CN108601800A - 肌肉损伤的预防或治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种在肌肉损伤的预防或治疗中有用的药剂。本发明涉及痘苗病毒接种炎症组织提取物的新型医药用途，涉及含有该提取物作为有效成分的肌肉损伤的预防或治疗剂。以该提取物作为有效成分的本发明所涉及的肌肉损伤的预防或治疗剂作为有效性和安全性高的药剂非常有用。

Description

肌肉损伤的预防或治疗剂

技术领域

本发明涉及痘苗病毒接种炎症组织提取物的新的医药用途，具体而言，涉及含有痘苗病毒接种炎症组织提取物作为有效成分的肌肉损伤的预防或治疗剂。

背景技术

肌肉损伤(肌肉的损伤)是指肌纤维受到损伤。并且，根据损伤的程度，划分为I度(肌纤维的细微损伤)、II度(肌纤维的一部分断裂)、III度(肌纤维的完全断裂)这3个阶段。

如果发生了肌肉损伤，首先引起血管扩张和透过性的亢进，引起以肿胀、热感为征兆的反应、即炎症反应。在炎症反应时，作为白细胞的一种的中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润至损伤部位，吞食坏死的肌纤维，同时分泌可使肌卫星细胞增殖的细胞因子等。肌卫星细胞在损伤部位被迅速活化，形成成肌细胞。成肌细胞反复增殖，此后相互融合，从而分化为肌管细胞。接着肌管细胞最终成熟为肌纤维，完成肌肉修复(自然愈合)。直至该肌肉修复完成所花费的时间，在肌肉损伤的程度为II度时，通常为3周～1个月左右。

作为肌肉损伤的治疗法，可以列举保守疗法、手术疗法等。其中，在肌肉损伤完全断裂时采用手术疗法，但是通常采用保守疗法。

但是，在大幅依赖于自然愈合力的保守疗法中，如上所述，存在一定程度的长时间受限于不自由生活的担心等，因此，要求能够快速修复肌肉损伤的治疗法。

关于作为本发明所涉及的肌肉损伤的预防或治疗剂(以下称为“本发明药剂”。)的有效成分的痘苗病毒接种炎症组织提取物，已知有镇痛作用、镇静作用、抗应激作用、抗过敏作用(参照专利文献1)、免疫促进作用、抗癌作用、肝硬化抑制作用(参照专利文献2)、对特发性血小板减少性紫斑病的治疗效果(参照专利文献3)、对带状疱疹后遗神经痛、脑水肿、痴呆、脊髄小脑变性症等的治疗效果(参照专利文献4)、对雷诺综合征、糖尿病性神经障碍、亚急性脊髓视神经病后遗症等的治疗效果(参照专利文献5)、激肽释放酶产生抑制作用、末梢循环障碍改善作用(参照专利文献6)、骨萎缩改善作用(参照专利文献7)、对败血症、内毒素性休克的治疗有效的一氧化氮产生抑制作用(参照专利文献8)、对骨质疏松症的治疗效果(参照专利文献9)、基于Nef作用抑制作用、趋化因子产生抑制作用的艾滋病治疗效果(参照专利文献10、11)、对脑梗塞等缺血性疾病的治疗效果(参照专利文献12)、对纤维肌痛症的治疗效果(参照专利文献13)、对感染症的治疗效果(参照专利文献14)、由抗癌剂引起的末梢神经障碍的预防或减轻作用(参照专利文献15)、慢性前列腺炎、间质性膀胱炎和/或排尿障碍的治疗效果(参照专利文献16)、BDNF等神经营养因子的产生促进作用(参照专利文献17)、软骨细胞中的胶原蛋白和粘蛋白合成促进作用(参照专利文献18)等。但是，尚不知道作为本发明药剂的有效成分的痘苗病毒接种炎症组织提取物对肌肉损伤的预防或治疗有效。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭53－101515号公报

