CN100409846C - 一种埃坡霉素b脂质体制剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种埃坡霉素B脂质体制剂，是由埃坡霉素B、磷脂、胆固醇、氨基酸和甘露醇组分组成，其重量百分比为：埃坡霉素B 0.1%～2%，磷脂10%～50%，胆固醇5%～50%，氨基酸0.5%～5%，甘露醇10%～70%。本发明所述的埃坡霉素B脂质体制剂为非肠道用制剂，用于制备治疗起源于人及动物组织或器官的原发或继发的癌、肉瘤或癌肉瘤的药物。本发明的埃坡霉素B脂质体制剂稳定性好，不易结晶，且易于溶解，临床使用可提高埃坡霉素B的治疗效果，降低毒性，减轻变态和免疫反应。

Description

一种埃坡霉素B脂质体制剂及应用

技术领域

本发明涉及一种脂质体制剂及其应用。更具体地说，本发明涉及一种埃坡霉素B的脂质体制剂及其制备方法，与在制备抗肿瘤疾病的药物中的应用。

背景技术

天然产物埃坡霉素A-F(Epothilones A-F)为具有细胞毒作用的十六元环大环内酯类化合物，最早是从Sorangium Cellulosum Stain 90菌株中分离得到。研究表明，埃坡霉素B不仅具有强效的抗肿瘤作用，而且在抑制肿瘤多药耐药性方面有较强的作用，其抗肿瘤作用机制与紫杉醇非常相似，是一类新型的微管稳定剂，具有促进GTP依赖性微管蛋白聚合形成微管的作用，并且对微管具有稳定作用，而通过稳定微管组装过程抑制微管的解聚，导致微管束的排列异常，形成星状体，进而抑制了细胞形成正常的有丝分裂纺锤体，从而抑制肿瘤细胞的生长，甚至诱导其死亡。在国外，瑞士Novartis公司研制的埃坡霉素B(EPO906)正在进行II期临床研究。

临床上，在将埃坡霉素B用于治疗患者疾病之前，必须将其配制成可给予患者的制剂形式。目前，国外采用主药和可药用溶剂制成注射液或冻干制剂，其中国专利CN99803672对此有详细描述，而中国专利CN02806992则公开了一种该品口服给药形式的口服药用剂型。

埃坡霉素B全身用药后，具有如骨髓抑制、呕吐、腹泻等胃肠道反应及其他毒性，因此将埃坡霉素B制成脂质体制剂给药，能够克服其毒性大的难题，降低药物不良反应而保持其药理学作用，显得十分必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种埃坡霉素B的脂质体制剂及其制备方法，与在制备抗肿瘤疾病的药物中的应用。

本发明的埃坡霉素B脂质体制剂，由治疗有效量的埃坡霉素B、磷脂、胆固醇、氨基酸、甘露醇等组分组成，其重量百分比为：

埃坡霉素B      0.1％-2％

磷脂           10％-50％

胆固醇         5％-50％

氨基酸         0.5％-5％

甘露醇         10％-70％

上述埃坡霉素B脂质体制剂，其组分的优选重量百分比为：

埃坡霉素B      0.1％-1％

磷脂           20％-40％

胆固醇         5％-30％

氨基酸      0.5％-3％

甘露醇      40％-70％

上述的埃坡霉素B脂质体制剂，其组分的最优选重量百分比为：

埃坡霉素B   0.5％

磷脂        30％

胆固醇      18％

氨基酸      1.5％

甘露醇      50％

其中所述的磷脂，是自然类磷脂或合成类磷脂以及二者的混合物，该混合物的重量比例是9∶1至1∶9。其自然类磷脂，优选为卵磷脂、脑磷脂或豆磷脂；合成类磷脂优选为二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂丁二酸单酰胺、二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷酸卵磷脂、硬脂酰胺、氢化豆磷脂、磷脂酰丝胺酸、磷脂酸等。

其中所述的氨基酸优选是赖氨酸、苏氨酸或蛋氨酸。

本发明的埃坡霉素B脂质体制剂的制备方法，包括但不限于如下操作步骤：将磷脂和胆固醇按一定比例混合(磷脂和胆固醇的比例为1∶5至10∶1)，用氯仿溶解后，在旋转蒸发膜蒸发器上，真空蒸发至呈干燥薄层，备用；用60％叔丁醇水溶液溶解埃坡霉素B，转入上述含有磷脂的容器中，以每分钟8-20转的速度搅拌，使之充分水合，即有脂质体生成，将此混悬液在4℃～6℃条件下放置8-15小时，即得埃坡霉素B脂质体溶液。

