KR20180036958A - 치료 목적을 위해 층판소체를 이용하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

치료 목적을 위해 층판소체를 이용하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

표면에 부착되고, 체외세포성다당류 물질(exopolymeric material)의 기질 내에 넣어진 다층화된 구조화 공동체를 미생물에 제공하는 균막 생성은 감염의 상향 조절된 독성과 관련되며 면역계 반응 및/또는 치료제의 효과를 제한할 수 있다. 균막 생성을 억제하거나 감소시키고, 미생물 감염을 치료하기 위한 정족수 감지를 조절하기 위한 층판소체(lamellar body)의 용도가 제공된다.

Description

치료 목적을 위해 층판소체를 이용하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 균막 생성을 억제하거나 감소시키기 위해 정족수 감지(quorum sensing)를 조절하기 위한 층판소체(lamellar body)의 용도에 관한 것이다. 표면에 부착되고, 체외세포성다당류 물질(exopolymeric material)의 기질 내에 넣어진 다층화된 구조화 공동체를 미생물에 제공하는 균막 생성은 감염의 상향 조절된 독성과 관련되며, 면역계 반응 및/또는 치료제의 효과를 제한할 수 있다. 따라서, 층판소체는 미생물 감염의 치료에서 중요한 역할을 한다.
박테리아에서 정족수 감지를 차단하는 것이 세포가 정족수 감지를 통해 동기화되는 독성 인자 생성과 같은 거동을 개시하는 것을 중단시킬 수 있음이 결정되었다(Rutherford, S. T. and Bassler, B. L. Bacterial Quorum Sensing: Its Role in Virulence and Possibilities for Its Control Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. (2012)). 또한, 균막이 형성된 미생물 감염은 임상적으로 더욱 유의하게 되고, 항생제로 치료하기 어려울 수 있다. 지속적인 만성 감염은 흔히 미생물 균막의 발달과 관련된다.
균막은 자체 생성된 세포외 중합체 기질 내에 엠베딩(embedding)된 미생물 세포의 밀집하게 패킹된 집단이다. DNA, 단백질 및 다당류와 같은 이러한 생체중합체의 기질은 탈수, 면역계 및 항미생물제로부터 미생물 세포를 보호한다. 균막은 진균 종, 예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 박테리아, 예를 들어, 슈도모나스(Pseudomonas), 바이러스, 예를 들어, HTLV-1 및 원생동물, 예를 들어, 아칸타모에바(Acanthamoeba)와 관련될 수 있다. 균막에서 성장하는 미생물 세포는 액체 배지 내의 단일 세포인 동일 유기체의 부유성 세포(planktonic cell)와 생리학적으로 구별된다. 임상적으로 중요한 박테리아, 예를 들어, 슈도모나스, 부르크홀데리아(Burkholderia) 및 스태필로코커스(Staphylococcus) 종은 숙주의 면역 방어 및 항생제로부터 이들을 보호하는 균막을 형성한다. 균막 형성은 많은 만성 감염 및 질병, 예를 들어, 낭성섬유증(CF), 및 스텐트, 션트, 보철 관절, 임플란트, 기관내관 및 카테터를 포함하는 내재 의료 장치와 관련된 감염과 관련되어 있다. 면역계 및 항감염제로부터 미생물을 보호하는 것뿐만 아니라, 균막은 또한 파이프, 유역, 저장 구역을 막고, 식품을 오염시키는 능력을 갖는다.
일반적으로, 박테리아는 성장 및 증식 동안 2개의 생활 형태를 가지며, 개별적 거동을 수행하는 기간과 그룹 거동을 수행하는 기간 사이를 순환한다. 전자에서, 박테리아는 독립적이고 활발히 분열하고 성장하는(부유성) 단일한 세포로 존재하는 반면, 후자에서는 이들은 감소된(정착성) 대사 활성을 갖지만, 항생제 또는 면역 방어 시스템에 대한 탄성을 통해 질병(독성)을 야기시키는 증가된 능력을 갖는 세포의 응집으로 조직화된다. 이들 전환은 정족수 감지로 언급되는 세포-세포 소통 과정에 의해 조절된다. 정족수 감지 분자가 방출되고, 축적되고, 박테리아 그룹에 의해 동기적으로 검출되어, 생물발광, 균막 형성 및 추가 독성 인자 생성과 같은 거동을 집합적으로 수행하는 유전자 발현 박테리아에서의 공동체-차원의 변화를 발생시킨다.
정착성 세포에서 관찰되는 바와 같은 감소된 성장 속도가 약물 내성에 기여할 수 있음을 암시하는 일부 증거가 있다. 이들 정착성 응집체는 상기 상태의 박테리아의 유전자 발현 프로파일의 인지에서 균막 성장 표현형으로 일반적으로 언급된다. 박테리아가 수성 환경에서 표면에 부착하고, 끈적한 아교-유사 물질을 분비하기 시작하는 경우에 균막이 형성된다. 통상적으로, 표면에 부착하는 최초의 박테리아 콜로니스트(colonist)는 초기에 반데르발스힘으로 언급되는 약한 가역성 결합을 유도함으로써 부착한다. 콜로니스트가 표면으로부터 즉시 분리되지 않는 경우, 이들은 세포 부착 분자를 이용하여 자신들을 더욱 영구적으로 고정시킬 수 있다. 이들 박테리아 콜로니스트는 더욱 다양한 부착 부위를 제공함으로써 다른 병원체의 도달을 촉진시킨다. 이들은 또한 균막을 함께 유지시키는 기질을 만들기 시작한다. 스스로 표면에 부착할 수 없는 종이 존재하는 경우, 이들은 종종 자신을 기질 또는 이전 콜로니스트에 직접 고정시킬 수 있다.
세포의 정착성 공동체를 둘러싸는 균막의 기질 또는 체외세포성다당류 물질(EPS)은 숙주의 자연 방어 메커니즘의 효과적인 배치에 대한 장벽으로 그리고 항생제의 확산에 대한 장벽 및/또는 항생제에 결합하는 하전된 표면으로 작용하는 것으로 생각된다. 만성 균막-기반 감염은 통상적으로 항생제 및 많은 다른 통상적인 항미생물제에 대해 극도로 내성이 있으며, 추가적으로 숙주 방어를 회피하는 극한의 능력을 갖는다. 균막 항생제 내성은 항생제 내성과 혼동되어선 안되는데, 이는 균막 내의 박테리아는 항생제 치료에 대해 생존하는 경향이 있으나, 균막이 파괴되거나 제거되는 경우에 이들이 상기 치료에 민감해지기 때문이다.
현재, 박테리아 균막 감염을 방지하거나 억제하기 위해, (i) 초기의 공격적인 항생체 치료; 및 (ii) 균막이 확리되어, 물리적으로 제거할 수 없는 경우 장기간의 억제 항생체 치료의 두가지 방법이 이용된다. 그러나, 박테리아 균막을 치료하기 위한 항생제의 투여는 종종 장기간 동안 고용량으로 여러 상이한 항생제이 조합을 요구하는데, 이는 통상적인 내성 메커니즘이 내재성 균막 내성 메커니즘을 강화시킬 것이기 때문이다. 따라서, 미생물이 숙주의 면역계 및/또는 항생제에 의해 파괴될 수 있도록 박테리아 균막의 발달을 억제하거나, 박테리아 균막을 파괴하거나, 제거하는 것을 포함하는 미생물 균막-관련 감염을 치료하는 더욱 효과적인 방법을 개발할 필요가 있음이 인지된다. 통상적으로 균막의 발달 및 정착성 상태로의 변화와 병행하여 상향 조절되는 감염의 독성 프로파일이 또한 감소된다.
본 발명자는 층판소체가 부유성 단계로부터 정착성 단계로 변화시키기 위해 박테리아에 의해 이용되는 정족수 감지 메시징(messaging) 시스템을 방해할 수 있고/있거나; 균막, 특히 박테리아 균막을 제거할 수 있고/있거나; 균막 형성을 억제할 수 있고/있거나; 박테리아 세포벽 투과성을 증가시킬 수 있는 것을 결정하였다. 특히, 본 발명자는 미생물 감염으로 고통받는 숙주 대상체에 층판소체를 투여하는 것이 상기 미생물에 대한 개선된 면역 반응 및/또는 미생물의 성장을 억제하거나 미생물을 파괴하기 위해 숙주 대상체에 제공되는 항생제의 강화작용을 발생시키는 것을 결정하였다.
광범위한 실험 후, 본 발명자는 층판소체가 균막을 붕괴시키고/시키거나 제거하고, 이에 따라 미생물을 부유성 단계에서 유지시키거나 부유성 단계로 역전시킴으로써 숙주의 면역 반응을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 층판소체가 균막, 특히 박테리아 균막을 붕괴시키고, 정족수 감지 분자의 박테리아 생성 및/또는 방출을 억제하거나 방해하여, 균막 생성을 개시시키고, 독성 관련 유전자를 발현시키기 위한 박테리아에 의한 "결정"에 대한 필수적 전조인 박테리아의 서로 간의 소통이 억제되는 것으로 생각한다. 결과로서, 균막은 제거되고, 이의 형성이 감소되거나 방지되어, 박테리아가 숙주의 방어 및/또는 항-감염 요법에 더욱 민감하게 만든다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 미생물 정족수 감지를 억제하거나 붕괴시키기 위한 층판소체의 용도가 제공된다. 구현예에서, 미생물 균막의 존재 또는 형성의 붕괴에서 사용하기 위해 미생물 정족수 감지를 억제하거나 붕괴시키는 층판소체의 용도가 제공된다.
