CN111904998B - 一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂及其制备方法 - Google Patents
一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂及其制备方法,它涉及口腔喷膜剂及其制备方法。本发明要解决现有普通口腔喷膜剂无法靶向抑制和杀灭病毒和细菌,作用时间短,无法长期有效隔离病毒生存环境及抑制病毒复制效率低的问题。口腔喷膜剂由丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温‑80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水组成;方法:先称取,固体粉碎,最后ABCD分步分相定溶,分装。
Description
技术领域
本发明涉及口腔喷膜剂及其制备方法。
背景技术
病毒是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成,不具细胞结构,但有遗传、复制等生命特征的微生物。病毒的特点是:①体积微小,直径在20~200nm,需借助电子显微镜观察,能通过滤菌器;②结构简单,为非细胞型微生物,病毒没有细胞壁、细胞膜,甚至没有细胞核,只是在遗传物质RNA或者DNA外面裹上一层蛋白衣壳,衣壳的功能:a具有抗原性,b保护核酸,c介导病毒与宿主细胞结合;③严格的细胞内寄生,自身是无法进行复制,病毒大部分的时候都在蛰伏状态,一旦遇到细胞,就会利用蛋白酶溶解细胞壁或者细胞膜,直接进入细胞;④病毒以自身核酸为模板进行复制繁殖,在遇到宿主细胞后,经过吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,完成对宿主细胞的侵染和大量繁殖。病毒种类繁多,国际病毒分类委员会(ICTV)将所有已知的病毒根据核酸类型分为DNA病毒、RNA病毒、DNA与RNA反转录病毒几大类。病毒在自然界分布广泛,可感染细菌、真菌、植物、动物和人,常引起宿主发病。
国家卫生健康委决定将新型冠状病毒感染的肺炎纳入法定传染病乙类管理,采取甲类传染病的预防、控制措施。2020年1月30日,世界卫生组织发布新型冠状病毒感染肺炎疫情为国际关注的突发公共卫生事件。SARS-CoV-2为一种属于β属的新型冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60~140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85%以上,基于目前的流行病学调查,潜伏期一般为3~7d,最长不超过14d。新冠病毒在潜伏期具有传染性,感染可引起的急性肺炎,临床表现(1)发热和/或呼吸道症状;(2)具有上述肺炎影像学特征;(3)发病早期白细胞总数正常或降低,或淋巴细胞计数减少。人群普遍易感,老年人、免疫能力低下及有基础疾病者感染后病情较重,少数患者病情危重。死亡病例多见于老年人和有慢性基础疾病者。
控制新型冠状病毒除了严格的封闭、隔离、防护并无特效药物可用,新冠病毒抗体疫苗要用在临床还需要很长的路要走,已经成为损害人类生命和经济的世界性难题,根据专家推测此次新冠病毒肺炎疫情预计将持续1-2年,屏蔽和隔离新冠病毒进入人体是做好有效防护持久战的第一关,而口腔是病毒进入人体的第一门户,资料显示流感病毒在人群中是通过咳嗽或者打喷嚏来传播的。这些咳嗽和打喷嚏一次可以喷出10万个唾液飞沫,每一个液滴大概含有一千个病毒,即打一个喷嚏,可以喷出10000万个病毒,而这些液滴以每小时160公里的速度在空气中超速前进,可以前进40米。喷嚏中的一滴液珠就携带有数千个入侵者,它们穿过人体的薄弱点和常规进食、呼吸的功能腔道鼻腔及口腔,这些外来的入侵者是极其狡猾的致命机器。比如腺病毒,是可以感染人类的20科病毒之一,可以引起各种各样的疾病,从一般感冒到肺炎。这也就是为什么,在众多防范措施中,特别重要的一条就是“戴口罩”的物理隔离和屏障作用,如有咳嗽、喷嚏时,注意用纸巾、衣物遮挡口鼻以减少病菌传播。
病毒的增殖,首先识别与吸附在宿主细胞表面特定位置,不同的病毒可能识别相同或者特殊的细胞表面蛋白,从而形成对特定细胞有选择的侵害。研究发现,SARS-CoV-2病毒是通过其刺突蛋白与人体细胞上的血管紧张素转换酶2(ACE2)的受体结合。而TMPRSS2酶有助于激活新冠病毒的刺突蛋白,从而帮助病毒进入宿主细胞,人类远低于10%的呼吸道细胞和肠道细胞同时产生ACE2和TMPRSS2,而这些细胞分为三种类型:鼻腔中分泌粘液的杯状细胞(goblet secretory cells)、肺部的Ⅱ型肺泡细胞(type II pneumocytes)和吸收性肠上皮细胞。因此SARS-CoV-2专门攻击薄弱的粘膜细胞和呼吸系统细胞,因此防止致命病毒侵害的第一步就是保护口粘膜,隔绝病毒侵入。
