CN102427817A - 起因于gne蛋白质功能降低的疾病的治疗用药物、食品组合物、食品添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种起因于GNE蛋白质功能降低的疾病的治疗用药物、食品组合物和食品添加剂。本发明的治疗用药物的特征在于包含具有增加细胞中的N-乙酰神经氨酸量的效果的化合物。作为治疗用药物中含有的化合物,可以列举N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物、N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、含有N-乙酰神经氨酸的化合物、含有N-乙酰神经氨酸衍生物的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺衍生物的化合物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质和所述中间产物的分解酶抑制物质等。
Description
技术领域
本发明涉及一种起因于GNE蛋白质功能降低的疾病的治疗用药物、食品组合物、食品添加剂。
背景技术
已知即使在肌病(肌肉疾病)中,远端型肌病(DMRV)或遗传性包涵体肌病(HIBM)等也是由于GNE基因功能丧失型突变而引起的,是15-40岁发病的常染色体隐性疾病。
GNE基因对在N-乙酰神经氨酸生物合成路径的限速酶UDP-GlcNAc2-差向异构酶/ManNAc-激酶进行编码(例如,参考非专利文献1、2),该酶负责从UDP-GlcNAc到ManNAc、和从ManNAc到ManNAc6-磷酸的两个酶反应。因此,报告称罹患肌病的骨骼肌细胞、其原代培养细胞中N-乙酰神经氨酸量减少(例如,参考Noguchi,S.etal.,J.Biol.Chem.279(12),11402-11407,2004;Nonaka,I.et al.,Curr.Neurol.Neurosci.Rep.5(1),61-65,2005)。
作为罹患这种起因于GNE基因突变的肌病的肌肉组织的病理学特征,可以列举边缘空泡的形成、肌肉纤维大小不同、核内包涵体形成、β淀粉状蛋白质沉积等。在临床病理学上,胫骨前肌特别容易被侵蚀,颈部屈肌群、脊旁肌、大腿后面的膝屈肌群也容易被侵蚀。随着症状的发展,小腿后面的肌群、上肢肌也被侵蚀,但股四头肌能保持到比较靠后的时间。
起因于GNE基因突变的肌病发展到肌肉萎缩的过程还不清楚,期待对其的解释以及有效的治疗方法和治疗药物的开发。
但是,为进行治疗而给予患者N-乙酰神经氨酸,对此有很多报告否定其可能性。例如,有报道称,由于N-乙酰神经氨酸分子为酸性,因此在GNE基因突变动物和正常动物中,不易被细胞吸收(例如,参考Datta,Biochemistry 13,3987-3991,1978;Harms and Reutter,Cancer Res.34,3165-3172,1974;Hirschberg et al.,Biochemistry15,3591-3599,1976;Diaz and Varki,Anal.Biochem.150,32-46,1985;Ferwerda et al.,Biochem.Soc.Transactions 17,744-745,1989)。还有报道称,N-乙酰神经氨酸在动物个体血中的半衰期非常短(例如,参考Nohle,U.et al.,Eur.J.Biochem.126,543-548,1982),并且给予游离的N-乙酰神经氨酸时,对增加神经节苷脂中的N-乙酰神经氨酸没有特别的效果(例如参考Carlson,S.E.and House,S.G.,J.Neutr.116,881-886,2009)等,认为将N-乙酰神经氨酸作为药剂给药难以得到临床效果。因此,作为药物的有效物质,N-乙酰神经氨酸自身未曾被研究(例如,参考WO2008/150477 A2公报)。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种起因于GNE蛋白质功能降低的肌病的治疗用药物、食品组合物、和食品添加剂。
解决问题的手段
本发明的药物是用于治疗起因于GNE蛋白质功能降低的疾病的药物,包括从由N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物、N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、含有N-乙酰神经氨酸的化合物、含有N-乙酰神经氨酸衍生物的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺衍生物的化合物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质和所述中间产物的分解酶抑制物质构成的群中选择的一种或两种以上的化合物的组合。
此处,所述N-乙酰神经氨酸衍生物用下述式1表示:
式中,XP(P为从1到6的整数)为O或S,对于RP(P为从2到6的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、烷酰基(アルカノイル)或烷基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为烷酰基或烷基,X1为O时,R1为氢、烷基或烷酰基烷基,X1为S时,R1为烷基或烷酰基烷基,R7为氢、烷酰基或羟基烷酰基。
另外,所述N-乙酰甘露糖胺衍生物用下述式2表示:
式中,XP(P为从1到4的整数)为O或S,对于RP(P为从1、3、4、5中选择的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、烷基、烷酰基烷基或烷酰基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为烷基、烷酰基烷基或烷酰基,R2为氢或烷酰基。
此外,优选式1和2中的烷酰基、烷基、烷酰基烷基和羟基烷酰基为低级基团。
此处,优选GNE蛋白质功能降低是由GNE基因突变引起的,进一步优选疾病为肾功能障碍或肌病。
此外,优选所述中间产物为N-乙酰甘露糖胺-6磷酸或N-乙酰神经氨酸-9磷酸。
另外,优选所述N-乙酰神经氨酸衍生物为Ac5NeuAc或Ac5NeuAc-Me,优选所述N-乙酰甘露糖胺衍生物为Ac4ManNAc。
另外,优选所述含有N-乙酰神经氨酸的化合物为唾液酸乳糖(シアリルラクト一ス)。
优选所述中间产物分解酶抑制物质为GlcNAcol或GlcNAcol衍生物,更优选GlcNAcol的衍生物为Ac5GlcNAcol。
本发明的食品组合物包含从由N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质和在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物的分解酶抑制物质构成的群中选择的一种或两种以上的化合物的组合。
此处,所述N-乙酰神经氨酸衍生物用下述式1表示:
