CN101596155A - 替尼泊苷固体脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种替尼泊苷固体脂质纳米粒及其可工业化应用的制备方法。它包括治疗有效量的替尼泊苷、脂质材料、乳化剂，本发明的替尼泊苷固体脂质纳米粒粒径较小、包封率高、稳定性好；不仅提高替尼泊苷溶解度及稳定性，降低其毒性，而且延长药物在血液中的循环时间，提高药物的治疗指数，使本制剂在临床应用上具有低毒性、低过敏性、高效性的特点。

Description

替尼泊苷固体脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药剂学领域，具体涉及含有抗肿瘤活性成分替尼泊苷的固体脂质纳米粒及其制备方法。

背景技术

替尼泊苷(teniposide，VM-26)是一种鬼臼毒素的半合成衍生物，属于植物来源的抗肿瘤药物。它是周期特异性细胞毒药物，抑制DNA拓扑异构酶II，导致双链或单链破坏使细胞有丝分裂停于S晚期或G2前期，从而阻碍肿瘤细胞分裂，抑制肿瘤生长。替尼泊苷疗效显著，其生物活性是同类型药物依托泊甙的5-10倍，且临床资料表明替尼泊苷副作用少，毒性较小，对肝、肾功能无影响。由于在临床具有广泛的抗肿瘤活性，替尼泊苷现广泛地应用于神经系统肿瘤、恶性淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、进展期胃癌等疾病的治疗，更因其中性亲脂特性，能透过血脑屏障，目前已成为治疗脑瘤的首选化疗药物。

然而，替尼泊苷在水中溶解度极低，因此在制备成制剂时存在一定困难。目前上市的替尼泊苷注射液，是50mg替尼泊苷溶解于5ml有机溶剂：二甲基甲酰胺、苯甲醇、聚氧乙烯蓖麻油、马来酸和乙醇，该注射液中含有大量聚氧乙烯蓖麻油，使用后可引起严重的过敏反应。因此替尼泊苷注射液说明书中明确标注“已有报道使用本品期间或用药后可发生过敏样的反应，主要表现为寒战、发热、心动过速、支气管痉挛呼吸困难以及低血压”，它们可能是由于溶媒中的聚氧乙烯蓖麻油组分或替尼泊苷本身引起的。为此，医生在医嘱前必须了解病人的过敏史，如是否对替尼泊苷或聚氧乙烯蓖麻油过敏；在临床使用时，医务人员需密切观察病人的情况，必要时使用抗组胺药物以减轻过敏反应，结果是临床上应用十分不便，而且给病人带来极大痛苦。因此，迫切需要改变替尼泊苷的剂型，以增加替尼泊苷的水溶性，避免由于溶媒聚氧乙烯蓖麻油引起的过敏反应和替尼泊苷自身的毒副作用。

为减少因聚氧乙烯蓖麻油及替尼泊苷自身带来的不良反应，提高替尼泊苷的抗肿瘤疗效，国内外药学工作者致力于替尼泊苷新的给药系统的研究。中国专利文献(CN200610107688.8)将替尼泊苷制成稳定的注射用微乳制剂，该制剂保证替尼泊苷达到药效浓度的同时，基本消除了聚氧乙烯蓖麻油带来大的过敏反应；中国专利文献(CN200710099846.5)公开了采用吐温、二甲基乙酰胺、聚乙二醇、无机盐制备的替尼泊苷的注射剂，显著提高了替尼泊苷在水中的溶解度，避免或降低了临床使用中的过敏反应。尽管对替尼泊苷的制剂的研究取得了明显的进展。但目前这些新剂型多数处于实验室的研究阶段，大都不符合用药的安全性和工业化生产的要求，至今未见上临床、上市的报道。因此，急需寻求一种有效的制剂，可以在不增加药物剂量的情况下，延长药物的半衰期，提高药物的抗肿瘤效果，减少药物的毒副作用，增强药物的临床应用性。

