KR20100057535A

KR20100057535A - 항암제에 의한 말초신경장애의 예방 또는 경감제

Info

Publication number: KR20100057535A
Application number: KR1020097026816A
Authority: KR
Inventors: 료조 오이시; 요시노리 이토; 노부아키 에가시라
Original assignee: 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠; 니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2007-08-31
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2010-05-31
Also published as: CN101790377A; US8613962B2; EP2191836A4; JPWO2009028605A1; HK1143734A1; TW200911277A; ES2385069T3; CA2698129A1; EP2191836B1; AU2008292407A1; WO2009028605A1; EP2191836A1; AU2008292407B2; US20110111051A1

Abstract

본 발명의 목적은 항암제 투여시의 부작용으로서 발현하는 말초신경장애의 예방 또는 경감에 있어서, 유효하고 또한 안전성이 높은 약제를 제공하는 것에 있다. 본 발명은 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 신규 의약 용도에 관한 것이고, 상기 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제에 관한 것이다. 상기 추출물을 유효 성분으로 하는 본 발명 약제는 항암제의 투여에 의해 야기되는 말초신경장애의 예방 또는 경감제로서, 부작용이 적고 안정성이 높은 약제로서 유용성이 높은 것이다.

항암제, 말초신경장애의 예방 또는 경감제

Description

항암제에 의한 말초신경장애의 예방 또는 경감제{PROPHYLACTIC OR ALLEVIATING AGENT FOR PERIPHERAL NERVE DISORDER INDUCED BY ANTI-CANCER AGENT}

본 발명은 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 신규 의약 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 항암제에 의한 말초신경장애의 예방 또는 경감제에 관한 것이다.

오늘날, 암(악성 종양)의 치료에 있어서는 외과 수술, 방사선 조사, 화학 요법이 각각 단독 또는 병용되어 적당하게 사용되고 있다. 이 중, 화학 요법에 사용되는 항암제(항악성종양제)는 본래 세포 독성, 세포 장애성을 갖는 것이고, 암(악성 종양) 세포뿐만아니라 인간의 정상 세포도 상해하는 것에 의한 부작용이 발생하기 때문에, 이러한 부작용을 가능한 한 예방 또는 경감하면서 충분한 항암(항악성종양) 효과가 발휘되도록 환자에 투여되는 것이 중요하다.

항암제 투여에 따른 부작용으로서는 혈액장애, 소화기장애, 신경장애를 들 수 있지만, 최근 경향으로서는 특히 급성 또는 만성 신경장애의 문제가 증대되고 있다. 이것은 현저한 항암 효과를 발휘하는 새로운 항암제에 의한 주된 부작용이 신경장애인 경우가 많은 것이나, 최근 치료의 중심으로 되고 있는 다제 병용 요법에 의한 영향이나, 혈액장애나 소화기장애의 부작용에 대해서는 개선 경향이 있는 것이 원인으로 생각되고 있다. 이렇게, 현재 암의 화학 요법에 따른 부작용의 중심이 되고 있는 신경장애는 신경 세포의 재생이 곤란한 점에서 일단 발현하면 유효한 대책이 없어, 위독한 증상을 보이거나, 불가역적 장애가 되거나 하는 경우가 있기 때문에 치료상 중요한 문제로 되어 있다.

항암제 투여에 따른 신경장애는 중추신경계, 자율신경계, 말초신경계 이외에 미각 등의 감각기에도 보인다. 이 중, 발생 빈도가 비교적 높아 문제가 되고 있는 것이 자통이나 타는 듯한 아픔 등의 동통, 사지말단의 저림, 작열감 등의 지각 이상, 냉감 자극에 대한 과민 등의 지각 과민, 감각 소실·감각 마비나 위화감 등의 감각 이상, 지각성 운동실조, 근력 저하 등의 말초신경계의 신경장애이다. 이 항암제 투여에 의한 말초신경계의 병변은 주로 축색의 변성에 의한 것이라고 생각되고 있다. 축색 내에 있는 미소관은 세포 분열시에 방추체를 형성하거나, 세포 내 소기관의 배치나 물질 수송 등, 세포의 정상 기능의 유지에 중요한 역할을 하고 있지만, 파클리탁셀, 도세탁셀 등의 탁산계 약제나, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈 등의 빈알칼로이드계 약제는 미소관을 표적으로 해서 작용함으로써 악성 종양 세포의 증식을 억제하기 때문에, 정상 신경 세포의 미소관도 상해되어서 신경장애를 일으킨다고 생각되고 있다. 또한, 옥사리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 네다플라틴 등의 백금 제제는 신경 세포를 직접 상해하는 결과, 이차적으로 축색 장애를 초래한다고 생각되고 있다.