구현예에서, 층판소체의 상기 용도는 숙주 대상체의 미생물 감염, 특히 숙주에서 균막 생성과 관련된 미생물 감염의 치료를 가능하게 한다. 구현예에서, 층판소체는 정족수 감지 길항제로 작용할 수 있다.
구현예에서, 층판소체는 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨 및 콜레스테롤을 포함한다. 특히, 층판소체는 중량을 기준으로 44-70% 범위 내의 포스파티딜콜린, 15-23% 범위 내의 스핑고미엘린, 6-10% 범위 내의 포스파티딜 에탄올아민, 2-6% 범위 내의 포스파티딜 세린, 2-4% 범위 내의 포스파티딜 이노시톨 및 4-12% 범위 내의 콜레스테롤을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 조성물은 0-3 중량% 범위 내의 리소포스파티딜 콜린을 추가로 포함한다.
구현예에서, 층판소체는 중량을 기준으로 약 55%의 포스파티딜콜린, 약 19%의 스핑고미엘린, 약 8%의 포스파티딜 에타올아민, 약 4%의 포스파티딜 세린, 약 3%의 포스파티딜 이노시톨 및 약 10%의 콜레스테롤을 포함하거나 이들로 구성된다(본원에 논의된 LMS-611 조성물). 특히, 구현예에서, 층판소체 조성물은 55.1% PC, 19.4% SP, 8.2% PE, 4.1% PS, 3.1% PI 및 10.1% CH를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 약 2 중량%의 리소포스파티딜 콜린을 추가로 포함한다.
구현예에서, 균막은 동물, 적합하게는 포유동물, 특히 인간 대상체; 식물; 또는 비활성 물질에 존재할 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 층판소체/층판소체들은 균막의 형성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 균막이 형성되었거나 형성되는 장치 또는 부위로의 층판소체의 적용을 통해 박테리아에 의한 오염을 감소시킬 수 있다.
구현예에서, 대상과 본 발명에 따른 층판소체를 접촉시키는 단계를 포함하는 박테리아 오염을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에서, 질환이 미생물 또는 박테리아의 정족수 감지 활성 또는 신호전달에 의해 야기되는 경우 상기 질환 또는 과정을 치료하거나, 예방하거나, 늦추는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 층판소체와 층판소체가 적용되는 대상 또는 대상체 사이의 접촉은 치료되는 부위로의 본 발명의 층판소체를 포함하는 용액의 분무, 침지, 솔질, 또는 기타 적용에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체 및 적어도 제1 비-층판소체 항미생물 활성제, 바람직하게는 항생제를 포함하는 조성물이 제공된다.
구현예에서, 층판소체는 항미생물제와의 동시, 별개적 또는 순차적 사용을 위한 조성물로 투여되거나 제공될 수 있다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 미생물 감염을 치료할 필요가 있는 대상체에 미생물 균막의 형성을 억제하거나 붕괴시키기 위해 치료적 유효량의 층판소체를 투여하는 단계를 포함하는 미생물 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 구현예에서, 대상체는 동물이다. 구현예에서, 대상체는 적합하게는 인간이다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 숙주 대상체의 미생물 균막, 특히 미생물 감염의 별개적, 순차적 또는 동시 치료를 위한 층판소체 및 조합 치료제, 예를 들어, 항미생물 활성제를 포함하는 부품 키트(kit of parts)가 제공된다. 적합하게는, 키트는 치료적 유효량의 항미생물제를 포함한다. 적합하게는, 항미생물제 또는 층판소체는 치료되는 특정 부위와 관련하여 사용하기 위해, 예를 들어, 비내 투여용, 국소 투여용 또는 정맥내 투여용으로 제형화된다. 적합하게는, 항미생물제 또는 층판소체는 치료되는 대상체로 다양한 투여 경로에 의해 제공되도록 제형화된다.
구현예에서, 미생물 균막은 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 및 원생동물을 포함하는 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 형성된다. 구현예에서, 미생물 균막은 박테리아에 의해 형성될 수 있다.
구현예에서, 붕괴되는 정족수 감지는 그람-양성 박테리아로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 붕괴되는 정족수 감지는 그람-음성 박테리아로부터 유래될 수 있다.
구현예에서, 미생물 감염은 임플란트-관련 및/또는 카테터-관련 및/또는 내재 의료 장치-관련 감염일 수 있다. 균막의 생성이 아스퍼질루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 및 뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii)에 의해 야기되는 것을 포함하는 다수의 흔하게 발생하는 생명을 위협하는 감염에 대한 중요한 독성 인자인 것이 문헌에서 잘 확립되어 있다.
진균 균막은 세포외다당류(exopolysaccharide) 기반이며, 이들 역시 층판소체, 특히 LMS-611 조성물에 의해 영향을 받을 것으로 생각된다. 예를 들어, HTLV-1을 포함하는 바이러스가 또한 균막을 형성하는 것으로 공지되어 있으며, 상기 균막의 형성을 억제하기 위해 층판소체, 특히 LMS-611이 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
구현예에서, 층판소체와 함께 사용될 수 있는 항미생물 활성제는 피페라실린(piperacillin), 아즈트레오남(aztreonam), 메로페넴(meropenem), 겐타마이신(gentamicin), 토브라마이신(tobramycin), 에리트로마이신(erythromycin), 타조신(tazocin), 세프타지딤(ceftazidime) 및 시프로플록사신(ciprofloxacin) 또는 이들의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 항생제 또는 항생제들일 수 있다.
구현예에서, 항생제는 피페라실린, 아즈트레오남, 메로페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 에리트로마이신, 타조신, 세프타지딤 및 시프로플록사신 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 층판소체, 특히 LMS-611은 조합 요법제, 예를 들어, 항생제, 예를 들어, 토브라마이신, 세프타지딤, 타조신 또는 시프로플록사신을 이용한 치료 전에 박테리아 콜로니에 제공된다. 적합하게는, 적어도 10 ㎍/㎖. 적어도 15 ㎍/㎖, 적어도 20 ㎍/㎖, 적어도 30 ㎍/㎖, 적어도 40 ㎍/㎖의 층판소체의 농도가 치료되는 부위에 제공된다. 구현예에서, 층판소체, 특히 LMS-611은, 예를 들어, 폐의 감염의 치료를 위해, 예를 들어, 타조신 전에 또는 이와 동시에 제공될 수 있다.
적합하게는, 치료되는 부위는 안구일 수 있다. 적합하게는, 치료되는 부위는 폐일 수 있다. 적합하게는, 층판소체는 조합 치료제, 예를 들어, 제공되는 항생제(들)과 상이한 투여 경로에 의해 치료되는 부위에 제공될 수 있다. 예를 들어, 층판소체는 비내 제공될 수 있는 한편, 항생제는 정맥내 제공된다.
정족수 감지 및 일부 경우에서 균막 생성은 미생물이 발효 산물의 높은 수율의 생성을 가능하게 하도록 충분한 밀도로 성장되는 경우에 문제가 될 수 있다. 생산 설비에서 세포 밀도의 증가를 가능하게 하고, 균막 생성을 최소화시키기 위해 정족수 감지를 조절하는 능력은 유리할 수 있다.
따라서, 공지된 미생물 집단의 부피 생산성을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은,
a) 균막을 형성할 수 있는 미생물, 예를 들어, 박테리아의 배양 배지에 층판소체를 도입하는 단계, 및
b) 미생물, 예를 들어, 박테리아를 성장시키는 단계를 포함하며,
여기서, 미생물의 부피 생산성은 미생물에 의해 생성되는 발효 생성물과 관련하여 층판소체의 부재하에서의 미생물의 발효 생성물의 부피 생산성보다 층판소체의 존재하에서 더 크다.
공지된 미생물 집단의 세포 밀도를 증가시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은,
a) 균막을 형성할 수 있는 미생물, 예를 들어, 박테리아의 배양 배지에 층판소체를 도입하는 단계, 및
b) 층판소체를 포함하는 배양 배지에서 미생물을 성장시키는 단계로서, 층판소체를 포함하는 배지에서 성장하는 경우 미생물이 층판소체를 포함하지 않고 동일한 배양 조건하에서 배양되는 달리 동일한 미생물의 배양 배지의 세포 밀도보다 큰 세포 밀도로 성장하는 단계.
발효 생성물을 생성하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은,
a) 발효 생성물을 생성할 수 있는 유전학적으로 변형된 공지된 미생물, 예를 들어, 박테리아를 제공하는 단계,
배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계로서, 배양 배지에 층판소체가 제공되는 경우 유전학적으로 변형된 미생물이 층판소체를 포함하지 않는 배양 배지에서 생성되는 경우의 동일 발효 생성물에 대한 부피 생산성보다 발효 생성물에 대해 더 높은 부피 생산성을 달성하는 능력을 갖는, 단계.