而现有普通口腔喷膜剂无法靶向抑制和杀灭病毒和细菌,作用时间短(5min~10min),无法长期有效隔离病毒生存环境及抑制病毒复制效率低。
发明内容
本发明要解决现有普通口腔喷膜剂无法靶向抑制和杀灭病毒和细菌,作用时间短,无法长期有效隔离病毒生存环境及抑制病毒复制效率低的问题,而提供一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂及其制备方法。
一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂由丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水组成。
一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂的制备方法,它是按以下步骤进行的:
一、称取丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水,然后将纯化水分为第一份纯化水及第二份纯化水;
二、将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛;
三、将丁香油、粉碎后的薄荷脑、粉碎后的冰片、甘油及乙醇混合并溶解,然后加入土温-80,得到溶液A;
四、将粉碎后的聚乙烯吡咯烷酮K30及粉碎后的羟甲基纤维素钠加入到第一份纯化水中溶解,得到溶液B;
五、利用高速磁力分子剪切,将溶液A和溶液B混合均匀,得到溶液C;
六、将粉碎后的乙二胺四乙酸二钠加入到溶液C中,在磁力搅拌下混合,得到溶液D;
七、将粉碎后的苯扎氯铵均匀分散于溶液D中,然后加入第二份纯化水在磁力搅拌下混合,分装,即得到一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂。
机理:该新型给药喷膜剂是一种结合膜剂及喷雾剂的优点,制成一种喷雾、喷洒在皮肤黏膜处,由于处方中聚乙烯吡咯烷酮K30成膜剂的作用机理可在口粘膜表面形成一层可溶性防护膜(2h可溶),隔离和防护粘膜细胞不受病毒和细菌攻击、黏住病毒使其无法复制;由于处方中缓释成膜剂羟甲基纤维素钠的缓释作用可延长药物在黏膜的停留时间,缓解释放、提高药效,通过物理和生物双重抗菌机制有效破坏了病毒和细菌的生存环境,起到抗炎、抑菌、隔离、杀灭病毒原微生物(包括细菌和病毒等)的作用,其形成的生物分子膜既是一种药物载体,宜可通过成膜发挥其保护、屏障作用,可减少水分蒸发,促进皮肤水合作用等功效,具有定量输出、顺应性好、提高药物生物利用度;由于靶向剂EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)在处方中的科学调剂,实现靶向和缓释给药相结合的工艺处方和成分机理双重优势。使其区别于普通传统喷膜剂的1)广谱隔离,但无法靶向针对某种病毒进行隔离、抑制和杀灭作用;2)作用时间短,无法长期有效隔离病毒生存环境;3)抑制病毒成分复杂,抑制效率不高,只有高浓度才能对人有作用效果,但那样就需要使用次数多,人体可能出现的积累性副作用也会增加。
本发明的有益效果是:
1、靶向技术引入:成分中含有靶向ACE2抑制剂,靶向抑制ACE2阳性细胞与病毒S蛋白结合,防止新冠病毒、SARS、MERS等致命性病毒直接与粘膜细胞表面的ACE2受体结合,病毒对细胞的侵染细胞能力显著下降,口腔喷膜剂与病毒相互作用后,慢病毒病毒滴度(TU/mL)仅为9.8×1010;
2、缓释技术应用:含有缓释剂羟甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮K30、丁香油等组成的长效成膜剂,保湿的同时,进一步破坏病毒和细菌生存环境、隔绝病菌的侵害粘膜细胞,释放度可达90%~95%,作用时间长,对新冠病毒的抑制作用可达到5h以上;
3、成膜保护和透气并存:成膜均匀致密,膜中无可见物质分布不均状态,既保证杀病毒和细菌药物进入口腔粘膜,渗透入口内细胞,又可隔绝外界微生物侵害,且喷成膜剂组和未喷成膜剂组氧气透过量无明显差异;
4、多组分协同作用:具有丰富的抗病毒、抑菌、通窍药物和草本精华(冰片、薄荷脑、丁香油)协同作用杀灭病毒和细菌,抑制病毒复制效率高。
5、本发明制备工艺的特点:以创新为基点突破传统工艺、处方中加入靶向剂乙二胺四乙酸二钠和缓释剂羟甲基纤维素钠即达到本发明制备工艺集成靶向和缓释等多项制剂前沿技术、采用所有固体组分溶前进行粉碎后微粉溶解、按照ABCD分步分相定溶、高速磁力分子剪切和高效混合等多项国际先进的制剂技术来复合和助力本产品的工艺制备。
本发明用于一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂及其制备方法。
附图说明