그러나, 항암제에 의한 신경 독성은 연구가 그다지 진행되고 있지 않는 영역이고, 신경장애의 예방·대증 방법은 확립되어 있지 않다. 그 때문에, 저림 증상의 완화를 위해서는 메코발라민 등의 비타민 제제나 한방약인 우차신기환(牛車腎氣丸)을 사용하거나, 동통에 대하여는 항우울제(염산아미트리프틴), 항간질제(카르바마제핀), 항부정맥제(염산멕실레틴)이나 부신피질 스테로이드 등이 사용되거나 하고 있지만, 현재 시점에서 근치 또는 예방법은 확립되어 있지 않고, 약제 투여를 중지·감량하는 것이 신경장애를 막는 단 하나의 확실한 방법이다(단, 투여 중지 후에도 신경장애는 지속되거나 또는 악화되는 경우도 있다). 이상과 같은 현재의 상태로부터, 항암제에 의한 신경장애에 대하여 유효한 예방 또는 경감제가 임상 현장에서 강하게 요구되고 있었다.

본 발명 약제의 유효 성분인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물에 대해서는 진통 작용, 진정 작용, 항스트레스 작용, 항알레르기 작용(특허문헌 1 참조), 면역 촉진 작용, 항암 작용, 간경변 억제 작용(특허문헌 2 참조), 특발성 혈소판 감소성 자반병에 대한 치료 효과(특허문헌 3 참조), 대상포진 후 신경통, 뇌부종, 치매, 척수소뇌변성증 등에의 치료 효과(특허문헌 4 참조), 레이노 증후군, 당뇨병성 신경장애, 스몬(SMON) 후유증 등에의 치료 효과(특허문헌 5 참조), 칼리크레인 산생 저해 작용, 말초순환장애 개선 작용(특허문헌 6 참조), 골위축 개선 작용(특허문헌 7 참조), 패혈증이나 내독소 쇼크의 치료에 유효한 일산화질소 산생 억제 작용(특허문헌 8 참조), 골다공증에 대한 치료 효과(특허문헌 9 참조), Nef 작용 억제 작용이나 케모카인 산생 억제 작용에 의거하는 에이즈 치료 효과(특허문헌 10, 11), 뇌경색 등의 허혈성 질환에 대한 치료 효과(특허문헌 12), 섬유근통증에 대한 치료 효과(특허문헌 13), 감염증에 대한 치료 효과(특허문헌 14) 등이 개 시되어 있다.

특히, 특허문헌 5에 있어서는 본 발명 약제의 유효 성분인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물이 생체 국소의 혈류 장애에 의해 허혈 상태에 빠진 조직이나 장기의 기능 장애에 수반되어 발생하는 저림, 동통, 사지 냉감, 지각 이상 등의 증상을 개선하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 특허문헌 5에 개시되어 있는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물에 의한 저림, 동통, 사지 냉감, 지각 이상 등의 개선 작용은 혈류장애에 의한 허혈 상태에 대한 혈류 개선 작용에 의거하는 효과로서, 본 발명과 같은 항암제 투여의 부작용(세포 상해)에 의해 발생하는 말초신경장애의 예방 또는 경감 작용은 전혀 다른 발병 메커니즘에 의거하는 말초신경장애에 대한 상기 추출물의 효과이고, 지금까지 알려져 있지 않은 지견이다. 즉, 상기 추출물이 항암제 투여에 의한 신경 축색의 미소관의 장애, 신경 축색의 탈수(脫髓), 신경 세포에의 직접 장애 등에 기인해서 발생한다고 생각되고 있는 말초신경장애의 경감 등에 유효하다는 것은 알려져 있지 않고, 그러한 의약 용도에 관한 발표나 보고는 지금까지 행하여져 있지 않다.

특허문헌 1 : 일본 특허공개 소53-101515호 공보

특허문헌 2 : 일본 특허공개 소55-87724호 공보(제 3, 5, 6쪽)

특허문헌 3 : 일본 특허공개 평1-265028호 공보(제 1, 2쪽)

특허문헌 4 : 일본 특허공개 평1-319422호 공보(제 3, 4쪽)

특허문헌 5 : 일본 특허공개 평2-28119호 공보(제 3쪽)

특허문헌 6 : 일본 특허공개 평7-97336호 공보(제 4쪽)

특허문헌 7 : 일본 특허공개 평8-291077호 공보

특허문헌 8 : 일본 특허공개 평10-194978호 공보

특허문헌 9 : 일본 특허공개 평11-80005호 공보(제 2, 3쪽)

특허문헌 10 : 일본 특허공개 평11-139977호 공보

특허문헌 11 : 일본 특허공개 2000-336034호 공보(제 2, 3쪽)

특허문헌 12 : 일본 특허공개 2000-16942호 공보

특허문헌 13 : 국제공개 WO2004/039383호 공보

특허문헌 14 : 일본 특허공개 2004-300146호 공보

본 발명의 목적은 항암제 투여시의 부작용으로서 발현하는 말초신경장애의 예방 또는 경감에 유효하고 또한 안전성이 높은 약제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 예의 연구를 행한 결과, 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물이 항암제에 의한 말초신경장애에 대하여 뛰어난 예방 또는 경감 효과를 나타내는 것을 찾아내고, 발명을 완성했다.

(발명의 효과)

백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 항암제의 투여에 의해 야기되는 말초신경장애를 예방 또는 경감한다고 하는 뛰어난 약리 작용을 갖는다. 또한, 상기 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 본 발명 약제는 부작용 등의 문제점이 적은 안전한 약제이고, 매우 유용성이 높은 것이다.

