco)中冻干(冻干程序为-40℃，10小时；-20℃，8小时；0℃，8小时；20℃，5小时)，即得多西他赛长循环固体脂质纳米粒冻干制剂。

实施例14

称取100mg多西他赛、800mg单硬脂酸甘油酯、400mg大豆磷脂、200mg聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-PE)加入50ml具塞锥形瓶中，加10ml乙醇∶丙酮(1∶1)混合溶剂，超声使其充分溶解并加热至75℃，构成有机相。另取150mg Poloxamer-188溶于30ml重蒸水中，构成水相。用注射器将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的75℃水相中，继续搅拌至形成半透明体系。40℃下减压蒸发除去有机溶剂，降至室温，得到长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例15

取100mg多西他赛、2000mg三棕榈酸甘油酯、600mg十八醇、800mg卵磷脂、200mg聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DPPE)溶解于乙醇10ml，超声溶解并加热至(80±2)℃构成有机相。另取120mg Myrj53加入30ml双蒸水中，超声使其充分溶解，构成水相。将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的(80±2)℃的恒温水相中形成初乳，继续搅拌约2～3h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明乳剂快速混于另一0～2℃的1000r/min搅拌的20ml冰水中，继续搅拌2小时，然后于高压均质机中乳匀5次(均质压力为15000psi)，即得长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例16

取100mg多西他赛、1000mg山嵛酸、200mg胆固醇、200mg氢化磷脂、200mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₅₀₀₀-DSPE)置于25ml梨形瓶中，于(75±2)℃的恒温水浴上加热使其充分熔融，构成油相；另取400mg胆酸钠溶于10ml水中，水浴加热至与有机相相同的温度，构成水相。将油相在1000r/min搅拌下注入水相中，搅拌4h，温度保持在(75±2)℃，形成O/W型初乳。将所得乳剂在搅拌(1000r/min)下快速混于0～2℃15ml水中，继续搅拌2h，然后于800W功率下超声处理30min，即得长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例17

称取100mg多西他赛、1000mg三月桂酸甘油酯、500mg大豆磷脂、200mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₄₀₀₀-DSPE)混合均匀，85℃加热使熔融，作为油相。将300mg脱氧胆酸钠、500mg甘油加注射用水25ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，20000rpm下高速搅拌30min后改用超声分散，室温，功率600W，超声时间10min，即制得多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例18

称取100mg多西他赛、2000mg三肉豆蔻酸甘油酯、200mg二油酰磷脂酰胆碱、100mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)混合均匀，85℃加热使熔融，作为油相。将500mg脱氧牛磺胆酸钠、1000mg丙二醇加注射用水25ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，继续搅拌1h后，转至高压均质机中，经20000psi压力乳匀10次，即可制得多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液。

实施例19

精密称取多西他赛100mg、双山嵛酸甘油酯1200mg、200mg氢化卵磷脂、200mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₅₀₀₀-DSPE)于1000ml圆底烧瓶中，加入50ml氯仿溶解，40℃下旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜。加入0.5％甘胆酸钠溶液25ml，600W功率下水浴超声20min，即得多西他赛长循环固体脂质纳米粒。

实施例20

称取多西他赛100mg、三油酸甘油酯2000mg、鲸蜡醇十六酸酯500mg、200mg氢化卵磷脂、200mg聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)，在通氮气条件下加热至(80±5)℃熔融，然后在搅拌条件下加入相同温度含2.5％甘油和0.5％牛磺胆酸钠的水溶液25ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机上25000psi压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成长循环固体脂质纳米粒混悬液。在4℃密封保存，供试验用。

实施例21

称取聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)200mg、二油酰磷脂酰乙醇胺500mg、棕榈酸1000mg和多西他赛100mg加入10ml乙醚超声使之溶解完全，然后在磁力搅拌下用6号针头注入25ml 2.5％Brij78溶液中。2000rpm搅拌30min后，转移至旋转蒸发仪中，40℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，直至形成乳白色悬浊液，加入山梨醇2g、甘氨酸2g经超声处理(超声功率600W)20min，药液于喷雾干燥机中干燥，喷雾干燥条件为：进风温度120℃，进料速度50ml/min，旋风分离器压差50mm水，雾化盘转速2500r/min，收集得到长循环固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例22

取实施例1中的多西他赛长循环固体脂质纳米粒测定包封率及载药量。

将多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液采用SS-5中空纤维超滤器(截留平均分子量为10000)进行超滤，弃去初滤液5ml，将超滤液和长循环固体脂质纳米粒混悬液用甲醇溶解并稀释至测定浓度，采用高效液相色谱测定包封率及载药量。