图1为实施例一制备的口腔喷膜剂放大50倍的成膜图;
图2为纯化水放大50倍的对照图;
图3为实施例一制备的口腔喷膜剂微生物培养结果图片;
图4为金黄色葡萄球培养结果图片;
图5为实施例一制备的口腔喷膜剂加入金黄色葡萄球后培养结果图片;
图6为不含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,白光下放大100倍的细胞状态图;
图7为不含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,荧光下放大100倍的细胞状态图;
图8为含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,白光下放大100倍的细胞状态图;
图9为含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,荧光下放大100倍的细胞状态图;
图10为实施例一制备的口腔喷膜剂的缓释度曲线图;
图11为病毒滴度对比图,A为原病毒滴度,B为实施例一制备的口腔喷膜剂消杀后病毒滴度;
图12为未侵染病毒的BEAS2B细胞放大40倍的状态图;
图13为生理盐水喷雾处理后的侵染病毒2h BEAS2B细胞放大400倍的状态图;
图14为生理盐水喷雾处理后的侵染病毒5h BEAS2B细胞放大400倍的状态图;
图15为实施例一制备的口腔喷膜剂消杀后侵染病毒2h BEAS2B细胞放大40的状态图;
图16为实施例一制备的口腔喷膜剂消杀后侵染病毒5h BEAS2B细胞放大40的状态图;
图17为透气性效果对比图,A为喷实施例一制备的口腔喷膜剂,B为未喷成膜剂。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂由丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水组成。
羟甲基纤维素钠具有增稠能力,排盐性、PH稳定性、保水性、尺寸稳定性、优良的成膜性以及广泛的耐酶性、分散性和粘结性等特点。医药行业主要用途:包衣材料、膜材、缓释制剂的控速聚合物材料、稳定剂、助悬剂、片剂黏合剂及增黏剂。
本实施方式的有益效果是:
1、靶向技术引入:成分中含有靶向ACE2抑制剂,靶向抑制ACE2阳性细胞与病毒S蛋白结合,防止新冠病毒、SARS、MERS等致命性病毒直接与粘膜细胞表面的ACE2受体结合,病毒对细胞的侵染细胞能力显著下降,口腔喷膜剂与病毒相互作用后,慢病毒病毒滴度(TU/mL)仅为9.8×1010;
2、缓释技术应用:含有缓释剂羟甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮K30、丁香油等组成的长效成膜剂,保湿的同时,进一步破坏病毒和细菌生存环境、隔绝病菌的侵害粘膜细胞,释放度可达90%~95%,作用时间长,对新冠病毒的抑制作用可达到5h以上;
3、成膜保护和透气并存:成膜均匀致密,膜中无可见物质分布不均状态,既保证杀病毒和细菌药物进入口腔粘膜,渗透入口内细胞,又可隔绝外界微生物侵害,且喷成膜剂组和未喷成膜剂组氧气透过量无明显差异;
4、多组分协同作用:具有丰富的抗病毒、抑菌、通窍药物和草本精华(冰片、薄荷脑、丁香油)协同作用杀灭病毒和细菌,抑制病毒复制效率高。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:每1000mL具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂中由8g~12g丁香油、0.08g~0.12g苯扎氯铵、20g~40g聚乙烯吡咯烷酮K30、3g~7g羟甲基纤维素钠、10g~20g土温-80、20g~40g甘油、0.5g~1.5g冰片、1g~2g薄荷脑、10mg~20mg乙二胺四乙酸二钠、10mL~15mL乙醇及余量纯化水组成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是:每1000mL具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂中由10g丁香油、0.1g苯扎氯铵、30g聚乙烯吡咯烷酮K30、5g羟甲基纤维素钠、15g土温-80、30g甘油、1g冰片、1.5g薄荷脑、10mg乙二胺四乙酸二钠、10mL乙醇及余量纯化水组成。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:所述的乙醇的质量百分数为95%。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五:本实施方式一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂的制备方法,它是按以下步骤进行的:
