CN103622924B - 一种多西他赛脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了一种适合工业化生产的多西他赛脂质体及其制备方法。本发明的制备方法如下：将溶解于主药的脂质体膜材的有机溶媒分散在极细的水溶性支撑剂微粉中，在减压的条件回收有机溶媒，将脂质吸附于水溶性载体上，既得粉体状态的脂质体。当这种粉体状态的脂质体与水化介质接触时，脂质溶胀而水溶性载体迅速溶解，在水相中形成多层脂质体，通过外加作用力降低粒径即得有蓝色乳光的澄清脂质体，加入冻干保护剂冷冻干燥得到脂质体粉末，使用前复溶即得脂质体溶液。本发明利用减压载体冻干技术制备脂质体，可以大幅度提高脂质体的稳定性，且本制备方法易于生产放大，为脂质体的工业化提供了新的思路。

Description

一种多西他赛脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及抗癌药物多西他赛脂质体制剂，还涉及所述制剂的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤,已成为严重危害人类健康和生命的顽固性、难治性疾病，被称为世界“第一号杀手”。根据世界卫生组织近些年的统计报告显示，全球癌症发病率将增加50%，即每年将新增1500万癌症患者。不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅猛上升，全球20%的新发癌症病人在中国，24%的癌症死亡病人在中国。由此可见，抗肿瘤药物及新制剂的研究开发具有重要的社会效益和巨大的潜在市场。一般来说，抗癌药物多具有较强的毒副反应，限制了恶性肿瘤的治疗效果，降低抗肿瘤药物毒副反应是开发制剂的一个重要方向。

脂质体是一种由磷脂双分子层构成的、具有类细胞结构的脂质囊泡，可以改变被包封药物的体内分布、提高药物治疗指数、减少给药剂量和降低药物毒性，体内易降解、无毒、无免疫原性，已广泛包载各类药物尤其是抗肿瘤药物。由于脂质体有良好的生物相容性，局部给药后可明显减少制剂材料引起的组织刺激性。并且脂质体材料易得、制备工艺完善、方法简单。脂质体内水相和脂质双分子层极性不同且均可载药，使脂质体可载药范围广，载药量相对较大。

然而，国外脂质体制剂的上市产品迄今仍屈指可数。主要原因是：(1)脂质体混悬液在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏，尤其水溶性药物的渗漏更显著；同时，天然磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求；(2)脂质体制剂的制备工艺较复杂，不易扩大生产。对脂质体进行冷冻干燥可在一定程度上缓解贮存稳定性问题，但工艺复杂、成本高。

多西他赛(Docetaxel)又名多西紫杉醇，缩写为DTX，其结构式如下。由于多西他赛以t-丁氧碳基取代了紫杉醇中的苯甲酸基团，因而水溶性略大于紫杉醇。其作用机制是通过刺激导管素的聚合，促进微管双聚体装配成微管并致使微管超稳定而抑制微管网动力学重组，最终使细胞增殖停止在有丝分裂静止期(GZ/M)的阶段。多西他赛新颖的作用机制及其在临床研究中显示出的独特疗效，使得多西他赛及其合并用药方案在临床上被越来越多的应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、头颈癌、胃癌、卵巢癌以及前列腺癌等多种肿瘤的治疗。

中国专利CN200510029634.0公开了一种多西他赛的液态脂质体的常规制备方法，这种方法制备的液态脂质体容易氧化，稳定性较固态形式保存的脂质体差，而且脂质体浓度低，限制制剂的应用。中国专利CN200710041810.1公开了一种多西他赛长循环脂质体及其制备方法,提高了药物的体内循环时间。但制备的脂质体载药量低，且因大量使用长循环材料而使其成本增高,难以实现工业化生产。本发明应用真空载体冻干技术解决了常规脂质体制备方法难于放大生产，液态脂质体稳定性差等问题，使脂质体的质量得到提高。

鉴于癌症对我国人民健康的巨大危害和多西他赛良好的治疗效果及生产过程中的局限性，本发明克服了现有技术的不足，研制开发载体法制备多西他赛脂质体，不但可以满足生产需求，而且可以取得较好的经济效益和社会效益。

