CN107468866B - 一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再生剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再生剂及其制备方法和应用，所述的深度皮肤再生剂的制备方法包括：(1)培养脐带间充质干细胞，并利用超滤等技术制备提取物；(2)提取由蓝莲花、玫瑰花、木槿花、芦荟、黄芪、甘草组成的中药的总黄酮；(3)将干细胞提取物和中药提取物混合。所述的深度皮肤再生剂能够通过促组织新生和杀伤成纤维细胞对糖尿病足起到显著的治疗效果，且安全、高效、副作用小，而且生产工艺简单、成本低廉。

Description

一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再 生剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再生剂及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病足，又名糖尿病足部溃疡，是一种由糖尿病引发的皮肤及神经病变。其主要原因是由于神经病变导致的足部软组织破坏，主要表现为轻度感觉丧失、溃疡和持续性感染，严重时会引发关节病变、足趾畸形甚至截肢。目前，对于糖尿病足的治疗仍缺乏确定有效的方法，因为周围神经损伤带来的感觉缺失，导致患者难以差别察觉足部的受损情况，进而引发感染、溃疡。而无自觉的损伤和神经病变又会导致血管和肌肉畸变，进而导致关节异常和足趾畸形。因此，要治疗糖尿病足，单纯从症状入手治疗皮肤破溃是远远不够的，而是要在对皮肤破损进行修复的基础上，对皮下的周围神经系统进行修复，并消除由于病变所产生的胼胝体，从而恢复患者的足趾知觉，以此来保证后续治疗的持续有效。
干细胞治疗方法被认为是最具潜能的治疗方法之一。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，间充质干细胞是其中被认为最具有医学价值的干细胞种类。这种细胞一方面具备干细胞自我复制分化的能力，另一方面富含各种类型的细胞因子，可以调节局部免疫水平，促进神经、血管等机体组织新生，从而有效治疗各种组织损伤和自身免疫疾病。例如专利文献CN103037872A，公开日2013.04.10，公开了一种损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清，所述干细胞来源于间充质干细胞，还公开了一种中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将所述的损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。
在糖尿病足的发生过程中，过量增生的胼胝可以认为是一种成纤维细胞引发的皮肤增生。中药提取物在抑制成纤维细胞的聚集，从而降低皮肤病理性增生方面有相关的报道。例如专利文献CN102319272A，公开日2012.01.18，公开了银杏酚酸在制备治疗皮肤病的外用制剂中的用途。所述银杏酚酸包括银杏酸、银杏酚、银杏二酚等，可通过化学分离方法，从银杏的叶、果、外种皮、根茎等部位的提取物中得到，所述皮肤病为脓疱疮、毛囊炎、疱疹、疣、癣、湿疹、荨麻疹、皮肤瘙痒症、皮炎、螨虫病、疥疮、灰指甲、鸡眼、胼胝、银屑病等多种皮肤病。
但是目前未见间充质干细胞提取物联合中药提取物治疗糖尿病足的报道，例如专利文献CN102548538A，公开日2012.07.04，公开的用于治疗慢性创伤如糖尿病创伤、烧伤、静脉性溃疡和压力性溃疡的药物盐酸艾司洛尔的新型局部凝胶制剂，专利文献CN101167875A，公开日2008.04.30，公开的治疗糖尿病足的中药制剂，都仍然仅局限于糖尿病足皮肤破损的修复。
发明内容
本发明的首要目的是针对现有技术中的不足，提供一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再生剂。
本发明再一个目的是，提供所述的深度皮肤再生剂的制备方法。
本发明另一的目的是，提供所述的深度皮肤再生剂的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再生剂，所述的深度皮肤再生剂的制备方法包括以下步骤：
(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；
(2)中药提取物的制备：按重量份称取充分干燥的物料：蓝莲花18-25份、玫瑰花8-12份、木槿花6-10份、芦荟6-10份、黄芪2-4份、甘草1-3份，加水磨碎静置；煮沸蒸馏，收集蒸馏液，离心取水相，按1:1-3的比例加入乙醇，充分混匀后离心取上清，用负压离心机进行浓缩，至总黄酮含量不小于20mg/L；
