WO2010131712A1 - Ｇｎｅタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤、食品組成物、食品添加物 - Google Patents

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acetylmannosamine
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悟 野口
メイ クリスティン マリクダン
一三 西野
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財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical agent, a food composition, and a food additive for treating a disease caused by a decrease in GNE protein function.
  • myopathy muscle diseases
  • DMRV distal myopathy
  • HIBM hereditary inclusion myopathy
  • the GNE gene encodes the rate-limiting enzyme UDP-GlcNAc2-epimerase / ManNAc-kinase of the N-acetylneuraminic acid biosynthetic pathway (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2), and this enzyme is converted from UDP-GlcNAc to ManNAc, It is responsible for two enzymatic reactions from ManNAc to ManNAc6-phosphate. For this reason, it has been reported that the amount of N-acetylneuraminic acid is decreased in skeletal muscle cells affected by myopathy and the primary cultured cells thereof (for example, Noguchi, S. et al., J. Biol. Chem. 279 (12), 11402-11407, 2004; Nonaka, I. et al., Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 5 (1), 61-65, 2005)).
  • Pathological features in muscle tissue affected by myopathy caused by such mutations in the GNE gene include formation of rimmed vacuoles, size of muscle fibers, formation of intranuclear inclusions, and deposition of ⁇ -amyloid protein. It is done. Clinicopathologically, the anterior tibial muscle is particularly susceptible, and the cervical flexors, paraspinal muscles, and the knee flexors at the back of the thigh are also likely to be affected. As the symptoms progress, the muscles and upper extremity muscles on the back of the lower leg are affected, but the quadriceps is maintained until relatively late.
  • N-acetylneuraminic acid molecule is acidic, so that it is difficult to be taken up by cells in GNE gene mutant animals and normal animals (for example, Datta, Biochemistry 13, 3987-3991, 1978; Harms and Reutter, Cancer Res. 34, 3165-3172, 1974; Hirschberg et al., Biochemistry 15, 3591-3599, 1976; Diaz and Varki, Anal. Biochem. 150, 32-46, 1985; Ferwerda et al., Biochem. Soc. Transactions 17, 744-745, 1989 reference).
  • N-acetylneuraminic acid has a very short half-life in animal blood (see, for example, Nohle, U. et al., Eur. J. Biochem. 126, 543-548, 1982) and free No special effect on N-acetylneuraminic acid increase in gangliosides when administered with N-acetylneuraminic acid (see, eg, Carlson, SE and House, SG, J. Neutr. 116, 881-886, 2009) It has been reported that it is difficult to obtain clinical effects by administering N-acetylneuraminic acid as a drug. For this reason, N-acetylneuraminic acid itself has not been studied as an effective substance for pharmaceutical agents (see, for example, WO2008 / 150477 A2).
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical agent, a food composition, and a food additive for treating myopathy caused by a decrease in GNE protein function.
  • the pharmaceutical agent according to the present invention is a therapeutic agent for a disease caused by a decrease in the function of GNE protein, which is obtained from N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway.
  • N-acetylneuraminic acid derivative is represented by the following formula 1.
  • X P integer P is 1 to 6
  • R P integer P is from 2 to 6
  • X P which bind adjacent to the R P is a O when hydrogen, alkanoyl, or alkyl
  • X P which bind adjacent to the R P is S, alkanoyl, or alkyl
  • R 1 is when X 1 is O, hydrogen, alkyl Or, when X 1 is S, it is alkyl or alkanoylalkyl
  • R 7 is hydrogen, alkanoyl or hydroxyalkanoyl.
  • the N-acetylmannosamine derivative is represented by the following formula 2.
  • X P (P is an integer from 1 to 4) is O or S
  • R P (P is an integer selected from 1, 3, 4, 5) is bonded adjacent to the R P.
  • X P is O to, hydrogen, alkyl, alkanoyl alkyl, or alkanoyl
  • X P which bind adjacent to the R P is S, alkyl, alkanoyl alkyl, or alkanoyl
  • R 2 Is hydrogen or alkanoyl.
  • alkanoyl, alkyl, alkanoylalkyl and hydroxyalkanoyl are preferably lower.
  • the decrease in the function of the GNE protein is caused by a mutation in the GNE gene, and it is more preferable that the disease is renal dysfunction or myopathy.
  • the intermediate product is preferably N-acetylmannosamine-6 phosphate or N-acetylneuraminic acid-9 phosphate.
  • the N-acetylneuraminic acid derivative is preferably Ac5NeuAc or Ac5NeuAc-Me, and the N-acetylmannosamine derivative is preferably Ac4ManNAc.