도 1은 파클리탁셀 투여에 의해 발생하는 지각 과민에 대한 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 경감 작용을 폰 프라이 시험에 있어서 조사한 결과이다.

도 2는 파클리탁셀 투여에 의해 발생하는 지각 이상에 대한 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 경감 작용을 아세톤 시험에 있어서 조사한 결과이다.

도 3은 파클리탁셀에 의해 유발되는 신경돌기 신전 저해에 대한 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 억제 작용을 PC12 세포를 이용하여 조사한 결과이다.

도 4는 파클리탁셀에 의해 유발되는 신경돌기 신전 저해에 대한 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 억제 작용을 DRG 세포를 이용하여 조사한 결과이다.

도 5는 옥사리플라틴에 의해 발생하는 지각 과민에 대한 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 경감 작용을 폰 프라이 시험에 있어서 조사한 결과이다.

도 6은 옥사리플라틴에 의해 발생하는 지각 과민에 대한 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 경감 작용을 콜드 플레이트 시험에 있어서 조사한 결과이다.

본 발명은 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 유효 성분으로서 함 유하는 항암제에 의한 말초신경장애의 예방 또는 경감제에 관한 것이다. 본 발명에 있어서의 말초신경장애를 발현시키는 항암제는 특히 미소관에 상해를 주어서 말초신경장애를 야기하는 항암제이다. 그러한 약제로서는 파클리탁셀, 도세탁셀 등의 탁산계 약제나, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈 등의 빈알칼로이드계 약제를 들 수 있다. 덧붙여서, 신경 세포의 상해에 의해 축색 장애를 초래함으로써 말초신경장애를 야기하는 약제로서, 옥사리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 네다플라틴 등의 백금 제제를 들 수 있다. 이들 항암제에 의한 말초신경장애로서는 동통, 저림, 지각 이상, 감각 이상, 지각 과민 등이 있고, 그 때문에 물건을 잘 잡을 수 없거나, 단추를 채우기 어렵거나, 보행 장애 등의 운동실조나 심부건 반사의 저하 등이 일어난다고 하는 일상생활 상의 장애가 생긴다. 본 발명 약제가 예방·개선 대상으로 하는 항암제에 의한 말초신경장애는 1종류의 항암제를 사용한 단제 요법에 의해 발생하는 말초신경장애는 물론, 작용기서가 다른 복수의 약제를 조합해서 투여하는 다제 병용 요법이나, 작용기서가 다른 약제가 최대의 유효성을 발휘할 수 있도록 약제의 조합이나 투여 방법에 연구를 집중시키는 바이오케미칼 모듈레이션(biochemical modulation)의 요법에 있어서 발생하는 말초신경장애를 포함하는 것이다.

본 발명 약제에 사용하는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물에 관해서, 백시니아 바이러스를 접종한 염증 조직에 있어서 산생되는 생리 활성 물질, 상기 물질을 병태 조직으로부터 추출하는 방법 및 그들의 약리 활성 등에 대해서는 상술한 바와 같이 여러 가지 보고되어 있다(상기 특허문헌 1 내지 14 등).

또한 시판되고 있는 의약품으로서는 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출액 제제가 있다. 이 제제는 의료용 의약품집(2007년판, 재단법인 일본 의약정보 센터 편집·발행)의 2697-2699쪽에 기재되어 있는 바와 같이, 백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 조직으로부터 추출 분리한 비단백성의 활성 물질을 함유하는 약제이고, 허리 통증, 경견완 증후군, 증후성 신경통, 견관절 주위염, 변형성 관절증, 피부 질환(습진, 피부염, 두드러기)에 따른 소양(搔痒), 알레르기성 비염, 스몬 후유 증상의 냉감·이상 지각·통증, 대상포진 후 신경통 등에 대한 적응이 인정되고 있으며, 피하, 근육 주사, 정맥 주사용의 주사제 및 정제가 의료용 의약품으로서 제조 승인을 받고서 시판되고 있다.

본 발명 약제에 사용하는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 상술한 바와 같은 백시니아 바이러스 접종 염증 조직으로부터 추출한 비단백성의 생체 기능 조정 물질이고, 상기 의료약 일본 의약품집에도 게재되어 있는 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출액 제제는 의약품의 제조 승인을 받아 시판되고 있어 입수 가능하다. 또한 상술한 특허문헌에 기재되어 있는 여러 가지 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 본 발명 물질로서 이용할 수 있고, 그들의 제조 방법이나 바람직한 투여량 등도 문헌 중에 설명되어 있다.

본 발명 약제에 사용하는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 백시니아 바이러스를 접종해서 천연두가 발병한 염증 조직을 파쇄하고, 추출 용매를 첨가하여 조직편을 제거한 후, 제단백(除蛋白) 처리를 행하고, 이것을 흡착제에 흡착시키고, 이어서 유효 성분을 용출함으로써 얻을 수 있다.

백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은, 예를 들면 이하의 공정으로 제조된다.