式中,XP(P为从1到6的整数)为O或S,对于RP(P为从2到6的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、烷酰基或烷基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为烷酰基或烷基,X1为O时,R1为氢、烷基或烷酰基烷基,X1为S时,R1为烷基或烷酰基烷基,R7为氢、烷酰基或羟基烷酰基。
另外,所述N-乙酰甘露糖胺衍生物用下述式2表示:
式中,XP(P为从1到4的整数)为O或S,对于RP(P为从1、3、4、5中选择的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、烷基、烷酰基烷基或烷酰基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为烷基、烷酰基烷基或烷酰基,R2为氢或烷酰基。
此外,优选式1和2中的烷酰基、烷基、烷酰基烷基和羟基烷酰基为低级基团。
此处,优选所述N-乙酰神经氨酸衍生物为Ac5NeuAc或Ac5NeuAc-Me,优选所述N-乙酰甘露糖胺衍生物为Ac4ManNAc。
另外,优选所述中间产物的分解酶抑制物质为GlcNAcol或GlcNAcol衍生物,更优选GlcNAcol的衍生物为Ac5GlcNAcol。
本发明的食品特征在于含有上述任一种食品组合物。
本发明的食品添加剂特征在于,含有从N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物或含N-乙酰神经氨酸的化合物中选择的一种或两种以上物质的组合,且所述N-乙酰神经氨酸、所述在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物和所述含有N-乙酰神经氨酸的化合物为自天然物质纯化的化合物或化学合成的化合物。
此处,优选所述N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物或含N-乙酰神经氨酸的化合物的总含量在50%以上。
本发明的含有食品添加剂的食品的制造方法其特征在于包括添加上述任一种食品添加剂的步骤。
本发明的含有食品添加剂的食品其特征在于是通过上述任一种含有食品添加剂的食品的制造方法制造的。
==相关申请的交叉引用==
本申请要求以2009年5月15日申请的日本专利申请2009-119272为基础的优先权,通过引用该基础申请,将其内容包含在本说明书中。
附图说明
图1是示出在本发明的一个实施方案中在各种试剂存在的条件下培养来自DMRV小鼠模型的肌管细胞时的结蛋白、WGA、SBA标识的显微镜照片。
图2是示出在本发明的一个实施方案中在浓度不同的各种试剂存在的条件下培养来自DMRV患者的肌管细胞时的NeuAc量的图表。
图3是示出在本发明的一个实施方案中在各种试剂存在的条件下培养来自DMRV小鼠模型的肌管细胞时的NeuAc量的图表。
图4是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时的存活率的图表。
图5是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时的存活率的图表。
图6是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时肌肉组织中的NeuAc量的图表。
图7是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型40或者400mg/kg的Ac4ManNAc时肌肉组织中的NeuAc量的图表。
图8是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时血中肌酸激酶活性的图表。
图9是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时的行走距离的图表。
图10是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时的行走距离的图表。
图11是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时的悬挂时间的图表。
图12是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时在持久力测试中小鼠受到电刺激次数的图表。
图13是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时在持久力测试中小鼠受到电刺激次数的图表。
图14是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时腓肠肌截面积的图表。
图15是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时腓肠肌比收缩力的图表。
图16是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时腓肠肌比收缩力的图表。
图17是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时Pt(等长性收缩力)/肌肉截面积的图表。
图18是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时Pt(等长性收缩力)/肌肉截面积的图表。
图19是在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时用苏木精-曙红染色(H-E)、酸性磷酸酶活性染色、抗淀粉状蛋白抗体(LC3)标识、刚果红染色的肌肉组织的显微镜照片。
图20是在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时抗β淀粉状蛋白抗体(Aβ1-40、Aβ1-42)标识、抗磷酸化tau抗体标识的肌肉组织的显微镜照片。
图21是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时肌肉组织中的边缘空泡数的图表。
图22是示出在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型各种试剂时肌肉组织中含有淀粉状蛋白的边缘空泡数的图表。
图23是在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型40或者400mg/kg的Ac4ManNAc时用苏木精-曙红染色(H-E)、改良Gomori三色染色或酸性磷酸酶活性染色的肌肉组织的显微镜照片。
图24是在本发明的一个实施方案中给予DMRV小鼠模型40或400mg/kg的Ac4ManNAc时抗Lamp2抗体标识、抗β淀粉状蛋白抗体(Aβ1-42)标识、抗p62蛋白质抗体标识的肌肉组织的显微镜照片。
具体实施方式
以下在列举实施例的同时对基于以上认知完成的本发明的实施方案进行详细说明。但是,本发明不限于以下实施例。