구현예에서, 상기 방법은 배양 배지로부터 적어도 하나의 발효 생성물을 수거하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 본 발명에 기재된 바와 같은 층판소체를 이용하여 정족수 감지의 진행을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 늦추는 방법이 제공된다.
본 발명의 구현예는 이제 하기 기재되는 도면을 참조하여 단지 예시로서 기재될 것이다.
도 1은 LMS-611 처리 후의 유전자 발현 데이터(A)를 예시하며, 여기서 마우스 폐는 50 ㎕ 인산염-완충 염수(PBS) 중 2 × 106 CFU의 P. 에어루지노사 균주 LESB65의 새로운 중간-대수 단계 용량으로 비내 감염되었다. 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간, 및 168시간에서 마우스 조직으로부터 분리된 RNA가 독성 인자 algD, flgD, lasR, rhlR, phzF 및 pelB에 대해 시험되는 모든 숙주 RNA 및 박테리아 RNA를 제거하기 위해 처리되었고, (B) 이는 비인두에서 P. 에어루지노사의 유전자 발현을 예시하며, 여기서 미처리 샘플에서 flgD 및 pelB는 7일의 기간(포인트 1 시간 0, 포인트 2 시간 24시간, 포인트 3 시간 48시간, 포인트 4 시간 72시간 및 포인트 5 시간 168시간(7일)) 동안 발현에서 현저한 증가를 나타내고, 처리 샘플에서 pelB에서 또한 증가가 있었으나, 이는 대조군에 비해 감소된다. 미처리 샘플은 algD 및 lasR에서 매우 큰 증가를 나타내지만, LMS-611 처리 샘플에서는 관찰되지 않는다.
도 2는 LMS-611 처리 후의 인공 객담 배양물에서 관찰된 피오시아닌 수준을 예시하며, 여기서 박테리아는 3일 동안 균막 상태로 성장된 후, 다양한 농도의 LMS-611로 24시간 동안 처리되었으며, ASM 균막 검정의 이미지(A)와 함께 550 ㎚에서의 흡광도에 의한 피오시아닌 생성의 정량(B)이 예시된다. n = 2.
도 3은 P. 에어루지노사(PA)가 이들이 LMS-611로 처리된 후에 대사적으로 활성인 활성 성장 단계로 유지되는 것을 예시하며, 여기서 레자주린은 미생물의 대사 활성을 측정하는 염료이다. 균막은 3일 동안 성장된 후, 다양한 농도의 LMS-611이 추가 24시간 동안 첨가되었다. ASM은 인공 객담 배지이다. 이후, 배양물은 첨가된 스푸타솔(Sputasol) 및 레자주린을 이용하여 균질화되었고, 1시간 동안 37℃에서의 인큐베이션 후에 측정이 수행되었다(비-파라미터 통계 시험이 수행되었고(순위에 대한 ANOVA 및 던 사후 검정(Dunn's post hoc test), 각각의 처리가 B65 대조군과 비교되었다. * = p<0.05).
도 4는 3일 동안 성장된 후, 다양한 농도의 LMS-611로 24시간 동안 처리된 균막에서의 PA에 대한 LMS-611의 효과를 예시한다. ASM에서의 PA 균막의 이미지. ASM 균막으로부터의 박테리아 수의 정량화(CFU/㎖). 각각의 처리의 cfu/㎖가 대조군과 유의한 차이가 있는지의 여부를 결정하기 위해 순위에 대한 ANOVA 및 던 사후 검정을 이용하였다. * = p<0.05.
도 5는 다양한 농도의 박테리아가 3일 동안 균막으로 성장된 후, 다양한 농도의 LMS-611 및/또는 항생제 토브라마이신(A) 및 시프로플록사신(B)으로 24시간 동안 처리된 항생제 강화를 예시한다. 각각의 처리의 cfu/㎖가 대조군과 유의한 차이가 있는지의 여부를 결정하기 위해 순위에 대한 ANOVA 및 던 사후 검정을 이용하였다. * = p<0.05.
도 6은 마우스 폐가 LESB65(50 ㎕ PBS 중 2X106 CFU)로 비내 감염되고, 감염 24시간 및 48시간 후에 LMS-611(용량 당 1 ㎎)가 비내 제공되고/되거나 타조신(용량 당 2 ㎎ 피페라실린 및 0.5 ㎎ 타조박탐)이 정맥내 제공된 마우스 감염 모델에서의 PA의 정량화를 예시한다. 박테리아는 비인두(A) 및 폐 조직(B)으로부터 정량되었다. 데이터는 그룹 당 5마리의 마우스로부터의 데이터이다. 이원 ANOVA 분석에서 * = p<0.05 및 ** =p<0.01.
도 7은 (A) LMS-611의 생체 내 시험이 뮤린 폐 모델에서 슈도모나스 콜로니 형성 단위(CFU)를 유의하게 감소시킬 수 있고(3일에서 p=0.01), (B) LMS-611로 슈도모나스 감염에 대한 대식세포 반응에서 유의한 증가(1일 내지 3일 동안 p=0.05)가 있음을 예시한다.
도 8. P. 에어루지노사(균주 PA01) 균막이 폴리스티렌 페그(peg)에서 24시간 동안 형성되었다. 균막이 3개의 상이한 농도(10 ㎎/㎖, 1.25 ㎎/㎖ 및 0.03 ㎎/㎖)의 LMS-611로 1시간 동안 처리되었다. 이후, 균막은 18시간 동안 1 x MIC(최소 억제 농도)의 농도로 임상적으로 중요한 항생제 아즈트레오남(A), 세프타지딤(B), 시프로플록사신(C), 메로페넴(D) 및 토브라마이신(E)으로 처리되었다. 균막-관련 세포의 생활력이 대사 XTT 검정을 이용하여 처리 후에 평가되었고, 처리된 균막이 세포 생활력(%)을 계산하기 위해 미처리 대조군 균막과 비교되었다. 오차 막대는 복제 균막 사이의 표준 편차를 나타낸다. 결과는 대조군과 처리 균막 사이의 쌍을 이루지 않은 양측 T-검정 비교를 수행하여 분석되었다. *=P≤0.05, **=P≤0.001, ***=P≤0.0001.
도 9는 PA 및 부르크홀데리아 세파시아 복합체(BCC) 대조군 균주 및 LMS-611 처리된 PA 및 BCC 균주 둘 모두에 대한 주사 전자 현미경의 조성을 예시하며, LMS-611 처리 균주에서 균막은 불충분하고 붕괴된 것을 나타낸다.
도 10은 24시간 동안 성장된 PA01의 미처리 균막(A) 및 18시간 동안 40 ㎎/㎖(B), 1.25 ㎎/㎖(C) 및 0.325 ㎎/㎖(D & E)의 생리식염수에 재구성된 LMS-611로 처리된 24시간 동안 성장된 PA01의 균막의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지(5000 x 배율)를 예시한다. 균막은 고정되고, 금으로 코팅된 후, JEOL 6400 주사 전자 현미경으로 이미지화되었다. 미처리 대조군 균막(A)은 다당류, 단백질 및 DNA로 구성된 균막의 웹-유사 기질 내에 넣어진 막대-형태의 P. 에어루지노사 세포의 다중층을 나타낸다. 가장 높은 용량의 LMS-611(40 ㎎/㎖)로 처리된 균막(B)에서, LMS는 균막의 표면을 코팅하는 것으로 보이며, 3D 구조에서 감소가 존재하는 것으로 보인다. 1.25 ㎎/㎖의 LMS-611(C) 및 0.325 ㎎/㎖의 LMS-611(D)로 처리된 균막은 다중층의 미처리 균막(A)에 비해 존재하는 세포의 수에서 명백한 감소를 나타내었다. 0.325 ㎎/㎖로 처리된 균막(E)의 확대된 이미지에서, P. 에어루지노사 세포의 수가 감소될 뿐만 아니라 남아 있는 세포가 변경된 형태를 가졌다. 건강한 막대 형태의 세포 대신, 이들 중 많은 것들이 처리에 의해 손상되었다.
도 11은 LMS-611과의 슈도모나스 세포의 인큐베이션(좌측의 배율 x 100 및 우측의 배율 x 1200)이 형광 염색에 의해 입증되는 바와 같이 박테리아 막이 프로피듐 요오다이드에 대해 침투성이 되도록 하는 것을 예시한다(좌측 이미지는 프로피듐 요오다이드 단독이고, 우측 이미지는 프로피듐 요오다이드 및 LMS-611임).