  • N-acetylneuraminic acid-containing compound is preferably sialyl lactose.
  • the intermediate product degrading enzyme inhibitor is preferably GlcNAcol or a GlcNAcol derivative, and more preferably the GlcNAcol derivative is Ac5GlcNAcol.
  • the food composition according to the present invention comprises an N-acetylneuraminic acid derivative, an N-acetylmannosamine derivative, an N-acetylneuraminic acid degrading enzyme inhibitor, an N-acetylmannosamine degrading enzyme inhibitor, and Any one selected from the group consisting of degrading enzyme inhibitors of intermediate products produced downstream from N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthetic pathway, or a combination of two or more compounds Containing.
  • N-acetylneuraminic acid derivative is represented by the following formula 1.
  • X P integer P is 1 to 6
  • R P integer P is from 2 to 6
  • X P which bind adjacent to the R P is a O when hydrogen, alkanoyl, or alkyl
  • X P which bind adjacent to the R P is S, alkanoyl, or alkyl
  • R 1 is when X 1 is O, hydrogen, alkyl Or, when X 1 is S, it is alkyl or alkanoylalkyl
  • R 7 is hydrogen, alkanoyl or hydroxyalkanoyl.
  • the N-acetylmannosamine derivative is represented by the following formula 2.
  • X P (P is an integer from 1 to 4) is O or S
  • R P (P is an integer selected from 1, 3, 4, 5) is bonded adjacent to the R P.
  • X P is O to, hydrogen, alkyl, alkanoyl alkyl, or alkanoyl
  • X P which bind adjacent to the R P is S, alkyl, alkanoyl alkyl, or alkanoyl
  • R 2 Is hydrogen or alkanoyl.
  • alkanoyl, alkyl, alkanoylalkyl and hydroxyalkanoyl are preferably lower.
  • the N-acetylneuraminic acid derivative is preferably Ac5NeuAc or Ac5NeuAc-Me, and the N-acetylmannosamine derivative is preferably Ac4ManNAc.
  • the intermediate product degrading enzyme inhibitor is preferably GlcNAcol or a GlcNAcol derivative, and the GlcNAcol derivative is more preferably Ac5GlcNAcol.
  • the food according to the present invention is characterized by containing any one of the above food compositions.
  • the food additive according to the present invention contains N-acetylneuraminic acid, an intermediate product produced downstream from N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway, or N-acetylneuraminic acid-containing Any one selected from compounds, or a combination of two or more thereof, is produced downstream from N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway.
  • the intermediate product and the N-acetylneuraminic acid-containing compound are a compound purified from a natural product or a chemically synthesized compound.
  • the total content of the N-acetylneuraminic acid, an intermediate product produced downstream of N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway, or the N-acetylneuraminic acid-containing compound Is preferably 50% or more.
  • the method for producing a food additive-containing food according to the present invention includes a step of adding any of the above food additives.
  • the food additive-containing food according to the present invention is produced by any one of the above-described methods for producing a food additive-containing food.
  • it is a microscope picture which shows a desmin, a WGA, and a SBA label
  • it is the graph which showed the amount of NeuAc at the time of culturing a human DMRV patient-derived myotube cell in the presence of various reagents with different concentrations.
  • it is the graph which showed the amount of NeuAc at the time of culturing a myotube cell derived from a DMRV model mouse in presence of various reagents.
  • it is a graph which shows the survival rate at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows the survival rate at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows the amount of NeuAc in a muscle tissue at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows the amount of NeuAc in a muscle tissue when 40 or 400 mg / kg of Ac4ManNAc is administered to a DMRV model mouse.
  • it is a graph which shows the blood creatine kinase activity at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows the travel distance at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows the travel distance at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows hanging time at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse.
  • it is a graph which shows the frequency
  • it is a graph which shows the gastrocnemius specific contractile force at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one Embodiment of this invention, it is a graph which shows the gastrocnemius specific contractile force at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse. In one embodiment of the present invention, is a graph showing a P t (isometric contraction force) / Sujidan area when administered various reagents DMRV model mice. In one embodiment of the present invention, is a graph showing a P t (isometric contraction force) / Sujidan area when administered various reagents DMRV model mice.
  • HE hematoxylin-eosin staining
  • LC3 anti-amyloid antibody
  • Congo red stained muscle tissue It is a micrograph.
  • it is a photomicrograph of muscle tissue labeled with anti- ⁇ amyloid antibody (A ⁇ 1-40, A ⁇ 1-42) and anti-phosphorylated tau antibody when various reagents are administered to a DMRV model mouse.