在对实施方案和实施例无特殊说明时,使用J.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis(Ed.),Molecular cloning,a laboratory manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York(2001);F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith,K.Struhl(Ed.),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Ltd.等标准方案集里记载的方法、或对其加以修饰或改变的方法。另外,在使用市售的试剂盒、测定装置时,无特殊说明的情况下使用其中所附的方案。
此外,对于本发明的目的、特征、优势及其思想,根据本说明书的记载,本领域技术人员可以明了,由本说明书的记载,本领域技术人员能很容易再现本发明。以下记载的发明的实施方案和具体的实施例等是本发明的优选实施方案,是用于例示或说明而示出的,不是用于进一步限定本发明的。在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内,基于本说明书的记载可以进行各种修饰,这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
===化合物===
首先,对用于制造本发明的药物、食品组合物或者食品添加剂的化合物进行详细说明。
(1)N-乙酰神经氨酸
对N-乙酰神经氨酸的来源没有限制,例如,可以是自包含N-乙酰神经氨酸的动物组织、培养细胞、哺乳动物的奶、鸡蛋等用公知的方法分离、纯化的天然来源的N-乙酰神经氨酸,也可以是化学合成的N-乙酰神经氨酸。
(2)在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物
在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物优选为N-乙酰甘露糖胺-6磷酸或N-乙酰神经氨酸-9磷酸。对这些中间产物的来源没有限制,例如,可以是自动物组织或培养细胞等用本领域技术人员公知的方法分离、纯化的天然来源的中间产物,也可以是化学合成的中间产物。
(3)N-乙酰神经氨酸衍生物和N-乙酰甘露糖胺衍生物
N-乙酰神经氨酸衍生物用下述式1表示:
式中,XP(P为从1到6的整数)为O或S,对于RP(P为从2到6的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、烷酰基或者烷基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为烷酰基或者烷基,X1为O时,R1为氢、烷基或者烷酰基烷基,X1为S时,R1为烷基或者烷酰基烷基,R7为氢、烷酰基或羟基烷酰基。此处,所谓与该RP相邻接并键合的XP,具体而言,对于R1、R2、R3、R4、R5、R6,分别是指X1、X2、X3、X4、X5、X6。此外,XP(P为从1到6的整数)和RP(P为从1到7的整数)分别独立选择。
N-乙酰甘露糖胺衍生物用下述式2表示:
式中,XP(P为从1到4的整数)为O或者S,对于RP(P为从1、3、4、5中选择的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、烷基、烷酰基烷基或者烷酰基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为烷基、烷酰基烷基或者烷酰基,R2为氢或者烷酰基。此处,所谓与该RP相邻并键合的XP,具体而言,对于R1是指X1、对于R3是指X2、对于R4是指X3、对于R5是指X4。此外,XP(P为从1到4的整数)和RP(P为从1到5的整数)分别独立选择。
此外,优选式1和2中的烷酰基、烷基、烷酰基烷基以及羟基烷酰基为低级基团。
只要没有特别限定,烷基、烷氧基、烯基、炔基等包括直链和侧链两者。像“丙基”那样没有支链的基团只包括直链的。
以下显示各R基的具体例子,但其不限于这些。低级烷基例如优选(C1-C6)烷基,这样的低级烷基或(C1-C6)烷基具体可以例举甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基。(C3-C6)环烷基可以例举环丙基、环丁基、环戊基或环己基。(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基可以例举环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、2-环丙基乙基、2-环丁基乙基、2-环戊基乙基、2-环己基乙基。(C2-C6)链烯基可以例举乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基。(C2-C6)炔基可以例举乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基。低级烷酰基例如优选直链或支链(C2-C6)烷酰基,具体地,可以例举乙酰基、丙酰基(プロパノイル)、丁酰基(ブタノイル)、戊酰基(ペンタノイル)、己酰基(ヘキサノイル)。卤代(C1-C6)烷基可以例举碘甲基、溴甲基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、2-氯乙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、五氟乙基。羟基(C1-C6)烷基可以例举羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、1-羟基丙基、2-羟基丙基、3-羟基丙基、1-羟基丁基、4-羟基丁基、1-羟基戊基、5-羟基戊基、1-羟基己基、6-羟己基。(C1-C6)烷氧羰基可以例举甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、异丙氧羰基、丁氧羰基、戊氧羰基、己氧羰基。(C2-C6)羟基烷酰基可以例举羟乙酰基、乳酰基、羟基丁酰基、羟基戊酰基、羟基己酰基。
对这些N-乙酰神经氨酸衍生物和N-乙酰甘露糖胺衍生物的来源没有特别限制,可以是天然来源的,也可以是用本领域技术人员公知的方法合成的各衍生物。合成N-乙酰神经氨酸衍生物的情况下,用于合成的原料化合物只要在能合成期望的N-乙酰神经氨酸衍生物的范围内则并无特别限制,例如,可以使用前述任一种N-乙酰神经氨酸,也可以用通过已经公知的方法合成的其他种类的N-乙酰神经氨酸衍生物。另外,合成N-乙酰甘露糖胺衍生物的情况下,用于合成的原材料化合物只要在能合成期望的N-乙酰甘露糖胺衍生物的范围内则并无特别限制,例如,可以使用N-乙酰甘露糖胺,也可以使用通过已经公知的方法合成的其他种类的N-乙酰甘露糖胺衍生物。
(4)含有N-乙酰神经氨酸的化合物、含有N-乙酰神经氨酸衍生物的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺的化合物和含有N-乙酰甘露糖胺衍生物的化合物