도 12는 암컷 C57BL/6 마우스에서 P. 에어루지노사 ATCC 15692(PA01) 안구 감염에 대한 시프로플록사신 및 LMS-611의 효과의 결과를 예시한다. 0일에서, 동물은 5 ㎕ PBS 중 슈도모나스 에어루지노사 현탁액으로 안구 접종되었다. 시험 물질은 박테리아 접종 5시간 및 10시간 후에 5마리의 동물의 그룹으로 투여되었다. 접종 7.5시간, 11시간, 13시간, 15시간 및 17시간 후에 안락사된 동물로부터 개별적 안구가 외과적으로 수거되었다. 안구는 1 ㎖ PBS에서 균질화되고, 희석액이 CFU 결정을 위해 MacConkey 아가 플레이트 상에 플레이팅되었다. CFU/g 안구가 각각의 수거 시점에 대해 계산되었다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 표시되었다. 일원 ANOVA 및 터키(Tukey) 다중 비교 검정이 각 측정 시점에서 처리 그룹과 비히클 그룹 사이에서의 비교를 위해 적용되었고, 시프로플록사신 단독과 LMS-611 그룹과 조합된 시프로플록사신 사이의 비교에 적용되었다. *: p<0.05 처리 대 비히클, **: p<0.001 처리 대 비히클, ***: p<0.0005 처리 대 비히클, ns: 유의한 효과 없음 - 투여 부피는 마우스 당 5 ㎕였다.
도 13은 암컷 C57BL/6 마우스에서 P. 에어루지노사 ATCC 15692(PA01) 안구 감염에 대한 시프로플록사신 및 LMS-611의 효과를 예시한다. 0일에서, 동물은 5 ㎕ PBS 중 P. 에어루지노사 세포의 현탁액으로 안구 접종되었다. 시험 물질은 박테리아 접종 5시간 및 10시간 후에 그룹당 5마리의 동물로 투여되었다. 접종 12시간, 18시간 또는 26시간 후에 안락사된 동물로부터 개별적 안구가 외과적으로 수거되었다. 안구는 1 ㎖ PBS에서 균질화되고, 희석액이 CFU 결정을 위해 MacConkey 아가 플레이트 상에 플레이팅되었다. CFU/g 안구가 각각의 수거 시점에 대해 계산되었다. 데이터는 +/- SEM으로 표시되었다. 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정이 각 측정 시점에서 처리 그룹과 비히클 그룹 사이에서의 비교를 위해 적용되었고, 시프로플록사신 단독과 LMS-611 그룹과 조합된 시프로플록사신 사이의 비교에 적용되었다. *: 비히클에 비해 p<0.05, **: 비히클에 비해 p<0.001, ***: 비히클에 비해 p<0.0005, #: 시프로플록사신에 비해 p<0.05, ns: 유의한 효과 없음. Cipro: 시프로플록사신.
도 14는 슈도모나스 에어루지노사 균주 PA01의 균막 MIC를 감소시키는데 있어서의 LMS-611과 겐타마이신의 효과를 예시하며, 이는 겐타마이신 단독보다 더 효과적임을 예시한다.
도 15는 슈도모나스 에어루지노사 균주 PA01의 균막 MIC를 감소시키는데 있어서 LMS-611과 세프타지딤의 효과를 예시하며, 이는 세프타지딤 단독보다 더 효과적임을 예시한다.
도 16은 슈도모나스 에어루지노사 균주 PA01의 균막 MIC를 감소시키는데 있어서 LMS-611과 콜리스틴의 효과를 예시하며, 이는 콜리스틴 단독보다 더 효과적임을 예시한다.
도 17은 슈도모나스 에어루지노사 균주 PA01의 균막 MIC를 감소시키는데 있어서 LMS-611과 피페라실린의 효과를 예시하며, 이는 피페라실린 단독보다 더 효과적임을 예시한다.
도 18은 2개의 상이한 작동 방식(Pari-boy(제트형) 및 Pari Flow(진동형 메쉬))를 갖는 분무기를 이용하여 PA 균주 217M과 함께 콜리스틴과 조합한 경우의 LMS-611의 분무의 효과를 예시하며, 분무된 LMS-611 조성물로부터의 공기역학적 입자 크기 분포 및 침착을 측정하기 위해 다단계 액체 임팩터(MSLI)가 사용되었고, 여기서 Copley로부터의 MSLI는 유럽 약전 지침(Chapter 29.9.18)에 따라 입자 크기를 측정하며, 임팩터는 인간 호흡기 시스템의 다양한 부분을 시뮬레이션하는 5단계를 갖는다. 동일한 관성을 갖는 입자는 특정 단계에서 충격을 주는 한편, 더 작은 입자는 다음 충격 단계로 이동하여, 다양한 단계에서 침착된 LMS-611의 양을 분석함으로써 미세 입자 용량 및 분획이 계산될 수 있으며, 여기서 미세 입자 용량(호흡 가능한 분획)은 기도에 이용 가능하게 만드는 흡입 장치(분무기)로부터의 용량의 비율이고, 이는 흡입 동안 전도 기도에 도달하는 LMS-611의 용량과 관련이 있다.
도 19는 PA2783 균주와 관련하여 콜리스틴과 조합되는 경우 LMS-611의 분무의 효과를 예시하며, 도 21이 예시하듯이 콜리스틴은 LMS-611과 조합되는 경우 더욱 효과적으로 전달되며, 조합물은 낭성섬유증 폐질환의 부위인 폐의 분열을 나타내는 MLSI 단계의 가장 큰 살균 효과를 갖는다.
도 20은 PA 균주 217M과 함께 토브라마이신과 조합되는 경우 LMS-611의 분무의 효과를 예시한다.
도 21은 PA 균주 27853과 함께 토브라마이신과 조합되는 경우 LMS-611의 분무의 효과를 예시하며, LMS-611과 조합된 토브라마이신이 MLSI의 모든 단계로 전달되고, 조합물의 살균 효과가 낭성섬유증 폐질환 부위를 나타내는 임팩터의 6.8 ㎛, 3.1 ㎛ 및 1.7 ㎛ 단계에 대해 더 큰 것을 예시한다.
본 발명의 발명자는 놀랍게도 박테리아로의 층판소체의 투여가 정착성 상태가 아닌 부유성 상태와 일치하는 유전자 발현 프로파일을 발생시키는 것을 발견하였다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 층판소체가 균막의 형성을 붕괴시키고, 독성 관련 유전자 발현을 하향조절하며, 이에 따라 박테리아의 병원성을 감소시키고, 숙주 대상체의 면역 반응 및/또는 항미생물제가 미생물에 접근 가능하게 하는 것으로 생각한다. 따라서, 균막의 형성을 억제하는 층판소체의 작용은 박테리아가 면역계 및/또는 항감염제, 예를 들어, 항생제에 의해 억제되고/되거나 사멸되는 것을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 본 발명자는 또한 슈도모나스 에어루지노사에 의해 생성된 피오시아닌의 이용가능성이 층판소체의 영향 하에서 시험관 내에서 감소되는 것을 입증하였으며, 피오시아닌은 정족수 감지 메커니즘의 조절하에서 박테리아에 의해 생성되는 주요 독성 인자이다. 본 발명자는 미생물 감염 부위로의 층판소체의 투여가 감염 부위로 보충되는 대식세포의 수에서의 유의한 증가를 발생시킬 수 있음을 입증하였다. 층판소체가 박테리아 벽의 침투성을 변경시킬 수 있으며, 이는 박테리아를 숙주의 면역 반응 및 항생제에 대해 더욱 민감하게 만들 수 있는 것으로 추가로 추측된다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 균막의 일부가 되는 미생물, 특히 박테리아가 미생물 세포 과정을 뒷받침하는 세포 대 세포 소통의 한 유형인 정족수 감지에 관여하는 것으로 생각된다. 정족수 감지 이면의 메커니즘은 완전히 이해되지는 않았지만, 상기 소통 과정이, 예를 들어, 단일 세포 박테리아가 다른 박테리아의 근접을 인지하는 것을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 박테리아가 다른 병원체의 충분히 밀집한 집단에 의해 둘러싸여 있다는 것을 감지할 수 있는 경우, 이는 균막의 형성 및 유전자 발현에서의 변형을 통한 피오시아닌 및 다른 독성 인자의 생성에 기여하도록 자극된다. 층판소체는 N-아실 호모세린 락톤(AHL)과 같은 정족수 감지 분자의 신호를 격리 및 켄칭시키는 능력을 가질 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명자는 숙주에 층판소체, 특히 LMS-611을 투여하는 것이 숙주의 면역계의 세포에 의한 미생물 감염의 청소를 개선시키는 것을 입증하였다. 구현예에서, 층판소체는 인지질 조성물 내에 중량을 기준으로 44-77% 범위 내의 포스파티딜 콜린(PC), 15-23% 범위 내의 스핑고미엘린(SP), 6-10% 범위 내의 포스파티딜 세린(PS), 2-4% 범위 내의 포스파티딜 이노시톨(PI) 및 4-12% 범위 내의 콜레스테롤(CH)을 포함하며, 특히 LMS-611 층판소체는 약 55% PC, 19% SP, 8% PE, 4% PS, 3% PI 및 10% CH를 포함한다.