(3)深度皮肤再生剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。
优选地，步骤(1)中所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。
优选地，步骤(1)中所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。
优选地，步骤(1)中所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。
优选地，步骤(2)中各物料的组成为：蓝莲花21份、玫瑰花10份、木槿花8份、芦荟8份、黄芪3份、甘草2份。
优选地，步骤(2)中，所述的用负压离心机进行浓缩，具体参数-20～-40mm Hg，40～50摄氏度。
优选地，步骤(3)中，所述的中药提取物和干细胞提取物的体积比为1:18-30。
优选地，步骤(1)中所述的胶原酶II浓度为0.1-0.2％。
优选地，步骤(1)中所述的使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，其传代数仅一代。
优选地，步骤(2)中，离心的参数均为10000-15000rpm，10-20min。
更优选地，所述的深度皮肤再生剂的制备方法包括以下步骤：
(1)干细胞提取物的制备：
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1-3.375mm3大小后，放入无菌培养皿；用含0.1-0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3-5代的细胞进行后续处理；
2)用含0.04-0.06M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔)，将破碎产物用10000-15000rpm离心10-20分钟，取上清；
4)将上清用孔径5000埃的超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa；
(2)中药提取物的制备：
1)按重量份称取充分干燥的物料：蓝莲花18-25份、玫瑰花8-12份、木槿花6-10份、芦荟6-10份、黄芪2-4份、甘草1-3份，加入蒸馏水，用组织磨碎器破碎，静置；
2)将混合物煮沸，进行蒸馏，收集蒸馏液，用高速离心机进行离心(4摄氏度，10000-15000rpm，10-20分钟)，取水相成分，沉淀丢弃；
3)按1:1-3的比例加入乙醇，充分混匀后10000-15000rpm离心10-20min，取上清，用负压离心机进行浓缩(-20～-40mm Hg，40～50摄氏度)，至总黄酮含量不小于20mg/L；
(3)深度皮肤再生剂的制备：将中药提取物和干细胞提取物按体积比为1:18-30混合。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的深度皮肤再生剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；
(2)中药提取物的制备：按重量份称取充分干燥的物料：蓝莲花18-25份、玫瑰花8-12份、木槿花6-10份、芦荟6-10份、黄芪2-4份、甘草1-3份，加水磨碎静置；煮沸蒸馏，收集蒸馏液，离心取水相，按1:1-3的比例加入乙醇，充分混匀后离心取上清，用负压离心机进行浓缩，至总黄酮含量不小于20mg/L；
(3)深度皮肤再生剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的深度皮肤再生剂在制备促进深度皮肤再生的药物中的应用。
所述的深度皮肤再生剂在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。
本文中，所述的蓝莲花中文名称：埃及蓝睡莲，拉丁名：Nymphaea coerulea。
应用本发明的深度皮肤再生剂治疗糖尿病足的方法为：
1)对糖尿病足患者进行表面清创；
2)对患处表面用75％乙醇消毒；
3)在皮下浅表注射深度皮肤再生剂200μl～1ml(视尼龙丝实验确定患处面积而定)；
4)将剩余液体涂抹在糖尿病足表面；
5)用敷料包裹创口表面。
每2天给药一次。
本发明的优点在于：
1、提出了治疗糖尿病足等深度皮肤创伤或溃疡的新方案：一方面通过对脐带间充质干细胞分离提纯来获取富含多种细胞因子的细胞制剂，促进糖尿病足创口部位的再生过程，尤其是周围神经细胞的再生和新生血管的生存；另一方面，通过特殊的中药提取物抑制成纤维细胞的聚集，从而降低糖尿病足上皮肤病理性增生。
2、细胞实验证实，本发明的深度皮肤再生剂可以有效促进神经干细胞、血管内皮细胞的生长，有效抑制胼胝体相关细胞尤其是成纤维细胞的生长。