色谱条件：色谱柱：ODS-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇∶水(体积比为76∶24)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：230nm；柱温：室温；进样量：20μL。结果见表1。

表1

实施例23

实施例2中多西他赛长循环固体脂质纳米粒包封率测定

包封率通过葡聚糖凝胶柱层析法测定。层析条件为：Sephadex-G50柱(18cm×2cm)，洗脱液为蒸馏水，流速1ml/min，室温下层析。移取长循环固体脂质纳米粒混悬液0.5ml上柱，以柱层析条件洗脱，每2ml收集1管，被包封药物量采用高效液相色谱测定，采用下式计算包封率。

包封率＝(M_包/M_总)×100％

式中，M_包表示被长循环固体脂质纳米粒包封的药物量，M_总表示长循环固体脂质纳米粒中的总含药量。

结果：测得长循环固体脂质纳米粒混悬液的包封率为90.36％。

实施例24

实施例3中多西他赛长循环固体脂质纳米粒理化性质研究。

1)形态学研究

取少量长循环固体脂质纳米粒混悬液滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0％磷钨酸钠溶液染色，在透射电镜下观察粒径大小和形态并拍摄照片，可见其外观为圆整的球形。

2)粒径和Zeta电位测定

取长循环固体脂质纳米粒混悬液适量加水稀释，用多功能Zeta电位粒度分析仪在632.8nm下测定粒径、粒度分布及Zeta电位。

结果：测得样品的平均粒径为105.0nm；平均Zeta电位-26.91mV。

3)包封率考察

取长循环固体脂质纳米粒混悬液适量进行低温超速离心(4℃，20000g，30min)，精密量取上清液1ml，甲醇稀释定容至10ml，用高效液相色谱法测定得多西他赛的峰面积为A_游，同法将长循环固体脂质纳米粒混悬液稀释后测得多西他赛的峰面积为A_总。

包封率(％)＝(1-A_游/A_总)×100％

结果：测得多西他赛长循环固体脂质纳米粒的包封率为91.20％。

实施例25

精密移取实施例4中多西他赛长循环固体脂质纳米粒混悬液0.5ml，放入处理过的透析袋(截留分子量为12000)中，透析袋两端夹紧至不渗漏；精密量取蒸馏水50ml，放入100ml烧杯中；将含药液透析袋移入装有释放介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封杯口；将烧杯置于恒温振荡器内，设置温度为37±0.5℃，水平振荡频率为100次/min，于0.5、1、2、4、6、8、12、24h取样，分别将烧杯内的释放介质全部取出，再加入50ml新的同种介质继续恒温振荡。将取出的释放介质溶液用高效液相测定多西他赛的浓度，计算药物的释放率，以累计释放率和时间做出体外释药曲线。结果见图1。

从图1中可观察到：多西他赛长循环固体脂质纳米粒在24小时的累计释放百分率仅31％，说明多西他赛在长循环固体脂质纳米粒的包裹下药剂学性质稳定，保证了纳米粒在体内循环时将所载药物转运至靶部位，故可以认为多西他赛长循环固体脂质纳米粒具有缓慢释放效果，达到了设计要求。

实施例26

取实施例10中的冻干品适量，密封，于冰箱4℃放置，于0、1、3、6、9、12月对粒径、包封率、含量等指标进行测定，评价多西他赛长循环固体脂质纳米粒冻干品的稳定性。结果见表2。

表2

表2说明，多西他赛长循环固体脂质纳米粒冻干品在冰箱4℃放置12个月，其粒径、包封率、含量等质量指标基本不变，表明多西他赛长循环固体脂质纳米粒冻干制剂稳定性良好。

实施例27

取上述实施例中的多西他赛长循环固体脂质纳米粒制剂进行刺激性实验。

(1)对家兔耳缘静脉血管刺激试验：

将多西他赛注射液的两种不同剂型按临床用药量进行体表面积换算得出实验兔用剂量。实验前按1ml/kg的给药量用无菌生理盐水注射液新鲜配制。选用体重2.5-3.0kg的健康新西兰白兔6只，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒后，3只白兔于右耳耳缘静脉注射多西他赛注射液，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照；另3只白兔于右耳耳缘静脉注射多西他赛长循环固体脂质纳米粒，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照。每日一次，连续3天，末次给药24小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，肉眼观察注射部位的反应情况，并解剖兔耳血管及周围组织作石蜡切片(注射部位下向心段1cm及5cm处)，染色，光镜检查。肉眼观察注射部位反应情况。结果见表3。