发明内容

制备脂质体的方法很多，常用的有被动包封法和主动包封法；其中被动包封法有：薄膜分散法、逆相蒸发法、溶剂注入法、表面活性剂分散法、冻结熔融法、冷冻干燥法、复乳法。由被动包封法制得的脂质体通常包封率不高，且包封条件不易掌握。主动包封法从根本上改变了难以制备高包封率脂质体的局面。主动包封法最早指pH梯度法，在此基础上又发展了硫酸铵梯度法和醋酸钙梯度法。主动包封法利用两亲性的弱酸、弱碱药物能以电中性的形式跨越脂质双层，而其电离形式却不能跨越的原理，通过形成脂质体膜内、外水相的pH梯度差异，使脂质体外水相中的药物自发地向脂质体内部聚集。硫酸铵梯度法包封阿霉素(Doxil)是在pH梯度法的基础上根据化学平衡移动原理而设计的。

前体法系将脂质体膜材和药物的混合溶液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表面，形成粉体状制剂，加水或缓冲液水化即形成脂质体溶液，具有脂质体制剂的特点。

前体法制备脂质体的优势：

(1)在制备过程中，只需除去溶剂，将膜材和药物的混合溶液只需沉积在可溶性固体载体表面，制备工艺简单。

(2)可溶性固体载体在水化过程中，可发挥增溶作用，制备的脂质体粒径更小，分布更均匀。

(3)制备工艺更适合于工业化生产。

本发明提供了一种前体法制备多西他赛脂质体及其制备方法，其制备工艺可以除菌除热源，无需特殊设备，生产时间短，更加易于工业化生产，使药物的含量更加可控，提高了药物及辅料的稳定性，为广大患者提供了更加安全稳定的制剂。

本发明的技术方案如下：

本发明采用前体法制备多西他赛脂质体，将主药和脂质体膜材（磷脂和胆固醇）的有机溶剂分散在极细的支撑剂水溶性载体中，在减压的条件下回收有机溶剂，将脂质吸附于水溶性载体上，既得粉体状态的脂质体。当这种粉体状态的脂质体与水化介质接触时，脂质溶胀而水溶性载体迅速溶解，在水相中形成多层脂质体，通过外加作用力处理即得有蓝色乳光的澄清脂质体。

本发明的技术方案详细描述如下：

本发明的技术方案是首先采用一种或几种适合于多西他赛药物本身性质的磷脂和胆固醇并将药物和磷脂、胆固醇溶于适量的有机溶剂中，在适当的温度和搅拌条件下使其充分溶解。向上述溶液中添加适量极细水溶性载体，在适当的温度及搅拌条件下使其形成均匀的混悬液。在适当的减压条件下回收有机溶剂，得到粉体状态的脂质体。向上述粉体状态脂质体中加入适量的冻干保护剂及水化介质，在适当的温度及搅拌条件下使其充分水化，得到脂质体溶液。通过外加作用力处理得到粒径较小的有蓝色乳光的澄清脂质体溶液。经适当工艺冻干后即得多西他赛冻干脂质体。

本发明中多西他赛的浓度为0.5-10mg/ml，优选0.5-5mg/ml。主药与磷脂的重量比为1:5-1:80，优选为1:15-1:30，最优值为1:20。

本发明中所用到的主要辅料为磷脂，所用磷脂可以为磷脂酰胆碱含量50%（优选80%）以上的天然大豆磷脂，蛋黄磷脂、心磷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化卵磷脂中的一种或几种。其中优选大豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰胆碱中的一种或几种。本发明中磷脂用量为1%-15%（g/ml），优选2%-5%（g/ml）。

本发明中胆固醇用于调节脂质体膜的流动性，胆固醇对磷脂的相变具有双向调节作用，当在相变温度以上时，胆固醇能降低膜的流动性，当在相变温度以下时，胆固醇能增加膜的流动性。本发明中胆固醇的用量与所用磷脂的重量比为1:40-1:1，优选1:10-1:2，最优范围在1:8-1:4。