专利文献2：日本特开昭55－87724号公报

专利文献3：日本特开平1－265028号公报

专利文献4：日本特开平1－319422号公报

专利文献5：日本特开平2－28119号公报

专利文献6：日本特开平7－97336号公报

专利文献7：日本特开平8－291077号公报

专利文献8：日本特开平10－194978号公报

专利文献9：日本特开平11－80005号公报

专利文献10：日本特开平11－139977号公报

专利文献11：日本特开2000－336034号公报

专利文献12：日本特开2000－16942号公报

专利文献13：国际公开第2004/039383号

专利文献14：日本特开2004－300146号公报

专利文献15：国际公开第2009/028605号

专利文献16：国际公开第2011/111770号

专利文献17：国际公开第2011/162317号

专利文献18：国际公开第2012/051173号

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供对肌肉损伤的预防或治疗有效且安全性高的药剂。

用于解决课题的方法

本发明的发明人对寻求有效治疗法的肌肉损伤的药剂治疗进行了深入研究，结果发现，痘苗病毒接种炎症组织提取物在肌肉损伤中具有优异的修复促进作用，从而完成了本发明。

根据本发明，能够大幅缩短肌肉损伤的修复愈合所需要的时间。

发明的效果

痘苗病毒接种炎症组织提取物具有促进肌肉损伤的修复这样的优异的药理作用。

由此，该提取物能够通过事先给药而发挥减轻肌肉损伤程度的效果，或者能够通过事后给药而发挥迅速愈合肌肉损伤的效果。

因此，含有该提取物作为有效成分的本发明药剂作为肌肉损伤的预防或治疗剂的有用性高。特别是本发明药剂是副作用等问题极少的药剂，因此安全性也很高。

具体实施方式

本发明涉及含有痘苗病毒接种炎症组织提取物作为有效成分的肌肉损伤的预防或治疗剂。因此，本发明药剂对肌肉损伤的预防或治疗有用。

另外，痘苗病毒接种炎症组织提取物对肌肉损伤的修复具有促进作用。因此，本发明药剂可以作为肌肉损伤的修复促进剂使用。

作为以本发明药剂进行预防或治疗对象的肌肉损伤中的肌肉，只要是发生肌肉损伤的部分或有担心发生肌肉损伤的部分即可，没有特别限定，例如，可以列举股四头肌、腘绳肌、椎旁肌和腓肠肌等。另外，肌肉损伤的原因没有特别限定，因手术侵袭引起的肌肉损伤也是本发明药剂的预防或治疗对象。

关于痘苗病毒接种炎症组织提取物，如上所述，已经报告了其是在接种了痘苗病毒的炎症组织中产生的生理活性物质，并报告了从病态组织提取该物质的方法以及它们的药理活性等(参照上述专利文献1～18等)。

另外，作为能够用作本发明药剂的市售的制剂，有痘苗病毒接种家兔炎症皮肤提取液制剂。该制剂如在日本的医疗用医药品集〔2016年版、一般财团法人日本医药情报中心编辑、发行〕的3525～3527页中记载的那样，是含有从接种了痘苗病毒的家兔的炎症皮肤组织提取分离的非蛋白质性的活性物质的制剂。被认可适用于腰痛症、颈肩腕综合症、症状性神经痛、肩关节周围炎、变形性关节病、伴随皮肤疾病(湿疹、皮炎、荨麻疹)的瘙痒、过敏性鼻炎、亚急性脊髓视神经病后遗症状的寒冷感、感觉异常和疼痛、带状疱疹后遗神经痛等，而且，皮下注射、肌肉注射、静脉注射用的注射剂以及片剂作为医疗用医药品得到承认并被销售。

以下，对制造作为本发明药剂的有效成分的痘苗病毒接种炎症组织提取物的方法等进行说明。

本发明药剂中使用的痘苗病毒接种炎症组织提取物能够通过如下操作得到：接种痘苗病毒，将发痘的炎症组织破碎，加入提取溶剂，除去组织碎片后，进行除蛋白处理，使其吸附于吸附剂，然后将有效成分洗脱。

痘苗病毒接种炎症组织提取物例如通过以下的工序制造。

(A)收集皮内接种了痘苗病毒并使其发痘的兔、小鼠等的皮肤组织等，将发痘组织破碎，加入水、苯酚水、生理盐水或苯酚加甘油水等提取溶剂，进行数日的提取处理后，通过过滤或离心分离除去组织碎片，得到粗提取液(滤液或上清)。

(B)将(A)中得到的粗提取液调整为酸性的pH并加热，进行过滤或离心分离，进行除蛋白处理。接着，将除蛋白后的溶液调整为碱性的pH并加热，进一步进行过滤或离心分离，得到了经除蛋白处理过的滤液或上清。