3、动物实验证实，本发明的深度皮肤再生剂可以有效促进皮肤组织的再生，尤其是血管再生，皮肤愈合时间加快。而对愈伤组织的免疫荧光实验证实，治疗组的愈伤组织血管较为丰富，平均血管密度相比于模型组显著提高，且成纤维细胞较少。
4、用特殊方法对脐带间充质干细胞分离提纯，保证了提取物中含有大量具有关键作用的细胞因子。
5、采用特殊方法，对特殊原料组成的中药进行提取，获得了可有效抑制成纤维细胞等胼胝体形成细胞聚集的提取物。
6、脐带间充质干细胞提取物和中药提取物的合用，具有协同促进创面修复的效果。
7、本发明的深度皮肤再生剂对细胞无毒副作用，不仅有效，而且安全。
8、本发明的深度皮肤再生剂所有原料均简便易得，且生产高效，制备快速。
9、本发明的深度皮肤再生剂均可在制备完成后长期保存，制备产物可在封装后长期保存，保存时间经检测可达到16个月。因此其生产成本和周期均远远低于国外同类产品，从而提升干细胞治疗的临床应用。
综上，本发明为深度皮肤再生，如糖尿病足的修复提供了有效的实施方法。
附图说明
附图1是对于间充质干细胞的细胞毒性实验结果。
附图2是对于皮肤创伤大鼠的治疗实验。
附图3是大鼠愈伤组织免疫荧光照片。
附图4是大鼠肉芽部位VEGF含量检测照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1本发明深度皮肤再生剂的制备(一)
步骤1：脐带间充质干细胞的提纯
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min、压力为0.3MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
步骤2：中药提取物的制备
1)准确称取已充分干燥的物料，包括蓝莲花21g、玫瑰花10g、木槿花8g、芦荟8g、黄芪3g、甘草2g，加入200ml蒸馏水，用组织磨碎器破碎，静置4h；
2)将混合物煮沸，进行蒸馏，收集蒸馏液，用高速离心机进行离心(4摄氏度，12000rpm，15分钟)，取水相成分，沉淀丢弃；
3)按1:1的比例加入乙醇，充分混匀后12000rpm离心15min，取上清，用负压离心机进行浓缩(-30mm Hg，45摄氏度)至5ml左右(约2h)；
4)取0.5ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
步骤3：深度皮肤再生剂的制备
1)取1ml上述中药提取物与24ml脐带间充质干细胞提取物，加入25ml无菌水混合；
2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。
实施例2本发明深度皮肤再生剂的细胞毒性实验
1、实验方法
1)原代培养脐带间充质干细胞；
2)将脐带间充质干细胞以2*105个/ml铺入12孔板进行实验，贴壁培养至少24h；
3)加入本发明所述的深度皮肤再生剂(质量浓度分别为0％、0.5％、1％、2％、4％、10％和15％)，并加入细胞损伤剂博来霉素作为对照；
4)对细胞进行流式细胞检测，检测细胞凋亡、细胞活力(CCK8法)。
2、实验结果
对于间充质干细胞的CCK8实验，结果见图1，可以看到本发明的深度皮肤再生剂在10％以下无细胞毒性，而4％的深度皮肤再生剂具有最佳的细胞修复效果。
实施例3本发明深度皮肤再生剂抑制成纤维细胞生长、促进神经干细胞和血管内皮细胞生长的细胞实验
1、实验方法
1)原代培养不同的细胞，包括成纤维细胞、神经干细胞和血管内皮细胞；
2)将细胞以2*105铺入12孔板进行实验，每种细胞4个孔，贴壁培养至少24h；
3)每种细胞分别加入本发明所述的深度皮肤再生剂(质量浓度4％)，并加入博来霉素(终浓度为2μg/ml)作为细胞损伤剂，具体加样方式为：
Figure BDA0001404670090000071
4)对所有细胞进行流式细胞检测，检测细胞凋亡、细胞活力(CCK8法)。
2、实验结果
各组细胞凋亡率结果见表1。从表1中结果可以看出：在4％深度皮肤再生剂存在的情况下，成纤维细胞出现10.2％的凋亡，相比于对照组的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)，而神经干细胞和血管内皮细胞的凋亡率相比于对照则有所下降，细胞活力较好；博来霉素对所有细胞都产生了显著的杀伤作用，相比于对照组的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)；在4％深度皮肤再生剂和博来霉素同时存在的情况下，成纤维细胞的凋亡率相比于只有博来霉素存在的组别又显著提高，而神经干细胞和血管内皮细胞组别的凋亡率却出现了显著的下降，与只有博来霉素存在的组别的凋亡率相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。
表1各组细胞凋亡率
Figure BDA0001404670090000072
Figure BDA0001404670090000081
