TWI705816B

TWI705816B - 用以製造肌損傷之預防或治療劑或修復促進劑之牛痘病毒接種炎症組織萃取物之用途

Info

Publication number: TWI705816B
Application number: TW106102113A
Authority: TW
Inventors: 稲毛一秀; 高橋和久; 大鳥精司; 折田純久
Original assignee: 國立大學法人千葉大學; 日商日本臟器製藥股份有限公司
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2020-10-01
Also published as: JPWO2017131169A1; EP3409283B1; KR20180104049A; US20190038677A1; EP3409283A4; WO2017131169A1; EP3409283A1; CN108601800B; CA3009611A1; CN108601800A; US20200297776A1; EP3409283B8; TW201726150A; JP6849191B2

Abstract

本發明之目的為提供一種於預防或治療肌損傷有用之藥劑。

本發明係關於牛痘病毒接種炎症組織萃取物之新穎的醫藥用途，關於含有該萃取物作為有效成分之肌損傷之預防或治療劑。本發明之將該萃取物作為有效成分之肌損傷之預防或治療劑係作為有效性及安全性高之藥劑而言為有用性非常高者。

Description

用以製造肌損傷之預防或治療劑或修復促進劑之牛痘病毒接種炎症組織萃取物之用途

本發明係關於牛痘病毒接種炎症組織萃取物之新穎的醫藥用途，具體而言，係關於含有牛痘病毒接種炎症組織萃取物作為有效成分之肌損傷之預防或治療劑。

所謂肌損傷(肌肉損傷)係肌纖維損傷。再者，根據損傷程度區分為I度(肌纖維的微細損傷)、Ⅱ度(肌纖維一部分斷裂)、Ⅲ度(肌纖維完全斷裂)3階段。

發生肌損傷時，首先引起血管擴張或透過性亢進，而引起症狀為腫脹或熱感之反應，亦即，引起炎症反應。炎症反應時，為白血球一種之嗜中性白血球或巨噬細胞等炎症細胞浸潤損傷部位，吞噬陷入壞死之肌纖維，同時分泌使肌衛星細胞增殖之細胞激素等。肌衛星細胞於損傷部位迅速活性化，成為肌芽細胞。肌芽細胞藉由反覆增殖後互相融合，而分化為肌管細胞。然後肌管細胞最終成熟為肌纖維，完成肌修復(自然治癒)。該肌修復到完成為止所需之時間，肌損傷程度為Ⅱ度之情形，通常約為3週至1個月。

肌損傷之治療法而言可列舉保存療法或手術療法等。其中，肌損傷為完全斷裂時採用手術療法，惟通常採用保存療法。

惟，於極力依賴自然治癒力之保存療法中，如上所述，由於有某種程度之長時間生活不自由之慮等，故尋求可將肌損傷早期修復之治療法。

本發明所述之肌損傷預防或治療劑(以下，稱為「本發明藥劑」)之屬於有效成分之牛痘病毒接種炎症組織萃取物，已知有鎮痛作用、鎮靜作用、抗壓力作用、抗過敏作用(參照專利文獻1)，促進免疫作用、抗癌作用、抑制肝硬化作用(參照專利文獻2)，針對特發性血小板減少性紫斑病之治療效果(參照專利文獻3)，對帶狀疱疹後神經痛、腦水腫、痴呆、脊髓小腦變性症等之治療效果(參照專利文獻4)，對雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、糖尿病性神經障礙、亞急性脊髓視神經炎(SMON，subacute myelo-optic neuropathy)後遺症等之治療效果(參照專利文獻5)，阻礙血管舒緩素(kallikrein)產生作用、改善末梢循環障礙作用(參照專利文獻6)，改善骨萎縮之作用(參照專利文獻7)，對治療敗血症或內毒素性休克(Endotoxic shock)有效之抑制一氧化氮產生之作用(參照專利文獻8)，針對骨質疏鬆症之治療效果(參照專利文獻9)，以抑制Nef作用之作用或抑制趨化激素(chemokine)產生之作用為基礎之愛滋病治療效果(參照專利文獻10、11)，針對腦梗塞等缺血性疾病之治療效果(參照專利文獻12)，針對纖維肌痛症之治療效果(參照專利文獻13)，針對感染症之治療效果(參照專利文獻14)，預防或減輕由於抗癌劑之末梢神經障礙之作用(參照專利文獻15)，慢性前列腺炎、間質性膀胱炎及/或排尿障礙之治療效果(參照專利文獻16)，促進BDNF等神經營養因子產生之作用(參照專利文獻17)，促進於軟骨細胞中之膠原蛋白及蛋白聚醣合成之作用(參照專利文獻18)等。惟，據本發明人等了解，目前未知有屬於本發明藥劑有效成分之牛痘病毒接種炎症組織萃取物，對於預防或治療肌損傷為有效之記載。