(C)将(B)中得到的滤液或上清调整为酸性的pH，使其吸附于活性炭、高岭土等吸附剂。

(D)在(C)中得到的吸附剂中加入水等提取溶剂，调整为碱性的pH，将吸附成分洗脱，由此能够得到痘苗病毒接种炎症组织提取物。

以上是基本的工序，以下对这些工序进行更详细地叙述。

关于(A)

作为用于接种痘苗病毒而得到炎症组织的动物，能够使用兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等感染痘苗病毒的各种动物，作为炎症组织，优选兔的炎症皮肤组织。

收集这些炎症组织，用苯酚溶液等清洗，进行消毒。将该炎症组织破碎，加入其1至5倍量的提取溶剂，形成乳化悬浊液。

其中，所谓破碎是指使用绞碎机等细细地破碎为肉末状。另外，作为提取溶剂，能够使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性至弱碱性的缓冲液等，也可以适当添加甘油等稳定剂、苯酚等杀菌-防腐剂、氯化钠、氯化钾、氯化镁等盐类等。此时，也能够通过冷冻融化、超声波、细胞膜溶解酶或表面活性剂等的处理来破坏细胞组织，使提取变得容易。将得到的悬浮液放置5日至12日。在该期间，可以边适当搅拌或不搅拌边加温到30至45℃。通过对得到的液体进行过滤或者离心分离而除去组织碎片，得到粗提取液(滤液或上清)。

关于(B)

将在(A)中得到的粗提取液通过过滤或者离心分离除去组织碎片，之后进行除蛋白处理。除蛋白操作能够由通常进行的公知方法实施，能够应用加热处理、利用蛋白质变性剂(例如酸、碱、脲、胍、丙酮等有机溶剂等)的处理、等电点沉淀、盐析等方法。接着，利用除去不溶物的通常方法，例如使用滤纸(纤维素、硝酸纤维素等)、玻璃过滤器、硅藻土、塞茨过滤板(Seitz filter)等的过滤、超滤、离心分离等，得到除去了析出的不溶蛋白质的滤液或上清。

关于(C)

将在工序(B)中得到的滤液或上清调整为酸性、优选调整为pH3.5～5.5，进行向吸附剂的吸附操作。作为能够使用的吸附剂，能够列举活性炭、高岭土等，在提取液中添加吸附剂进行搅拌，或使提取液通过吸附剂填充柱，能够使有效成分吸附于该吸附剂。在提取液中添加吸附剂时，通过过滤或离心分离等除去溶液，能够得到吸附有活性成分的吸附剂。

关于(D)

为了使有效成分从(C)中得到的吸附剂中洗脱(脱离)，能够在该吸附剂中加入洗脱溶剂，在室温或适当加热下或者搅拌进行洗脱，以过滤或离心分离等通常的方法除去吸附剂来实现。作为所使用的洗脱溶剂，能够使用碱性溶剂，例如，能够使用调整为碱性pH的水、甲醇、乙醇、异丙醇等或它们的适当的混合溶液，能够优选使用调整为pH9～12的水。洗脱溶剂的量能够适当设定。

这样操作得到的提取物(洗脱液)能够适当制备为作为制剂用原药、医药品制剂优选的形态。例如，也能够将溶液的pH调整为中性附近，形成为制剂用原药，另外，也能够通过浓缩、稀释使其达到所期望的浓度。另外，也能够作为注射用制剂添加氯化钠而制备为与生理盐水等渗的溶液。另外，通过将这些溶液浓缩干固或冻结干燥，也可以制备为能够用作片剂等的原料的固态物的形态。

作为对患者给药的方法，除了口服给药以外，还可以列举皮下、肌肉内、静脉内给药等，给药量能够根据痘苗病毒接种炎症组织提取物的种类适当设定。就市售的制剂中批准的给药量而言，根据上述日本的医疗用医药品集(3525页)，例示有基本上在内服时1天给药16NU、在注射剂时1天给药3.6～7.2NU，但能够根据疾病的种类、严重程度、患者的个体差异、给药方法、给药周期等而适当增减给药量(NU：神经妥乐平单位。所谓神经妥乐平单位，是使用疼痛阈值比正常动物低的慢性应激动物即SART应激小鼠，按照改进的Randall-Selitto方法进行试验，基于镇痛效力的ED₅₀值而规定的。1NU表示ED₅₀值为100mg/kg时的神经妥乐平制剂的含镇痛活性成分1mg的活性。)。