含有N-乙酰神经氨酸的化合物、含有N-乙酰神经氨酸衍生物的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺的化合物和含有N-乙酰甘露糖胺衍生物的化合物只要是包含上述N-乙酰神经氨酸、N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺或者N-乙酰甘露糖胺衍生物中的任一个作为其构造的一部分的化合物就没有特别限制,例如,可以列举天然来源的作为含有N-乙酰神经氨酸的糖的唾液酸乳糖、作为含有N-乙酰神经氨酸的肽的酪蛋白糖巨肽或粘蛋白、作为含有N-乙酰神经氨酸的糖脂的神经节苷脂等。这些化合物可以是天然来源的化合物,也可以是用本领域技术人员公知的方法人工合成的化合物。
(5)分解酶抑制物质
N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质或者在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物的分解酶抑制物质只要是抑制存在于细胞内的N-乙酰神经氨酸、N-乙酰甘露糖胺或中间产物的分解酶的功能的物质,就没有特别限制。作为N-乙酰神经氨酸的分解酶,例如可以列举N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂合酶。另外,作为N-乙酰甘露糖胺的分解酶,例如可以列举GlcNAc2-差向异构酶。作为由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物,例如可以列举N-乙酰甘露糖胺-6磷酸或者N-乙酰神经氨酸-9磷酸。分解酶抑制物质只要在有抑制酶功能的作用的范围内则无特别限制,例如对编码酶的DNA序列特异的siRNA那样的表达抑制物质也可以。在为siRNA的情况下,可用本领域技术人员公知的方法合成期望的siRNA。或者,抑制物质也可以是通过与酶结合来抑制功能的化合物,对于N-乙酰甘露糖胺的分解酶,例如,N-乙酰葡糖胺醇(N—アセチルグルコサミニト一ル,GlcNAcol)、GlcNAcol衍生物那样的化合物也可以。作为GlcNAcol衍生物的合适的例子,可以列举乙酰化N-乙酰葡糖胺醇(Ac5GlcNAcol)那样的具有细胞透过性的衍生物。GlcNAcol和GlcNAcol衍生物可以用本领域技术人员公知的方法合成,其来源无限制。另外,作为针对作为N-乙酰神经氨酸的分解酶的细菌来源的乙酰神经氨酸裂合酶(在哺乳类中称为N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂合酶)的抑制物质,可以列举N-乙酰-4-氧代-神经氨酸。
==药物的制造方法==
本发明的药物包含从上述“化合物”中记载的N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物、N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、含有N-乙酰神经氨酸的化合物、含有N-乙酰神经氨酸衍生物的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺的化合物、含有N-乙酰甘露糖胺衍生物的化合物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质以及所述中间产物的分解酶抑制物质构成的群中选择的至少一个或是两个以上的化合物的组合。
本发明的药物剂型化可以使用本领域技术人员公知的药学允许的载体、稀释剂、赋形剂等制剂用添加剂。其形态只要是适合将本药物送达至患者患处的剂型,就没有特别限制,例如,作为口服剂,可以剂型化为片剂、胶囊、颗粒、粉剂、糖浆、肠溶剂、缓释胶囊、カシユ一、咀嚼片、滴剂、丸剂、内用液剂、糖锭、缓释片剂、缓释颗粒等。另外,剂型化为注射剂也可以。或者也可以剂型化为シツプ剤、软膏等外用药。本发明的药物除上述制剂用添加剂之外还可以配合不同的药物组合物。
==治疗用药物的使用方法==
本发明的治疗用药物具有在动物个体内增加细胞中的N-乙酰神经氨酸量的效果。因此,本发明的治疗用药物能用于治疗或预防由于细胞中N-乙酰神经氨酸量降低所产生的任一种疾病,例如,可以将起因于GNE蛋白质功能降低的疾病作为治疗对象。此处,所谓的GNE蛋白质功能降低包括GNE蛋白质对其目标蛋白质应有的功能完全丧失或降低两种情况。此时,对其原因无特别限制,例如,可以是由于GNE蛋白质表达过程有障碍而没表达蛋白质,或翻译后的蛋白质变性为无法正常发挥功能的结构,或由于抑制或修饰等障碍所引起的蛋白质没有正常发挥功能,其原因可以是产生GNE基因突变那样的遗传因素,也可以是抑制物质等外部因素。作为这样的起因于GNE基因突变的疾病,例如,可以列举肾小球肾炎、间质性肾炎、肾结核、以肾病综合征为代表的肾功能障碍、肌病、心肌病,但不限于这些。此外,本药物的给药对象不限于动物,优选人或人以外的脊椎动物。
本发明的治疗用药物在安全的给药量范围内用适当的方法给予必要的量。本发明的药物给药量要考虑剂型的种类、给药方法、患者等给药对象的年龄和体重、患者等给药对象的症状等,最终根据医生或兽医的判断恰当确定。
==食品组合物==
本发明的食品组合物包含从上述“化合物”中记载的N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质、以及在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物的分解酶抑制物质构成的群中选择的至少一个或者两个以上的化合物的组合。
本发明的食品组合物可以配入任意期望成分。例如,可以是维生素E、维生素C等维生素类、乳化剂、张力剂(緊張化剤)、缓冲剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂,或者也可以是不同的食品组合物。本发明的食品组合物的用途无特别限制,例如作为制造食品、营养辅助食品、补充剂等的食品原料,或者可以作为食品添加剂使用。此时,含有本食品组合物的食品的制造方法无特别限制,本领域技术人员可以适当选择。此外,这些食品中包含的食品组合物的比例无特别限制。另外,包含本发明的食品组合物的食品也可以包含后述的食品添加剂。
==食品添加剂==
作为食品添加剂,是指在食品制造过程中或为了加工或者保存而通过向食品中添加、混合、浸润及其他方法而使用的物质。本发明的食品添加剂包含从上述“化合物”中记载的N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物、或含有N-乙酰神经氨酸的化合物中选择的1个或两个以上的组合。本发明的食品添加剂中含有的这些化合物是自天然物质纯化的化合物或化学合成的化合物。本食品添加剂中的这些化合物的总含量优选在50%以上,更优选在70%以上,进一步优选在90%以上。
本发明的食品添加剂中除上述化合物以外还可以配入任意期望成分。例如,可以是维生素E、维生素C等维生素类、乳化剂、张力剂、缓冲剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂,或者也可以是不同的食品添加剂。不过,作为食品添加剂不合适的成分,例如,在加工成食品时添加物浓度对摄取该食品的动物有毒性的成分等不能配入本食品添加剂中。