固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)是近年来实验研究的一种新型纳米级给药系统，以天然或合成的类脂如磷脂、三酰甘油等为载体，将疏水性药物包裹于类脂核中制成粒径约10-1000nm的胶体给药体系。由于其纳米级的特性，因此SLN不同于普通的混悬性注射剂，兼具下述脂质体、乳剂以及高分子聚合物纳米粒的优点：(1)SLN使用的脂质毒性低，生物相容性高，在体内可降解，不会产生蓄积；(2)固态或半固态的类酯核使SLN具有控释、避免药物降解及泄漏、良好的靶向性等优点；另外，SLN可采用高压均质法或微乳法进行工业化生产；SLN的水分散系统可以经高压灭菌或辐射灭菌，具有长期的物理化学稳定性，也可通过冻干或喷雾干燥制成固体制剂。目前，已有喜树碱、齐多夫定脂化物等药物作模型药物被研制成脂质纳米粒，研究表明，这些药物的脂质纳米粒制剂具有控释、长效、靶向等特性。因此，将替尼泊苷制成脂质纳米粒制剂能提高其生物利用度，降低过敏反应和自身毒副作用，达到长效、高效、安全、低毒的目的，该剂型的研发将为患者带来福音。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种性质稳定且可采用现有技术工业化生产的替尼泊苷固体脂质纳米粒，本发明将替尼泊苷包裹于内脂核中，增加了替尼泊苷的水溶性和稳定性，具有长期物理化学稳定、可控制药物释放、靶向定位释放等优点，既能消除现有制剂的过敏反应，减少替尼泊苷自身的毒性反应，又能提高替尼泊苷的生物利用度及其治疗指数。

本发明的另一目的是提供上述替尼泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，而且制备方法灵活多样，均采用常规的工艺设备，可工业规模、高效率生产，产品质量保持稳定，可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

本发明的又一目的是提供一种替尼泊苷固体脂质纳米粒固体制剂，该固体制剂是上述替尼泊苷固体脂质纳米粒加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

本发明的再一目的是提供一种替尼泊苷注射剂或口服制剂，其是由上述的替尼泊苷固体脂质纳米粒制备而成的。

本发明的替尼泊苷固体脂质纳米粒由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊苷：1份

脂质材料：4-80份

乳化剂：0.1-60份。

优选地，本发明的替尼泊苷固体脂质纳米粒由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊苷：1份

脂质材料：5-50份

乳化剂：2-30份。

上述的脂质材料选自甘油脂(单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单山嵛酸甘油酯、双山嵛酸甘油酯、三山嵛酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三油酸甘油脂、三辛酸/癸酸甘油酯或其混合物)、脂肪酸(硬脂酸、豆蔻酸、棕榈酸、山嵛酸、辛酸、癸酸或其混合物)、磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂、氢化卵磷脂或其混合物)、类固醇(胆固醇)、蜡脂(鲸蜡醇棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡或其混合物)、十八醇及其混合物。

所述的乳化剂选自胆酸盐、脱氧胆酸盐、短链醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯及其混合物。其中胆酸盐选自胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠及其混合物；脱氧胆酸盐选自脱氧胆酸钠、脱氧牛磺胆酸钠及其混合物；短链醇选自甘油、丙二醇及其混合物；泊洛沙姆优选Poloxamer-108、Poloxamer-188及其混合物；聚山梨醇酯优选吐温-80；聚氧乙烯脂肪醇醚优选Brij 78、Brij 35、Brij 30及其混合物；聚氧乙烯脂肪酸酯优选Myrj 53、Myrj 59及其混合物。

所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒的粒径小于1000nm，优选粒径小于500nm，包封率大于80％。

本发明提供替尼泊苷固体脂质纳米粒的制备方法。

该制备方法可以使用以下几种方法中的任意一种：

方法一：乳化-沉淀法制备，称取处方量的替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，然后减压蒸发除去有机溶剂，然后进行超声或高压均质处理，即可得到固体脂质纳米粒。或

方法二：乳化挥发-低温固化法制备，即将替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂按比例溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，减压蒸发除去有机溶剂，并使体系浓缩，将浓缩液迅速混于2-50倍体积的0-4℃低温水相中，搅拌降温，然后可进行超声或高压均质处理得到替尼泊苷固体脂质纳米粒。或

方法三：薄膜-分散法制备，称取处方量的替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于一定量的有机溶剂中，在20-60℃水浴中减压蒸干成膜，加入一定量含水溶性乳化剂的水溶液，超声或高压均质处理即得到替尼泊苷固体脂质纳米粒。或

方法四：热熔分散法制备，称取处方量替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂在60-90℃下加热至熔融，作为油相。将水溶性乳化剂溶于水中加热至相同温度作为水相。在搅拌下将油相、水相混合，经超声或高压均质处理，即可制得替尼泊苷固体脂质纳米粒。

上述制备方法中所述的有机相和水相温度为20-80℃，优选温度为60-80℃；所述的有机溶剂选自氯仿、乙醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种及其混合溶剂；为减小固体脂质纳米粒的粒径，可采用超声或高压均质工艺。其中，超声功率为100-1000W，超声时间为10-40min；高压均质压力为10000-25000psi，高压均质次数为3次-10次。