以下，例示痘苗病毒接种炎症组织提取物的制造方法的具体例以及该提取物的新的药理作用、即肌肉损伤的修复促进作用的药理试验结果，但是本发明不受这些实施例记载的任何限制。

实施例

实施例1

在健康的成年家兔的皮肤中接种痘苗病毒，剥下发痘的皮肤，将其破碎并添加苯酚水。接着对其进行加压过滤，将所得到的滤液用盐酸调整为pH5之后，以90～100℃加热处理30分钟。进行过滤并除蛋白之后，用氢氧化钠调整为pH9，接着以90～100℃加热处理15分钟之后进行过滤。将滤液用盐酸调整为约pH4.5，添加2％的活性炭并搅拌2小时之后，进行离心分离。在收集的活性炭中添加水，用氢氧化钠调整为pH10，在60℃搅拌1.5小时之后，进行离心过滤分离得到上清。向收集的活性炭中再次添加水，用氢氧化钠调整为pH11，在60℃搅拌1.5小时之后，进行过滤分离得到上清。合并两上清，用盐酸进行中和，得到痘苗病毒接种家兔炎症皮肤提取物。

实施例2

在健康的成年家兔的皮肤中接种痘苗病毒使其感染之后，无菌地剥下发痘的皮肤，将其细切之后添加入含有苯酚的甘油水，用匀浆器磨碎，形成为乳状。接着将其过滤，将得到的滤液用盐酸调整为弱酸性(pH4.5～5.5)之后，在100℃进行加热处理并过滤。将滤液用氢氧化钠调整为弱碱性(pH8.5～10.0)，接着在100℃加热处理后进行过滤。将滤液用盐酸调整为约pH4.5，添加约1.5％的活性炭，搅拌1～5小时后进行过滤。在过滤得到的活性炭中添加水，用氢氧化钠调整为pH9.4～10，搅拌3～5小时后，进行过滤，将滤液用盐酸中和。

实施例3

在健康的成年家兔的皮肤中接种痘苗病毒，使其活化之后，将活化的皮肤无菌地剥下，将其细切之后添加水，用匀浆器磨碎，形成为乳状物。接着将其加压过滤，将得到的滤液用盐酸调整为pH5.0后，在流通蒸气下以100℃进行加热处理。进行过滤并除蛋白之后，用氢氧化钠调整为pH9.1，进一步在100℃加热处理之后进行过滤。将滤液用盐酸调整为pH4.1，添加活性炭2％，搅拌2小时之后进行过滤。滤液中进一步添加活性炭5.5％，搅拌2小时之后进行过滤。在最初的过滤得到的活性炭中加入水，用氢氧化钠调整为pH9.9，在60℃搅拌1.5小时之后进行过滤。在最初的活性炭和接着的活性炭中添加水，用氢氧化钠调整为pH10.9，在60℃搅拌1.5小时之后进行过滤。合并滤液并用盐酸中和之后，以使用了分子量100的膜的电透析法进行脱盐处理，在减压下干固。

接着，例示将上述实施例1中得到的本发明的痘苗病毒接种炎症组织提取物(以下，也记载为“本提取物”。)作为被验药，对于肌肉损伤预防和治疗作用相关的药理试验的结果的一例。

药理试验

使用8周龄雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠24只。以棘突为中心，将右侧作为损伤侧，实施全身麻醉(用生理食盐水进行倍量稀释，对腹腔内给药戊巴比妥0.3～0.5mL)后，在各大鼠的四肢安装橡胶带，固定于实验台。将损伤预定部(右侧椎旁肌，高位为第4腰椎水平)充分剃毛。在损伤预定部设置塑料制圆柱的前端，从1m的高度使115g的重锤落下(在塑料制圆柱内自由落下)，使椎旁肌损伤[对参考文献(Crisco JJ,Joki P,Heinen GT,Connell MD,Panjabi MM.A muscle contusion injury model.Biomechanics,physiology,and histology.Am J Sports Med.1994；22(5):702-10.)中记载的drop-mass法做了一部分修正]。此后，分为立即在损伤部皮下注射生理盐水(5μL)的组(未治疗组：n＝12)和立即皮下注射本提取物(5μL)的组(治疗组：n＝12)进行各组的评价。

