JP6849191B2 - 筋損傷の予防又は治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するものであり、具体的にはワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する筋損傷の予防又は治療剤に関する。

筋損傷（筋肉の損傷）とは、筋線維が損傷することである。そして、損傷の程度によって、Ｉ度（筋線維の微細な損傷）、ＩＩ度（筋線維の一部断裂）、ＩＩＩ度（筋線維の完全断裂）の３段階に区分される。

筋損傷が発生すると、まず血管拡張や透過性の亢進を引き起こし、腫脹や熱感を兆候とする反応、すなわち炎症反応が引き起こる。炎症反応時には白血球の一種である好中球やマクロファージ等の炎症細胞が損傷部位に浸潤して、壊死に陥った筋線維を貪食し、同時に筋衛星細胞を増殖させるサイトカイン等を分泌する。筋衛星細胞は損傷部位で速やかに活性化され、筋芽細胞となる。筋芽細胞は増殖を繰り返し，その後互いに融合することで筋管細胞へ分化する。そして筋管細胞は最終的に筋線維に成熟し筋修復が完了する（自然治癒）。この筋修復が完了するまでにかかる期間は、筋損傷の程度がＩＩ度の場合、通常３週間〜１ヶ月間程度である。

筋損傷の治療法としては、保存療法や手術療法等が挙げられる。そのうち、筋損傷が完全断裂である場合には手術療法が採用されるが、通常、保存療法が採用される。
しかし、自然治癒力に大きく依存する保存療法では、上述したように、ある程度の長期期間、不自由な生活を強いられるおそれ等があることから、筋損傷を早期に修復することができる治療法が求められている。

本発明に係る筋損傷の予防又は治療剤（以下「本発明薬剤」という。）の有効成分であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物には、鎮痛作用、鎮静作用、抗ストレス作用、抗アレルギー作用（特許文献１参照）、免疫促進作用、抗癌作用、肝硬変抑制作用（特許文献２参照）、特発性血小板減少性紫斑病に対する治療効果（特許文献３参照）、帯状疱疹後神経痛、脳浮腫、痴呆、脊髄小脳変性症等への治療効果（特許文献４参照）、レイノー症候群、糖尿病性神経障害、スモン後遺症等への治療効果（特許文献５参照）、カリクレイン産生阻害作用、末梢循環障害改善作用（特許文献６参照）、骨萎縮改善作用（特許文献７参照）、敗血症やエンドトキシンショックの治療に有効な一酸化窒素産生抑制作用（特許文献８参照）、骨粗鬆症に対する治療効果（特許文献９参照）、Ｎｅｆ作用抑制作用やケモカイン産生抑制作用に基づくエイズ治療効果（特許文献１０、１１参照）、脳梗塞等の虚血性疾患に対する治療効果（特許文献１２参照）、線維筋痛症に対する治療効果（特許文献１３参照）、感染症に対する治療効果（特許文献１４参照）、抗癌剤による末梢神経障害の予防又は軽減作用（特許文献１５参照）、慢性前立腺炎、間質性膀胱炎及び／又は排尿障害の治療効果（特許文献１６参照）、BDNF等の神経栄養因子の産生促進作用（特許文献１７参照）、軟骨細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成促進作用（特許文献１８参照）などがあることが知られている。しかし、我々が知る限り、本発明薬剤の有効成分であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が、筋損傷の予防又は治療に有効であることは知られていない。

特開昭５３−１０１５１５号公報 特開昭５５−８７７２４号公報 特開平１−２６５０２８号公報 特開平１−３１９４２２号公報 特開平２−２８１１９号公報 特開平７−９７３３６号公報 特開平８−２９１０７７号公報 特開平１０−１９４９７８号公報 特開平１１−８０００５号公報 特開平１１−１３９９７７号公報 特開２０００−３３６０３４号公報 特開２０００−１６９４２号公報 国際公開第２００４／０３９３８３号 特開２００４−３００１４６号公報 国際公開第２００９／０２８６０５号 国際公開第２０１１／１１１７７０号 国際公開第２０１１／１６２３１７号 国際公開第２０１２／０５１１７３号

本発明の目的は、筋損傷の予防又は治療に有効で且つ安全性が高い薬剤を提供することにある。

本発明者は、有効な治療法が求められている筋損傷の薬剤治療について鋭意研究を行った結果、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物が筋損傷において、優れた修復促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。

本発明により、筋損傷の修復による治癒に要する期間を大幅に短縮することができる。

ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、筋損傷の修復を促進するという優れた薬理作用を有する。
これにより、該抽出物は、事前の投与により筋損傷の程度を軽減し又は事後の投与により筋損傷を早期に治癒させる効果を奏する。
よって、該抽出物を有効成分として含有する本発明薬剤は、筋損傷の予防又は治療剤として有用性の高いものである。特に、本発明薬剤は、副作用等の問題点の極めて少ない薬剤であることから、安全性も高いものである。

本発明はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する筋損傷の予防又は治療剤に関する。従って、本発明薬剤は筋損傷の予防又は治療に有用である。
また、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、筋損傷の修復を促進する作用を有する。従って、本発明薬剤は筋損傷の修復促進剤として用いてもよい。