(a) 백시니아 바이러스를 접종하여 천연두를 발병시킨 토끼, 생쥐 등의 피부 조직 등을 채취하고, 천연두가 발병한 조직을 파쇄하고, 물, 페놀수, 생리식염액 또는 페놀 첨가 글리세린수 등의 추출 용매를 첨가한 후, 여과 또는 원심분리함으로써 추출액(여과액 또는 상청액)을 얻는다.

(b) 상기 추출액을 산성의 pH로 조정해서 가열하여 제단백 처리한다. 이어서 제단백한 용액을 알칼리성으로 조정해서 가열한 후에 여과 또는 원심분리한다.

(c) 얻어진 여과액 또는 상청액을 산성으로 하여 활성탄, 카올린 등의 흡착제에 흡착시킨다.

(d) 상기 흡착제에 물 등의 추출 용매를 첨가하여 알칼리성의 pH로 조정하고, 흡착 성분을 용출함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 얻을 수 있다. 그 후, 소망에 따라서 적당하게 용출액을 감압 하에서 증발 건고(乾固) 또는 동결 건조함으로써 건고물로 할 수도 있다.

백시니아 바이러스를 접종해 염증 조직을 얻기 위한 동물로서는 토끼, 소, 말, 양, 염소, 원숭이, 쥐(rat), 생쥐(mouse) 등 백시니아 바이러스가 감염되는 여러 가지 동물을 사용할 수 있고, 염증 조직으로서는 토끼의 천연두 발병 피부 조직이 바람직하다.

이들 염증 조직을 채취해서 파쇄하고, 그 1 내지 5배 양의 추출 용매를 첨가하여 유화 현탁액으로 한다. 추출 용매로서는 증류수, 생리식염수, 약산성 내지 약 염기성의 완충액 등을 사용할 수 있고, 글리세린 등의 안정화제, 페놀 등의 살균·방부제, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘 등의 염류 등을 적당하게 첨가해도 된다. 이 때, 동결 융해, 초음파, 세포막 용해 효소 또는 계면활성제 등의 처리에 의해 세포 조직을 파괴해서 추출을 용이하게 할 수도 있다.

얻어진 유상 추출액을 여과 또는 원심분리 등에 의해 조직편을 제거한 후, 제단백 처리를 행한다. 제단백 조작은 통상 행하여지고 있는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 가열 처리, 단백질 변성제, 예를 들면 산, 염기, 요소, 구아니딘, 아세톤 등의 유기 용매 등에 의한 처리, 등전점 침전, 염석 등의 방법을 적용할 수 있다. 이어서, 불용물을 제거하는 통상의 방법, 예를 들면 여과지(셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등), 유리 필터, 셀라이트, 자이츠 여과판 등을 사용한 여과, 한외여과, 원심분리 등에 의해 석출된 불용 단백질을 제거한다.

이렇게 해서 얻어진 유효 성분 함유 추출액을 염산, 황산, 브롬화수소산 등의 산을 이용하여 산성, 바람직하게는 pH3.5 내지 5.5로 조정하고, 흡착제에의 흡착 조작을 행한다. 사용할 수 있는 흡착제로서는 활성탄, 카올린 등을 들 수 있고, 추출액 중에 흡착제를 첨가해 교반하거나, 추출액을 흡착제 충전 컬럼에 통과시켜서 상기 흡착제에 유효 성분을 흡착시킬 수 있다. 추출액 중에 흡착제를 첨가했을 경우에는 여과나 원심분리 등에 의해 용액을 제거하고, 유효 성분을 흡착시킨 흡착제를 얻을 수 있다.

흡착제로부터 유효 성분을 용출(탈리)시키기 위해서는 상기 흡착제에 용출 용매를 첨가하고, 실온 또는 적당하게 가열하거나 또는 교반해서 용출하고, 여과나 원심분리 등의 통상의 방법으로 흡착제를 제거해서 달성할 수 있다. 사용되는 용출 용매로서는 염기성의 용매, 예를 들면 염기성의 pH로 조정한 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등 또는 이들의 적당한 혼합 용액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 pH9 내지 12로 조정한 물을 사용할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 추출물(용출액)은 제제용 원체(原體)나 의약품 제제로서 바람직한 형태로 적당하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 용액의 pH를 중성 부근으로 조정해서 제제용 원체로 할 수도 있고, 또한 농축·희석에 의해 소망의 농도로 맞출 수도 있다. 또한 주사용 제제로서 염화나트륨을 첨가하여 생리식염액과 등장(等張)용액으로 조제할 수도 있다. 또한, 이들 용액을 농축 건고 또는 동결 건조함으로써 정제 등의 원료로서 이용할 수 있는 고형물의 형태로 조제해도 좋다.