对本发明的食品添加剂的用途并无特别限制,例如,可以添加到由下述制造方法制造的食品等中,并制造含有食品添加剂的食品。
==含有食品添加剂的食品的制造方法==
本发明的含有食品添加剂的食品,是在制造步骤添加了本发明的食品添加剂而制造的。添加食品添加剂在食品制造步骤中哪个阶段都可以,本领域技术人员可以根据制造的食品的种类适当决定。另外,食品中添加的食品添加剂的量可以由摄取制造的食品的动物中食品添加剂的必要量和该食品的摄取量算出,并由本领域技术人员适当确定。不过,优选添加食品添加剂使得N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物、或者含有N-乙酰神经氨酸的化合物的浓度在制造的食品中占10%以上。另外,本发明的含有食品添加剂的食品也可以含有前述食品组合物。
==含有食品组合物的食品和含有食品添加剂的食品==
作为本发明的含有食品组合物的食品或含有食品添加剂的食品的形态,可以例示糕点类、调味料、嗜好性食品、饮料等普通食品。作为具体的形态,可以为甜饼、饼干、糖果、口香糖、果冻等固体或半固体嗜好食品类,果汁、茶、咖啡、清凉饮料等等嗜好饮料类,面包、面条等主食食品类,汤、咖喱、煨炖菜、各种沙司等副食食品类,各种风味、调味料类。此处,本发明的食品也可包含营养补充食品、功能性食品、特定保健用食品、管饲营养剂等。另外,可以制成与上述本发明的药物同样的剂型。
对摄取本发明的食品组合物或本发明的含有食品添加剂的食品的动物无特别限制,优选人或人以外的脊椎动物,例如,也可以是罹患作为本发明的药物治疗对象的疾病的患者。
本发明的含有食品组合物的食品、以及本发明的含有食品添加剂的食品作为民间药、功能性食品、健康食品、营养补充食品等,在安全的摄取量范围内,人或人以外的脊椎动物可以摄取必要的量。本发明的食品的摄取量可以考虑食品的种类、摄取者的年龄和体重来确定,例如,如果摄取者患有某种疾病,则优选考虑该疾病的种类、症状等适当确定。此外,对于该食品的用途,优选在食品上标识具有该效果的意思表示,作为其示该表示的实例,可以列举旨在用于提高细胞中N-乙酰神经氨酸量、或旨在用于改善起因于GNE蛋白质功能降低的疾病的症状等,只要该表示是表示食品的效果的表示就可以,不局限于这些例子。
实施例
(实验方法)
==DMRV病人==
DMRV病人是通过GNE基因突变检查而确认罹患DMRV的成年病人。(患者人数:42例、发病年龄:20-30岁、性别:男女)根据国立精神·神经中心承认的方案,对经过知情同意的这些患者自愿者实施局部麻醉,通过活组织检查采集骨骼肌(肱二头肌、胫骨前肌)。
==DMRV小鼠模型==
DMRV小鼠模型使用特开2007-312641记载的GNE(-/-)hGNED176V-Tg。另外,作为对照,使用没有GNE基因突变的同胞正常个体。本实施例使用的小鼠自由摄取水和食物,并摄取包含于食物中的N-乙酰神经氨酸化合物,摄取量为平均14mg/kg体重/日。
==试剂==
N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)从ナカライテスク社购入。五-O-乙酰基-N-乙酰神经氨酸(Ac5NeuAc)、五-O-乙酰基-N-乙酰神经氨酸甲酯(Ac5NeuAc-Me)从长良サイエンス社购入。唾液酸乳糖(NeuAcα2-3Galβ1-4Glc)从Sigma-Aldrich社购入。四-O-乙酰基-N-乙酰甘露糖胺(Ac4ManNAc)从NZP社购入。五-O-乙酰基N-乙酰葡糖胺醇(Ac5GlcNAcol)使用N-乙酰葡糖胺醇(从Marker Gene Technologies社购入),根据Luchansky等(J.Biol.Chem.278,8035-8042,2003)的方法合成。具体地,将0.5g的N-乙酰葡糖胺醇溶解于5ml的吡啶后,加入2.5ml的无水乙酸,搅拌一个晚上使其反应。使溶剂蒸发,将残渣溶解于三氯甲烷后,将三氯甲烷相用1.0M盐酸、固体碳酸氢钠、饱和食盐水清洗。将三氯甲烷相蒸发干燥成固体后,溶解于乙醇,并将经HPLC生成的生成物溶解于乙醇中,在-20℃下保存。
==肌管细胞的原代培养细胞的制备==
将从上述DMRV病人或者小鼠模型中采集的骨骼肌组织在PBS或Hank’s平衡盐中轻轻洗净后,用0.25%胰蛋白酶处理5分钟。使用眼科用剪子将组织细细地剪成几毫米大,用0.4%胶原酶II/0.25%胰蛋白酶在37℃消化30分钟后静置,回收上清。再次用上述酶液处理沉淀。静置后,使沉淀在DMEM-Ham’sF-12培养基中充分悬浮。将该组织液通过尼龙网除去组织,将清洗液和上述上清合并,离心并回收细胞。这样得到的细胞以每个直径100mm的塑料皿106个细胞的密度在DMEM-Ham’sF-12培养基中接种并将其在37℃、5%CO2的环境下培养4-7天。
==由HPLC法进行的NeuAc和NeuGc量测定==
在样本为培养细胞的情况下,将细胞用PBS清洗3次之后,加入400μl的50mM硫酸,80℃下培养60分钟,并通过水解使NeuAc和NeuGc游离。在样本为组织片时,将组织冷冻后,使用气锤粉碎,在KCl-Tris溶液中将其匀浆。将沉淀再次在KCl-Tris溶液中洗净后,在50mM硫酸中在80℃加热一个小时使其水解,使NeuAc和NeuGc游离。在以此方式游离出NeuAc和NeuGc的样本中,添加7mmol的1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯二盐酸盐(MDB、同人化学社)溶液(将15.8mg MDB、48.8mg Na2S2O4、735μl 2-巯基乙醇溶于蒸馏水达到10ml)400μl,在60℃下使其反应2.5小时。这样生成的荧光衍生物用HPLC(日本分光)测定。此时,作为标准,使用了0.05-5nmol/μl的Neu5Ac和Neu5Gc标准品。组织中的蛋白质量使用Bio-Rad Protein Assay试剂盒(Bio-Rad Laboratories社)测定。
(实施例1)
本实施例表明,NeuAc、NeuAc衍生物、在NeuAc生物合成路径中由ManNAc在下游生成的中间产物在肌管细胞的原代培养细胞中使唾液酸化糖化合物增加。
==试剂的给药==
在来自上述DMRV小鼠模型的肌管细胞的原代培养细胞的培养基中添加试剂,分别调制为最终浓度5mM ManNAc、5mM NeuAc、5mMAc5NeuAc、0.5mM Ac5NeuAc-Me、0.2mM Ac4ManNAc。其后,进一步继续培养3天。
==NeuAc的组织学检测方法==