本发明采用前体法系将脂质体膜材和药物的混合溶液在减压搅拌下逐步分布到一种水溶性固体载体表面，形成粉体状制剂，加水或缓冲液水化即形成脂质体溶液，使其具有脂质体制剂的特点。所述水溶性载体可以为葡萄糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、氯化钠中的一种或几种。其中优选葡萄糖、甘露醇、乳糖中的一种或几种。本发明中用到的水溶性载体需为极细小颗粒，使用前需过100目筛。本发明中水溶性载体的用量为5%-50%（g/ml），优选10%-30%，最优范围为15%-20%。

由于脂质体的不稳定性，本发明所制备的脂质体需冻干处理，所用冻干保护剂可以为甘油、聚烯吡酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、糖类（甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、麦芽糖、右旋糖酐）中的一种或几种。根据冻干产品的外观、再分散性，本发明优选糖类（甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、麦芽糖、右旋糖酐）中的一种或几种作为冻干保护剂。冻干保护剂的用量为5%-30%（g/ml），优选5%-15%（g/ml），最优值为10%（g/ml）。

本发明中多西他赛脂质体的制备过程中需用到有机溶剂溶解药物、磷脂和胆固醇，最终在减压蒸发条件下除去。本发明所用有机溶剂可以为乙醇、叔丁醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种。出于安全性考虑，优选毒性较小的乙醇或叔丁醇中的一种或几种。为了更好地溶解，可以选择超声或提高温度等方式。本发明中有机溶剂的用量为最终制剂体积的50%-200%，考虑到溶剂溶解性能及节省制备时间，优选溶剂用量为最终制剂体积的60%-120%，最优值为100%。

本发明中所用到的水化介质可以为蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PH5-8），醋酸盐缓冲液（PH5-8），碳酸盐缓冲液（PH5-8）、甘氨酸缓冲液（PH5-8）。优选蒸馏水为水化介质。

本发明所述多西他赛脂质体，可以是注射液，也可以是冻干粉针剂。

本发明可以通过以下措施来实现：

处方：

制备工艺如下：

1.将多西他赛、磷脂、胆固醇溶于有机溶剂中，加入活性炭过滤除热源；

2.在40-60℃（优选48-52℃，最优值为50℃）加入水溶性载体粉末，控制适宜真空度，减压除去有机溶剂形成干燥粉末；

3.在40-60℃（优选50-60℃，最优值为55℃）条件下，向2中干燥粉末中加入水化介质，振摇或磁力搅拌条件下使其均匀水化，通过外加作用力（探头超声、高压匀质、微射流等）降低水化后脂质体溶液粒径，经0.22um滤膜过滤除菌，得到带有蓝色乳光的脂质体溶液；

4.加入冻干保护剂，经冷到干燥除去水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

本发明中用于降低脂质体粒径的方法有探头超声，高压匀质、微射流等，优选探头超声或高压匀质，探头超声条件为200-600w，5-10min。最优条件为400w超声5min（工作3s间歇3s）。

附图说明：

图1为透射电镜显微镜下观察多西他赛脂质体的表观形态；

图2为实施例6制备的多西他赛脂质体粒子大小及粒度分布；

图3为实施例6中多西他赛脂质体累积释药曲线；

图4为实施例6中大鼠体内药动学曲线。

实施例一：

1）将1g多西他赛、25g大豆磷脂和3g胆固醇溶于800ml叔丁醇中，加入1%活性炭过滤除热原；

2）在40℃，加入50g氯化钠载体粉末，减压除去有机溶剂，形成干燥粉末；

3）在40℃，加入含有磷酸盐缓冲剂（PH6.5）的水化介质1000ml，通过外加作用力（探头超声）降低水化后的溶液的粒径，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

4）加入50g乳糖，经冷冻干燥后去除水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

所制备脂质体多西他赛浓度为1mg/ml，包封率为93.3%。

实施例二：

1）将5g多西他赛、150g神经鞘磷脂和75g胆固醇溶于1000ml乙醇中，加入1%活性炭过滤除热原；

2）在45℃，加入200g山梨醇载体粉末，减压除去有机溶剂，形成干燥粉末；

3）在45℃，加入含有醋酸盐缓冲剂的水化介质（PH7.4）1000ml，通过外加作用力（超声振荡）降低水化后的溶液的粒径，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