实施例4本发明深度皮肤再生剂促进皮肤组织再生的动物实验
1、实验方法
1)雄性SD大鼠25只，按体重随机分为5组，分别为正常组(5只)、模型组(5只)、干细胞提取物治疗组(5只)、中药提取物治疗组(5只)和深度皮肤再生剂治疗组(5只)；
2)模型制备：正常组予以普通饲料喂养，其余4组予以高脂饲料喂养(高脂配方：1％胆固醇，10％猪油，10％蛋黄粉，79％基础饲料)，4周后禁食16h(不禁水)，一次性腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH＝4.4)配制的链脲佐菌素45mg/kg，建立大鼠Ⅱ型糖尿病模型；
3)第七天断尾取血测空腹血糖，除正常组外血糖＞16mmol/L者作为造模成功大鼠，5组均以10％水合氯醛0.003g/kg腹腔注射麻醉，背部剃毛，常规消毒，用打孔器与大鼠背部左侧相同部位打孔，直径约2cm，深达筋膜层，无菌纱布覆盖，分笼饲养，自由饮水进食，均恢复普通饲料喂养；
4)建模后第一天开始给药，正常组以及模型组均涂以1ml生理盐水溶液，干细胞提取物治疗组涂抹实施例1制备的脐带间充质干细胞提取物1ml，中药提取物治疗组涂抹实施例1制备的中药提取物1ml，深度皮肤再生剂治疗组涂抹实施例1制备的深度皮肤再生剂1ml(参见图2)。无菌纱布覆盖，胶条固定，每日换药，连续15天；
5)溃疡愈合面积观察，开始给药后第1、4、7、10、14天计算各个大鼠创面愈合率，计算公式为(1－未愈合创面面积/原创面面积)×100％，并拍照观察；
6)通过免疫荧光实验观察愈伤组织的血管生成情况和成纤维细胞增长情况；
7)用ELISA方法检测溃疡肉芽组织中VEGF的含量。
2、实验结果
模型大鼠的血糖监测实验结果表明，模型组和实验组的血糖均超过阈值，造模成功。
给药后第1、4、7、10、14天各组大鼠创面愈合率见表2。结果表明，模型组大鼠伤口恢复缓慢，而各治疗组在一定程度上伤口恢复较快，且深度皮肤再生剂治疗组的伤口修复速度接近甚至超过了正常组，从结果还可以分析得出，深度皮肤再生剂对皮肤创伤的修复速率显著高于干细胞提取物或中药提取物单用，将干细胞提取物和中药提取物组合使用可发挥一定的协同促修复作用。
表2给药后第1、4、7、10、14天各组大鼠创面愈合率
Figure BDA0001404670090000091
注：*P<0.05，vs正常组；#P<0.05，vs模型组。
参见图3，左图为深度皮肤再生剂治疗组大鼠愈伤组织免疫荧光照片，右图为模型组大鼠愈伤组织免疫荧光照片，可见深度皮肤再生剂治疗组大鼠溃疡创面修复速率显著高于模型组，愈伤组织血管较为丰富，成纤维细胞较少。光密度值定量分析表明，深度皮肤再生剂治疗组愈伤组织平均血管密度(MVD)比模型组高3.2倍，比干细胞提取物治疗组高0.8倍，比中药提取物治疗组高1.7倍。
参见图4，左图为深度皮肤再生剂治疗组大鼠肉芽部位VEGF含量检测照片，右图为模型组大鼠肉芽部位VEGF含量检测照片，可见深度皮肤再生剂治疗组大鼠肉芽部位VEGF含量显著低于模型组。
实施例5影响本发明深度皮肤再生剂治疗效果的因素考察
本申请发明人结合经验，利用细胞实验对可能影响深度皮肤再生剂疗效的因素进行了初步考察。设置的组别包含以下三组：
实验组1：制备深度皮肤再生剂，方法同实施例1，不同之处在于，脐带间充质干细胞的提纯方法为：
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代7代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min、压力为0.3MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
实验组2：制备深度皮肤再生剂，方法同实施例1，不同之处在于，脐带间充质干细胞的提纯方法为：
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代5代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min、压力为0.3MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
实验组3：制备深度皮肤再生剂，方法同实施例1，不同之处在于，中药提取物的制备方法为：
1)准确称取已充分干燥的物料，包括蓝莲花21g、茉莉花10g、木槿花8g、芦荟8g、黄芪3g、甘草2g，加入200ml蒸馏水，用组织磨碎器破碎，静置4h；
2)将混合物煮沸，进行蒸馏，收集蒸馏液，用高速离心机进行离心(4摄氏度，12000rpm，15分钟)，取水相成分，沉淀丢弃；
3)按1:1的比例加入乙醇，充分混匀后12000rpm离心15min，取上清，用负压离心机进行浓缩(-30mm Hg，45摄氏度)至5ml左右(约2h)；