表3

结果，如表3所示，多西他赛长循环固体脂质纳米粒血管刺激性明显弱于多西他赛注射液。

(2)肌肉刺激性试验

多西他赛注射液的剂量换算、药物配制、新西兰白兔的选择同上(共4只，每种剂型2只)。剪去白兔两侧股四头肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒后，分别在右侧股四头肌注射多西他赛长循环固体脂质纳米粒和多西他赛注射液1ml，左侧股四头肌注射等量无菌生理盐水注射液作对照，注射48小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，解剖股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反应情况，确定反应级数。

0级：无变化

1级：轻度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以下

2级：中度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以上

3级：重度充血，伴有肌肉变性

4级：出现坏死，有褐色变性

5级：出现广泛性坏死

然后算出4块股四头肌反应级数总和，如果股四头肌反应级数的最高值与最低值之差大于2，则应另取2只白兔重新实验。得到结果后，若四块股四头肌反应级数总和小于10，则认为供试品的局部刺激性实验符合规定。

表4

结果(见表4)表明，多西他赛长循环固体脂质纳米粒的肌肉刺激性明显弱于多西他赛注射液。

实施例28过敏试验

给药方法取适量多西他赛注射液用生理盐水稀释一定倍数，为样品A；取自制多西他赛长循环固体脂质纳米粒用生理盐水稀释一定倍数，为样品B。取豚鼠12只，分成A、B两组，分别供样品A和B进行过敏性试验用。每组豚鼠6只，体重250～350g。隔天ip供试品0.5ml，连续3次。然后将A、B组豚鼠再分别平均分成A1、A2及B1、B2组，其中A1、B1组于首次注射后的第14天由后脚掌外侧静脉注入供试品1ml进行攻击，观察注射后动物有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克、死亡等反应，A2、B2组于首次注射后的第21天同样由后脚掌外侧静脉注入供试品并进行观察。

结果：多西他赛注射液：多次抓鼻、多次颤抖、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难，两例动物出现大小便失禁；多西他赛长循环固体脂质纳米粒：竖毛、少数动物颤抖。

根据豚鼠过敏反应级数标准表，对本试验进行评定，反应级数达2级以上(包括2级)时，可认为该供试品过敏反应试验阳性。

结果：A组为3级，B组为1级。即A组(市售多西他赛注射液)可导致明显的过敏反应，为阳性，而B组(自制多西他赛长循环固体脂质纳米粒)过敏试验为阴性。

实施例29溶血性实验

自新西兰白兔的颈总动脉取血20ml，置于烧瓶内，用玻璃棒轻轻搅动数分钟后，除去纤维蛋白，取出血液，加等量生理盐水注射液，离心(1500rpm，10min)，除去上清液；沉淀的红细胞再加生理盐水注射液清洗。如此反复直到上清液透明，按红细胞的容量用生理盐水配成2％的混悬液。

取干净试管7支，分别编号，依次加入下表内各液，第6管不加供试品作空白对照管，第7管用蒸馏水代替生理盐水，摇匀，置于37℃水浴中，分别于0.5、1、2、3小时观察是否有溶血现象发生。结果见表5和表6。

表5

表6

结果表明，多西他赛注射液和多西他赛长循环固体脂质纳米粒都未见溶血发生，两种剂型的溶血性实验均合格。

实施例30毒性实验

实验方法：取实施例11的多西他赛长循环固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂，加水分散并稀释成适当浓度。将体重18～22g性别一致的昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，动物实验前禁食4小时，自由饮水，分别尾静脉注射多西他赛长循环固体脂质纳米粒和多西他赛注射液，组间剂量按等比级数排列，比值1∶0.8，给药后连续观察动物反应并记录10天时间内动物死亡数。将各剂量组动物死亡数按简化几率单位法计算出LD₅₀(95％置信限)值。

多西他赛注射液                LD₅₀＝105±31mg/kg

多西他赛长循环固体脂质纳米粒  LD₅₀＝240±28mg/kg

LD₅₀的实验结果表明，多西他赛长循环固体脂质纳米粒与多西他赛注射液相比，毒性明显降低。

实施例31

取实施例12的长循环固体脂质纳米粒固体制剂进行体外抑瘤活性实验。

采用噻唑蓝体外试验法(MTT法)检测多西他赛注射液、多西他赛长循环固体脂质纳米粒和空白固体脂质纳米粒对膀胱癌细胞株的生长抑制作用。采用EJ细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液，以2.5×10⁴/孔的浓度接种于96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液。培养24小时细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的多西他赛注射液、多西他赛长循环固体脂质纳米粒、空白固体脂质纳米粒及空白和单培养液对照(药物浓度分别为20、40、80μg/ml)，每个样品设4复孔。将培养板置37℃、含5％CO₂培养箱培养48h后，加MTT 20μl，继续培养4h，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，待结晶溶解后置入酶标仪，于570nm处测每孔OD值，计算抑制率。