为延长替尼泊苷固体脂质纳米粒的存放时间，便于运输，可将本发明的替尼泊苷固体脂质纳米粒通过喷雾干燥或冷冻干燥工艺制成固体制剂；为防止干燥工艺中固体脂质纳米粒的聚集需加入支架剂，可以选择的支架剂选自氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖及其混合物，其用量按脂质材料和乳化剂总重量计为1份总重量加入0.05-4份冻干支架剂。

本发明以脂质为载体材料，采用多种制备方法，使替尼泊苷包载于固体脂质纳米粒中。所得替尼泊苷固体脂质纳米粒粒径小(＜1000nm)，包封率高(＞80％)，稳定性佳，且可以以注射或口服方式给药，其中注射方式可以为静脉输注、静脉注射，优选静脉输注方式给予患者。

本发明的替尼泊苷固体脂质纳米粒以及由其制备成的固体制剂具有以下优点：

1、该固体脂质纳米粒消除了现有制剂的过敏反应，毒性低，保证了用药的安全性，提高了机体耐受性。

2、该固体脂质纳米粒将替尼泊苷包裹于内脂核中，增加了药物的稳定性，提高药物在载体中的分散程度；可控制药物缓慢释放，提高血药浓度，延长在血液中的循环时间；且改变药物在体内的药动学行为，具有靶向性能，能选择性到达病变部位、组织和细胞，从而提高药物的生物利用度及其治疗指数。

3、该固体脂质纳米粒可经冷冻干燥和喷雾干燥制成固体产品，保证制品在贮藏及运输过程中的稳定性，延长了产品的有效期，提高了药品的质量。

4、该固体脂质纳米粒制备工艺成熟，方法简便易行，材料来源广，产品质量稳定，便于工业化生产。

附图说明

图1为本发明替尼泊苷固体脂质纳米粒的体外释药曲线图。

具体实施方式：

下面再以实施例对本发明作进一步说明，给出本发明的实施细节。

实施例1：

称取100mg替尼泊苷、800mg卵磷脂溶于20ml的二氯甲烷中，在50℃下减压蒸干，形成脂质膜，加入10ml的吐温-80(2.5％)，超声分散30min(超声功率600W)，即得固体脂质纳米粒混悬液，2℃保存备用。其平均粒径为245nm，90％粒子均在500nm以下，粒径分布狭窄，表明固体脂质纳米粒大小较为均一；该固体脂质纳米粒混悬液可在室温下稳定数天并在4℃下稳定12个月，贮存期间观察不到沉淀。

实施例2：

称取100mg替尼泊苷、500mg单硬脂酸甘油酯、600mg大豆磷脂加入50ml具塞锥形瓶中，加10ml乙醇∶丙酮(1∶1)混合溶剂，超声使其充分溶解并加热至75℃，构成有机相。另取200mg Poloxamer-188溶于30ml重蒸水中，构成水相。用注射器将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的75℃水相中，继续搅拌至形成半透明体系。40℃下减压蒸发除去有机溶剂，降至室温，得到固体脂质纳米粒混悬液。

实施例3：

取200mg替尼泊苷、2400mg三棕榈酸甘油酯、600mg十八醇、800mg二棕榈酰磷脂酰胆碱溶解于乙醇10ml，超声溶解并加热至(80±2)℃构成有机相。另取1200mg myrj 53加入30ml双蒸水中，超声使其充分溶解，构成水相。将有机相缓慢注入1000r/min搅拌的(80±2)℃的恒温水相中形成初乳，继续搅拌约2～3h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明乳剂快速混于另一0～2℃的1000r/min搅拌的20ml冰水相中，继续搅拌2小时，然后于高压均质机中乳匀5次(均质压力为15000psi)，即得固体脂质纳米粒混悬液。

实施例4

取300mg替尼泊苷、6000mg山嵛酸、600mg胆固醇、3600mg二硬脂酰磷脂酰甘油置于25ml梨形瓶中，于(75±2)℃的恒温水浴上加热使其充分熔融，构成油相；另取800mg胆酸钠溶于10ml水中，水浴加热至与有机相相同的温度，构成水相。将油相在1000r/min搅拌下注入水相中，搅拌4h，温度保持在(75±2)℃，形成O/W型初乳。将所得乳剂在搅拌(1000r/min)下快速混于0～2℃10ml水中，继续搅拌2h，然后于800W功率下超声处理30min，即得固体脂质纳米粒混悬液。

实施例5：

称取200mg替尼泊苷、8000mg三月桂酸甘油酯、1800mg二棕榈酰磷脂酰丝氨酸混合均匀，85℃加热使熔融，作为油相。将800mg脱氧胆酸钠、600mg甘油加注射用水40ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，20000rpm下高速搅拌30min后改用超声分散，室温，功率600W，超声时间10min，即制得替尼泊苷固体脂质纳米粒混悬液。