LMS-611은 또한 박테리아에 대한 항생제의 최소 억제 농도(MIC - 미생물의 가시적인 성장을 억제하는 항미생물제의 가장 낮은 농도)를 감소시켜, 박테리아 청소 및/또는 동일 효능을 갖는 더 낮은 용량(또는 상이한 경로를 통함)의 LMS-611/항생제 조합물의 이용을 개선시키는 여지를 제공함으로써 다양한 항생제를 강화시키는 것으로 보인다. 항생제의 사용 및 용량이 종종 이의 부작용 및/또는 독성 프로파일에 의해 제한되는 것을 감안할 때, 이는 또한 사용이 달리 제한되는 강력한 항생제의 잠재적 사용을 증가시킨다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재되고/되거나, 본 발명의 개시를 읽었을 때 당업자에게 명백해질 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계 등을 포함한다.
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본 문헌 전체에 걸쳐 사용되는 "층판소체" 또는 "미세소체(microbody)"는 인지질, 다중층, 이중층 구조를 나타낸다.
"치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 치료, 방지 및 예방을 나타내며, 특히 대상체가 괴로워하는 경우 허약 또는 질병 또는 질환 또는 사건의 발생의 예방(방지) 또는 이들의 발생의 정도 또는 가능성의 치유 또는 감소를 위해 대상체와 관련한 약물의 투여 또는 의학 절차의 수행을 나타낸다.
"치료적 유효량"은 본 발명의 조성물을 이용한 치료를 위해 고려되는 질환 또는 결핍과 관련된 증상을 감소시키거나 방지하기에 충분한 양이다.
"조합 요법"은 본 발명의 제제와 다른 활성제 또는 치료 양식의 사용을 나타낸다. 이들 다른 제제 또는 치료는 약물, 예를 들어, 항미생물제, 특히 항균제, 예를 들어, 항생제, 항진균제, 항바이러스제 또는 항원생동물 제제; 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 항-염증 화합물, 또는 감염을 치료하거나 경감시키는데 유용한 다른 제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 제제와 이들 다른 요법 또는 치료 양상의 조합된 사용은 동시적일 수 있거나, 다른 요법 또는 치료 양상 전에, 다른 요법 또는 치료 양상 후에, 또는 다른 요법 또는 치료 양상과 상이한 경로를 통해 본 발명의 제제가 제공될 수 있도록 치료가 나누어질 수 있다.
"국소 투여"는 균막 질병 또는 감염 부위 또는 그 부근에서의 비-전신 경로에 의한 직접 투여를 의미한다.
"치료 모이어티"는 작은 유기 화학 화합물, 또는 단백질 또는 펩티드, 또는 핵산, 또는 항체 또는 항체 단편, 또는 탄수화물이든 간에 층판소체에 부착될 수 있고, 치료가 이로울 수 있는 질병 또는 질환으로 고통받는 대상체에 투여될 수 있는 임의의 치료적으로 효과적인 분자를 나타낸다. 선택적으로, 치료 모이어티는 층판소체를 구성하는 인지질 이중층 상 또는 내에 포함될 수 있다.
합성 층판소체의 생성
본 발명의 초점은 박테리아 감염을 치료하고/하거나 균막의 형성을 억제하기 위한 층판소체의 치료적 용도이다. 하기 정보는 층판소체의 생성을 위한 방법의 세부사항을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 층판소체의 주요 인지질 성분은 포스파티딜콜린(PC), 스핑고미엘린(SP), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 및 포스파티딜이노시톨(PI), 및 콜레스테롤이다.
층판소체는 PC 44-70%, SP 15-23%, PE 6-10%, PS 2-6%, PI 2-4%, 콜레스테롤 4-12% 범위 내로 이들 성분을 포함할 수 있거나, 이들 성분을 필수적으로 포함할 수 있다. 이들 수치는 중량 백분율이다.
인지질 다중층 미세소체(층판소체)에 대한 인지질 및 콜레스테롤의 바람직한 조성은 PC 55%: SP 19%: PE 8%: PS 4%: PI 3%: 콜레스테롤 10%를 포함한다.
합성 층판소체는 인지질 혼합물을 상기 중량에 의해 제공된 백분율로 콜레스테롤과 함께 취하고, 이들을 클로로포름/메탄올 용매 혼합물(2:1 vol/vol)에 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 이후, 지질 용액은 둥근-바닥 플라스크에 도입되고, 회전 증발기에 부착될 수 있다. 플라스크는 비워지고, 건조 지질막이 침전될 때까지 30℃의 온도에서 자동온조조절식으로 조절되는 수조에서 60 r.p.m.으로 회전된다. 질소가 플라스크에 도입되고, 잔여 용매가 제거된 후, 동결건조기에 연결되며, 여기서 이는 1시간 동안 실온에서 고진공에 적용된다. 진공의 방출 및 질소를 이용한 플러싱(flushing) 후, 포획을 위한 용질(선택된 항원)을 함유하는 염수가 첨가된다. 지질은 플라스크 내에서 수화되고, 질소로 플러싱되고, 증발기에 부착되고, 30분 동안 실온에서 60 r.p.m.에서 회전된다. 현탁액은 실온에서 2시간 동안 방치되어 팽창 과정이 완료된다.
구현예에서, 층판소체는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 치료적 유효량으로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 층판소체는 정확한 투여를 촉진하기 위해 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 용어 "단위 투여 형태"는 인간 대상체 및 다른 동물, 특히 포유동물에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제와 회합된 원하는 치료 효과를 발생시키도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다. 통상적인 단위 투여 형태는 액체 조성물의 미리 충전되고 미리 측정된 앰풀 또는 주사기 또는 고체 조성물의 경우 환약, 정제, 캡슐 등을 포함한다. 단위는, 예를 들어, 단일 사용 바이알, 미리 충전된 주사기, 단일 경피 패치 등일 수 있다. 단위 투여 형태는 단위 용량 또는 단위 사용 패키지일 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 단위 용량 패키지는 편리한 환자 준비 단위이다. "단위 투여 형태"는 55 ㎎의 포스파티딜콜린, 19 ㎎의 스핑고미엘린, 8 ㎎의 포스파티딜에탄올아민, 4 ㎎의 포스파티딜세린, 3 ㎎의 포스파티딜이노소톨(phosphatidylinosotol) 및 10 ㎎의 콜레스테롤이 존재할 수 있는 5 ㎖의 층판소체의 현탁액일 수 있다.
특정 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 미국 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나, 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용을 위해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 상기 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 오일, 예를 들어, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등일 수 있다.
멸균 등장성 수성 완충액이 약학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우에 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다.
적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어, 트리글리세라이드를 갖는 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다. 상기 조성물은 대상체로의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 치료적 유효량의 화합물을 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
바람직한 구현예에서, 조성물은 대상체로의 정맥내 투여에 적합화된 약학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 통상적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제, 예를 들어, 리도카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 샤세와 같은 기밀적으로 밀봉된 용기 중에 단위 투여 형태, 예를 들어, 동결 건조된 분말 또는 물 비함유 농축물로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 멸균된 약학적 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있는 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
본원에 기재된 질환의 치료에서 효과적일 층판소체 조성물 및/또는 층판소체 및 항미생물 조합물의 양은 본 발명의 기재를 기초로 하여 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 시험관내 검정이 선택적으로 이용될 수 있다. 제형에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 장애의 심각성에 좌우될 것이며, 개업자의 판단 및 각각의 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 정맥내 투여를 위한 적합한 투여량 범위는 일반적으로 체중 킬로그램 당 약 20-500 마이크로그램의 활성 화합물이다. 비내 투여를 위한 적합한 투여량 범위는 일반적으로 약 0.01 pg/㎏ 체중 내지 1 ㎎/㎏ 체중이다. 효과적인 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 상기 용기(들)와 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 지정한 형태의 통지서일 수 있으며, 상기 통지서는 (a) 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인, (b) 사용 지침, 또는 둘 모두를 반영한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는, 비제한적인 예로, 수술 동안의 국소 주입 또는 수술 후 노출된 조직으로의 층판소체를 함유하는 용액의 분무, 국소 적용, 주사, 카테터, 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있고, 상기 임플란트는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질, 예를 들어, 막, 예를 들어, 실라스틱 막, 또는 섬유 또는 공중합체, 예를 들어, Elvax이다(문헌[Ruan et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10872-10876] 참조). 일 구현예에서, 투여는 에어로졸화된 흡입에 의한 직접 주사에 의한 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 층판소체는 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌[Langer, 상기; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Solen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. (1983) Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한 Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105] 참조). 또 다른 구현예에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만 필요로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release (1984) 상기, vol. 2, pp. 115-138] 참조). 다른 적합한 조절 방출 시스템은 문헌[Langer (1990) Science 249: 1527 - 1533]에 의한 개관에 논의되어 있다.
본 발명은 이제 예시 목적을 위해 제공되고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되고자 하는 것은 아닌 하기 실시예를 참조로 하여 기재될 것이다.
실시예
실시예 1
박테리아 균막을 형성하는 유전자의 발현에 대한 합성 층판소체의 작용
많은 박테리아, 예를 들어, 슈도모나스, 부르크홀데리아 및 스태필로코커스가 숙주의 면역 방어 및 항미생물제로부터 박테리아를 보호하는 작용을 하는 균막을 생성시키는 것이 공지되어 있다.