4）加入150g右旋糖酐，经冷冻干燥后去除水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

所制备脂质体多西他赛浓度为5mg/ml，包封率为89.5%。

实施例三：

1）将2g多西他赛、10g心磷脂和2.5g胆固醇溶于600ml氯仿中，加入1%活性炭过滤除热原；

2）在50℃，加入100g蔗糖载体粉末，减压除去有机溶剂,形成干燥粉末；

3）在50℃，加入含有碳酸盐缓冲剂（PH7.4）的水化介质1000ml，通过外加作用力（高压匀质）降低水化后的溶液的粒径，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

4）加入50g山梨醇，经冷冻干燥后去除水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

所制备脂质体多西他赛浓度为2mg/ml，包封率为88%。

实施例四：

1）将5g多西他赛、100g大豆磷脂和10g胆固醇溶于2.4L甲醇中，加入1%活性炭过滤除热原；

2）在55℃，加入300g葡萄糖载体粉末，减压除去有机溶剂，形成干燥粉末；

3）在55℃，加入蒸馏水水化介质2L，通过外加作用力（微射流）降低水化后的溶液的粒径，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

4）加入100g甘露醇，经冷冻干燥后去除水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

所制备脂质体多西他赛浓度为2.5mg/ml，包封率为94.7%。

实施例五：

1）将5g多西他赛、200g蛋黄磷脂和200g胆固醇溶于12L无水乙醇中，加入1%活性炭过滤除热原；

2）在60℃，加入3kg甘露醇载体粉末，减压除去有机溶剂，形成干燥粉末；

3）在60℃，加入含有蒸馏水水化介质10L，通过外加作用力（高压匀质）降低水化后的溶液的粒径，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

4）加入3kg蔗糖，经冷冻干燥后去除水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

所制备脂质体多西他赛浓度为0.5mg/ml，包封率为90.1%。

实施例六：

1）将1.5g多西他赛、30g大豆磷脂和5g胆固醇溶于1000ml无水乙醇中，加入1%活性炭过滤除热源；

2）在50℃，加入150g葡萄糖载体粉末，减压除去有机溶剂，形成干燥粉末；

3）在55℃，加入含有蒸馏水的水化介质1000ml，通过外加作用力（探头超声）降低水花后的溶液粒径，经0.22um滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

4）加入100g甘露醇，经冷冻干燥后除去水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

所制备脂质体多西他赛浓度为1.5mg/ml，包封率为97.8%。

实施例七：

将实施例六制备的多西他赛脂质体复溶后理化性质考察

（1）脂质体溶液的形态观察

滴加适量多西他赛脂质体溶液于喷碳铜网上，使液体形成薄的脂质体液膜。用2%磷钨钼酸(W：W)负染液膜，用滤纸转移多余的液体后风干，于透射电子显微镜下观察多西他赛脂质体的表观形态，结果见图1，可以看出，脂质体为单室的脂质体溶液。

（2）脂质体粒径大小及分布

将复溶后三批多西他赛脂质体，在室温下，滴加到激光粒度测定仪的样品池中，测定其粒子大小及粒度分布，结果见图2，平均粒径为（112±19）nm（<200nm），跨距为0.45，表明粒度分布较窄，可以满足临床静脉注射的要求。

（3）pH值的测定

取复溶后的多西他赛脂质体溶液，使用pH计分别测定其pH值，平行测定三批，测定结果见表1，可知pH可以满足临床注射要求。

表1多西他赛脂质体的pH值

（4）游离脂肪酸的检查

精密量取复溶后多西他赛脂质体溶液10mL，加到50mL乙醚－乙醇(1：1)的混合液（临用前加酚酞指示液1.0mL，用氧化钠滴定液调制微显粉红色）中，振摇，使完全溶解(可缓慢加热)用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至粉红色持续30秒种不退。三批样品10mL所消耗的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的量均小于2.0mL。表明游离脂肪酸的检查合格。