환자에의 투여 방법으로서는, 경구 투여 이외에 피하, 근육 내, 정맥 내 투여 등을 들 수 있고, 투여량은 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 종류에 따라 적당하게 설정할 수 있다. 시판 제제에서 인정되고 있는 투여량은 상기 의료용 의약품집(2697쪽)에 따르면, 기본적으로는 내복에서는 1일 16NU, 주사제에서는 1일 3.6 내지 7.2NU를 투여하도록 의료용 의약품으로서는 나타내어져 있지만, 질환의 종류, 중상도, 환자의 개인차, 투여 방법, 투여 기간 등에 따라 적당하게 증감가능하다(NU : 뉴로트로핀 단위. 뉴로트로핀 단위란, 동통역치가 정상 동물보다 저하된 만성 스트레스 동물인 SART 스트레스 생쥐를 사용하고, Randall-Selitto 변법에 준해서 시험을 행하고, 진통 효력의 ED₅₀값을 가지고서 규정한다. 1NU는 ED₅₀값이 100mg/kg일 때의 뉴로트로핀 제제의 진통 활성 함유 성분 1mg을 나타내는 활성이다.).

이하에, 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 제조 방법의 예, 및 상기 추출물의 신규 약리 작용, 즉 항암제에 의한 신경장애의 예방 또는 경감 작용에 관한 약리 시험 결과를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예의 기재에 의해 전혀 제한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

건강한 성숙 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하여 천연두가 발병한 피부를 벗겨내고, 이것을 파쇄해서 페놀수를 첨가했다. 이어서 이것을 가압 여과하고, 얻어진 여과액을 염산으로 pH5로 조정한 후에 90~100℃에서 30분간 가열 처리했다. 여과해서 제단백한 후에 수산화나트륨으로 pH9로 하고, 90~100℃에서 15분간더 가열 처리한 후에 여과했다. 여과액을 염산으로 약 pH4.5로 조정하고, 2%의 활성탄을 첨가하여 2시간 교반한 후에 원심분리했다. 채취한 활성탄에 물을 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH10으로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후에 원심분리 여과해서 상청액을 얻었다. 채취한 활성탄에 다시 물을 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH11로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후에 원심분리해서 상청액을 얻었다. 양 상청액을 합하고, 염산으로 중화하여 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출물을 얻었다. 이하의 약리 시험에서는 실험에 적합한 농도로 적당하게 조정해서 사용했다.

실시예 2

건강한 성숙 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종해 감염시킨 후, 천연두가 발병한 피부를 무균적으로 벗겨내고 이것을 세절한 후에 페놀 첨가 글리세린수를 첨가하고, 호모지나이저로 마쇄하여 유상으로 했다. 이어서 이것을 여과하고, 얻은 여과액을 염산으로 약산성(pH4.5 내지 5.5)으로 조정한 후, 100℃에서 가열 처리하여 여과했다. 여과액을 수산화나트륨으로 약알칼리성(pH8.5 내지 10.0)으로 하고, 100℃에서 더 가열 처리한 후 여과했다. 여과액을 염산으로 약 pH4.5로 하고, 약 1.5%의 활성탄을 첨가하여 1 내지 5시간 교반한 후에 여과했다. 여과한 활성탄에 물을 첨가하여 수산화나트륨으로 pH9.4 내지 10으로 조정하고, 3 내지 5시간 교반한 후에 여과하여 여과액을 염산으로 중화했다.

실시예 3

건강한 성숙 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하여 활성화시킨 후에 활성화된 피부를 무균적으로 벗겨내고, 이것을 세절해서 물을 첨가하고, 호모지나이저로 마쇄하여 유상물로 했다. 이어서 이것을 가압 여과하고, 얻어진 여과액을 염산으로 pH5.0으로 조정한 후, 유통증기 하 100℃에서 가열 처리했다. 여과해서 제단백한 후에 수산화나트륨으로 pH9.1로 하고, 100℃에서 더 가열 처리한 후 여과했다. 여과액을 염산으로 pH4.1로 조정하고, 활성탄 2%를 첨가하여 2시간 교반한 후 여과했다. 여과액은 활성탄 5.5%를 더 첨가하여 2시간 교반한 후 여과했다. 최초로 여과한 활성탄에 물을 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH9.9로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후 여과했다. 최초의 활성탄 및 다음의 활성탄에 물을 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH10.9로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후 여과했다. 여과액을 합쳐서 염산으로 중화한 후, 분자량 100의 막을 사용한 전기투석법으로 탈염 처리를 행하고, 감압 하에서 건고했다.

이어서, 상기 실시예 1에서 얻어진 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 피험약으로서 사용한 항암제에 의한 신경장애의 경감 작용에 관한 약리 시험 결과의 일례를 나타낸다. 또한, 모든 약리 시험에 있어서, 유의차 검정에는 투키-크레이머(Tukey-Kramer)법을 사용했다.

약리 시험 1 : 파클리탁셀에 의한 쥐 말초신경장애에 대한 작용

항암제인 파클리탁셀을 투여했을 경우에 발생하는 기계적 자극에 의한 이질통(통상 아픔을 일으키지 않는 촉각 자극에 의해 야기되는 격통) 등의 지각 과민 및 저온 자극에 있어서의 지각 이상 대한 본 발명 추출물(실시예 1에서 제조된 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출물)의 효과를 조사했다. 본 발명 추출물을 피험약으로 해서 쥐에 경구 투여하고, 이하의 실험(폰 프라이 시험 및 아세톤 시험)을 행했다.