슈도모나스 감염의 마우스 모델에서, 마우스를 P. 에어루지노사의 균주인 LESB65(50 ㎕ PBS 중 2 x 106 CFU)로 비내 감염시켰고, LMS-611 처리 마우스에 용량 당 1 ㎎의 LMS-611을 투여하였다.
박테리아 RNA를 0일, 1일, 2일, 3일 및 7일에 마우스 폐 및 비인두에서 분리하였다.
대조군(LMS-611 미처리) 마우스 및 LMS-611로 처리된 마우스에 대한 유전자 발현 프로파일을 세포 내의 발현된 유전자(메신저 RNA)의 "스냅샷(snapshot)"을 가능하게 하는 qPCR(정량적 중합효소 연쇄 반응) 분석에 의해 완료하였다.
LMS-611 미처리 샘플은 세포외다당류(균막 빌딜 블록) 생성 및 정족수 감지와 관련된 유전자의 상향조절을 나타내었다. 특히, pelB(균막 형성과 관련된 세포외다당류), flgD(편모/운동성 관련 유전자), algD(균막 알기네이트 유전자) 및 lasR(정족수 감지에서의 중심 유전자)이 미처리 샘플에서 증가되며, LMS-611 처리 마우스로부터의 샘플에서 유의하게 감소된다.
도 1b에서, LMS-611 미처리 샘플에서, flgD 및 pelB가 7일의 기간 동안 발현에서 현저한 증가를 나타내는 것으로 나타났다. 처리 샘플에서 pelB에서 증가가 존재하는 반면, 이는 미처리 대조군 샘플과 관련하여 감소된다. 이들 마커의 발현을 참조 유전자인 proC로 표준화시켰고, 따라서 상기 수는 관찰된 박테리아 수의 증가에 의해 영향을 받지 않는다.
이러한 데이터는 LMS-611이 정족수 감지 기구의 간섭을 통해 균막 형성을 억제한다는 결정을 뒷받침한다.
폐에 대해 낮은 수준의 LMS-611, 예를 들어, 30-40 ㎍/㎖의 LMS-611을 공급하는 것이 유리할 수 있고, 항생제는 분무되며, 이렇게 하는데 20 내지 30분이 걸릴 수 있고, 따라서 부피가 감소되는 경우, 이러한 처리 시간, 항생제의 부피 및 관련 부작용이 모두 감소될 수 있다. 안구에 대해서도 유사하게, 안구가 수용할 수 있기에는 부피가 너무 많아서, 감소가 유리할 수 있다.
실시예 2
시험관 내에서, CF에서 관찰되는 통상적인 균막을 나타내는 것으로 생각되는 인공 객담 모델(Artificial Sputum Model; ASM)을 슈도모나스 에어루지노사 감염을 연구하기 위해 사용하였다.
P. 에어루지노사에 의해 생성되고, 정족수 감지 시스템(집단 밀도와 관련된 박테리아간 신호전달 시스템) 및 이에 따른 박테리아 배양물에서의 이의 존재 및 농도에 의해 조절되는 청색-녹색 페나진 색소인 피오시아닌이 정족수 감지 활성의 강도의 지표를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 농도의 LMS-611에 노출된 PA 감염된 ASM에서 검출된 수준을 측정하였다.
도 2에서 입증되는 바와 같이, 인공 객담 배양물에서 검출된 피오시아닌 수준은 LMS-611 처리 배양물에서 피오시아닌 이용가능성이 감소되는 것을 암시하며 - 피오시아닌의 청색 녹색은 더 높은 농도의 LMS-611로 처리된 웰에서 찍은 이미지에서 점진적으로 덜 강한 것이 관찰될 수 있다. 이용 가능한 피오시아닌의 수준은 10 ㎎/㎖로부터 0.3125 ㎎/㎖로 감소된다.
슈도모나스 및 부르크홀데리아 콜로니의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 LMS-611의 존재 및 부재하에서 성장시켰다. 도 9는 LMS-611이 존재하는 경우 박테리아 균막이 박멸되는 것을 예시한다.
도 11은 24시간 동안 성장된 PA01의 미처리 균막(A) 및 18시간 동안 40 ㎎/㎖(B), 1.25 ㎎/㎖(C) 및 0.325 ㎎/㎖(D & E)의 생리식염수에 재구성된 LMS-611로 처리된 24시간 동안 성장된 PA01의 균막의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지(5000 x 배율)를 제시한다. 미처리 대조군 균막(A)은 다당류, 단백질 및 DNA로 구성된 균막의 웹-유사 기질 내에 넣어진 막대-형태의 P. 에어루지노사 세포의 다중층을 나타낸다. 가장 높은 용량의 LMS-611(40 ㎎/㎖)로 처리된 균막(B)에서, LMS는 균막의 표면을 코팅하는 것으로 보이며, 3D 구조에서 감소가 존재하는 것으로 보인다. 1.25 ㎎/㎖ LMS-611(C) 및 0.325 ㎎/㎖(D)로 처리된 균막은 다중층의 미처리 균막(A)에 비해 존재하는 세포의 수에서 명백한 감소를 나타내었다. 0.325 ㎎/㎖로 처리된 균막(E)의 확대된 이미지에서, P. 에어루지노사 세포의 수가 감소될 뿐만 아니라 남아 있는 세포가 변경된 형태를 가졌다. 건강한 막대 형태의 세포 대신, 이들 중 많은 것들이 처리에 의해 손상되었다.
실시예 3
레자주린(Resazurin) 검정을 이용하여 인공 객담 모델(ASM)에서 슈도모나스 에어루지노사의 대사 활성이 측정되었고, 여기서 검출되는 형광은 박테리아의 대사 활성과 직접 비례한다(도 3).
도 3에 예시된 결과는 슈도모나스 에어루지노사가 이들이 이들의 가장 생물학적으로 활성이고, 숙주의 면역 반응 및 항미생물제에 가장 민감한 활성 성장 단계에 남아 있음을 나타낸다.
이는 LMS-611이 부유성유발(pro-planktonic) 효과를 가짐을 예시한다.
이러한 부유성유발 효과는 슈도모나스 에어루지노사 박테리아가 3일 동안 균막으로 성장한 후 24시간 동안 다양한 농도의 LMS-611로 처리되는 경우에, 박테리아의 증가된 수가 LMS-611-처리 균막에 대해 결정된 것이 도 4에 의해 추가로 예시된다. 인공 객담 모델은 마우스 모델과 일치하는 것으로 보인다. ㎖ 당 콜로니 형성 단위는 미처리 대조군에 비해 형성된 균막의 LMS-611 처리 후에 유의하게 증가한다. 증가는 용량 의존적인 것으로 보이며, 더 높은 농도의 LMS-611(10-20 ㎎/㎖)로 처리된 배양물에서 가장 큰 증가가 있었다. 3개의 처리(20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖ 및 0.313 ㎎/㎖)에서 레자주린에 의해 검출된 대사 활성에서 유의한 증가가 있었고, 이는 LMS-611이 배양물의 대사 활성을 증가시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 4
인공 객담 배지 상의 예비 형성된 균막에 대해, 시프로플록사신 및 토브라마이신과 개별적으로 조합된 LMS-611을 이용한 처리는 항생제 처리 단독에 비해 유의하게 큰 박테리아 청소를 발생시켰다(도 5).
MBEC peg 플레이트 상의 예비 형성된 균막에 대해, 성숙 P. 에어루지노사 균막을 24시간 동안 형성시켰고, 1시간 동안 다양한 농도의 LMS-611로 예비 처리하였다. LMS 처리 후, 균막을 생리식염수로 충분히 헹구어 LMS를 제거하였다. 이후, 균막을 1/10 x, 1/5 x 및 1 x MIC로 항생제 아즈트레오남, 시프로플록사신, 세프타지딤, 메로페넴 및 토브라마이신으로 처리하였다. 처리 후의 균막-관련 세포의 생활력(%)을 대사 XTT 검정을 이용하여 평가하였다. LMS 예비 처리는 시험된 모든 항생제의 활성에 대한 균막 내의 세포의 민감성을 증가시키는 것으로 보인다.
LMS-611이 40 ㎍/㎖로 사용되는 경우, 토브라마이신 및 시프로플록사신 둘 모두에 대해 전체 박테리아 사멸이 관찰된 도 5에 예시된 바와 같이 항생제 강화가 가장 두드러졌다.
이러한 효과는 생체 내에서 확인되었다. 마우스 폐가 슈도모나스로 감염된 후, 흡입용 LMS-611 또는 염수로 처리된 뮤린 모델을 개발하였다. 주요 변수로서 콜로니 형성 단위(CFU)를 이용하여, LMS-611이 3일에서 CFU 수를 유의하게 감소시킨 것이 입증되었다. LMS-611이 박테리아의 은폐를 방지하고/하거나 박테리아를 노출시킴으로써 신체의 면역 반응을 향상시킨다는 주장을 뒷받침하면서, 대식세포 수에서의 유의한 증가가 또한 입증되었고, 이는 균막의 제거 또는 균막의 억제가 박테리아를 면역 세포에 더 잘 보이게 만드는 것을 나타낸다. 이들은 도 7b 및 13에 예시되어 있다.