将在各试剂存在的条件下培养的细胞用4%多聚甲醛在室温下固定15分钟,在冰上用0.05%皂苷处理30分钟。将处理后的细胞用作为肌管细胞的标记物的抗结蛋白抗体(货号69-181、ICN Pharmaceuticals社)检测,并用DAPI(和光纯药)对比染色。作为二次抗体,使用Alexa Fluor 568标识抗体(Invitrogen社)在室温孵育30分钟。进而,用生物素标识SBA凝集素(生化学工业株式会社)或生物素标识WGA凝集素(生化学工业株式会社)标识。进而,用FITC标识抗生物素蛋白(Vector社)室温孵育30分钟,并对生物素标识的各凝集素进行荧光标识。此外,SBA识别糖链末端结构中的GalNAc结构,WGA识别唾液酸簇(sialic acid cluster)结构,该唾液酸中含有NeuAc。这些经标识的原代培养细胞用共焦点激光扫描荧光显微镜(Olympus社)观察。
如图1所示,在未处理组的原代培养细胞中,结蛋白阳性肌管细胞为WGA阴性、SBA阳性。即,表示在这些肌管细胞中,糖链末端结构中的唾液酸修饰减少,GalNAc修饰增加。另一方面,将各试剂加入培养基培养的任一组的肌管细胞中,与未处理组相比较,WGA标识增加,相反,SBA标识减少。即,肌管细胞的唾液酸修饰增加。
以上结果表明,在本实施例中加入培养基中的任一种试剂化合物都具有增加来自DMRV小鼠模型的肌管细胞中糖链末端结构的唾液酸修饰的效果。因此,这些试剂化合物具有增加细胞中的唾液酸修饰量的效果。
(实施例2)
本实施例表明NeuAc、NeuAc衍生物、ManNAc衍生物、在NeuAc生物合成路径中由ManNAc在下游生成的中间产物具有依赖于给药量的增加NeuAc的效果。
==试剂的给予==
在来自上述DMRV病人的肌管细胞的原代培养细胞的培养基中加入ManNAc、NeuAc或Ac5NeuAc使最终浓度为0.005、0.05、0.5、或5mM。另外,对于在高浓度下具有细胞毒性的Ac4ManNAc,将其加入使最终浓度为0.0002、0.002、0.02或0.2mM。在阴性对照组的细胞中加入GalNAc使其为0.005、0.05、0.5或5mM。其后,进一步继续培养3天。根据上述HPLC法测定该培养细胞的NeuAc量(N=3)。
如图2所示,ManNAc、NeuAc和Ac5NeuAc依赖于其用量,显示了增加细胞的NeuAc量的效果。另外,Ac4ManNAc在低浓度区域同样地显示了依赖用量的增加NeuAc量的效果。
以上结果表明ManNAc、NeuAc、Ac5NeuAc和Ac4ManNAc的增加DMRV肌管细胞中的NeuAc量的效果依赖于用量。
(实施例3)
本实施例表明,GalNAc2-差向异构酶抑制剂增大由ManNAc所产生的增加NeuAc量的效果。
==试剂的给予==
在来自上述DMRV小鼠模型的肌管细胞的原代培养细胞培养基中添加ManNAc使最终浓度为10mM,并添加Ac5GlcNAcol使最终浓度为100μM或500μM,培养3天。在对照组的培养细胞的培养基中只添加10mM葡萄糖(Glc)。根据上述HPLC法,测定该培养细胞的NeuAc量(N=3)。
如图3所示,在来自DMRV小鼠模型的肌管细胞中,与对照组比较,添加ManNAc时NeuAc量增加,除ManNAc之外还添加100或500μM Ac5GlcNAcol时NeuAc量进一步增加。
以上结果表明,NeuAc生物合成的中间产物以及该中间产物的分解酶抑制剂具有增加肌管细胞的NeuAc量的效果。进而表明,如果一起使用中间产物及其分解酶抑制剂,则该增加NeuAc的效果增强。
(实施例4)
本实施例表明,ManNAc、NeuAc、NeuAc生物合成路径的中间产物、NeuAc衍生物、ManNAc衍生物、含有NeuAc的化合物改善DRVM小鼠模型的病状和存活率。
==药物的给予==
从11-15周龄到56-58周龄,对DMRV小鼠模型以20mg/kg体重/日的用量给予溶解于饮用水的ManNAc(N=6)、NeuAc(N=5)或唾液酸乳糖(N=7),持续43-45周。另外,对同年龄的DMRV小鼠模型以40mg(N=5)或400mg/kg体重/日(N=4)的用量给予溶解于饮用水的Ac4ManNAc,持续43-47周。安慰剂组的小鼠给予没有添加药物的饮用水。
在给予上述药剂期间,定期进行体重测定、存活率确认、血液采集(开始给药0、25、49日后、以及其后每28日)、悬挂测试(开始给药0、49日后、以及其后每56日),对结束给药时活着的个体(ManNAc给药组:N=5、NeuAc给药组:N=5、唾液酸乳糖组:N=6)进行平板试验,之后取出肌肉组织,进行肌肉收缩测试、NeuAc量测定、肌肉组织病理观察。
==血中肌酸激酶活性测定==
在给予药物期间,定期从小鼠的尾巴采集血液。通过离心分离由该血液制备血清,用デタミナ一CPK-L试剂盒(协和メデツクス社)测定血中肌酸活性。另外,使用Titan Gel Isoenzyme kit(HelenLaboratories社)使血清电泳,确认肌酸激酶。此外,已知肌酸激酶在由于剧烈运动、肌肉疾病引起肌肉纤维障碍时流出到血中,血中浓度上升。
==悬挂试验==
在50cm高的筒上放置直径约0.5mm的金属丝制成的6mm格子的金属网。在该金属网上小鼠被颠倒着捕获,测量直到落下的时间。每个个体试验3次。
==平板试验==
为了在装置内驯化小鼠,从一周前开始训练。在该驯化期间,一共七天使小鼠每天以5-15m/分的速度在7度的坡度上行走30分钟。在本试验中,作为运动能力测试,从初速度20m/分开始以每分钟10m/分加速,测定到小鼠不能行走的累计行走距离。作为持久力测试,使小鼠在7度的坡度上以20m/分的速度行走60分钟后,再使其行走3分钟,测量在这3分钟内小鼠从行走轨道最终部的刺激栅受到的电刺激数。
==肌肉收缩测试==
在小鼠腹腔内给予戊巴比妥(40mg/kg体重)进行麻醉,将连接胫骨前肌与腓肠肌的肌肉组织分离出来。将该分离肌肉组织的末端的腱和胫骨用绳系起来,将各绳端分别与绳吊管(控制肌肉长度的装置)、等张传感器(TB-651T(腓肠肌用)、TB-653TD-112S(胫骨前肌用)、日本光电社)垂直连接。将肌肉组织放置于乳酸林格氏液(95%O2、5%CO2)中,使用电刺激装置(SEN-3301、日本光电)和放大器(PP-106H、日本光电)在给予400μs的单收缩刺激的同时使肌肉组织伸长,测定得到最大收缩力的长度(L0)和此时的收缩力(等长性收缩力:Pt)。进而,在使肌肉组织保持在得到收缩力的长度(L0)的情况下使电刺激降低至3ms,在此基础上以两分钟以上的间隔进行300-600次10-1000Hz的反复刺激,确定此时的最大收缩力(P0)。该测定后,计算肌肉组织的平均截面积(CSA:肌肉重量/L0)。
==肌肉组织病理观察==
将上述肌肉收缩测试使用的腓肠肌在用液氮冷却的异戊烷中冷冻,用冷冻切片机制作成6μm厚的冷冻切片。将该切片铺在载玻片上,在相邻切片上进行苏木精-曙红(H-E)染色、酸性磷酸酶活性染色(参照Malicdan et al.Method.Enzymol.453,379-396,2009)或改良Gomori三色染色(参照Malicdan et al.Method.Enzymol.453,379-396,2009)。在光学显微镜下观察这些切片。另外,将以同样的方式制作的10μm厚的冷冻切片用4%多聚甲醛固定后,进行刚果红染色并在荧光显微镜下观察。