(1) 피험약의 투여

실험 동물로서 7~8주령의 SD 웅성 쥐를 사용하고, 대조군, 파클리탁셀 투여군, 파클리탁셀 및 피험약 투여군(파클리탁셀+피험약 투여군)의 3군으로 군 구성했다. 파클리탁셀 투여군에는 파클리탁셀의 주 1회의 복강 내 투여(6mg/㎏)를 4주간 계속해서 총 4회 실시했다. 파클리탁셀+피험약 투여군에 대해서는 피험약을 파클리탁셀의 투여 직전, 투여 1일 후, 투여 2일 후의 주 3회의 경구 투여(200NU/㎏)를 4 주간 계속해서 총 12회 실시했다. 또한, 대조군에는 파클리탁셀 투여에 있어서의 용매(폴리옥시에틸렌피마자유:에탄올=1:1)를 마찬가지로 투여했다.

(2) 폰 프라이 시험(von Frey test)

바닥이 금속망으로 되어 있는 케이지에 상기 (1)의 3군의 쥐를 넣고, 1시간 순화시킨 후에 폰 프라이 필라멘트의 2, 4, 6, 8, 10, 15g의 강도의 것을 사용하여, 뒷다리 안쪽에 대하여 수직으로 필라멘트가 구부러질 때까지 압박해서 6초간 정지하고, 좌우 6회씩 시행해서 회피 반응의 회수를 측정했다. 또한, 측정은 투여 개시로부터 0, 2, 4, 5, 6주간 후에 행했다. 필라멘트 강도(g)를 x, 회피 반응수를 y로 한 산포도를 작성 후, 최소 제곱법을 이용하여 묘사한 y=A/(1+(exp(-B×(x-C)))의 시그모이드 곡선을 기초로, 6회(50%)의 반응에 상당하는 필라멘트 강도를 50% 반응역치로서 산출하고, 피험약의 이질통에 대한 효과를 시험했다.

상기 시험 결과의 일례를 도 1에 나타낸다. 파클리탁셀 투여군에서는 대조군에 비하여 현저하게 50% 반응역치가 저하되었다. 파클리탁셀에 본 발명 추출물을 병용해서 투여한 파클리탁셀+피험약 투여군에서는 대조군과 같은 정도의 50% 반응역치를 나타내고, 파클리탁셀 투여군과 비교하여 유의하게 50% 반응역치의 저하를 억제했다. 또한, 파클리탁셀+피험약 투여군에 있어서는, 피험약의 투여를 종료한 후에도 동통역치의 저하 억제를 계속해서 유지하는 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터, 본 발명 추출물은 파클리탁셀에 의한 지각 과민에 대하여 뛰어난 예방 또는 개선 작용을 갖는 것이 확인되었다.

(3) 아세톤 시험(Acetone test)

바닥이 금속망으로 되어 있는 케이지에 상기 (1)의 3군의 쥐를 각각 넣고, 1시간 순화시킨 후에 MicroSprayer(PENN-CENTURY사제)를 이용하여 뒷발에 아세톤 50㎕를 5초간 걸쳐서 분무하고, 아세톤 기화시의 냉각 작용을 이용해서 냉자극을 주었다. 분무 개시로부터 40초간 쥐의 회피 반응을 관찰하고, 반응할 때까지의 시간(잠복 시간)을 기록했다. 시험은 좌우 3회씩 행하여 평균치를 산출했다.

상기 시험 결과의 일례를 도 2에 나타낸다. 아세톤에 의한 냉자극에 대하여 파클리탁셀 투여군에서는 현저하게 잠복 시간이 단축되었지만, 파클리탁셀+피험약 투여군에서는 대조군과 거의 같은 정도로 잠복 시간이 회복되었다. 이상의 결과로부터, 본 발명 추출물은 파클리탁셀에 의한 지각 이상(냉감 자극에 대한 과민)에 대하여 뛰어난 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또한, 열자극에 의한 시험(발바닥 시험)에 있어서는 파클리탁셀 투여에 의한 잠복 시간의 단축은 보이지 않고, 파클리탁셀+피험약 투여군에 있어서도 대조군과 파클리탁셀 투여군과 잠복 시간은 동등했다. 항암제에 의한 말초신경장애의 증상에 있어서는 냉감 자극에 대하여 과민해지는 것을 특징적으로 들 수 있지만, 본 시험(아세톤 시험)은 이 증상을 반영한 것이고, 항암제에 의한 지각 과민에 대한 본 발명 추출물의 뛰어난 예방 또는 개선 작용을 나타내는 것이다.

약리 시험 2 : 인 비트로(in vitro) 시험계에서의 파클리탁셀에 의한 신경 세포 변성에 대한 작용

항암제인 파클리탁셀 처치에 의해 일어나는 신경 세포 변성에 대한 본 발명 추출물의 약리 작용을 조사할 목적으로, 신경 분화·돌기 신전의 모델 세포주인 쥐 부신 크롬 친화성 세포종(PC12, Pheochromocytoma 12) 및 척수후근신경절(dorsal root ganglia, DRG)의 세포를 이용하여 이하의 실험을 행했다.