利用上述制备的埃坡霉素B脂质体溶液，可以制备非肠道用制剂，优选为非肠道用冻干制剂。

上述非肠道用冻干制剂可以采用常规的冷冻干燥法制备，如将氨基酸与甘露醇以1∶140至1∶2比例混合后加水溶解，然后将上述制备的埃坡霉素B脂质体溶液与之混合，用超声波仪超声粉碎或高压匀浆泵进行匀浆，采用0.01μm～0.4μm滤膜过滤，优选采用0.1μm～0.22μm微孔滤膜过滤，将无菌过滤后的溶液分装于药用玻璃瓶内，预冷至-40℃±2℃，恒温6至8小时，再将冷阱温度降至-55℃±2℃，开启真空系统，冷冻固体升华干燥，20小时～24小时后，将温度升至0℃，保持24小时进行冻干，通入无菌过滤的惰性气体如氮气等封口，即获得埃坡霉素B脂质体冻干制剂。

利用本发明的制备方法获得的埃坡霉素B脂质体制剂，性能稳定，全部粒子粒径在2μm以下，毒性低，符合药用标准，制作方便，成品率高，能够满足人们的需要。

本发明的埃坡霉素B脂质体制剂一般应存储在适合的容器中，如棕色可药用的玻璃瓶中，更适合于存储在灌入有惰性气体，如氮气、氩气等，优选为氮气的可药用玻璃瓶中。由于埃坡霉素B对低pH敏感，对光敏感，易发生降解作用，因此在制备、实验、储藏、运输过程中应避光操作。

本发明提供的埃坡霉素B脂质体冻干制剂的使用方法，如但不限于如下方法：使用水性溶液稀释本发明的埃坡霉素B脂质体冻干制剂后，给被治疗对象非胃肠道使用。

在本发明所述的埃坡霉素B脂质体制剂中，

埃坡霉素B为一种微管稳定剂，具有促进GTP依赖性微管蛋白聚合形成微管的作用，并且对微管具有稳定作用，通过稳定微管组装过程抑制其解聚，抑制有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞的生长，甚至诱导其死亡。埃坡霉素B具有很强的抗肿瘤活性，能在较低浓度杀死癌细胞。

磷脂为两性物质，其结构上含有亲水亲油基团，具有两条疏水链，在水中能自发的形成脂质双分子层，作为成膜材料使用。

胆固醇也属于两性物质，其结构上亦具有亲水亲油两种基团，它可以调节双分子层的流动性、通透性等。胆固醇和磷脂是共同构成脂质体的基础物质，二者结合后形成“U”型排列，将药物溶于其中的水膜或双分子层中，从而改变了药物的部分性质。

本发明所用的氨基酸包括赖氨酸、苏氨酸或蛋氨酸，氨基酸系两性物质，在一定pH条件下可以产生带电性，从而防止聚集，而不会有埃坡霉素结晶。且成本低，原料易得。

本发明所用的甘露醇为分散性支架剂，以便得到不会裂开或收缩的最终块状物，这种块状物为多孔材料，易于溶解，并具有优良的外观。

通过以上组分制备的埃坡霉素B脂质体制剂，可以将埃坡霉素B包封于磷脂双分子层形成的薄膜中间，稳定性好，不易结晶，且易于溶解，适于临床使用。

本发明的埃坡霉素B脂质体制剂的应用，用于制备治疗起源于人及动物大脑、中枢神经系统、肾脏、肝脏、胆囊、胰腺、甲状腺、肺脏、食管、纵隔、胃、乳腺、子宫、子宫内膜、子宫颈、卵巢、输卵管、前列腺、膀胱、结直肠、头颈部、眼睛、鼻咽部、口腔、淋巴结、淋巴管等淋巴系统、皮肤、粘膜、腺体、血液、血管、骨组织、脂肪的原发或继发的癌、肉瘤或癌肉瘤的药物。