另外,将以与上述同样的方式制作的6μm厚的冷冻切片用丙酮固定,并将切片用封闭液(添加5%正常山羊血清或2%酪蛋白的PBS)封闭。与抗自噬标记蛋白质LC3兔多克隆抗体(NB100-2220、NovusBiologicals社、100倍稀释)、抗β淀粉状蛋白兔多克隆抗体(Aβ1-40、AB5074P、Chemicon社、100倍稀释)、抗β淀粉状蛋白兔多克隆抗体(Aβ1-42、AB5078P、Chemicon社、100倍稀释)、抗磷酸化tau小鼠单克隆抗体(90206、Innogenetics社、100倍稀释)、抗淀粉状蛋白小鼠单克隆抗体(6E10、Covance社、400倍稀释)、抗p62蛋白质兔多克隆抗体(PW9860、Biomol社、500倍稀释)或抗溶酶体膜蛋白质2(Lamp2)兔多克隆抗体(ABL-93、从Developmental StudiesHybridoma Bank at the University of Iowa得到、100倍稀释)在室温下孵育1小时。作为二次抗体,适合用Alexa Fluor 488或568标识抗兔/小鼠IgG(H+L)(Molecular Probes社)。在荧光显微镜下观察这些免疫染色制品。此外,刚果红染色和LC3标识在相邻切片上进行。
此外,可知在罹患肌病的患者的肌肉组织中看到的边缘空泡为酸性磷酸酶阳性。DMRV的骨骼肌纤维内积蓄有淀粉状蛋白质,刚果红识别淀粉状蛋白并发出荧光。tau蛋白质被淀粉状蛋白β蛋白质磷酸化。可知在起因于GNE基因突变的肌病中,Lamp2蛋白质在局部存在的溶酶体小胞积蓄。另外,可知p62蛋白质识别多聚泛蛋白,并与LC3直接键合,在多聚泛蛋白的积蓄部位诱发自噬作用,但显示在罹患肌病的肌肉组织中与淀粉状蛋白共同局部存在。
==边缘空泡形成计数==
在以100μm间隔制作的10μm厚的H-E染色的6块病理切片上,对在肌肉组织截面整体观察到的边缘空泡数进行计数。另外,为了进行淀粉状蛋白阳性蛋白质沉淀的计数,在以100μm间隔制作的10μm厚的6块切片中,对肌肉组织截面整体观察到的存在抗淀粉状蛋白抗体(6E10)标识沉淀的细胞数进行计数。
如图4所示,与安慰剂组比较,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,DMRV小鼠模型的存活率明显上升。另外,如图5所示,在给予Ac4ManNAc的组的DMRV小鼠模型中,与安慰剂组比较,存活率也上升。
在安慰剂组、给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中测定肌肉组织的NeuAc量。如图6所示,与安慰剂组的DMRV小鼠模型比较,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,NeuAc量明显增加。
另外,在给予40mg/kg或400mg/kg的Ac4ManNAc的组中,也测定了肌肉组织的NeuAc量。如图7所示,与安慰剂组的DMRV小鼠模型比较,在给予400mg/kg的Ac4ManNAc的组中,DMRV小鼠模型中的肌肉组织的NeuAc量明显增加。
图8示出各小鼠血中的肌酸激酶活性。与安慰剂组比较,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,活性明显降低。
另外,图9和图10示出运动能力测试中的各组小鼠的累计行走距离。显示了与安慰剂组比较,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,累计行走距离明显增加,运动能力得到改善(图9)。另外,显示了在以400mg/kg给予Ac4ManNAc的DMRV小鼠模型中,与安慰剂组比较,累计行走距离明显增加,运动能力得到改善(图10)。
如图11所示,与安慰剂组比较,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,鼠的悬挂时间增加。
图12、图13示出在持久力测试中3分钟的电刺激数。显示了在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组的MRV小鼠模型中,与安慰剂组比较,电刺激数明显减少,持久力得到改善(图12)。进而,也显示了在给予40mg或400mg/kg的Ac4ManNAc的组的DMRV小鼠模型中,与安慰剂组比较、电刺激数明显减少,持久力得到改善(图13)。
如图14、图15所示,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组的DMRV小鼠模型中,与安慰剂组比较,腓肠肌截面积和腓肠肌比收缩力(单位肌肉截面积的P0)明显增加。另外,如图16所示,在给予Ac4ManNAc 40mg和400mg/kg的组的DMRV小鼠模型中,与安慰剂组比较,腓肠肌比收缩力明显增加。进而,如图17和图18所示,与安慰剂组比较,单位肌肉截面积的Pt在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组(图17)、给予Ac4ManNAc 400mg/kg的组(图18)的DMVR小鼠模型中明显增加。
给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组的DMRV小鼠模型肌肉组织的病理观察结果示于图19和20。如图19A所示,在安慰剂组的DMRV小鼠模型中,可以观察到边缘空泡(箭头)和肌肉细胞萎缩(箭簇),组织中高频率的酸性磷酸酶活性染色阳性部位被确认。另一方面,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,未观察到边缘空泡或肌肉细胞萎缩(图19E、I、M),酸性磷酸酶活性染色为阴性(图19F、J、N)。进而,可知DMRV的骨骼肌纤维积蓄有淀粉状蛋白质,在安慰剂组中,观察到各抗淀粉状蛋白抗体(LC3、Aβ1-40、Aβ1-42)标识(图19C、图20A、B),与此相比较,在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中标识显著减少(图19G、K、O、图20D、E、G、H、J、K)。同样地,由识别淀粉状蛋白的刚果红染色仅在安慰剂组中辨识出荧光标识(图19D、H、L、P)。另外,抗磷酸化tau抗体的标识仅在安慰剂组中观察到(图20C、F、I、L)。以上病理观察结果在DMRV小鼠模型的病理组织得到确认,表明边缘空泡形成、肌肉细胞萎缩、淀粉状蛋白积蓄等症状在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中得到改善。
图21示出在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中,与安慰剂组比较、边缘空泡数明显减少。另外,如图22所示,与安慰剂组比较,淀粉状蛋白阳性细胞数在给予ManNAc、NeuAc和唾液酸乳糖的组中明显减少。