(1) 세포의 배양

PC12 세포는 5% 소 태아 혈청, 10% 말 혈청, 100단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Gibco BRL사제)을 함유하는 RPMI1640배지(MP Biomedicals사제)를 사용하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 80㎤ 플라스크에서 배양했다.

또한, DRG 세포는 웅성 Sprague-Dawley계 쥐로부터 추출하여 초대 배양한 후, L4-5의 DRG 5절을 콜라게나아제 타입I(후나코시사제) 및 디스파제I(산코쥰야쿠사제)로 처리하고, 24well 플레이트에 파종하여 배양했다. 또한, 배양은 10% 소 태아 혈청, 100unit/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Gibco BRL사제)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM 배지, MP Biomedicals사제)를 사용하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 행했다.

(2) 약품의 처치 및 신경돌기 길이의 측정

PC12 세포를 24well 플레이트에 10,000cell/well로 파종하고, 3시간 후에 포스콜린 10μM를 처치해 돌기를 신전시키고, 24시간 후에 약물의 처치를 행했다. 또한, DRG 세포에 대해서는 1주간 배양하고, 세포의 접착 및 돌기의 신전을 확인 후, 약물의 처치를 행했다. 또한, 약물은 파클리탁셀 10ng/㎖만인 경우 및 파클리탁셀10ng/㎖에 각 농도의 피험약(0.001, 0.003, 0.01, 0.03NU/㎖)을 더 병용했을 경우를 각각 처치했다. 약물을 처치한 24 및 96시간 후에 각각 소정 농도의 약물 및 피 험약을 함유하는 새로운 배지로 교환하고, 168시간 후에 트리판 블루 염색액으로 사세포(死細胞)를 나누어 염색하고, 광학현미경으로 사진을 촬상했다(×200, 3시야/well). 촬상 후, 해석 소프트 Image J로 생세포에 있어서의 돌기의 길이를 측정했다.

상기 시험 결과의 일례를 도 3 및 4에 나타낸다. PC12 세포 및 DRG 세포 중 어느 것에 있어서나 파클리탁셀에 의해 신경돌기의 신전이 저해되지만, 본 발명 추출물을 병용해서 처치함으로써 농도 의존적으로 돌기 신전 저해가 유의하게 억제되는 것이 확인되었다. 특히, 신경 세포인 DRG 세포에 있어서 상기 효과가 확인된 점에서, 본 발명 추출물의 말초신경장애의 경감 작용은 신경돌기 신전 장애에 대한 억제가 그 작용기서의 하나다라는 것이 시사되었다.

약리 시험 3 : 옥사리플라틴에 의한 쥐 말초신경장애에 대한 작용

상기 약리 시험 1과 마찬가지로 백금 제제인 옥사리플라틴을 투여했을 경우에 생기는 기계적 자극에 의한 이질통 등의 지각 과민 및 저온 자극에 있어서의 지각 이상에 대한 본 발명 추출물(실시예 1에서 제조된 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출물)의 효과를 조사했다. 옥사리플라틴은 가장 말초신경장애를 일으키기 쉬운 약제이고, 본 장애를 예방·개선하는 방법이 강하게 요구되고 있다.

(1) 피험약의 투여

약리 시험 1과 마찬가지로, 대조군, 옥사리플라틴 투여군, 옥사리플라틴 및 피험약 투여군(옥사리플라틴+피험약 투여군)의 3군으로 쥐를 군 구성했다. 옥사리플라틴(100mg 동결 건조 제제)은 5% 포도당액에 용해해서 사용했다. 옥사리플라틴 투여군에는 옥사리플라틴을 2일간 연속 주 2회의 복강 내 투여(4㎎/㎏)를 4주간 계속해서 총 8회 실시했다. 옥사리플라틴+피험약 투여군에 대해서는 피험약을 옥사리플라틴의 투여 개시일, 2일째, 3일째의 주 3회, 경구 투여(200NU/㎏)했다. 피험약은 옥사리플라틴 투여 직전에 투여하고, 4주간 계속해서 총 12회 실시했다. 또한, 대조군에는 옥사리플라틴 투여에 있어서의 용매(5% 포도당액)를 마찬가지로 투여(1㎖/㎏)했다.

(2) 폰 프라이 시험(von Frey test)

약리 시험 1 (2)와 같은 방법으로, 매주 옥사리플라틴 투여 개시일로부터 6일째에 폰 프라이 시험을 행하여, 피험약의 이질통에 대한 효과를 시험했다.

상기 시험 결과의 일례(2주째)를 도 5에 나타낸다. 상기 시험의 2주째에는 옥사리플라틴 투여군에서는 대조군에 비하여 현저하게 50% 반응역치가 저하되었다. 이에 대하여, 옥사리플라틴에 본 발명 추출물을 병용해서 투여한 옥사리플라틴+피험약 투여군에서는 대조군과 같은 정도의 50% 반응역치를 나타내고, 옥사리플라틴 투여군과 비교해서 유의하게 50% 반응역치의 저하를 억제했다. 이상의 결과로부터 본 발명 추출물은 옥사리플라틴에 의한 지각 과민에 대하여 뛰어난 예방 또는 개선 작용을 갖는 것이 확인되었다.