一、称取丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水,然后将纯化水分为第一份纯化水及第二份纯化水;
二、将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛;
三、将丁香油、粉碎后的薄荷脑、粉碎后的冰片、甘油及乙醇混合并溶解,然后加入土温-80,得到溶液A;
四、将粉碎后的聚乙烯吡咯烷酮K30及粉碎后的羟甲基纤维素钠加入到第一份纯化水中溶解,得到溶液B;
五、利用高速磁力分子剪切,将溶液A和溶液B混合均匀,得到溶液C;
六、将粉碎后的乙二胺四乙酸二钠加入到溶液C中,在磁力搅拌下混合,得到溶液D;
七、将粉碎后的苯扎氯铵均匀分散于溶液D中,然后加入第二份纯化水在磁力搅拌下混合,分装,即得到一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂。
本实施方式的有益效果是:本实施方式制备工艺的特点:以创新为基点突破传统工艺、处方中加入靶向剂乙二胺四乙酸二钠和缓释剂羟甲基纤维素钠即达到本实施方式制备工艺集成靶向和缓释等多项制剂前沿技术、采用所有固体组分溶前进行粉碎后微粉溶解、按照ABCD分步分相定溶、高速磁力分子剪切和高效混合等多项国际先进的制剂技术来复合和助力本产品的工艺制备。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一或不同的是:步骤一中所述的乙醇的质量百分数为95%。其它与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是:步骤一中所述的第一份纯化水与第二份纯化水的体积比为1:(1~3)。其它与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:步骤二中将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛得到粉体粒径为450目~550目。其它与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是:步骤五中利用高速磁力分子剪切,在转速为8000r/min~10000r/min的条件下,将溶液A和溶液B混合均匀25min~35min,得到溶液C。其它与具体实施方式一至八相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是:步骤六中所述的磁力搅拌的转速为8000r/min~10000r/min;步骤七中所述的磁力搅拌的转速为8000r/min~10000r/min。其它与具体实施方式一至九相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果:
实施例一:
一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂,具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂由丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水组成,所述的乙醇的质量百分数为95%;具体如下表1:
表1
制备方法:
一、称取10g丁香油、0.1g苯扎氯铵、30g聚乙烯吡咯烷酮K30、5g羟丙甲纤维素钠、15g土温-80、30g甘油、1g冰片、1.5g薄荷脑、10mg乙二胺四乙酸二钠、10mL质量百分数为95%的乙醇及余量纯化水,然后将纯化水分为第一份纯化水及第二份纯化水;
所述的第一份纯化水与第二份纯化水的体积比为1:2;
二、将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛;
三、将丁香油、粉碎后的薄荷脑、粉碎后的冰片、甘油及乙醇混合并溶解,然后加入土温-80,得到溶液A;
四、将粉碎后的聚乙烯吡咯烷酮K30及粉碎后的羟甲基纤维素钠加入到第一份纯化水中溶解,得到溶液B;
五、利用高速磁力分子剪切,将溶液A和溶液B混合均匀,得到溶液C;
六、将粉碎后的乙二胺四乙酸二钠加入到溶液C中,在磁力搅拌下混合,得到溶液D;
七、将粉碎后的苯扎氯铵均匀分散于溶液D中,然后加入第二份纯化水在磁力搅拌下混合,分装,即得到一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂。
步骤二中将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛得到粉体粒径为500目;
步骤五中利用高速磁力分子剪切,在转速为9000r/min的条件下,将溶液A和溶液B混合均匀30min,得到溶液C;