实施例6

称取200mg替尼泊苷、4000mg三肉豆蔻酸甘油酯、800mg二油酰磷脂酰胆碱混合均匀，85℃加热使溶解，作为油相。将500mg脱氧牛磺胆酸钠、1000mg丙二醇加注射用水40ml，搅拌溶解，迅速加热到85℃作为水相。在搅拌下将水相趁热滴加到同温度油相中，继续搅拌1h后，转至高压均质机中，经20000psi压力乳匀10次，即可制得替尼泊苷固体脂质纳米粒混悬液。

实施例7

精密称取替尼泊苷300mg、双山嵛酸甘油酯3600mg、3400mg氢化卵磷脂、600mg二月桂酰磷脂酰胆碱于1000ml圆底烧瓶中，加入50ml氯仿溶解，40℃下旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜。加入5％甘胆酸钠溶液20ml，600W功率下水浴超声20min，即得替尼泊苷固体脂质纳米粒。

实施例8

称取替尼泊苷300mg、三油酸甘油酯6000mg、鲸蜡醇十六酸酯3000mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱3000mg，在通氮气条件下加热至(80±5)℃熔融，然后在搅拌条件下加入相同温度含2.5％甘油和0.5％牛磺胆酸钠的水溶液20ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机上25000psi压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成固体脂质纳米粒混悬液。在4℃密封保存，供试验用。

实施例9

称取二油酰磷脂酰乙醇胺4g、棕榈酸3g和替尼泊苷0.3g加入10ml乙醚超声使之溶解完全，然后在磁力搅拌下用6号针头注入30ml 2.5％brij78溶液中。2000rpm搅拌30min后，转移至旋转蒸发仪中，40℃旋转减压蒸发除去有机溶剂，直至形成乳白色悬浊液，加入山梨醇2g、甘氨酸2g经超声处理(超声功率600W)20min，药液于喷雾干燥机中干燥，喷雾干燥条件为：进风温度120℃，进料速度50ml/min，旋风分离器压差50mm水，雾化盘转速2500r/min，收集得到替尼泊苷固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例10

精密称取Poloxamer-1080.6g、甘油0.25g，在高速磁力搅拌条件下，加入到已加热至(60±5)℃的10ml蒸馏水中，待完全溶解作为水相；另称双硬脂酸甘油酯5g、二棕榈酰磷脂酰甘油0.5g、替尼泊苷0.1g加热熔融作为油相；将油相缓慢滴加至水相中，高速剪切(Fluko，12000rpm)5min，制成O/W型乳剂后，改用水浴式超声仪超声分散(室温，功率600W，超声时间20min)，即得乳光明显的澄明的固体脂质纳米粒混悬液。加入1.5g甘露醇和1.5g葡萄糖超声溶解，于-40℃预冻6h后，以-40℃，8h；-30℃，8h；-20℃，8h；-10℃，6h；20℃，8h的程序冷冻干燥，即得替尼泊苷固体脂质纳米粒冻干制剂。

实施例11

精密称取甘油单棕榈酸酯500mg、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺500mg、替尼泊苷50mg，加入乙酸乙脂10ml，超声使完全溶解。将所得的混合物溶液加入到含1％brij 35溶液20ml中，高速搅拌(20000rpm)5min，得SLN混悬液。加入1000mg乳糖、750mg葡萄糖、750mg海藻糖超声溶解后，于微型喷雾干燥器中喷雾干燥(进口温度130-140℃，出口温度50-60℃，空气压力1.2Atm，加料速度60ml/min)，即得替尼泊苷固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂。

实施例12

取替尼泊苷300mg、双棕榈酸甘油酯4000mg、癸酸2000mg和甲醇∶丙酮(1∶1)20ml加入25ml梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入3000mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，微热使溶成有机相。另取500mg mrij59溶于水20ml中构成水相。将有机相在(1000r/min)搅拌下注入(75±2)℃的水相中，继续搅拌4h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ml。将所得的半透明体系搅拌下(1000r/min)快速混于另一0～2℃的15ml水相，继续搅拌2h，即得替尼泊苷固体脂质纳米粒混悬液。该混悬液加入2000mg阿拉伯胶、2000mg甘露醇超声溶解后，于-40℃预冻6小时，于冷冻干燥机中冻干，冻干程序为-40℃，8小时；-30℃，6小时；-20℃，6小时；-10℃，5小时；0℃，5小时；15℃，5小时。