（5）包封率的测定

取复溶后三批多西他赛脂质体，测定脂质体包封率和含量。结果见表2，结果可知平均包封率在90%以上。

表2多西他赛脂质体的包封率

（6）体外释放度实验

精密量取复溶后的多西他赛脂质体2mL，放于处理好的透析袋（分子量8000～14400）中，两端用透析夹夹紧，加入400mL透析介质，温度控制在（37±1）℃，搅拌速度为50r·min^-1。在不同时间吸取透析液5mL,同时向烧杯中加入5mL释放介质。透析液过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液测定。计算多西他赛累积释放百分率，结果见图3。

（7）大鼠体内药物动力学研究

以市售多西他赛注射液作为参比制剂，与多西他赛脂质体冻干粉复溶后通过大鼠尾静脉注射测定多西他赛脂质体和注射剂的药物动力学参数，并通过DAS2.1软件进行统计矩模型拟和并计算的药物动力学参数。

大鼠体内药物动力学研究结果见表3。药时曲线见图4。DAS2.1拟和计算的药动学参数见表4。

表3多西他赛脂质体和注射液各时间点血药浓度

注:ND代表检测浓度低于最低定量限

表4多西他赛脂质体和注射液药动学参数

由结果可知本发明制备的多西他赛脂质体体外释放72h可以释药80%以上，体内也具有较好的缓释能力，血药浓度更高，生物利用度更高，体内循环时间更长，更有助于发挥药效。

Claims (15)

1.一种适合工业生产的多西他赛脂质体的制备方法，其特征在于，采用减压载体沉积制备脂质体技术与冻干技术相结合，将主药和脂质体膜材中的磷脂和胆固醇的有机溶剂分散在极细的支撑剂水溶性载体中，在减压的条件下回收有机溶剂，将脂质吸附于水溶性载体上，即得粉体状态的脂质体，其中，多西他赛与磷脂的重量比为1:20，胆固醇的用量与所用磷脂的重量比为1:10-1:2，所述的水溶性载体的重量体积比为5%-50%，多西他赛的浓度为0.5-10mg/ml。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：

（1）将适量的多西他赛、脂质膜材溶于有机溶剂中，分别加入活性炭过滤除热原；

（2）在40-60℃，加入适量的极细水溶性载体粉末，控制适宜真空度，减压除去有机溶剂，形成干燥粉末；

（3）在40-60℃，在（2）的粉末中加入含有pH调节剂的水化介质，通过外加作用力降低水化后的溶液的粒径，经0.22μm滤膜过滤除菌，得到均匀的有蓝色乳光的脂质体溶液；

（4）加入冻干保护剂，经冷冻干燥去除水分，得到干燥的多西他赛脂质体冻干粉针剂，使用前水化振摇后复原成脂质体，注射给药。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，水溶性载体为葡萄糖或氯化钠，用量为10%-30%。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，水溶性载体的范围为15%-20%。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的外加作用力为探头超声、高压匀质机、微射流。

6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，多西他赛的浓度为0.5-5mg/ml。

7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，胆固醇的用量与所用磷脂的重量比为1:8-1:4。

8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，磷脂为磷脂酰胆碱含量50%以上的天然大豆磷脂，蛋黄磷脂、心磷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、氢化卵磷脂中的一种或几种。

9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰胆碱中的一种或几种，磷脂的重量体积比为1%-15%。

10.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，磷脂的重量体积比为2%-5%。

11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂为甘油、聚烯吡酮、聚乙二醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、山梨醇、麦芽糖、右旋糖酐中的一种或几种；冻干保护剂的重量体积比为5%-30%。

12.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂的重量体积比为5%-15%。

13.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂的重量体积比为10%。

14.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的水化介质为蒸馏水、生理盐水、PH5-8的磷酸盐缓冲液，PH5-8的醋酸盐缓冲液，PH5-8碳酸盐缓冲液、PH5-8的甘氨酸缓冲液。

15.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的水化介质为蒸馏水。