评价项目为关于损伤后1日、3日、7日的各组(各n＝4)的损伤部椎旁肌的苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin：HE)染色的急性期反应和组织修复反应进行比较研究。

在各时间进程中，在实施全身麻醉(用生理食盐水进行倍量稀释，腹腔内给药戊巴比妥0.3～0.5mL)之后摘取损伤部的椎旁肌，用4％多聚甲醛(Paraformaldehyde：PFA)液实施组织固定。对于4％PFA固定的被检测体，使用Tissue-Tek[注册商标]VIP(SakuraFinetek Japan Co.,Ltd.制)，用乙醇脱水，制作石蜡块，将其设置于切片机SM2010R(Leicamicrosystems制(Leica microsystems,Wetzlar,Germany))，制作厚度约4μm的石蜡切片。以脱石蜡(二甲苯3槽：计3分钟30秒→乙醇4槽：计5分钟)、流水水洗(3分钟)、蒸馏水水洗(1分钟)、核的染色(梅氏苏木精液(苏木精I：20秒→苏木精II：3分钟))、流水水洗(3分钟)、用磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline)显色、流水水洗(1分钟)、50％乙醇(20秒)、细胞质等的染色(伊红：30秒)、脱水(100％乙醇5槽：计4分钟)、透明(二甲苯4槽：计4分钟)、封入的顺序进行HE染色的处理。使用处理后的切片，用显微镜(BX51，奥林巴斯株式会社制)对损伤部中的上述评价项目进行观察。

结果

作为HE染色的评价方法，将水肿、出血等急性反应现象、中性粒细胞聚集和成纤维细胞等的增殖性(组织修复开始)现象以及脂肪变性和肌纤维的萎缩(组织延迟愈合)现象的各观察项目的相对强度(量)分为：0分：无现象；1分：很轻度；2分：中等度；3分：高度共计4阶段进行评价并评分。

每个时间进程的各组中的椎旁肌HE染色评价的平均分结果如下表所示。

[表1]

表1.损伤后1日

在损伤后1日，治疗组与未治疗组相比，水肿和出血的分值为低值，显示了在急性期对水肿和出血的抑制。

[表2]

表2.损伤后3日

在损伤后3日，治疗组与未治疗组相比，中性粒细胞聚集和成纤维细胞出现的分值为高值，显示了更确实地开始了组织修复过程。

[表3]

表3.损伤后7日

在损伤后7日，治疗组与未治疗组相比，脂肪变性肌肉萎缩的分值为低值，没有确认到组织延迟愈合趋势，显示了进行着良好的组织修复过程(变性细胞组织的吸收和肌纤维的修复等)。

根据上述表1～3的结果，显示治疗组与未治疗组相比，在损伤后1日的水肿和出血的抑制、在损伤后3日的组织修复过程的确实开始、在损伤后7日的良好的组织修复过程进展。即，显示了本提取物具有肌肉损伤的修复促进作用。

产业上的可利用性

如由上述药理试验的结果可知，确认了本发明药剂具有肌肉损伤的修复促进作用，因此，显示本发明药剂作为肌肉损伤的预防或治疗剂有用。市售的痘苗病毒接种家兔炎症皮肤提取液制剂长年使用，作为安全性非常高的药剂得到承认。这样，本发明药剂作为肌肉损伤的预防或治疗剂有效，几乎没有副作用，安全性高，有用性极高。

Claims (10)

1.一种肌肉损伤的预防或治疗剂，其特征在于：

含有痘苗病毒接种炎症组织提取物作为有效成分。

2.如权利要求1所述的预防或治疗剂，其特征在于：

炎症组织为皮肤组织。

3.如权利要求2所述的预防或治疗剂，其特征在于：

炎症组织为兔的炎症皮肤组织。

4.如权利要求1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其特征在于：其为注射剂。

5.如权利要求1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其特征在于：其为口服剂。

6.一种肌肉损伤的修复促进剂，其特征在于：

含有痘苗病毒接种炎症组织提取物作为有效成分。

7.如权利要求6所述的修复促进剂，其特征在于：

炎症组织为皮肤组织。

8.如权利要求7所述的修复促进剂，其特征在于：

炎症组织为兔的炎症皮肤组织。

9.如权利要求6～8中任一项所述的修复促进剂，其特征在于：其为注射剂。

10.如权利要求6～8中任一项所述的修复促进剂，其特征在于：其为口服剂。