实施例13

称取替尼泊苷300mg、三山嵛酸甘油酯5000mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺1000mg，在通氮气条件下加热至(80±5)℃，然后在搅拌条件下加入相同温度含2.5％甘油和0.5％吐温-80的水溶液20ml，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机(Avestin，C5)上15000psi压力下乳匀5次，形成固体脂质纳米粒混悬液。该混悬液加入3000mg木糖醇、2000mg果糖于-40℃预冻10小时，于冷冻干燥机(labconco)中冻干(冻干程序为-40℃，10小时；-20℃，8小时；0℃，8小时；20℃，5小时)，即得替尼泊苷固体脂质纳米粒冻干制剂。

实施例14

取实施例1中的替尼泊苷固体脂质纳米粒测定包封率及载药量。

将替尼泊苷固体脂质纳米粒混悬液采用SS-5中空纤维超滤器(截留平均分子量为10000)进行超滤，弃去初滤液20ml，将超滤液和固体脂质纳米粒混悬液用甲醇溶解并稀释至测定浓度，采用高效液相色谱测定包封率及载药量。

色谱条件：用苯基-己基硅烷键合硅胶为填充剂(PhenomenexRLUNA Phenyl-Hexyl，250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈-水(20∶80)为流动相A，乙腈-水(56∶44)为流动相B，流速为1.25ml/min，先以流动相A 100％维持4min，流动相B以每分钟约3％的速率增加至35.5％，维持20min，流动相B再以每分钟约2.7％的速率增加至100％，维持30min，进样量10μl，220nm检测。结果见表1。

表1

实施例15

实施例2中替尼泊苷固体脂质纳米粒包封率测定

包封率通过葡聚糖凝胶柱层析法测定。层析条件为：Sephadex-G50柱(16cm×2cm)，洗脱液为蒸馏水，流速1ml/min，室温下层析。移取固体脂质纳米粒混悬液0.5ml上柱，以柱层析条件洗脱，每2ml收集1管，被包封药物量采用高效液相色谱测定，采用下式计算包封率。

包封率＝(M_包/M_总)×100％

式中，M_包表示被固体脂质纳米粒包封的药物量，M_总表示固体脂质纳米粒中的总含药量。

结果：测得固体脂质纳米粒混悬液的包封率为87.36％。

实施例16

实施例3中替尼泊苷固体脂质纳米粒理化性质研究。

1、形态学研究

取少量固体脂质纳米粒混悬液滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0％磷钨酸钠溶液染色，在透射电镜下观察粒径大小和形态并拍摄照片，可见其外观为圆整的球形。

2、粒径和Zeta电位测定

取固体脂质纳米粒混悬液适量加水稀释，用多功能Zeta电位粒度分析仪在632.8nm下测定粒径、粒度分布及Zeta电位。

结果：测得样品的平均粒径为85.0nm；平均Zeta电位-25.91mV。

3、包封率考察

取固体脂质纳米粒混悬液适量进行低温超速离心(4℃，12000rpm，60min)，精密量取上清液1ml，甲醇稀释定容至10ml，用高效液相色谱法测定得替尼泊苷的峰面积为A_游，同法将固体脂质纳米粒混悬液稀释后测得替尼泊苷的峰面积为A_总。

包封率(％)＝(1-A_游/A_总)×100％

结果：测得替尼泊苷固体脂质纳米粒的包封率为91.50％。

实施例17

精密移取实施例4中替尼泊苷固体脂质纳米粒混悬液0.5ml，放入处理过的透析袋(截留分子量为12000)中，透析袋两端夹紧至不渗漏；精密量取pH7.4磷酸盐缓冲液50ml，放入100ml烧杯中；将含药液透析袋移入装有释放介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封杯口；将烧杯置于恒温振荡器内，设置温度为37±0.5℃，水平振荡频率为100rpm，于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36h取样，分别将烧杯内的释放介质全部取出，再加入50ml新的同种介质继续恒温振荡。将取出的释放介质溶液用紫外分光光度计测定替尼泊苷的浓度，计算药物的释放率，以累计释放率和时间做出体外释药曲线。结果见图1。

从图1中可观察到：释放初期(4h)有突释现象(释放了总药量的35％)，随后SLN中的药物呈持续释放，至36h药物累积释放84％。SLN是药物与脂质的骨架结构，由于纳米粒比表面积大，药物分子一部分吸附在纳米粒表面，另一部分分散在脂质骨架中，形成固体溶液。外层药物分子很快释放，从而产生累积释放曲线初始阶段的突释现象；此后，药物的释放主要从骨架中扩散，具有缓释的特点。

实施例18

取实施例10中的冻干品适量，密封，于冰箱4℃放置，于0、1、3、6、9、12月对粒径、包封率、含量等指标进行测定，评价替尼泊苷固体脂质纳米粒冻干品的稳定性。结果见表2。