[先行技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開昭53-101515號公報

[專利文獻2]日本特開昭55-87724號公報

[專利文獻3]日本特開平1-265028號公報

[專利文獻4]日本特開平1-319422號公報

[專利文獻5]日本特開平2-28119號公報

[專利文獻6]日本特開平7-97336號公報

[專利文獻7]日本特開平8-291077號公報

[專利文獻8]日本特開平10-194978號公報

[專利文獻9]日本特開平11-80005號公報

[專利文獻10]日本特開平11-139977號公報

[專利文獻11]日本特開2000-336034號公報

[專利文獻12]日本特開2000-16942號公報

[專利文獻13]國際公開第2004/039383號

[專利文獻14]日本特開2004-300146號公報

[專利文獻15]國際公開第2009/028605號

[專利文獻16]國際公開第2011/111770號

[專利文獻17]國際公開第2011/162317號

[專利文獻18]國際公開第2012/051173號

本發明之目的係提供一種在預防或治療肌損傷有效且安全性高之藥劑。

本發明人等針對被要求有效治療法之肌損傷之藥劑治療進行深入研究之結果發現牛痘病毒接種炎症組織萃取物於肌損傷，具有優異之修復促進作用，因而完成本發明。

藉由本發明，可大幅度縮短修復肌損傷所需要之治癒時間。

牛痘病毒接種炎症組織萃取物具有促進肌損傷修復之優異的藥理作用。

據此，將該萃取物藉由事前投予來減輕肌損傷之程度，或事後投予來發揮使肌損傷於早期治癒之效果。

故，含有該萃取物作為有效成分之本發明藥劑，係作為肌損傷之預防或治療劑之有用性高者。尤其是，由於本發明藥劑為副作用等問題點極少之藥劑，故安全性亦高者。

本發明係關於含有牛痘病毒接種炎症組織萃取物作為有效成分之肌損傷之預防或治療劑。因此，本發明藥劑對肌損傷之預防或治療有用。

再者，牛痘病毒接種炎症組織萃取物具有促進肌損傷修復之作用。因此，本發明藥劑亦可作為肌損傷之修復促進劑使用。

所謂屬於本發明藥劑之預防或治療對象之肌損傷中之肌，只要是有發生肌損傷之部位或有可能發生之部位即可，並無特別限制，可列舉例如：大腿四頭肌、大腿後肌(hamstring)、脊側肌及腓腸肌等。又，肌損傷之原因並無特別限制，經由手術侵襲之肌損傷亦為本發明藥劑預防或治療之對象。

關於牛痘病毒接種炎症組織萃取物，已如上述有各式報告關於經接種有牛痘病毒之炎症組織所產生之生理活性物質，將該物質從病態組織萃取之方法及該等之藥理活性等(參照上述專利文獻1至18等)。

又，可作為本發明藥劑使用之市售製劑而言，有牛痘病毒接種家兔炎症皮膚萃取液製劑。該製劑如日本之醫療用醫藥品集[2016年版，一般財團法人日本醫藥情報中心編集‧發行]第3525至3527頁中之記載，為含有從接種有牛痘病毒之家兔的炎症皮膚組織萃取分離之非蛋白性之活性物質之製劑。經確認適用於腰痛症、頸肩腕症候群、神經痛症狀、肩關節周圍炎、變形性關節症、皮膚疾病(濕疹、皮膚炎、蕁麻疹)伴隨之騷癢、過敏性鼻炎、亞急性脊髓視神經炎後遺症狀之冷感/知覺異常/疼痛、帶狀疱疹後神經痛等，並且皮下、肌肉注射、靜脈注射用注射劑及錠劑被承認作為醫療用醫藥品販賣。

以下，針對製造屬於本發明藥劑有效成分之牛痘病毒接種炎症組織萃取物之方法等進行說明。

本發明藥劑中使用之牛痘病毒接種炎症組織萃取物，可藉由將接種牛痘病毒且發痘之炎症組織粉碎，加入萃取溶劑並且去除組織片後，進行去蛋白處理，使其吸附於吸附劑，接著將有效成分溶出而獲得。