本发明的埃坡霉素B脂质体制剂，一般以治疗人体的肿瘤疾病为主，包括减缓肿瘤增长或使肿瘤消退等。由于埃坡霉素B脂质体对淋巴系统的靶向性和对癌细胞的亲和性，改变了埃坡霉素B在组织中的分布，使药物选择性的杀伤癌细胞或抑制癌细胞的繁殖，从而提高疗效，降低毒性，减轻变态和免疫反应。

本发明的埃坡霉素B脂质体制剂的使用剂量，取决于很多因素，其主要因素为肿瘤的体积以及病理分型、病人的身体状况、给药方式、疾病的进展情况及治疗反应等。其常用的剂量以埃坡霉素B计为0.1mg/m²～300mg/m²(指体表面积)，以0.1mg/m²～100mg/m²为理想，以1mg/m²～50mg/m²为最理想。

利用本发明所述的埃坡霉素B脂质体冻干制剂进行动物体内试验，以小鼠抑瘤试验为例，结果表明：接种S180肿瘤细胞株的小鼠腹腔注射埃博霉素B脂质体冻干制剂7天，0.01mg/ml和0.005mg/ml(以埃坡霉素B计)的高、中浓度的埃坡霉素B脂质体冻干制剂组的抑瘤率明显高于常规埃坡霉素冻干制剂组，相同浓度的埃坡霉素脂质体制剂组的抑瘤率高于常规埃坡霉素阳性对照组，且对动物的体重影响较小，说明本发明的埃坡霉素B脂质体制剂是一个比常规埃坡霉素B制剂更为安全和有效的制剂。

附图说明

图1埃博霉素脂质体制剂对肿瘤细胞的细胞毒作用剂量反应曲线

具体实施方式

实施例1

按如下重量称取各组分：

埃坡霉素B   0.05g

DPPC        2.0g

DMPC        1.5g

硬脂酰胺    0.5g

胆固醇      2.0g

氨基酸      0.6g

甘露醇      13g

将DPPC、DMPC、硬脂酰胺和胆固醇混合均匀，用100ml氯仿溶解后，在旋转蒸发膜蒸发器上，30℃水浴真空蒸发除去溶媒，使脂质在瓶内壁均匀成膜，抽干。将埃坡霉素B溶解于20ml 60％叔丁醇溶液中，缓缓加入到含磷脂膜的容器中，密封，以18转/分钟的速度搅拌5分钟，使充分溶胀水合，将此混悬液在4℃低温下放置10小时。用80ml水溶解氨基酸和甘露醇形成溶液，和上述低温放置的埃坡霉素B混悬液充分混合后，用高压匀浆泵匀浆2次，采用0.22μm微孔滤膜过滤后，经检验粒径小于2μm，包封率高于80％，即可分装于药用西林瓶内，冷冻干燥，通入惰性气体，封口，即得埃坡霉素B脂质体冻干制剂。

实施例2

按如下重量称取各组分：

埃坡霉素B    0.1g

MPEG-DSPE    5.5g

卵磷脂       0.5g

胆固醇       3.6g

氨基酸       0.3g

甘露醇       10g

将磷脂酰胆碱、磷脂酸和胆固醇混合均匀，用200ml氯仿溶解后，在旋转蒸发膜蒸发器上，30℃水浴真空蒸发除去溶媒，使脂质在瓶内壁均匀成膜，抽干。然后将埃坡霉素B溶解于20ml 60％叔丁醇溶液中，缓缓加入到含磷脂膜的容器中，密封，13转/分钟的速度搅拌7分钟，使充分溶胀水合，将此混悬液在5℃低温下放置12小时。用50ml水溶解氨基酸和甘露醇形成溶液，和上述低温放置的埃坡霉素B混悬液充分混合后，用高压匀浆泵匀浆2次，采用0.22μm微孔滤膜过滤后，经检验粒径小于2μm，包封率高于80％，即可分装于药用西林瓶内，冷冻干燥，通入惰性气体，封口，即获得所说的冻干制剂。