表2

表2说明，替尼泊苷固体脂质纳米粒冻干品在冰箱4℃放置12个月，其粒径、包封率、含量等质量指标基本不变，表明替尼泊苷固体脂质纳米粒冻干制剂稳定性良好。

实施例19

取上述实施例中的替尼泊苷固体脂质纳米粒制剂进行刺激性实验。

(1)对家兔耳缘静脉血管刺激试验：

将替尼泊苷注射液的两种不同剂型按临床用药量(50mg/次)进行体表面积换算得出实验兔用剂量(2.5mg/kg)。实验前按1ml/kg的给药量用无菌生理盐水注射液新鲜配制。选用体重2.5-3.0kg的健康新西兰白兔6只，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒后，3只白兔于右耳耳缘静脉注射替尼泊苷注射液，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照；另3只白兔于右耳耳缘静脉注射替尼泊苷固体脂质纳米粒，左耳注射相同体积无菌生理盐水注射液作对照，注射速度为1ml/min(相当于人临床注射速度)。每日一次，连续3天，末次给药24小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，肉眼观察注射部位的反应情况，并解剖兔耳血管及周围组织作石蜡切片(注射部位下向心段1cm及5cm处)，染色，光镜检查。肉眼观察注射部位反应情况。结果见表3。

表3

结果，如表3所示，替尼泊苷固体脂质纳米粒血管刺激性明显弱于替尼泊苷注射液。

(2)肌肉刺激性试验

替尼泊苷注射液的剂量换算、药物配制、新西兰白兔的选择同上(共4只，每种剂型2只)。剪去白兔两侧股四头肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒后，分别在右侧股四头肌注射替尼泊苷固体脂质纳米粒和替尼泊苷注射液1ml，左侧股四头肌注射等量无菌生理盐水注射液作对照，注射48小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，解剖股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反应情况，确定反应级数。

0级：无变化

1级：轻度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以下

2级：中度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以上

3级：重度充血，伴有肌肉变性

4级：出现坏死，有褐色变性

5级：出现广泛性坏死

然后算出4块股四头肌反应级数总和，如果股四头肌反应级数的最高值与最低值之差大于2，则应另取2只白兔重新实验。得到结果后，若四块股四头肌反应级数总和小于10，则认为供试品的局部刺激性实验符合规定。

表4

结果(见表4)表明，替尼泊苷固体脂质纳米粒的肌肉刺激性明显弱于替尼泊苷注射液。

实施例20过敏试验

给药方法取适量替尼泊苷注射液用生理盐水稀释一定倍数，为样品A；取自制替尼泊苷固体脂质纳米粒用生理盐水稀释一定倍数，为样品B。替尼泊苷给药剂量为2.5mg/kg。取豚鼠12只，分成A、B两组，分别供样品A和B进行过敏性试验用。每组豚鼠6只，体重250～350g。隔天ip供试品0.5ml，连续3次。然后将A、B组豚鼠再分别平均分成A1、A2及B1、B2组，其中A1、B1组于首次注射后的第14天由后脚掌外侧静脉注入供试品1ml进行攻击，观察注射后动物有无用爪搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克、死亡等反应，A2、B2组于首次注射后的第21天同样由后脚掌外侧静脉注入供试品并进行观察。

结果：替尼泊苷注射液：多次抓鼻、多次颤抖、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难，两例动物出现大小便失禁；替尼泊苷固体脂质纳米粒：竖毛、少数动物颤抖。

根据豚鼠过敏反应级数标准表，对本试验进行评定，反应级数达2级以上(包括2级)时，可认为该供试品过敏反应试验阳性。

结果：A组为3级，B组为1级。即A组(市售替尼泊苷注射液)可导致明显的过敏反应，为阳性，而B组(自制替尼泊苷固体脂质纳米粒)过敏试验为阴性。

实施例21溶血性实验

自新西兰白兔的颈总动脉取血20ml，置于烧瓶内，用玻璃棒轻轻搅动数分钟后，除去纤维蛋白，取出血液，加等量生理盐水注射液，离心(1500rpm，10min)，除去上清液；沉淀的红细胞再加生理盐水注射液清洗。如此反复直到上清液透明，按红细胞的容量用生理盐水配成2％的混悬液。

取干净试管7支，分别编号，依次加入下表内各液，第6管不加供试品作空白对照管，第7管用蒸馏水代替生理盐水，摇匀，置于37℃水浴中，分别于0.5、1、2、3小时观察是否有溶血现象发生。结果见表5和表6。