牛痘病毒接種炎症組織萃取物可例如以下述步驟製造。

(A)採集皮內接種有牛痘病毒且發痘之兔子、小鼠等之皮膚組織等，將發痘組織粉碎，加入水、苯酚水、生理食鹽液或苯酚加甘油水等萃取溶劑，進行數日之萃取處理後藉由過濾或離心分離，獲得去除組織片之粗萃取液(濾液或上清液)。

(B)將於(A)獲得之粗萃取液調整為酸性之pH值並且加熱，過濾或離心分離，進行去蛋白處理。接著，將去蛋白之溶液調整為鹼性之pH值並且加熱，進一步過濾或離心分離，獲得經去蛋白處理之濾液或上清液。

(C)將於(B)獲得之濾液或上清液調整為酸性之pH值，吸附於活性碳、高嶺土等吸附劑。

(D)將水等萃取溶劑添加於在(C)獲得之吸附劑中，調整為鹼性之pH值，藉由溶出吸附成分，而獲得牛痘病毒接種炎症組織萃取物。

以上為基本之步驟，以下更詳細地敍述該等步驟。

關於(A)

用於接種牛痘病毒來獲得炎症組織之動物而言，可使用感染牛痘病毒之兔子、牛、馬、羊、山羊、猴子、大鼠、小鼠等各種動物，作為炎症組織，較佳為兔子之發痘皮膚組織。

採集該等炎症組織，以苯酚溶液等洗淨，進行消毒。將該炎症組織粉碎，添加其1至5倍量之萃取溶劑，作成乳化懸浮液。此處，粉碎係指使用碎肉機等細碎成碎肉狀。又，作為萃取溶劑可使用蒸餾水、生理食鹽水、弱酸性至弱鹼性之緩衝液等，亦可適當添加甘油等安定化劑、苯酚等殺菌/防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時，可藉由凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素或界面活性劑等處理，將細胞組織破壞，使萃取變容易。將獲得之懸浮液放置5日至12日。其間可邊適當攪拌或不攪拌，邊於30至45℃加溫。將獲得之液藉由過濾或離心分離等去除組織片，獲得粗萃取液(濾液或上清液)。

關於(B)

將於(A)獲得之粗萃取液藉由過濾或離心分離等去除組織片後進行去蛋白處理。去蛋白操作可藉由通常進行之公知方法實施，可適用加熱處理、蛋白質變性劑(例如酸、鹼、尿素、胍、丙酮等有機溶劑等)之處理、等電點沈澱、鹽析等方法。接著，藉由去除不溶物之通常方法，例如藉由使用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃過濾器、矽藻土、賽茨(Seitz)過濾板等之過濾、超濾、離心分離等，可獲得經去除析出之不溶蛋白質之濾液或上清液。

關於(C)

將於(B)獲得之濾液或上清液使用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸調整為酸性，較佳為pH值調整為3.5至5.5，進行吸附於吸附劑之操作。可使用之吸附劑可列舉活性碳、高嶺土等，可於萃取液中添加吸附劑進行攪拌或是將萃取液通過填充吸附劑之管柱，使有效成分吸附於該吸附劑。於萃取液中添加吸附劑時，藉由過濾或離心分離等去除溶液，可獲得吸附有活性成分之吸附劑。

關於(D)

使有效成分從於(C)獲得之吸附劑溶出(脫離)，可以在該吸附劑中加入溶出溶劑，於室溫或適當加熱或攪拌溶出，過濾或離心分離等通常方法去除吸附劑而達成。作為使用之溶出溶劑可使用鹼性溶劑，例如調整為鹼性pH值之水、甲醇、乙醇、異丙醇等或該等之適當混合溶液，較佳為可使用調整為pH值9至12之水。溶出溶劑之量可適當設定。

經由此獲得之萃取物(溶出液)可適當調製成較佳形態作為製劑用原體或醫藥品製劑。例如可將溶液之pH值調整為接近中性作成製劑用原體，或可藉由濃縮/稀釋，使符合期望之濃度。另，亦可加入氯化鈉調製成與生理食鹽液等張之溶液作為注射用製劑。又，可藉由將該等溶液濃縮乾燥或凍結乾燥，調製成可作為錠劑等的原料利用之固形物形態。