뮤린 호흡기 감염 모델에서, BALB/c 마우스의 그룹을 가볍게 마취하고, 비내 점적주입에 의해 50 ㎕의 LMS-611(20 ㎎/㎖) 또는 비히클 대조군(0.9% NaCl)으로 처리하였다(Carter et al, 2010). 처리 약 120분 후, 모든 마우스를 1 x 106 콜로니 형성 단위(CFU)의 박테리아 슈도모나스 에어루지노사(LES65B)로 공격하였다. LMS-611 및 대조군을 이용한 처리를 약 24, 48 및 72시간 후에 반복하였다. 0일에서 감염 5시간 후 및 1일, 2일, 3일에서 처리 5시간 후에 샘플링된 비인두, 폐 및 혈액(시점 당 5마리의 동물)으로 임상 징후를 모니터하였고, 콜로니 형성 단위, 염증 세포 침윤 및 염증유발 매개체가 측정되는 7일까지 감염을 후속시켰다.
슈도모나스 에어루지노사(LES65B)로 감염된 마우스의 폐에 주입되는 경우 LMS-611은 비인두 및 폐에서 콜로니 형성 단위의 수를 감소시켰다. 3일에서, 콜로니 형성 단위의 수는 대조군에 비해 LMS-611 처리 마우스에서 1.5 logs(92%)만큼 유의하게(p < 0.05) 감소되었으며, 이는 훨씬 덜 심각한 감염을 나타낸다. 대조군 감염의 프로파일은 3일에서 "스파이크(spike)" 감염의 과거 데이터와 일치하였다(Carter et al, 2010). 감염을 7일까지 후속시켰고, 이때 처리 그룹 사이에 차이가 없었다.
LMS-611 처리는 대조군에 비해 대식세포의 수에서의 유의한 증가를 자극하였다. 대조적으로, 다형핵 백혈구, 단핵구 수, 대식세포 염증 단백질-2(MIP2) 및 종양 괴사 인자(TNF) 수준의 증가는 둘 모두의 그룹에서 유사하였다. LMS-611 처리 동물의 콜로니 형성 단위에서의 유의한 감소는 박테리아 감염의 중증도를 감소시키기에 충분한 식균작용성 대식세포의 증가 및/또는 마우스의 염증 반응에 대한 박테리아의 노출을 증가시키는 LMS-611의 부유성유발 효과에 기인하는 것으로 보인다.
이 연구는 LMS-611(20 ㎎/㎖)의 반복된 투여가 뮤린 폐에서 유도된 슈도모나스 에어루지노사 감염을 유의하게 감소시키는 항-감염 효과를 갖는 것을 입증한다.
실시예 5
본 발명자는 또한 LMS-611이 항생제의 효과를 강화시키는 작용을 하는지의 여부를 연구하였다. 이러한 이론을 시험하기 위해, 본 발명자는 슈도모나스 콜로니에 대해 LMS-611과 함께 및 LMS-611 없이 다양한 항생제의 MIC를 결정하였다.
LMS-611은 다양한 항생제를 강화시켜 박테리아 청소를 개선시키고/시키거나, 동일 효능으로 낮은 용량으로(또는 상이한 경로를 통해) LMS-611/항생제 조합을 이용하는 여지를 제공하는 것을 발견하였다. 항생제의 사용 및 용량이 종종 이들의 부작용 프로파일에 의해 제한되는 것을 감암할 때, 이는 또한 사용이 달리 제한되는 강력한 항생제의 잠재적 사용을 증가시킨다.
항생제의 LMS-611 강화는 다원적일 수 있다. 박테리아가 부유성 상태를 채택하거나 부유성 상태로 남아있도록 하는 것에 더하여, LMS-611이 박테리아 벽의 침투성을 변경시켜 잠재적으로 이들을 항생제 및 면역 반응에 더욱 민감하게 만들 수 있는 것으로 생각된다(도 14 참조).
실시예 6
슈도모나스 에어루지노사 균주 PA01, PA14, 2개의 임상 낭성섬유증(CF) 균주 H183, YH1 및 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia) 균주 K56-2, YHBCC5, YHBCC6, YHBCC7 및 YHBCC8을 락킹 플랫폼(rocking platform)에서 48시간 동안 Nunc Immunosorp PEG 플레이트 모델에서 성장시켰다. 균막을 PA 균주에 대해 항생제, 피페라실린, 아즈트레오남, 메로페넴, 겐타마이신, 토브라마이신, 에리트로마이신 및 시프로플록사신 및 BCC 균주에 대해 피페라실린, 겐타마이신, 에리트로마이신 및 시프로플록사신과 조합된 LMS-611(9.8 ㎎/㎖)을 이용하여 바둑판식 어레이로 시험하였다. 피페라실린 및 겐타마이신을 이용한 공격 전의 다양한 시점(5분, 1시간, 8시간 및 24시간)에서 LMS-611로 균막을 예비 처리하는 효과를 또한 연구하였다. 시험된 균막을 평가하기 위해 주사 전자 현미경을 이용하였다.
호흡기 감염의 치료에서 사용되는 다양한 항생제와 함께 PA 균주에 대해 사용되는 경우, LMS-611(9.8 ㎎/㎏)은 피페라실린(4-16배), 겐타마이신(4-8배) 및 시프로플록사신(1-16배)의 정착성 MIC를 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 아즈트레오남(2-4배), 메로페넴(1-2배) 및 토브라마이신(1-4배)으로 상승작용이 또한 입증되었다.
호흡기 감염의 치료에서 사용되는 다양한 항생제와 함께 BCC 균주를 사용하여 시험하는 경우, LMS-611(9.8 ㎎/㎏)은 피페라실린(4-8배), 겐타마이신(4-8배) 및 시프로플록사신(2-4배)의 정착성 MIC를 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 에리트로마이신으로는 효과가 관찰되지 않았다(표 1 및 표 2).
Figure pct00001
표 1: MBEC 검정을 이용하여 슈도모나스 에어루지노사의 4개의 균주에 대한 LMS-611(10 ㎎/㎖)의 부재 및 존재하에서의 다양한 항생제의 정착성 최소 억제 농도(MIC ㎎/㎖)
Figure pct00002
표 2: MBEC 검정을 이용하여 부르크홀데리아 세노세파시아의 4개의 균주에 대한 LMS-611(10 ㎎/㎖)의 부재 및 존재하에서의 다양한 항생제의 정착성 최소 억제 농도(MIC ㎎/㎖)
PA 및 BCC 대조군 균주 및 LMS-611 처리 PA 및 BCC 균주 둘 모두에 대한 주사 전자 현미경사진의 비교는 박테리아 균막이 LMS-611을 이용한 처리 후에 거의 없고 분산되어 있는 것을 나타내었다.
실시예 7
비내 투여되는 LMS-611 및 정맥내 타조신이 제공된 슈도모나스 마우스 모델(용량 당 2 ㎎의 피페라실린 및 0.5 타조박탐을 함유하는 약물로서, 여기서 타조박탐은 피페라실린에 대한 내성을 예방하는 베타-락탐 억제제임)에서, 비인두 조직으로부터 성장한 콜로니뿐만 아니라 감염 72시간 후에 분리된 폐 조직은 슈도모나스의 콜로니 수에서 급격한 감소를 나타내었다. 폐 조직에 대한 결과는 두가지 이유로 특히 놀랍다. 첫째로, 타조신과 조합된 LMS-611은 이러한 생체내 모델에서 완전한 박테리아 사멸을 발생시켰다. 둘째로, LMS-611 및 타조신이 상이한 경로, 즉, 비내 및 IV로 각각 적용되더라도 타조신의 강화가 달성되었다. 이러한 두번째 발견은 박테리아를 항생제 및 면역 방어 시스템의 효과에 대해 개방시키는 LMS-611의 부유성유발/정족수 감지 신호전달 중단 운용 방식을 입증한다(예를 들어, 도 7b 참조).
실시예 8
C57BL/6 마우스에서 각막 감염 모델에서 슈도모나스 에어루지노사 균주 ATCC 15692(PA01)에 대해 LMS-611 및 시프로플록사신의 항미생물 활성을 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 좌측 각막을 희생시키고, 1.79 x 106 CFU/마우스의 접종물 크기로 P. 에어루지노사 균주 ATCC 15692(PA01)의 현탁액을 접종시켰다. 시험 물질의 국소 처리를 적용 당 5 ㎕로 감염 5시간 및 10시간 후에 적용시켰다.
시험 물질은 0.001% 단독(단일요법)으로 투여되는 시프로플록사신 및 LMS-611(10 ㎎/㎖)과 조합하여 투여되는 시프로플록사신 및 LMS-611 투여 단독(10 ㎎/㎖)이었다.
동물을 접종 후 7.5시간, 11시간, 13시간, 15시간 및 17시간 후에 안락사시키고, 좌측 안구를 촬영하고, 절제하였다. 박테리아 수를 안구 조직 그램 당 콜로니 형성 단위(CFU)로서 측정하였다.