(3) 콜드 플레이트 시험(Cold plate test)

옥사리플라틴 투여 개시일로부터 5일째에 콜드 플레이트 시험을 행하고, 저온 자극에 있어서의 지각 이상에 대한 피험약의 효과를 시험했다. 시험 전일에 상기 (1)의 3군의 쥐를 콜드 플레이트(Hot/Cold plate Cat. No.35100 Ugo Basile Biological Research Aparatus사제) 상에 30분간을 두어서 충분히 순화시켰다. 시험 당일은 4℃로 설정한 콜드 플레이트 상에 쥐를 올려놓고, 150초간 쥐의 행동을 관찰하고, 뒷발의 회피까지의 반응 시간(잠복 시간)을 측정했다. 또한, 행동 관찰은 시험 실시자의 선입관을 배제하기 위해서, 쥐 각 군의 투여 약물을 알지 못하도록 배려해서 행했다. 시험은 3회 행해서 평균하고, 평균치·표준 오차를 산출했다. 여러 군간의 비교는 1원 배치 분산 분석(one-way ANOVA) 후, 각 군간의 비교를 다른 약리 시험과 마찬가지로 투키-크레이머법에 의해 검정을 행했다. 검정에는 Stat View(Abacus Concepts, Berkely, CA, USA)를 사용하고, 5% 미만(p<0.05)의 위험률을 유의차로 간주했다.

상기 시험 결과의 일례(2주째)를 도 6에 나타낸다. 상기 시험의 2주째에는 콜드 플레이트에 있어서의 냉자극에 대하여, 옥사리플라틴 투여군에서는 현저하게 잠복 시간이 단축되었지만, 옥사리플라틴+피험약 투여군에서는 대조군과 거의 같은 정도로 잠복 시간이 회복되었다. 이상의 결과로부터, 본 발명 추출물은 옥사리플라틴에 의한 지각 이상(냉감 자극에 대한 과민)에 대하여 뛰어난 효과를 갖는 것이 확인되었다. 파클리탁셀과 마찬가지로, 옥사리플라틴에 의한 말초신경장애의 증상에 있어서는 냉감 자극에 대하여 과민해지는 것을 특징적으로 들 수 있지만, 상기 약리 시험 1 (3)의 아세톤 시험의 결과와 마찬가지로 본 시험(콜드 플레이트 시험)도 이 증상을 반영한 것이고, 항암제에 의한 지각 과민에 대한 본 발명 추출물의 뛰어난 예방 또는 개선 작용을 나타내는 것이다.

상기 약리 시험 결과로부터 분명하게 나타나 있는 바와 같이, 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 파클리탁셀이나 옥사리플라틴 등의 항암제의 투여에 의해 발생하는 기계적 자극에 의한 이질통 등의 지각 과민 및 저온 자극에 있어서의 지각 이상을 말초신경장애의 지표로서 실시한 쥐 경구 투여 시험에 있어서, 말초신경장애에 대한 뛰어난 예방 또는 경감 작용을 갖는 것이 확인되었다. 또한, 파클리탁셀에 의해 유발되는 신경돌기 신전 저해에 관한 인 비트로 시험에 있어서도 현저한 억제 작용을 나타냈다. 따라서, 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 파클리탁셀이나 옥사리플라틴 등의 항암제의 투여에 의해 야기되는 말초신경장애에 대하여 유효한 것이 나타내어졌다. 시판의 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출액 제제는 오랜 세월에 걸쳐서 사용되고, 매우 안정성이 높은 약제로서 인정받고 있다. 이렇게, 본 발명 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 사지말단의 저림 등의 지각 이상이나 동통 등의 지각 과민 등의 항암제에 의한 말초신경계의 신경장애 예방 또는 경감제로서 유효하고, 부작용도 거의 없고 안정성이 높은 매우 유용성이 높은 것이다.

Claims

백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제에 의한 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 1 항에 있어서, 상기 항암제는 미소관 저해제인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 2 항에 있어서, 상기 미소관 저해제는 탁산계 약제인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 3 항에 있어서, 상기 탁산계 약제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 3 항에 있어서, 상기 탁산계 약제는 파클리탁셀인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 2 항에 있어서, 상기 미소관 저해제는 빈알칼로이드계 약제인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 1 항에 있어서, 상기 항암제는 백금 제제인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 7 항에 있어서, 상기 백금 제제는 옥사리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴 또는 네다플라틴인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 7 항에 있어서, 상기 백금 제제는 옥사리플라틴인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제에 의한 말초신경장애는 급성 또는 만성의 동통, 저림, 지각 이상, 지각 과민 또는 감각 이상인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증 조직은 토끼의 피부 조직인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 경구제인 것을 특징으로 하는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사제인 것을 특징으로 하 는 말초신경장애의 예방 또는 경감제.