作為於患者之投予方法，除了經口投予之外，可列舉皮下、肌肉內、靜脈內投予等，投予量可依據牛痘病毒接種炎症組織萃取物之種類來適當設定。於市售製劑被認定之投予量，根據上述之日本醫療用醫藥品集(3525頁)，揭示基本上內服為1日投予16NU、注射劑為1日投予3.6至7.2NU，惟，可根據疾病之種類、重傷度、患者之個人差異、投予方法、投予期間等適當增減(NU：神經托品單位(neurotropin unit)。所謂神經托品單位，係使用疼痛閾值較正常動物低之慢性壓力動物之SART壓力小鼠，以Randall-Selitto變法為基準進行試驗，以鎮痛效力之ED₅₀值規定。1NU顯示ED₅₀值為100mg/kg時神經托品製劑之鎮痛活性含有成分1mg之活性)。

以下，顯示牛痘病毒接種炎症組織萃取物製造方法之具體例及該萃取物之新穎藥理作用，亦即促進肌損傷修復作用之藥理試驗結果，惟，本發明係不被該等實施例之記載以任意方式限制者。

[實施例] 實施例1

於健康成熟家兔之皮膚接種牛痘病毒，剝出發痘之皮膚，將該皮膚粉碎並且加入苯酚水。接著，將此加壓過濾，獲得之濾液以鹽酸調整pH值為5後，於90至100℃加熱處理30分鐘。過濾並且去蛋白後，以氫氧化鈉調整pH值為9，進一步於90至100℃加熱處理15分鐘後進行過濾。將濾液以鹽酸調整pH值為約4.5，加入2%活性碳並且攪拌2小時後進行離心分離。於經採取之活性碳中加入水，以氫氧化鈉調整pH值為10，於60℃攪拌1.5小時後，離心分離過濾，獲得上清液。於採取之活性碳再次加入水，以氫氧化鈉調整pH值為11，於60℃攪拌1.5小時後離心分離，獲得上清液。合併兩上清液，以鹽酸中和，獲得牛痘病毒接種家兔炎症皮膚萃取物。

實施例2

於健康成熟家兔之皮膚接種牛痘病毒使其感染後，於無菌下將發痘之皮膚剝出，並且將此細切後加入苯酚加甘油水，以均質器磨碎成乳狀。接著，將此過濾，將獲得之濾液以鹽酸調整為弱酸性(pH值為4.5至5.5)後，於100℃ 加熱處理並且過濾。濾液以氫氧化鈉調整為弱鹼性(pH值為8.5至10.0)，進一步於100℃加熱處理後過濾。濾液以鹽酸調整pH值為約4.5，加入約1.5%之活性碳，攪拌1至5小時後過濾。於濾取之活性碳中加入水，並且以氫氧化鈉調整pH值為9.4至10，攪拌3至5小時後過濾，將濾液以鹽酸中和。

實施例3

於健康成熟家兔之皮膚接種牛痘病毒，使其活性化後，於無菌下將經活性化之皮膚剝出，將此細切並且加入水，以均質器磨碎成乳狀物。接著，將此加壓過濾，獲得之濾液以鹽酸調整pH值為5.0後，於流通蒸氣下以100℃加熱處理。過濾去蛋白後，以氫氧化鈉調整pH值為9.1，進一步於100℃加熱處理後過濾。濾液以鹽酸調整pH值為4.1，加入活性碳2%，攪拌2小時後過濾。濾液進一步加入活性碳5.5%，攪拌2小時後過濾。於最初濾取之活性碳中加入水，以氫氧化鈉調整pH值為9.9，於60℃攪拌1.5小時後過濾。於最初之活性碳及接著之活性碳中加入水，以氫氧化鈉調整pH值為10.9，於60℃攪拌1.5小時後過濾。合併濾液並且以鹽酸中和後，以使用分子量100之膜之電透析法進行脫鹽處理，於減壓下乾固。

接著，表示使用上述實施例1獲得之本發明牛痘病毒接種炎症組織萃取物(以下，亦記載為「本萃取物」)作為試藥，對於肌損傷預防/治療作用之藥理試驗結果之一例。

藥理試驗

使用8週齡雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠24隻。將棘狀突起作為中心，將右側作成損傷側施行全身麻醉(以生理食鹽水倍量稀釋，腹腔內投予戊巴比妥(somnopentyl)0.3至0.5mL)後，於各大鼠之四肢安裝橡皮筋並且固定於實驗台。將損傷予定部(右側脊側肌，高位為第4腰椎水平)充分剃毛。於損傷予定部設置塑膠製圓柱之尖端，從1m高度落下115g之重錘(自由落下塑膠製圓柱內)，使脊側肌損傷[將記載於參考文獻(Crisco JJ,Joki P,Heinen GT,Connell MD,Panjabi MM.A muscle contusion injury model.Biomechanics,physiology,and histology.Am J Sports Med.1994；22(5)：702-10.)之重鎚落下(dropmass)法部份修正]。之後立刻分為於損傷部皮下注射有生理食鹽水(5μL)之群(未治療群：n=12)以及皮下注射有本萃取物(5μL)之群(治療群：n=12)，於各群進行評估。

