JP6849191B2 - 筋損傷の予防又は治療剤 - Google Patents
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Description
しかし、自然治癒力に大きく依存する保存療法では、上述したように、ある程度の長期期間、不自由な生活を強いられるおそれ等があることから、筋損傷を早期に修復することができる治療法が求められている。
これにより、該抽出物は、事前の投与により筋損傷の程度を軽減し又は事後の投与により筋損傷を早期に治癒させる効果を奏する。
よって、該抽出物を有効成分として含有する本発明薬剤は、筋損傷の予防又は治療剤として有用性の高いものである。特に、本発明薬剤は、副作用等の問題点の極めて少ない薬剤であることから、安全性も高いものである。
また、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物は、筋損傷の修復を促進する作用を有する。従って、本発明薬剤は筋損傷の修復促進剤として用いてもよい。
(A)ワクシニアウイルスを皮内接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液又はフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えて数日間抽出処理を行った後、濾過又は遠心分離することによって組織片が除去された粗抽出液(濾液又は上清)を得る。
(B)(A)で得られた粗抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、濾過又は遠心分離して除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液を塩基性のpHに調整して加熱し、更に濾過又は遠心分離して除蛋白処理された濾液又は上清を得る。
(C)(B)で得られた濾液又は上清を酸性のpHに調整して、活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
(D)(C)で得られた吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、塩基性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得る。
以上が基本的な工程であるが、これらの工程を更に詳しく述べると次のとおりである。
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの発痘皮膚組織が好ましい。
ここで、破砕とは、ミンチ機等を使用してミンチ状に細かく砕くことを意味する。また、抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。得られた懸濁液を、5日乃至12日間放置する。その間、適宜攪拌しながら又は攪拌せずに、30乃至45℃に加温してもよい。得られた液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去して粗抽出液(濾液又は上清)を得る。
(A)で得られた粗抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤(例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒など)による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙(セルロース、ニトロセルロース等)、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶蛋白質を除去した濾液又は上清を得る。
(B)で得られた濾液又は上清を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、活性成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
(C)で得られた吸着剤から有効成分を溶出(脱離)させるには、当該吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。溶出溶媒の量は適宜設定することができる。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90〜100℃で30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90〜100℃で15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5に調整し、2%の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性(pH4.5乃至5.5)に調整した後、100℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性(pH8.5乃至10.0)とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5とし、約1.5%の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH9.4乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5.0に調整した後、流通蒸気下100℃で加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9.1とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でpH4.1に調整し、活性炭2%を加えて2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭5.5%を加えて2時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行い、減圧下に乾固した。
8週齢雄性SD(Sprague-Dawley)ラット24匹を用いた。棘突起を中心とし、右側を損傷側とし全身麻酔(生理食塩水にて倍量に希釈し,ソムノペンチル0.3〜0.5mL 腹腔内投与)施行後に、各ラットの四肢にゴムバンドを装着し実験台に固定した。損傷予定部(右側傍脊柱筋、高位は第4腰椎レベル)を十分剃毛した。損傷予定部にプラスチック製円柱の先端を設置し1mの高さより115gの重錘を落下(プラスチック製円柱内を自由落下)させ、傍脊柱筋を損傷した[参考文献(Crisco JJ, Joki P, Heinen GT, Connell MD, Panjabi MM. A muscle contusion injury model. Biomechanics, physiology, and histology. Am J Sports Med. 1994;22(5):702-10.)に掲載のドロップマス法を一部修正]。その直後に、損傷部に生食水を皮下注射(5μL)した群(未治療群:n=12)と本抽出物を皮下注射(5μL)した群(治療群:n=12)に分け、各群における評価を行った。
各タイムコースにおいて、全身麻酔(生理食塩水にて倍量に希釈し,ソムノペンチル0.3〜0.5mL 腹腔内投与)施行後に損傷部の傍脊柱筋を摘出し、4%パラホルムアルデヒド(Paraformaldehyde:PFA)液にて組織固定を施した。4%PFA固定した検体に対しTissue-Tek [登録商標] VIP(サクラファインテックジャパン株式会社製)を用いてエチルアルコールで脱水して作製したパラフィンブロックを、ミクロトームSM2010R(ライカマイクロシステムズ製(Leica microsystems, Wetzlar, Germany))に設置し、厚さ約4μmのパラフィン切片スライドを作製した。脱パラフィン(キシレン3槽:計3分30秒→アルコール4槽:計5分)、流水水洗(3分)、蒸留水水洗(1分)、核の染色(マイヤーヘマトキシリン液(ヘマトキシリンI:20秒→ヘマトキシリンII:3分))、流水水洗(3分)、リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline)による色だし、流水水洗(1分)、50%アルコール(20秒)、細胞質等の染色(エオジン:30秒)、脱水(100%アルコール5槽:計4分)、透徹(キシレン4槽:計4分)、封入の順にHE染色の処理を行った。処理後のスライドを用い、顕微鏡(BX51, オリンパス株式会社製)にて損傷部における前述の評価項目に関しての観察を行った。
HE 染色の評価方法としては、浮腫、出血などの急性反応所見、好中球集簇及び線維芽細胞などの増殖性(組織修復開始)所見並びに脂肪変性及び筋線維の委縮(組織遷延治癒)所見の各観察項目の相対的な強さ(量)を0点:所見なし、1点:ごく軽度、2点:中等度、 3点:高度の計 4段階に分けて評価しスコア化を行った。
タイムコース毎の各群における傍脊柱筋HE染色評価の平均スコア結果は以下の表に示す通りであった。
Claims (14)
- ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する筋損傷(遺伝的変異に基づく筋損傷を除く)の予防又は治療剤。
- 筋損傷が外力によるものである請求項1記載の予防又は治療剤。
- 筋損傷が手術侵襲によるものである請求項1記載の予防又は治療剤。
- 炎症組織が皮膚組織である請求項1乃至3のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
- 炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項4記載の予防又は治療剤。
- 注射剤である請求項1乃至5のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
- 経口剤である請求項1乃至5のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
- ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する筋損傷(遺伝的変異に基づく筋損傷を除く)の修復促進剤。
- 筋損傷が外力によるものである請求項8記載の修復促進剤。
- 筋損傷が手術侵襲によるものである請求項8記載の修復促進剤。
- 炎症組織が皮膚組織である請求項8乃至10のいずれか一項に記載の修復促進剤。
- 炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項11記載の修復促進剤。
- 注射剤である請求項8乃至12のいずれか一項に記載の修復促進剤。
- 経口剤である請求項8乃至12のいずれか一項に記載の修復促進剤。
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