表5

表6

结果表明，替尼泊苷注射液和替尼泊苷固体脂质纳米粒都未见溶血发生，两种剂型的溶血性实验均合格。

实施例22毒性实验

实验方法：取实施例11的替尼泊苷固体脂质纳米粒喷雾干燥制剂，加水分散并稀释成适当浓度。将体重18～22g性别一致的昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，动物实验前禁食4小时，自由饮水，分别尾静脉注射替尼泊苷固体脂质纳米粒和替尼泊苷注射液，组间剂量按等比级数排列，比值1∶0.8，给药后连续观察动物反应并记录7天时间内动物死亡数。将各剂量组动物死亡数按bliss法计算出LD₅₀(95％置信限)值。

替尼泊苷注射液            LD₅₀＝18.2±1.2mg/kg

替尼泊苷固体脂质纳米粒    LD₅₀＝37.5±1.4mg/kg

LD₅₀的实验结果表明，替尼泊苷固体脂质纳米粒与替尼泊苷注射液相比，毒性明显降低。

实施例23

取实施例12的固体脂质纳米粒固体制剂进行体外抑瘤活性实验。

采用噻唑蓝体外试验法(MTT法)检测替尼泊苷注射液、替尼泊苷固体脂质纳米粒和空白固体脂质纳米粒对膀胱癌细胞株的生长抑制作用。采用EJ细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液，以2.5×10⁴/孔的浓度接种于96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液。培养24小时细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的替尼泊苷注射液、替尼泊苷固体脂质纳米粒、空白固体脂质纳米粒及空白和单培养液对照(药物浓度分别为5、2.5、1μg/ml)，每个样品设4复孔。将培养板置37℃、含5％CO₂培养箱培养48h后，加MTT 20μl，继续培养4h，弃去上清液，每孔加入100μlDMSO，待结晶溶解后置入酶标仪，于570nm处测每孔OD值，计算抑制率。

抑制率＝(1-试验组OD值/对照组OD值)×100％

表7

由表7可见，替尼泊苷注射液和替尼泊苷固体脂质纳米粒随着浓度的增加，对肿瘤细胞活性的抑制率相应增加。当替尼泊苷注射液浓度为1、2.5、5μg/ml时，抑制率分别为20.9、35.8、45.7％；当替尼泊苷固体脂质纳米粒浓度为1、2.5、5μg/ml时，抑制率分别为21.5、40.6、67.3％。替尼泊苷注射液的抑制率低于替尼泊苷固体脂质纳米粒，低浓度时两组间无统计学差异(p＞0.05)，而高浓度时两组间有显著性差异(p＜0.05)。

实施例24细胞毒性测定

细胞毒性测定采用四唑盐比色法。采用293T细胞，用含10％小牛血清的DMEM培养液，以2.5×10⁴/孔的浓度接种于96孔培养板，每孔体积100μl。

培养24小时细胞贴壁生长后，每组三孔分别加入不同浓度的替尼泊苷注射液、替尼泊苷固体脂质纳米粒(浓度分别为10、20、30、40、50μg/ml)及空白水溶液对照，培养24h后，每孔加入MTT溶液20μl，培养4小时后，弃去上清液，每孔加入DMSO150μl终止反应。将培养板水平振荡30min后，用酶标仪测定490nm处的吸收度，按下式计算细胞存活率：

细胞存活率＝A₄₉₀(样品)/A₄₉₀(对照)×100％

其中A₄₉₀(样品)为加入样品后的细胞吸收度，A₄₉₀(对照)为空白水溶液对照的细胞吸收度。

表8

实验结果显示，替尼泊苷固体脂质纳米粒、替尼泊苷注射液的细胞毒性随溶液浓度的增加而增加，同浓度的替尼泊苷固体脂质纳米粒比替尼泊苷注射液的细胞毒性低，表明以固体脂质纳米粒作替尼泊苷的载体可降低替尼泊苷的毒性。

实施例25药动学实验

将12只SD大鼠随机分成2组，实验前禁食一夜。甲组为对照组，于右后股静脉注射替尼泊苷注射液(1mg/ml)，乙组为受试组，于右后股静脉注射替尼泊苷固体脂质纳米粒，分别于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24小时眼眶取血0.5ml，置预先肝素化的尖底离心试管中，离心，分离出血浆。按一定方法处理后，取20μl进样，测定各血浆样品中替尼泊苷的浓度。

将实验所得血浓经时数据用kinetita软件包处理，判断房室模型，同时进行统计矩分析，并将所得药动学参数经spss统计软件进行t检验。其中AUC_0-24和AUC_0-∞均为梯形法计算结果，Cmax为实测值。