  • it is a graph which shows the number of bordering vacuoles in a muscle tissue at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse.
  • it is a graph which shows the number of amyloid containing bordering vacuoles in a muscle tissue at the time of administering various reagents to a DMRV model mouse.
  • muscle tissue stained with hematoxylin-eosin staining (HE), modified Gomori trichrome staining, or acid phosphatase activity when 40 or 400 mg / kg of Ac4ManNAc is administered to a DMRV model mouse FIG.
  • N-acetylneuraminic acid The origin of N-acetylneuraminic acid is not limited.
  • N-acetylneuraminic acid can be derived from animal tissues, cultured cells, mammalian milk, chicken eggs, etc. It may be a naturally-derived N-acetylneuraminic acid that has been isolated and purified, or a chemically synthesized N-acetylneuraminic acid.
  • N-acetylneuraminic acid derivative and N-acetylmannosamine derivative The N-acetylneuraminic acid derivative is represented by the following formula 1.
  • X P integer P is 1 to 6
  • R P integer P is from 2 to 6
  • X P which bind adjacent to the R P is a O when hydrogen, alkanoyl, or alkyl
  • X P which bind adjacent to the R P is S, alkanoyl, or alkyl
  • R 1 is when X 1 is O, hydrogen, alkyl Or, when X 1 is S, it is alkyl or alkanoylalkyl
  • R 7 is hydrogen, alkanoyl or hydroxyalkanoyl.
  • R and X P which bind adjacent to the P, in particular R 1, R 2, R 3, R 4, R 5, respectively R 6 X 1, X 2, X 3 , X 4 , X 5 , X 6 .
  • X P (P is an integer from 1 to 6) and R P (P is an integer from 1 to 7) are independently selected.
  • the N-acetyl mannosamine derivative is represented by the following formula 2.
  • X P (P is an integer from 1 to 4) is O or S
  • R P (P is an integer selected from 1, 3, 4, 5) is bonded adjacent to the R P.
  • X P is O to, hydrogen, alkyl, alkanoyl alkyl, or alkanoyl
  • X P which bind adjacent to the R P is S, alkyl, alkanoyl alkyl, or alkanoyl
  • R 2 Is hydrogen or alkanoyl.
  • the X P to bind adjacent to the R P in particular with respect to X 3, R 5 relative to X 2, R 4 relative to X 1, R 3 relative to R 1 X is 4.
  • X P (P is an integer from 1 to 4) and R P (P is an integer from 1 to 5) are independently selected.
  • alkanoyl, alkyl, alkanoylalkyl and hydroxyalkanoyl are preferably lower.
  • alkyl, alkoxy, alkenyl, alkynyl and the like include both straight and side chains.
  • Unbranched groups such as “propyl” include only straight chains.
  • Lower alkyl is preferably (C 1 -C 6 ) alkyl, for example, and such lower alkyl or (C 1 -C 6 ) alkyl is specifically methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, Examples include isobutyl, sec- (sec-) butyl, pentyl, 3-pentyl and hexyl.
  • Examples of (C 3 -C 6 ) cycloalkyl include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • (C 3 -C 6 ) cycloalkyl (C 1 -C 6 ) alkyl is cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, 2-cyclopropylethyl, 2-cyclobutylethyl, 2-cyclopentylethyl, An example is 2-cyclohexylethyl.
  • (C 2 -C 6 ) alkenyl is vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1- Examples include hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl and 5-hexenyl.
  • (C 2 -C 6 ) alkynyl is ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1- Examples include hexynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl and 5-hexynyl.
  • Lower alkanoyl is preferably, for example, linear or branched (C 2 -C 6 ) alkanoyl, and specific examples include acetyl, propanoyl, butanoyl, pentanoyl and hexanoyl.
  • halo (C 1 -C 6 ) alkyl include iodomethyl, bromomethyl, chloromethyl, fluoromethyl, trifluoromethyl, 2-chloroethyl, 2-fluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl and pentafluoroethyl.
  • Hydroxy (C 1 -C 6 ) alkyl is hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl, 1-hydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 1-hydroxybutyl, 4-hydroxybutyl, 1-hydroxy Examples thereof include hydroxypentyl, 5-hydroxypentyl, 1-hydroxyhexyl and 6-hydroxyhexyl.
  • Examples of (C 1 -C 6 ) alkoxycarbonyl include methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, butoxycarbonyl, pentoxycarbonyl and hexylcarbonyl.
  • Examples of (C 2 -C 6 ) hydroxyalkanoyl include glycolyl, lactyl, hydroxybutanoyl, hydroxypentanoyl and hydroxyhexanoyl.