本発明薬剤による予防又は治療の対象である筋損傷における筋とは、筋損傷が生じた部分又は生じるおそれがある部分であれば特に限定されず、例えば、大腿四頭筋、ハムストリングス、傍脊柱筋及び腓腹筋等が挙げられる。また、筋損傷の原因は特に限定されず、手術侵襲による筋損傷も、本発明薬剤の予防又は治療の対象である。

ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物に関しては、ワクシニアウイルスを接種した炎症組織において産生される生理活性物質であること、該物質を病態組織から抽出する方法並びにそれらの薬理活性等が上述のようにすでに種々報告されている（上記特許文献１乃至１８等参照）。

また、本発明薬剤として使用可能な市販されている製剤として、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤がある。この製剤は、日本の医療用医薬品集〔2016年版、一般財団法人日本医薬情報センター編集・発行〕の3525乃至3527頁に記載されているように、ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚組織から抽出分離した非タンパク性の活性物質を含有するものである。腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、じんま疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症状の冷感・異常知覚・痛み、帯状疱疹後神経痛等に対する適応が認められており、皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として承認を受けて販売されている。

以下、本発明薬剤の有効成分であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を製造する方法等について説明する。

本発明薬剤に用いるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって得ることができる。

ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。
（A）ワクシニアウイルスを皮内接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液又はフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えて数日間抽出処理を行った後、濾過又は遠心分離することによって組織片が除去された粗抽出液（濾液又は上清）を得る。
（B）（A）で得られた粗抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、濾過又は遠心分離して除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液を塩基性のpHに調整して加熱し、更に濾過又は遠心分離して除蛋白処理された濾液又は上清を得る。
（C）（B）で得られた濾液又は上清を酸性のpHに調整して、活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（D）（C）で得られた吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、塩基性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得る。
以上が基本的な工程であるが、これらの工程を更に詳しく述べると次のとおりである。

（A）について
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの発痘皮膚組織が好ましい。

これら炎症組織を採取して、フェノール溶液等で洗浄、消毒を行なう。この炎症組織を破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。
ここで、破砕とは、ミンチ機等を使用してミンチ状に細かく砕くことを意味する。また、抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。得られた懸濁液を、5日乃至12日間放置する。その間、適宜攪拌しながら又は攪拌せずに、30乃至45℃に加温してもよい。得られた液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去して粗抽出液（濾液又は上清）を得る。

（B）について
（A）で得られた粗抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤（例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒など）による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶蛋白質を除去した濾液又は上清を得る。

（C）について
（B）で得られた濾液又は上清を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、活性成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。

（D）について
（C）で得られた吸着剤から有効成分を溶出（脱離）させるには、当該吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。溶出溶媒の量は適宜設定することができる。

このようにして得られた抽出物（溶出液）は、製剤用原体や医薬品製剤として好ましい形態に適宜調製することができる。例えば、溶液のpHを中性付近に調整して製剤用原体とすることもでき、また濃縮・希釈によって所望の濃度に合せることもできる。さらに注射用製剤として塩化ナトリウムを加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することもできる。また、これら溶液を濃縮乾固又は凍結乾燥することによって、錠剤等の原料として利用できる固形物の形態に調製してもよい。

患者への投与方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げられ、投与量はワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定することができる。市販製剤で認められている投与量は、前記日本の医療用医薬品集（3525頁）によれば、基本的には内服では1日16NU、注射剤では1日3.6乃至7.2NUを投与するよう示されているが、疾患の種類、重傷度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能である（NU：ノイロトロピン単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED₅₀値をもって規定する。1NUはED₅₀値が100 mg／kgであるときのノイロトロピン製剤の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。）。

以下に、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の製造方法の具体例、並びに該抽出物の新規な薬理作用、すなわち筋損傷の修復促進作用の薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。

実施例１
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90〜100℃で30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90〜100℃で15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5に調整し、2％の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。

実施例２
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性（pH4.5乃至5.5）に調整した後、100℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性（pH8.5乃至10.0）とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5とし、約1.5％の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH9.4乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。

実施例３
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5.0に調整した後、流通蒸気下100℃で加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9.1とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でpH4.1に調整し、活性炭2％を加えて2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭5.5％を加えて2時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行い、減圧下に乾固した。

次に、上記実施例１で得られた本発明ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物（以下、「本抽出物」とも記載する。）を被験薬として用いた筋損傷に対する予防・治療作用に関する薬理試験の結果の一例を示す。