步骤六中所述的磁力搅拌的转速为9000r/min;步骤七中所述的磁力搅拌的转速为9000r/min。
(1)成膜效果验证:
将实施例一制备的口腔喷膜剂和纯化水分别喷涂适量在两个25.4mm×76.2mm载玻片上,置于30℃细菌培养箱中使其烘干,然后将载玻片置于Leica正置显微镜下,物镜选择5倍,目镜选择10倍,调整光圈和焦距,并对表面形态结构进行拍照分析。
图1为实施例一制备的口腔喷膜剂放大50倍的成膜图;图2为纯化水放大50倍的对照图;结果可见,本实施例口腔喷膜剂边缘整齐,成膜均匀致密,膜中无可见物质分布不均的状态。
(2)口腔喷膜剂稳定性试验:
将实施例一制备的口腔喷膜剂分别放置在4℃、20℃(对照)、37℃及40℃环境中24小时,然后在对应温度下进行离心加速试验10min,试验后,分析样本分层情况、沉淀物,采用色谱定量分析口腔喷膜剂中关键成分苯扎氯铵情况,详见表2。
表2
由表可知,本实施例制备的口腔喷膜剂在不同温度及离心下均无沉淀及分层,且苯扎氯铵含量分布均匀,组成稳定。
(3)抑菌效果试验:
微生物实验对比方法:
1、供试品:分别取本实施例制备的口腔喷膜剂0.5mL置直径90mm的无菌平皿中,平行制备2个平皿,分别加入温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基,置33℃培养箱中,培养3天。
2、阳性:取金黄色葡萄球1mL(含菌量小于100cfu),置直径90mm的无菌平皿中,平行制备2个平皿,分别加入温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基,置33℃培养箱中,培养3天。
3、供试品对照组:取本实施例制备的口腔喷膜剂0.5mL及金黄色葡萄球1mL置直径90mm的无菌平皿中混匀,平行制备2个平皿,分别加入温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基,置33℃培养箱中,培养3天。
图3为实施例一制备的口腔喷膜剂微生物培养结果图片;图4为金黄色葡萄球培养结果图片;图5为实施例一制备的口腔喷膜剂加入金黄色葡萄球后培养结果图片;由图可知,口腔喷膜剂可抑制菌的生长。
(4)喷膜剂显著抑制病毒对细胞的侵染:
接种细胞:选择生长状态良好的293T细胞,计数,按照1×105/mL的密度,接种在6cm培养皿中。以正常培养基为对照组,以培养基中加入10%喷膜剂为实验组;
细胞侵染:取10uL含有EGFP荧光标记的慢病毒空载体原液加入两组培养基中,于37℃培养1天。荧光显微镜下观察细胞被侵染情况。
图6为不含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,白光下放大100倍的细胞状态图;图7为不含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,荧光下放大100倍的细胞状态图;图8为含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,白光下放大100倍的细胞状态图;图9为含实施例一制备的口腔喷膜剂的培养体系中293T细胞被侵染后,荧光下放大100倍的细胞状态图;
由图可知,经过本实施例喷膜剂处理,病毒对细胞的侵染细胞能力显著下降。
(5)释放度测定:
随机抽取3批口腔喷膜剂,分别放置10min、30min、60min、90min及120min,以蒸馏水为供试品溶液。用紫外-可见分光光度计,在256nm波长处分别测定吸收度。分别计算不同时间的缓释度。
图10为实施例一制备的口腔喷膜剂的缓释度曲线图;由图可知,有效成分可缓慢释放到溶质中,释放度可达90%~95%。
(6)口腔粘膜保护试验:
选用直线加速器6MV-X线对动物口腔进行照射,建立口腔粘膜损伤模型。将大鼠分为3组,空白组(不做任何处理)、模型组(口腔粘膜损伤)、喷雾组(实施例一口腔喷雾后进行口腔粘膜损伤)。24h后观察动物口腔情况,处死动物,采集血液,口腔腔组织。
试验结果
①动物观察:模型组动物照射后口腔粘膜出现充血、分泌物增多的情况,食欲不振,不善动。空白组和喷雾组动物无异常。
②生理指标变化,如表3所示:
表3
空白组 | 模型组 | 喷雾组 | |
口腔粘膜Ⅲ级病变率(%) | 0.00±0.00 | 98.12±4.67 | 25.63±3.69 |
粘膜SOD变化(NU/mL) | 582.93±20.13 | 209.14±17.69 | 536.47±18.68 |
粘膜MDA变化(nmol/mgprot) | 2.43±0.08 | 6.12±0.05 | 3.17±0.09 |
由表可知,喷雾后可有效保护口腔面膜不受损伤。
(7)将喷膜剂隔离后,病毒滴度明显下降:
接种细胞:选择生长状态良好的293T细胞,计数,按照1×105/mL的密度,接种在6cm培养皿中。放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