0.001%의 시프로플록사신 단일요법의 투여는 비히클 처리 그룹에 비해 감염 7.5시간, 11시간, 13시간, 15시간 및 17시간 후에 박테리아 수에서 유의한 감소를 발생시켰다(도 15).
LMS-611(10 ㎎/㎖)과 시프로플록사신의 조합은 또한 비히클 대조군에 비해 감염 후 7.5시간, 11시간, 13시간, 15시간 및 17시간 후에 박테리아 수의 감소에 있어서 유의하게 효과적이었으나, 조합은 모든 시점에서 시프로플록사신 단일요법 그룹에 비해 유의한 효과를 야기시키지 않았다.
10 ㎎/㎖의 LMS-611 단독을 이용한 처리는 모든 시점에서 비히클 대조군에 비해 박테리아 수 감소에 있어서 어떠한 유의한 효과와 관련되지 않았다.
실시예 9
C57BL/6 마우스의 각막 감염 모델에서 슈도모나스 에어루지노사 균주 ATCC 15692(PA01)에 대해 시프로플록사신 및 LMS-611의 항미생물 활성을 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 좌측 각막을 희생시키고, 1.74 x 106/마우스의 접종물 크기로 P. 에어루지노사 세포 균주 ATCC 15692(PA01)의 현탁액으로 접종시켰다. 시험 품목의 국소 처리를 적용 당 5 ㎕로 감염 5시간 및 10시간 후에 적용시켰다. 시프로플록사신을 단독으로(단일요법) 그리고 LMS-611(10 ㎎/㎖)와 함께 0.001%로 시험하였다. 단독으로 시험하는 경우의 LMS-611을 10 및 20 ㎎/㎖로 투여하였다. 동물을 접종 2시간, 5시간, 12시간, 18시간, 26시간 또는 36시간 후에 안락사시키고, 좌측 안구를 절제하였다. 박테리아 수를 안구 조직 그램 당 콜로니 형성 단위(CFU)로 측정하였다.
박테리아 수를 감소시키는데 있어서 0.001%의 시프로플록사신의 효능은 시간-의존적이었다. 시프로플록사신 단일요법은 비히클 처리 그룹에 비해 감염 18시간, 26시간 및 36시간 후에 박테리아 수에서 유의한 감소를 발생시켰다. 그러나, 시프로플록사신 단일요법은 감염 12시간 후에 측정하는 경우 박테리아 수에서 유의한 감소를 발생시키지 않았다(도 16).
시프로플록사신과 LMS-611(10 ㎎/㎖)의 조합 처리는 감염 12시간 후에 박테리아 수에서 유의한 감소를 발생시켰다. 이러한 유의한 효과는 비히클 및 시프로플록사신 단독 처리 그룹에 비해 인지되었다. LMS-611(10 ㎎/㎖)과 시프로플록사신의 조합이 또한 비히클 대조군에 비해 감염 18시간, 26시간 및 36시간 후에 수의 감소에 있어서 유의하게 효과적이었으나, 조합은 이들 이후 시점에서 시프로플록사신 단일요법에 비해 유의한 효과를 발생시키지 않았다.
10 ㎎/㎖의 LMS-611 단독을 이용한 처리는 시험된 모든 시점에서 비히클 대조군에 비해 박테리아 수를 감소시키는데 있어서 유의한 효과와 관련되지 않았다. 20 ㎎/㎖ 용량은 18시간 시점에서 박테리아 수를 감소시키는데 있어서 박테리아 수를 감소시키는 것에 대해 일시적이긴 했으나 유의한 효과를 가졌다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 구현예의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구현예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 상기 특정 구현예로 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 또한, 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하는 기재된 방식의 다양한 변형이 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (24)

  1. 층판소체(lamellar body)를 미생물에 적용시키는 단계를 포함하는 균막을 형성할 수 있는 미생물(microbe/microorganism)의 미생물 정족수 감지(quorum sensing)를 붕괴시키는 방법.
  2. 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물.
  3. 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체 및 적어도 제1 비-층판소체 항미생물 활성제를 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체 및 적어도 제1 비-층판소체 항미생물 활성제를 포함하는 조성물로서, 항미생물제가 항생제인, 조성물.
  5. 박테리아 감염의 치료를 위한 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물.
  6. 슈도모나스(Pseudomonas), 부르크홀데리아(Burkholderia) 및 스태필로코커스(Staphylococcus) 종으로부터 선택된 박테리아 감염의 치료를 위한 제5항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물로서, 감염이 폐 또는 안구의 감염인, 조성물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물로서, 제1 비-층판소체 항미생물 활성제가 층판소체의 경로와 상이한 경로에 의해 미생물 감염 부위에 제공되는, 조성물.
  9. 폐 또는 기도의 미생물 감염의 치료를 위한 제8항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물로서, 제1 비-층판소체 항미생물 활성제가 정맥내 제공되고, 층판소체가 비내 제공되는, 조성물.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 미생물 감염의 치료에서 사용하기 위한 치료적 유효량의 층판소체를 포함하는 조성물로서, 적어도 제1 항미생물 활성제 및 층판소체가 별개로, 순차적으로 또는 동시에 조합하여 제공되는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 미생물 집단의 세포 밀도를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    - 균막을 형성할 수 있는 미생물의 배양 배지에 층판소체를 도입함으로써 층판소체를 적용하는 단계,
    - 층판소체를 포함하는 배양 배지에서 미생물을 성장시키는 단계로서, 층판소체를 포함하는 배지에서 성장하는 경우 미생물이 층판소체를 포함하지 않고 동일한 배양 조건하에서 배양되는 달리 동일한 미생물의 배양 배지의 세포 밀도보다 큰 세포 밀도로 성장하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 미생물 집단의 부피 생산성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    a) 균막을 형성할 수 있는 미생물의 배양 배지에 층판소체를 도입함으로써 층판소체를 적용하는 단계, 및
    b) 미생물을 성장시키는 단계를 포함하며,
    미생물의 부피 생산성이 미생물에 의해 생성되는 발효 생성물과 관련하여 층판소체의 부재하에서의 미생물의 발효 생성물의 부피 생산성보다 층판소체의 존재하에서 더 큰, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 발효 생성물을 제공하는 방법으로서, 상기 방법이,
    a) 발효 생성물을 생성할 수 있는 유전학적으로 변형된 미생물을 제공하는 단계,
    b) 층판소체가 적용된 배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계로서, 유전학적으로 변형된 미생물이 층판소체를 포함하지 않는 배양 배지에서 생성되는 경우의 동일 발효 생성물에 대한 부피 생산성보다 발효 생성물에 대해 더 높은 부피 생산성을 달성하는 능력을 갖는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 미생물 정족수 감지 및 미생물 균막 형성을 붕괴시키기 위한 미생물의 별개적, 순차적 또는 동시 치료를 위한 층판소체 및 항미생물 활성제를 포함하는 부품 키트(kit of parts).
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 층판소체가 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨 및 콜레스테롤을 포함하는 방법 또는 조성물 또는 키트.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 층판소체가 중량을 기준으로 44-70% 범위 내의 포스파티딜콜린, 15-23% 범위 내의 스핑고미엘린, 6-10% 범위 내의 포스파티딜 에탄올아민, 2-6% 범위 내의 포스파티딜 세린, 2-4% 범위 내의 포스파티딜 이노시톨 및 4-12% 범위 내의 콜레스테롤을 포함하는 방법 또는 조성물 또는 키트.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 층판소체가 중량을 기준으로 약 55%의 포스파티딜콜린, 약 19%의 스핑고미엘린, 약 8%의 포스파티딜 에탄올아민, 약 4%의 포스파티딜 세린, 약 3%의 포스파티딜 이노시톨 및 약 10%의 콜레스테롤을 포함하는 방법 또는 조성물 또는 키트.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 균막이 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 및 원생동물을 포함하는 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 형성되는 방법 또는 조성물 또는 키트.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 균막이 박테리아에 의해 형성되는 방법 또는 조성물 또는 키트.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 그람 음성 박테리아인 방법 또는 조성물 또는 키트.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 감염이 임플란트-관련 및/또는 카테터-관련 및/또는 내재 의료 장치-관련 감염인 방법 또는 조성물 또는 키트.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 층판소체와 함께 사용되는 항미생물 활성제가 피페라실린(piperacillin), 아즈트레오남(aztreonam), 메로페넴(meropenem), 겐타마이신(gentamicin), 토브라마이신(tobramycin), 에리트로마이신(erythromycin), 타조신(tazocin) 및 시프로플록사신(ciprofloxacin), 세프타지딤(ceftazidime) 또는 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 항생제인 방법 또는 조성물 또는 키트.
  23. 숙주의 미생물 감염 부위에 층판소체를 제공하는 단계를 포함하는 숙주 대상체에서 균막 생성과 관련된 미생물 감염을 치료하는 방법으로서, 층판소체가 정족수 감지 길항제로 작용하는, 방법.
  24. 질환이 미생물의 정족수 신호전달/감지 분자에 의해 야기되는 경우 숙주의 질환 또는 과정을 치료하거나, 예방하거나, 늦추는 방법으로서, 미생물 부위에 층판소체를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
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