4)取0.5ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
然后按照实施例3细胞实验的方法检测各实验组制备的皮肤再生剂对成纤维细胞、神经干细胞和血管内皮细胞生长的影响，结果见表3-5。分析结果可以看出：相比于实施例1制备的深度皮肤再生剂，实验组1制备的深度皮肤再生剂抑制神经干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力均出现了显著下降，促进成纤维细胞凋亡的能力有所下降，表明脐带间充质干细胞传代培养的代数对提取物中关键活性成分产生了较显著的影响；相比于实施例1制备的深度皮肤再生剂，实验组2制备的深度皮肤再生剂促进成纤维细胞凋亡的能力和抑制神经干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力均无明显下降，表明脐带间充质干细胞传至第5代其细胞中包含有大量能够抑制神经干细胞和血管内皮细胞凋亡的活性物质；相比于实施例1制备的深度皮肤再生剂，实验组3制备的深度皮肤再生剂促进成纤维细胞凋亡的能力出现显著下降，抑制神经干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力略微下降，表明中药原材料的选择决定了活性物质的种类，该活性物质的种类对于深度皮肤再生剂的疗效有显著的影响。
表3实验组1细胞凋亡率
Figure BDA0001404670090000111
Figure BDA0001404670090000121
表4实验组2细胞凋亡率
Figure BDA0001404670090000122
Figure BDA0001404670090000131
表5实验组3细胞凋亡率
Figure BDA0001404670090000132
Figure BDA0001404670090000141
实施例6本发明深度皮肤再生剂的制备(二)
步骤1：脐带间充质干细胞的提纯
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成3.375mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.04M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(100W，20S*25次，10S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为25min、压力为0.35MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
步骤2：中药提取物的制备
1)准确称取已充分干燥的物料，包括蓝莲花19g、玫瑰花10g、木槿花8g、芦荟8g、黄芪3g、甘草2g，加入200ml蒸馏水，用组织磨碎器破碎，静置4h；
2)将混合物煮沸，进行蒸馏，收集蒸馏液，用高速离心机进行离心(4摄氏度，15000rpm，10分钟)，取水相成分，沉淀丢弃；
3)按1:3的比例加入乙醇，充分混匀后15000rpm离心10min，取上清，用负压离心机进行浓缩(-20mm Hg，50摄氏度)至5ml左右；
4)取0.5ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
步骤3：深度皮肤再生剂的制备
1)取1ml上述中药提取物与18ml脐带间充质干细胞提取物，加入19ml无菌水混合；
2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。
实施例7本发明深度皮肤再生剂的制备(三)
步骤1：脐带间充质干细胞的提纯
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代5代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.06M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(150W，10S*15次，20S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为40min、压力为0.25MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
步骤2：中药提取物的制备
1)准确称取已充分干燥的物料，包括蓝莲花21g、玫瑰花8g、木槿花8g、芦荟8g、黄芪3g、甘草2g，加入200ml蒸馏水，用组织磨碎器破碎，静置4h；
2)将混合物煮沸，进行蒸馏，收集蒸馏液，用高速离心机进行离心(4摄氏度，10000rpm，20分钟)，取水相成分，沉淀丢弃；