喷膜剂准备:在24孔板中,分别在三个孔中喷入实施例一制备的口腔喷膜剂、三个孔中喷入生理盐水,在37℃培养箱中使其干燥,成膜。每个孔中加入慢病毒悬液0.5mL,使其在孔板中作用24小时后,分别收集病毒悬液。
病毒悬液稀释液准备:将上述收集的病毒悬液在EP管中用293T细胞完全培养基做10倍梯度稀释,连续10个稀释度,稀释方法如下:每种病毒准备10个1.5mL EP管,每管加入90μL培养液,往第一个管中加入10μL病毒原液,混匀后,吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推,即为10-1~10-10。
细胞侵染:将稀释好的各组病毒稀释液更换到培养好的293T细胞上,每个滴度3个平行,侵染2h后,用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液,加入4mL琼脂糖覆盖物,让琼脂糖于室温固化10min~20min。用Parafilm膜封住毎个平板(以防干涸),于37℃培养5天。
病毒滴度计算:准备台盼蓝覆盖物,倾覆1mL至培养了4天、蚀斑形成较好的培养皿中。于37℃过夜温育培养皿,让染料扩散进入死细胞。计数蓝色蚀斑的数目并确定病毒滴度。
滴度计算公式为滴度(TU/mL)=(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μL)。其中X孔为可记出蚀斑数的孔的蚀斑数量,Y孔为X孔的十倍稀释倍数孔的蚀斑数量。
生理盐水对照处理后滴度检测:
表4
平行1孔 | 平行2孔 | 平行3孔 | 平均值 | |
X孔(10<sup>-7</sup>) | 115 | 157 | 126 | 133 |
Y孔(10<sup>-8</sup>) | 22 | 31 | 29 | 27 |
根据以上公式计算;病毒滴度(TU/mL)为2.03×1012。
成膜剂作用后滴度检测:
表5
平行1孔 | 平行2孔 | 平行3孔 | 平均值 | |
X孔(10<sup>-6</sup>) | 72 | 68 | 88 | 76 |
Y孔(10<sup>-7</sup>) | 12 | 9 | 15 | 12 |
根据以上公式计算;病毒滴度(TU/mL)为9.8×1010。
图11为病毒滴度对比图,A为原病毒滴度,B为实施例一制备的口腔喷膜剂消杀后病毒滴度,由图可知,经口腔喷膜剂与病毒相互作用后,病毒被喷膜剂抑制,进而杀灭,病毒数量明显下降。
(8)抗新冠病毒效果验证:
病毒包装:
1)试剂/质粒
试剂:lip2000转染试剂盒,opti-MEM培养基
质粒:a)pCDH-CMV-3F-HnCoV-S-EF1-copGFP(含新冠病毒S蛋白)质粒(购买自上海海吉浩格生物科技有限公司);b)pMD2.G质粒;c)psPAX2质粒
2)病毒包装:
a)细胞准备:293T细胞50%密度时,更换无抗培养基培养24h;转染前更换opti-MEM培养基。
b)转染样品准备:在50ulopti-MEM培养基中加入3种质粒,轻轻混匀。使用前轻轻混匀lip2000,然后加入到opti-MEM培养基中,再轻轻混匀,室温静止5min。将两种稀释液1:1混合,轻轻混匀,室温静止20min。
c)将混合液环状滴入细胞中,混匀,培养6h后更换为正常培养基。
d)每24h收集一次培养基上清液,收集3次,4℃暂存。收集完成后,用超滤管浓缩病毒,检测病毒滴度,-80℃长期保存。
3)病毒包装用量
表6
接种细胞:选择生长状态良好的人ACE2阳性的肺上皮BEAS2B,计数,按照1×105/mL的密度,接种在6cm培养皿中。
病毒稀释:根据滴度检测,选择适合的稀释浓度(选择10-7)。
喷膜剂喷雾消杀:向含有新冠病毒的培养皿底部喷对照生理盐水或本实施例制备的口腔喷膜剂,静止60min,分别收集皿底病毒。
消杀效果验证:分为3组,1)空白组(BEAS2B细胞未经任何处理);2)病毒侵染对照组(BEAS2B中添加经生理盐水喷雾处理后的病毒收集液);3)消杀病毒侵染对照组(BEAS2B中添加经实施例制备的口腔喷膜剂喷雾处理后的病毒收集液),分别在侵染2h及5h观察细胞状态。
图12为未侵染病毒的BEAS2B细胞放大40倍的状态图,由图可知,BEAS2B细胞贴壁,形态完全展开,形态饱满。
图13为生理盐水喷雾处理后的侵染病毒2h BEAS2B细胞放大400倍的状态图;图14为生理盐水喷雾处理后的侵染病毒5h BEAS2B细胞放大400倍的状态图;病毒侵染对照组,可见生理盐水并未抑制新冠病毒对细胞的侵染作用,病毒侵染后随着时间的增加,BEAS2B细胞形态变圆,立体感下降,平铺在壁上,易脱落,颗粒增加,杂质变多。