实施例3

按如下重量称取各组分：

埃坡霉素B     0.15g

磷脂酰胆碱    2.0g

磷脂酸        6.0g

胆固醇        5.5g

氨基酸        0.2g

甘露醇        6.0g

将MPEG-DSPE、卵磷脂和胆固醇混合均匀，用300ml氯仿溶解后，在旋转蒸发膜蒸发器上，30℃水浴真空蒸发除去溶媒，使脂质在瓶内壁均匀成膜，抽干。然后将埃坡霉素B溶解于30ml 60％叔丁醇溶液中，缓缓加入到含磷脂膜的容器中，密封，以10转/分钟的速度搅拌10分钟，使充分溶胀水合，将此混悬液在4℃低温下放置8小时。将上述重量的氨基酸和甘露醇溶解于40ml水中形成混合物溶液，和上述制备的低温混悬液充分混合，用高压匀浆泵匀浆2次，采用0.22μm微孔滤膜过滤后，经检验粒径小于2μm，包封率高于80％，即可分装于药用西林瓶内，冷冻干燥，通入惰性气体，封口，即得埃坡霉素B脂质体冻干制剂。

实施例4

按如下重量称取各组分：

埃坡霉素B     0.1g

MPEG-DSPE     0.5g

氢化豆磷脂    6.0g

胆固醇        3.0g

氨基酸        0.3g

甘露醇        8.0g

将按以上重量称取的MPEG-DSPE、氢化豆磷脂、胆固醇和埃坡霉素B置于100ml烧瓶中，加入60ml氯仿溶解，在氮气流下旋转蒸发(速度：40-60转/分钟)，减压除去有机溶媒，再真空干燥24-36小时，得到恒重的脂质薄膜，然后加入80ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0，内含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)，旋转摇动烧瓶，制成脂质体悬浊液，静置24-30小时后，超声处理30分钟，以减小脂质体粒径，用葡聚糖凝胶透析除盐，得埃坡霉素B脂质体，然后加入氨基酸和甘露醇的水溶液50ml，经冷冻干燥制成冻干制剂。

实施例5、用MTT法检测埃博霉素脂质体制剂对肿瘤细胞的细胞毒作用

通过MTT法检测埃博霉素脂质体制剂样品对BEL-7402、Hela癌细胞株的细胞毒作用。实验采用96孔板进行，首先将在培养瓶中培养48小时的细胞接入96孔板中，细胞培养条件是：温度37℃，含5％CO₂的空气，湿度RH100％，96孔板在此条件下继续将细胞孵育12小时，细胞培养液加量100μl/孔。实验设置本底空白对照(包含完全培养基和MTT，无细胞)和药物空白对照(包含完全培养基和不同浓度的埃博霉素制剂以及MTT，无细胞)以及细胞对照组，完全培养基使用无血清的MEM，本底空白组按照100μl/孔加入MEM。然后将实施例1的方法制备的埃博霉素脂质体制剂中配制成浓度梯度为10nM，50nM，100nM，300nM，500nM(以埃博霉素计)的溶液，各取20μl加入96孔板中受试药物组和药物空白组对应的孔中，每个药物浓度做3个平行孔。将MTT用PBS缓冲液配成2mg/ml的溶液加入96孔板中，每孔加量50μl，继续孵育4小时，使MTT还原为Formazan颗粒，吸出并弃掉上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)使Formazan颗粒溶解。最后用酶标仪(Bio-Red 13550型)在560nm处检测每个孔的光密度值OD₅₆₀，将各测试孔的OD值减去本底OD值或药物空白孔OD值，各重复孔的OD值取平均数±SD。相对抑制率以T/C％(T：加药细胞的OD值，C：对照细胞的OD值)，求出T/C％为50％的药物浓度即IC₅₀值。

埃博霉素脂质体制剂对BEL-7402、Hela癌细胞株的IC₅₀值以埃坡霉素计分别为50nM和77nM，其细胞毒作用剂量反应曲线如图1所示。

实施例6、埃博霉素B脂质体制剂治疗肿瘤的体内试验

本实施例提供了实施例2埃博霉素B脂质体冻干制剂用于治疗肿瘤的动物体内试验情况。

具体步骤如下：

1、材料

1.1试验动物：成年健康KM小鼠60只，合格证号200008001，雌雄各半，体重20±2克，购于山东鲁抗医药集团有限公司。

1.2试验样品：本发明实施例2所述的埃博霉素B脂质体冻干制剂。

1.3阳性对照：埃坡霉素B、顺铂。

1.4肿瘤细胞株：S180，购于山东省医科院药物研究所。

2、方法

2.1动物称重，编号，随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养。

2.2样品处理：精密称取埃博霉素B脂质体冻干粉适量，分别用注射用生理盐水溶解并稀释成0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.001mg/ml(以埃坡霉素B计)三个浓度的溶液，分别作为高、中、低浓度样品组。