評估項目為於損傷後第1日、第3日、第7日對各群(各n=4)的損傷部脊側肌進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin：HE)染色之急性期反應及組織修復反應之比較檢討。

於各時間過程，於全身麻醉(以生理食鹽水倍量稀釋，腹腔內投予戊巴比妥(somnopentyl)0.3至0.5mL)施行後，取出損傷部之脊側肌，以4%三聚甲醛(Paraformaldehyde： PFA)液實施組織固定。對於經4%PFA固定之檢體，使用Tissue-Tek[註冊商標]VIP(櫻花精機日本股份有限公司(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.)製)，並且以乙醇脫水製作石蠟塊，將該石臘塊設置於顯微鏡用薄片切片機(microtome)SM2010R(雷卡微系統公司製(Leica microsystems,Wetzlar,Germany))，製作厚度約4μm之石蠟切片載片。藉由脫石蠟(二甲苯3槽：計3分30秒鐘→乙醇4槽：計5分鐘)、流水水洗(3分鐘)、蒸餾水水洗(1分鐘)、核染色(麥芽蘇木精(Mayer's Hematoxylin)液(蘇木精I：20秒鐘→蘇木精Ⅱ：3分鐘))、流水水洗(3分鐘)、磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline)進行染色，以流水水洗(1分鐘)、50%乙醇(20秒鐘)、細胞質等之染色(伊紅：30秒鐘)、脫水(100%乙醇5槽：計4分鐘)、透徹(二甲苯4槽：計4分鐘)、封入之順序進行HE染色處理。使用處理後之載片，於顯微鏡(BX51，奧林巴斯(Olympus股份有限公司製)觀察損傷部之上述評估項目。

結果

作為HE染色之評估方法，將觀察到浮腫、出血等急性反應、觀察到嗜中性白血球聚集及線維芽細胞等增殖性(組織修復開始)、觀察到脂肪變性及肌纖維萎縮(組織延後治癒)之各觀察項目之相對強度(量)分為0點：未觀察到、1點：極輕度、2點：中度、3點：高度等4階段評估，進行評分。

每個時間過程，各群之脊側肌HE染色評估之平均評分結果如下表所示。

於損傷後第1日，治療群相較於未治療群，浮腫及出血評分為低值，表示抑制急性期之浮腫及出血。

於損傷後第3日，治療群相較於未治療群，嗜中性白血球聚集及線維芽細胞出現評分為高值，表示組織修復過程更為確實地開始。

於損傷後第7日，治療群相較於未治療群，脂肪變性肌萎縮評分為低值，未觀察到組織延後治癒傾向，表示進行著良好的組織修復過程(變性細胞組織之吸收及肌纖維之修復等)。

由上述表1至3之結果，治療群相較於未治療群，顯示於損傷後第1日抑制浮腫及出血，於損傷後第3日組織修復過程確實地開始，於損傷後第7日進行著良好之組織修復過程。亦即，本萃取物顯示具有促進肌損傷修復之作用。

[產業上之利用可能性]

由上述藥理試驗之結果可明瞭本發明藥劑具有促進肌損傷修復之作用，表示本發明藥劑可作為肌損傷之預防或治療劑使用。市售之牛痘病毒接種家兔炎症皮膚萃取液製劑確認為經長年使用安全性非常高之藥劑。因此，本發明藥劑作為肌損傷之預防或治療劑有效，為幾乎無副作用、安全性高且有用性非常高之藥劑。

Claims

一種牛痘病毒接種炎症組織萃取物之用途，該用途係用以製造肌損傷之預防或治療劑。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該炎症組織為皮膚組織。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中，該炎症組織為兔子的炎症皮膚組織。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之用途，其中，肌損傷之預防或治療劑為注射劑。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之用途，其中，肌損傷之預防或治療劑為經口劑。
一種牛痘病毒接種炎症組織萃取物之用途，該用途係用以製造肌損傷之修復促進劑。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中，該炎症組織為皮膚組織。
如申請專利範圍第7項所述之用途，其中，該炎症組織為兔子之炎症皮膚組織。
如申請專利範圍第6項至第8項中任一項所述之用途，其中，肌損傷之修復促進劑為注射劑。
如申請專利範圍第6項至第8項中任一項所述之用途，其中，肌損傷之修復促進劑為經口劑。