图15为实施例一制备的口腔喷膜剂消杀后侵染病毒2h BEAS2B细胞放大40的状态图;图16为实施例一制备的口腔喷膜剂消杀后侵染病毒5h BEAS2B细胞放大40的状态图;由图可知,经过实施例一口腔喷膜剂消杀后,BEAS2B细胞状态状态良好,不论是2h还是5h,基本与未侵染细胞状态相似,因此本实施例口腔喷膜剂可以长时间起到对新冠病毒的抑制作用,防止其进入肺部和粘膜细胞。
(9)喷膜剂透气性效果验证
取6块1.5cm2的人造皮肤,随机分2组,其中1组喷实施例一制备的口腔喷膜剂,另一组不喷,使用氧气透过率测试系统检测氧气通过量。
各组氧气通过量表:
表7
喷成膜剂组cm<sup>3</sup>/(cm<sup>3</sup>*24h) | 未喷成膜剂组cm<sup>3</sup>/(cm<sup>3</sup>*24h) |
18655.71±331.54 | 19389.04±241.33 |
图17为透气性效果对比图,A为喷实施例一制备的口腔喷膜剂,B为未喷成膜剂;由图可知,喷成膜剂组和未喷成膜剂组氧气透过量无明显差异。
Claims (5)
1.一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂,其特征在于具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂由丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水组成;
且每1000mL具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂中由8g~12g丁香油、0.08g~0.12g苯扎氯铵、20g~40g聚乙烯吡咯烷酮K30、3g~7g羟甲基纤维素钠、10g~20g土温-80、20g~40g甘油、0.5g~1.5g冰片、1g~2g薄荷脑、10mg~20mg乙二胺四乙酸二钠、10mL~15mL乙醇及余量纯化水组成;
上述一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂的制备方法,它是按以下步骤进行的:
一、称取丁香油、苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、土温-80、甘油、冰片、薄荷脑、乙二胺四乙酸二钠、乙醇及纯化水,然后将纯化水分为第一份纯化水及第二份纯化水;
二、将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛;
三、将丁香油、粉碎后的薄荷脑、粉碎后的冰片、甘油及乙醇混合并溶解,然后加入土温-80,得到溶液A;
四、将粉碎后的聚乙烯吡咯烷酮K30及粉碎后的羟甲基纤维素钠加入到第一份纯化水中溶解,得到溶液B;
五、利用高速磁力分子剪切,在转速为8000r/min~10000r/min的条件下,将溶液A和溶液B混合均匀25min~35min,得到溶液C;
六、将粉碎后的乙二胺四乙酸二钠加入到溶液C中,在转速为8000r/min~10000r/min的磁力搅拌下混合,得到溶液D;
七、将粉碎后的苯扎氯铵均匀分散于溶液D中,然后加入第二份纯化水在转速为8000r/min~10000r/min的磁力搅拌下混合,分装,即得到一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂。
2.根据权利要求1所述的一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂,其特征在于每1000mL具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂中由10g丁香油、0.1g苯扎氯铵、30g聚乙烯吡咯烷酮K30、5g羟甲基纤维素钠、15g土温-80、30g甘油、1g冰片、1.5g薄荷脑、10mg乙二胺四乙酸二钠、10mL乙醇及余量纯化水组成。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂,其特征在于所述的乙醇的质量百分数为95%。
4.根据权利要求1所述的一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂,其特征在于步骤一中所述的第一份纯化水与第二份纯化水的体积比为1:(1~3)。
5.根据权利要求1所述的一种具有靶向、缓释及成膜作用的抑制病毒或细菌的口腔喷膜剂,其特征在于步骤二中将苯扎氯铵、聚乙烯吡咯烷酮K30、羟甲基纤维素钠、冰片、薄荷脑及乙二胺四乙酸二钠分别进行粉碎过筛得到粉体粒径为450目~550目。
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GR01 | Patent grant | ||
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