表9

^*P＜0.05；^**P＜0.01。

结果：替尼泊苷固体脂质纳米粒的MRT、AUC_0-24和AUC_0-∞分别是替尼泊苷注射液的1.51、1.54和1.62倍，具有显著差异(P＜0.05)，CL是参比制剂的0.38倍，具有极显著差异(P＜0.01)，表明在同样剂量条件下，药物被纳米粒包裹后延长了药物在血液中的滞留时间，使药物在体内消除速度较慢并保持了较高的血药浓度，从而发挥长效作用。替尼泊苷固体脂质纳米粒改变了替尼泊苷在大鼠体内的药动学性质，具有一定的缓释特征。

Claims (11)

1、一种替尼泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊苷：1份

脂质材料：4-80份

乳化剂：0.1-60份。

2、根据权利要求1所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，由包含以下重量份的原料制备而成：

替尼泊苷：1份

脂质材料：5-50份

乳化剂：2-30份。

3、根据权利要求1或2所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，所述的脂质材料为十八醇、甘油脂、磷脂、脂肪酸、类固醇或蜡脂及其混合物，其中所述的甘油脂选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、单山嵛酸甘油酯、双山嵛酸甘油酯、三山嵛酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三油酸甘油脂、三辛酸/癸酸甘油酯及其混合物；所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂、氢化卵磷脂及其混合物；所述的脂肪酸为硬脂酸、豆蔻酸、棕榈酸、山嵛酸、辛酸、癸酸或其混合物；所述的类固醇为胆固醇；所述的蜡脂为鲸蜡醇棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯、微晶石蜡或其混合物。

4、根据权利要求1或2所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，所述的乳化剂为胆酸盐、脱氧胆酸盐、短链醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯或其混合物；其中，所述的胆酸盐选自胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠及其混合物；所述的脱氧胆酸盐选自脱氧胆酸钠、脱氧牛磺胆酸钠及其混合物；所述的短链醇选自甘油、丙二醇及其混合物；所述的泊洛沙姆选自Poloxamer-108、Poloxamer-188及其混合物；所述的聚山梨醇酯选自吐温-80；所述的聚氧乙烯脂肪醇醚选自Brij 78、Brij 35、Brij 30及其混合物；所述的聚氧乙烯脂肪酸酯选自Myrj 53、Myrj 59及其混合物。

5、根据权利要求1或2所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，其粒径小于1000nm，包封率大于80％。

6、根据权利要求5所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒，其特征在于，其粒径小于500nm。

7、权利要求1或2所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，采用以下不同方法中的任意一种：

1)乳化-沉淀法：称取处方量的替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂得有机相，称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，然后减压蒸发除去有机溶剂，然后进行超声或高压均质处理，即可得到固体脂质纳米粒；或

2)乳化挥发-低温固化法：将替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂按比例溶于有机溶剂得有机相；称取水溶性乳化剂溶于水中得水相；有机相和水相分别加热至相同温度，搅拌下将有机相和水相混合，减压蒸发除去有机溶剂，并使体系浓缩，将浓缩液迅速混于2-50倍体积的0-4℃低温水相中，搅拌降温，然后进行超声或高压均质处理得到替尼泊苷固体脂质纳米粒；或

3)薄膜-分散法：称取处方量的替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂中，在20-60℃下水浴中减压蒸干成膜，加入含水溶性乳化剂的水溶液，超声或高压均质处理即得替尼泊苷固体脂质纳米粒；或

4)热熔分散法：称取替尼泊苷、脂质材料、脂溶性乳化剂在60-90℃下加热至熔融，作为油相；将水溶性乳化剂溶于水中加热至相同温度作为水相；在搅拌下将油相、水相混合，经超声或高压均质处理，即制得替尼泊苷固体脂质纳米粒；

所述有机溶剂为氯仿、乙醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或其混合溶剂；所述有机相和水相的温度为20-80℃；高压均质时压力为10000-25000psi，高压均质的次数为3次-10次；超声功率为100-1000W，超声时间为10-40min。

8、根据权利要求7所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，有机相和水相的温度为60-80℃。

9、一种替尼泊苷固体脂质纳米粒固体制剂，其特征在于，所述固体制剂是权利要求1或2中的替尼泊苷固体脂质纳米粒加入支架剂并采用冷冻干燥或喷雾干燥的工艺制成的。

10、根据权利要求9所述的替尼泊苷固体脂质纳米粒固体制剂，其特征在于，所述的支架剂选自氨基酸、麦芽糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖及其混合物；并且其用量按脂质材料和乳化剂总重量计为1份总重量加入0.05-4份冻干支架剂。

11、一种替尼泊苷注射剂或口服制剂，其特征在于，是由权利要求1或2中的替尼泊苷固体脂质纳米粒制备而成的。

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