给予40mg/kg或400mg/kg的Ac4ManNAc的组的DMRV小鼠模型中的肌肉组织的病理观察结果示于图23和24。在安慰剂组的DMRV小鼠模型中,与图19A中观察到的同样,在H-E染色或改良Gomori三色染色的组织中辨识出边缘空泡和肌肉细胞萎缩(图23A、B)。另外,辨识出组织中高频率的酸性磷酸酶活性染色阳性部位(图23C)。在给予40mg/kg Ac4ManNAc的组中,与安慰剂组比较,边缘空泡、肌肉萎缩频率显著降低(图23D、F),零星地辨识出酸性磷酸酶活性染色阳性部位(图23E)。另一方面,在给予400mg/kg Ac4ManNAc的组中,未辨识出边缘空泡和肌肉细胞萎缩(图23G、H),酸性磷酸酶活性染色为阴性(图23I)。在安慰剂组的DMRV小鼠模型的骨骼肌中,Lamp2、β淀粉状蛋白(Aβ1-42)和p62蛋白质为阳性(图24A、B、C)。对于Lamp2,在给予40mg/kg的Ac4ManNAc的组的DMRV小鼠模型中,辨识出极弱的染色,而在给予400mg/kg的Ac4ManNAc的组中为阴性。Aβ1-42、p62蛋白质在给予40和400mg/kg的Ac4ManNAc的组中的任一组的DMRV小鼠模型中均为阴性。由此确认了DMRV小鼠模型的病理组织,边缘空泡形成、肌肉细胞萎缩、淀粉状蛋白积蓄、纤维状结构等症状在给予Ac4ManNAc的组中得到改善。
以上结果表明,通过对罹患DMRV的个体给予ManNAc、NeuAc、NeuAc生物合成路径的中间产物、NeuAc衍生物、ManNAc衍生物、含有NeuAc的化合物,获得了具有疾病的肌肉组织症状改善、个体运动能力恢复和致死率改善的效果。
产业上利用的可能性
根据本发明,能提供起因于GNE蛋白质功能降低的疾病的治疗用药物、食品组合物和食品添加剂。
Claims (19)
1.一种药物,是用于治疗起因于GNE蛋白质功能降低的疾病的药物,其特征在于,
含有从由N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物、N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、含有N-乙酰神经氨酸的化合物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质和所述中间产物的分解酶抑制物质构成的群中选择的任一种或两种以上的化合物的组合,
所述N-乙酰神经氨酸衍生物用下述式1表示:
式中,XP(P为从1到6的整数)为O或S,对于RP(P为从2到6的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、低级烷酰基或低级烷基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为低级烷酰基或低级烷基,
X1为O时,R1为氢、低级烷基或低级烷酰基烷基,X1为S时,R1为低级烷基或低级烷酰基烷基,
R7为氢、低级烷酰基或低级羟基烷酰基,
所述N-乙酰甘露糖胺衍生物用下述式2表示:
式中,XP(P为从1到4的整数)为O或S,对于RP(P为从1、3、4、5中选择的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、低级烷基、低级烷酰基烷基或低级烷酰基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为低级烷基、低级烷酰基烷基或低级烷酰基,
R2为氢或低级烷酰基。
2.权利要求1所述的药物,其特征在于,所述GNE蛋白质功能降低是由GNE基因突变引起的。
3.权利要求1或2所述的药物,其特征在于,所述疾病为肾功能障碍或肌病。
4.权利要求1-3任一项所述的药物,其特征在于,所述中间产物为N-乙酰甘露糖胺-6磷酸或N-乙酰神经氨酸-9磷酸。
5.权利要求1-4任一项所述的药物,其特征在于,所述N-乙酰神经氨酸衍生物为Ac5NeuAc或Ac5NeuAc-Me。
6.权利要求1-5任一项所述的药物,其特征在于,所述N-乙酰甘露糖胺衍生物为Ac4ManNAc。
7.权利要求1-6任一项所述的药物,其特征在于,所述含有N-乙酰神经氨酸的化合物为唾液酸乳糖。
8.权利要求1-6任一项所述的药物,其特征在于,所述中间产物的分解酶抑制物质为GlcNAcol或GlcNAcol衍生物。
9.权利要求8所述的药物,其特征在于,所述GlcNAcol的衍生物为Ac5GlcNAcol。
10.一种食品组合物,其特征在于,
含有从由N-乙酰神经氨酸衍生物、N-乙酰甘露糖胺衍生物、N-乙酰神经氨酸的分解酶抑制物质、N-乙酰甘露糖胺的分解酶抑制物质和在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物的分解酶抑制物质构成的群中选择的任一种或两种以上的化合物的组合,
所述N-乙酰神经氨酸衍生物用下述式1表示:
式中,XP(P为从1到6的整数)为O或S,对于RP(P为从2到6的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP(P为从2到6的整数)为氢、低级烷酰基或低级烷基,当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为低级烷酰基或低级烷基,
X1为O时,R1为氢、低级烷基或低级烷酰基烷基,X1为S时,R1为低级烷基或低级烷酰基烷基,
R7为氢、低级烷酰基或低级羟基烷酰基,
所述N-乙酰甘露糖胺衍生物用下述式2表示:
式中,XP(P为从1到4的整数)为O或S,
对于RP(P为从1、3、4、5中选择的整数),当与该RP相邻并键合的XP为O时,该RP为氢、低级烷基、低级烷酰基烷基或低级烷酰基,
对于RP(P为从1、3、4、5中选择的整数),当与该RP相邻并键合的XP为S时,该RP为低级烷基、低级烷酰基烷基或低级烷酰基,
R2为氢或低级烷酰基。
11.权利要求10所述的食品组合物,其特征在于,所述N-乙酰神经氨酸衍生物为Ac5NeuAc或Ac5NeuAc-Me。
12.权利要求10或11所述的食品组合物,其特征在于,所述N-乙酰甘露糖胺衍生物为Ac4ManNAc。
13.权利要求10-12任一项所述的食品组合物,其特征在于,所述中间产物的分解酶抑制物质为GlcNAcol或GlcNAcol衍生物。
14.权利要求13所述的食品组合物,其特征在于,所述GlcNAcol衍生物为Ac5GlcNAcol。
15.一种食品,含有权利要求10-14任一项所述的食品组合物。
16.一种食品添加剂,其特征在于,
含有从N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物或含有N-乙酰神经氨酸的化合物中选择的任一种或两种以上的组合,
所述N-乙酰神经氨酸、所述在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物和所述含有N-乙酰神经氨酸的化合物为自天然物质纯化的化合物或化学合成的化合物。
17.权利要求16所述的食品添加剂,其特征在于,所述N-乙酰神经氨酸、在N-乙酰神经氨酸生物合成路径中由N-乙酰甘露糖胺在下游生成的中间产物或含有N-乙酰神经氨酸的化合物的总含量在50%以上。
18.一种含有食品添加剂的食品的制造方法,其特征在于,包括添加权利要求16或17所述的任一种食品添加剂的步骤。
19.一种通过权利要求18所述的制造方法制造的含有食品添加剂的食品。
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