3)按1:2的比例加入乙醇，充分混匀后1000rpm离心20min，取上清，用负压离心机进行浓缩(-40mm Hg，40摄氏度)至5ml左右；
4)取0.5ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
步骤3：深度皮肤再生剂的制备
1)取1ml上述中药提取物与30ml脐带间充质干细胞提取物，加入31ml无菌水混合；
2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。
实施例8本发明深度皮肤再生剂的制备(四)
步骤1：脐带间充质干细胞的提纯
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(150W，10S*25次，20S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为40min、压力为0.35MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
步骤2：中药提取物的制备
1)准确称取已充分干燥的物料，包括蓝莲花21g、玫瑰花8g、木槿花7g、芦荟7g、黄芪3g、甘草2g，加入200ml蒸馏水，用组织磨碎器破碎，静置4h；
2)将混合物煮沸，进行蒸馏，收集蒸馏液，用高速离心机进行离心(4摄氏度，12000rpm，15分钟)，取水相成分，沉淀丢弃；
3)按1:1的比例加入乙醇，充分混匀后12000rpm离心20min，取上清，用负压离心机进行浓缩(-30mm Hg，50摄氏度)至5ml左右；
4)取0.5ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
步骤3：深度皮肤再生剂的制备
1)取1ml上述中药提取物与21ml脐带间充质干细胞提取物，加入22ml无菌水混合；
2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的深度皮肤再生剂，其特征在于，所述的深度皮肤再生剂的制备方法包括以下步骤：
(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；
(2)中药提取物的制备：按重量份称取充分干燥的物料：蓝莲花18-25份、玫瑰花8-12份、木槿花6-10份、芦荟6-10份、黄芪2-4份、甘草1-3份，加水磨碎静置；煮沸蒸馏，收集蒸馏液，离心取水相，按1:1-3的比例加入乙醇，充分混匀后离心取上清，用负压离心机进行浓缩，至总黄酮含量不小于20mg/L；
(3)深度皮肤再生剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。
2.根据权利要求1所述的深度皮肤再生剂，其特征在于，步骤(1)中所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。
3.根据权利要求1所述的深度皮肤再生剂，其特征在于，步骤(1)中所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。
4.根据权利要求1所述的深度皮肤再生剂，其特征在于，步骤(1)中所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。
5.根据权利要求1所述的深度皮肤再生剂，其特征在于，步骤(2)中各物料的组成为：蓝莲花21份、玫瑰花10份、木槿花8份、芦荟8份、黄芪3份、甘草2份。
6.根据权利要求1所述的深度皮肤再生剂，其特征在于，步骤(2)中，所述的用负压离心机进行浓缩，具体参数-20～-40mm Hg，40～50摄氏度。
7.根据权利要求1所述的深度皮肤再生剂，其特征在于，步骤(3)中，所述的中药提取物和干细胞提取物的体积比为1:18-30。
8.权利要求1所述的深度皮肤再生剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；
(2)中药提取物的制备：按重量份称取充分干燥的物料：蓝莲花18-25份、玫瑰花8-12份、木槿花6-10份、芦荟6-10份、黄芪2-4份、甘草1-3份，加水磨碎静置；煮沸蒸馏，收集蒸馏液，离心取水相，按1:1-3的比例加入乙醇，充分混匀后离心取上清，用负压离心机进行浓缩，至总黄酮含量不小于20mg/L；
(3)深度皮肤再生剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。
9.权利要求1所述的深度皮肤再生剂在制备促进深度皮肤再生的药物中的应用。
10.权利要求1所述的深度皮肤再生剂在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。
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