抑制率＝(1-试验组OD值/对照组OD值)×100％

表7

由表7可见，多西他赛注射液和多西他赛长循环固体脂质纳米粒随着浓度的增加，对肿瘤细胞活性的抑制率相应增加。当多西他赛注射液浓度为20、40、80μg/ml时，抑制率分别为74.33％、80.36％、89.12％；当多西他赛长循环固体脂质纳米粒浓度为20、40、80μg/ml时，抑制率分别为78.12％、84.96％、93.32％。两组细胞抑制率均大于74％，随着药物浓度的升高，抑制率升高。多西他赛注射液的抑制率略低于多西他赛长循环固体脂质纳米粒，但两组间差异无统计学意义(p＞0.05)。

实施例32药物动力学实验

昆明小鼠(20±2g)150只，随机分为3组，每组50只小鼠，3组小鼠以10mg/kg的剂量分别iv多西他赛注射液、长循环固体脂质纳米粒、普通固体脂质纳米粒。每组小鼠分8个时间点，每个时间点5只小鼠。分别于0、0.5、1、2、4、8、14和24h眼眶取血，3000r/min离心取血清于-20℃冰箱中保存。

血清药物浓度测定方法：取血清100μL，加入叔丁基甲醚2.0mL涡旋振荡90s，离心，将上层有机相于40℃水浴中氮气吹干，再用流动相溶解，用高效液相法测定药物浓度。流动相为：甲醇∶乙腈∶水(45∶30∶25)；检测波长为230nm；进样量为50μL。

将实验所得血浓经时数据用kinetita软件包处理，判断房室模型，同时进行统计矩分析，并将所得药动学参数经spss统计软件进行t检验。其中AUC_0-24和AUC_0-∞均为梯形法计算结果。

表8

^*P＜0.05；^**P＜0.01。

结果：多西他赛长循环固体脂质纳米粒的MRT、AUC_0-24和AUC_0-∞分别是多西他赛普通固体脂质纳米粒的2.74、5.37、4.96倍，具有极显著差异(P＜0.01)，CL是普通纳米粒的0.27倍，具有极显著差异(P＜0.01)，说明在同样剂量条件下，长循环固体脂质纳米粒在体内能够维持较长的循环时间，使其有更多的机会达到靶部位，实现靶向作用。因为长循环固体脂质纳米粒表面柔顺的PEG长链可以吸附大量水分子，在纳米粒表面形成一层水分子的空间位阻，减少体内巨噬细胞的吞噬，从而延长固体脂质纳米粒在血液中的循环时间。

Claims (6)

1.一种多西他赛长循环固体脂质纳米粒，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

多西他赛：   1份

脂质材料：   4-80份

长循环辅料： 0.1-40份

乳化剂：     0.1-60份；

所述的长循环固体脂质纳米粒的粒径小于1000nm，包封率大于80％；

所述的脂质材料为磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰甘油、大豆磷脂或卵磷脂；

所述的长循环辅料为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；所述的聚乙二醇的分子量为1000-5000；

所述的乳化剂为甘油、泊洛沙姆-108或苄泽35。

2.根据权利要求1所述的多西他赛长循环固体脂质纳米粒，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

多西他赛：  1份

脂质材料：  10-50份

长循环辅料：0.5-20份

乳化剂：    1-30份。

3.根据权利要求1所述的多西他赛长循环固体脂质纳米粒，其特征在于，其粒径小于500nm。

4.一种多西他赛长循环固体脂质纳米粒的固体制剂，其特征在于，所述固体制剂是权利要求1或2中的多西他赛长循环固体脂质纳米粒加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

5.根据权利要求4所述的多西他赛长循环固体脂质纳米粒的固体制剂，其特征在于，所述的支架剂为氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖或其混合物；并且其用量为1-40(w/v)％。

6.一种多西他赛注射剂或口服制剂，其特征在于，是由权利要求1或2中的多西他赛长循环固体脂质纳米粒制备而成的。

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