薬理試験
8週齢雄性SD(Sprague-Dawley)ラット24匹を用いた。棘突起を中心とし、右側を損傷側とし全身麻酔(生理食塩水にて倍量に希釈し,ソムノペンチル0.3〜0.5mL 腹腔内投与)施行後に、各ラットの四肢にゴムバンドを装着し実験台に固定した。損傷予定部(右側傍脊柱筋、高位は第4腰椎レベル)を十分剃毛した。損傷予定部にプラスチック製円柱の先端を設置し1mの高さより115gの重錘を落下(プラスチック製円柱内を自由落下)させ、傍脊柱筋を損傷した[参考文献(Crisco JJ, Joki P, Heinen GT, Connell MD, Panjabi MM. A muscle contusion injury model. Biomechanics, physiology, and histology. Am J Sports Med. 1994;22(5):702-10.)に掲載のドロップマス法を一部修正]。その直後に、損傷部に生食水を皮下注射(5μL)した群（未治療群：n=12）と本抽出物を皮下注射(5μL)した群(治療群：n=12)に分け、各群における評価を行った。

評価項目は、損傷後1日、3日、7日での各群(各n=4)の損傷部傍脊柱筋ヘマトキシリン・エオジン(Hematoxylin-Eosin：HE)染色の急性期反応及び組織修復反応に関する比較検討とした。
各タイムコースにおいて、全身麻酔(生理食塩水にて倍量に希釈し,ソムノペンチル0.3〜0.5mL 腹腔内投与)施行後に損傷部の傍脊柱筋を摘出し、4%パラホルムアルデヒド(Paraformaldehyde：PFA)液にて組織固定を施した。4%PFA固定した検体に対しTissue-Tek [登録商標] VIP(サクラファインテックジャパン株式会社製)を用いてエチルアルコールで脱水して作製したパラフィンブロックを、ミクロトームSM2010R（ライカマイクロシステムズ製(Leica microsystems, Wetzlar, Germany)）に設置し、厚さ約4μmのパラフィン切片スライドを作製した。脱パラフィン(キシレン3槽:計3分30秒→アルコール4槽:計5分)、流水水洗(3分)、蒸留水水洗(1分)、核の染色(マイヤーヘマトキシリン液(ヘマトキシリンＩ:20秒→ヘマトキシリンＩＩ:3分))、流水水洗(3分)、リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline)による色だし、流水水洗(1分)、50%アルコール(20秒)、細胞質等の染色(エオジン:30秒)、脱水(100%アルコール5槽:計4分)、透徹(キシレン4槽:計4分)、封入の順にHE染色の処理を行った。処理後のスライドを用い、顕微鏡(BX51, オリンパス株式会社製)にて損傷部における前述の評価項目に関しての観察を行った。

結果
HE 染色の評価方法としては、浮腫、出血などの急性反応所見、好中球集簇及び線維芽細胞などの増殖性(組織修復開始)所見並びに脂肪変性及び筋線維の委縮(組織遷延治癒)所見の各観察項目の相対的な強さ(量)を0点：所見なし、1点：ごく軽度、2点：中等度、 3点：高度の計 4段階に分けて評価しスコア化を行った。
タイムコース毎の各群における傍脊柱筋HE染色評価の平均スコア結果は以下の表に示す通りであった。

損傷後1日では、治療群は未治療群と比較して、浮腫及び出血スコアが低値であり、急性期における浮腫及び出血の抑制が示された。

損傷後3日では、治療群は未治療群と比較して、好中球集簇及び線維芽細胞出現スコアが高値であり、組織修復過程がより確実に開始されていることが示された。

損傷後7日では、治療群は未治療群と比較して、脂肪変性筋委縮スコアが低値であり、組織遷延治癒傾向は認められず、良好な組織修復過程(変性細胞組織の吸収及び筋線維の修復など)が進行していることが示された。

上記表1乃至3の結果より、治療群は未治療群と比較して、損傷後1日での浮腫及び出血の抑制、損傷後3日での組織修復過程の確実な開始、損傷後7日での良好な組織修復過程進行を示していた。すなわち、本抽出物は、筋損傷の修復促進作用を有することが示された。

上記薬理試験の結果より明らかなように、本発明薬剤は、筋損傷の修復促進作用を有することが認められたことから、本発明薬剤は筋損傷の予防又は治療剤として有用であることが示された。市販のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤は長年に亘って使用され、非常に安全性の高い薬剤として認められている。このように、本発明薬剤は、筋損傷の予防又は治療剤として有効であり、副作用もほとんどない安全性の高い極めて有用性の高いものである。

Claims (14)

1. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する筋損傷（遺伝的変異に基づく筋損傷を除く）の予防又は治療剤。
2. 筋損傷が外力によるものである請求項１記載の予防又は治療剤。
3. 筋損傷が手術侵襲によるものである請求項１記載の予防又は治療剤。
4. 炎症組織が皮膚組織である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
5. 炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項４記載の予防又は治療剤。
6. 注射剤である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
7. 経口剤である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
8. ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する筋損傷（遺伝的変異に基づく筋損傷を除く）の修復促進剤。
9. 筋損傷が外力によるものである請求項８記載の修復促進剤。
10. 筋損傷が手術侵襲によるものである請求項８記載の修復促進剤。
11. 炎症組織が皮膚組織である請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の修復促進剤。
12. 炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項１１記載の修復促進剤。
13. 注射剤である請求項８乃至１２のいずれか一項に記載の修復促進剤。
14. 経口剤である請求項８乃至１２のいずれか一項に記載の修復促進剤。