2.3埃坡霉素B阳性对照组：精密称取5mg埃坡霉素B纯品，用注射用生理盐水配制成0.005mg/ml埃坡霉素B对照溶液。

2.4顺铂阳性对照组：将顺铂冻干粉用注射用生理盐水配成0.01mg/ml混悬液，现用现配。

2.5阴性对照：注射用生理盐水

2.6接种肿瘤：于每只小鼠右腹股沟皮下注射0.2ml S180稀释液。

2.7给药及观察：48小时后腹腔注射给药，样品组与对照组的每只小鼠均注射0.2ml，连续注射7天，观察小鼠特征变化，包括行为活动、被毛、精神状态、口腔、鼻腔、耳道、肛门、生殖器官是否正常，以及肿瘤生长及小鼠死亡的情况。第14天称重后脱椎处死，解剖剥离瘤块，称瘤重，计算肿瘤抑制率。

3、结果与结论

结果：如下表所述

P＜0.05

结论：由以上结果可以看出，对接种S180瘤株的小鼠腹腔注射埃博霉素脂质体冻干制剂7天，高、中浓度样品组(以埃坡霉素B计分别为0.01mg/ml、0.005mg/ml)小鼠均生长发育正常，被毛浓密而有光泽，运动活泼，鼻腔、口腔、耳道、眼、肛门及生殖器官未见异常，且抑瘤率明显高于阳性对照组，相同浓度的埃坡霉素脂质体制剂组的抑瘤率高于常规埃坡霉素阳性对照组，且对动物的体重影响较小，说明本发明的埃博霉素脂质体冻干制剂具有抑制肿瘤的良好效果和较低的副作用。

实施例7埃博霉素B脂质体制剂治疗肿瘤的体内试验

本实施例提供了实施例3埃博霉素B脂质体冻干制剂用于治疗肿瘤的动物体内试验情况。

给雄性6-8周龄小鼠接种5×10⁶人激素顽固性前列腺肿瘤细胞(PC-3)，每周检测2次肿瘤生长情况，直到肿瘤体积在60-100mm²的范围为止。然后将动物分成数组并通过尾静脉静脉注射0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg(以埃坡霉素B计)剂量的常规埃坡霉素B冻干制剂进行治疗，隔天一次，持续4天。同时配制成0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg剂量(以埃坡霉素B计)的埃坡霉素B脂质体冻干制剂如上述方法尾静脉注射，对照组动物接受生理盐水或空白脂质体，计算平均存活时间并在第34天处死所有存活的动物。

应用0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg和1.0mg/kg剂量的常规埃坡霉素B冻干制剂的小鼠到第34天时实验动物存活率为100％、100％、76％和34％，然而使用埃坡霉素B脂质体冻干制剂的实验动物，0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg剂量组的存活率分别为100％、98％、53％和0％。

遵循相同的给药方案，使用0.1mg/kg、0.2mg/kg剂量的常规埃坡霉素B冻干制剂和0.5、1.0mg/kg剂量的埃坡霉素B脂质体冻干制剂重复本治疗试验，每周通过三个长轴对肿瘤的体积进行测定。结果0.5mg/kg、1.0mg/kg剂量的脂质体制剂治疗组较常规制剂治疗组肿瘤体积明显减少，且对动物的毒性相对减少。因此埃坡霉素B脂质体冻干制剂比常规埃坡霉素B冻干制剂是更为安全和有效的抗肿瘤药物制剂。

Claims (1)

1. 一种埃坡霉素B脂质体制剂，其特征在于，由埃坡霉素B、磷脂、胆固醇、氨基酸和甘露醇组分组成，其特征在于，其重量为：

埃坡霉素B       0.05g

DPPC            2.0g

DMPC            1.5g

硬脂酰胺        0.5g

胆固醇          2.0g

氨基酸          0.6g

甘露醇          13g。

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