  • N-acetylneuraminic acid derivatives and N-acetylmannosamine derivatives are not particularly limited, and may be naturally derived or each derivative synthesized by a method well known to those skilled in the art.
  • the raw material compound used for the synthesis is not particularly limited within the range in which the desired N-acetylneuraminic acid derivative can be synthesized.
  • Neuraminic acid may be used, or another type of N-acetylneuraminic acid derivative synthesized by a known method may be used.
  • the raw material compound used for the synthesis is not particularly limited as long as the desired N-acetyl mannosamine derivative can be synthesized.
  • N-acetyl mannosamine derivative Or other types of N-acetylmannosamine derivatives synthesized by a well-known method may be used.
  • N-acetylneuraminic acid-containing compound, N-acetylneuraminic acid derivative-containing compound, N-acetylmannosamine-containing compound, and N-acetylmannosamine derivative-containing compound include the above-mentioned N-acetylneuraminic acid, N-acetylneuraminic acid derivative, There is no limitation as long as it is a compound containing either N-acetyl mannosamine or an N-acetyl mannosamine derivative as part of its structure, for example, a naturally-derived N-acetyl neuraminic acid-containing sugar.
  • Sialyl lactose and casein glycomacrope which is a peptide containing N-acetylneuraminic acid Peptides, mucins, gangliosides, which are glycolipids containing N-acetylneuraminic acid, and the like can be mentioned.
  • These compounds may be naturally derived compounds or artificially synthesized by methods well known to those skilled in the art.
  • N-acetylneuraminic acid degrading enzyme inhibitor N-acetylmannosamine degrading enzyme inhibitor, or N-acetylneuraminic acid biosynthetic pathway from N-acetylmannosamine
  • the intermediate product degradation enzyme inhibitor produced downstream is not limited as long as it inhibits the functions of N-acetylneuraminic acid, N-acetylmannosamine and intermediate product degradation enzymes present in cells.
  • Examples of N-acetylneuraminic acid degrading enzymes include N-acetylneuraminic acid pyruvate lyase.
  • Examples of N-acetylmannosamine degrading enzymes include GlcNAc2-epimerase.
  • Examples of intermediate products produced downstream from N-acetylmannosamine include N-acetylmannosamine-6 phosphate and N-acetylneuraminic acid-9 phosphate.
  • the degrading enzyme inhibitor is not limited as long as it has the function of inhibiting the function of the enzyme, and may be an expression inhibitor such as siRNA specific to the DNA sequence encoding the enzyme.
  • siRNA a desired siRNA can be synthesized by methods well known to those skilled in the art.
  • the inhibitor may be a compound that inhibits the function by binding to an enzyme.
  • N-acetylmannosamine degrading enzyme for example, N-acetylglucosaminitol (GlcNAcol) or a GlcNAcol derivative is used. It may be a compound.
  • GlcNAcol derivative include derivatives having cell permeability such as acetylated N-acetylglucosaminitol (Ac5GlcNAcol).
  • GlcNAcol and GlcNAcol derivatives can be synthesized by methods well known to those skilled in the art, and their origin is not limited.
  • N-acetylneuraminate pyruvate lyase as an inhibitor for bacteria-derived acetylneuraminate lyase (called N-acetylneuraminate pyruvate lyase in mammals), which is a degrading enzyme of N-acetylneuraminic acid, for example, N-acetyl-4-oxo -Neuraminic acid.
  • the pharmaceutical agent according to the present invention is an N-acetylneuraminic acid / intermediate product produced downstream of N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthetic pathway described in “Compound” above, N— Acetylneuraminic acid derivative, N-acetylmannosamine derivative, N-acetylneuraminic acid-containing compound, N-acetylneuraminic acid derivative-containing compound, N-acetylmannosamine-containing compound, N-acetylmannosamine derivative-containing Any one selected from the group consisting of a compound, a degrading enzyme inhibitor of N-acetylneuraminic acid, a degrading enzyme inhibitor of N-acetylmannosamine, and a degrading enzyme inhibitor of the intermediate product, or Contains a combination of two or more compounds.
  • pharmaceutical additives such as pharmaceutically acceptable carriers, diluents, and vaginal agents well known to those skilled in the art are used.
  • the form is not particularly specified as long as it is an appropriate dosage form for delivering the pharmaceutical agent to an affected area of a patient.
  • an oral agent a tablet, capsule, granule, powder, syrup, enteric solvent, sustained-release capsule , Cashews, chewable tablets, drops, pills, liquids for internal use, confectionery tablets, sustained release tablets, sustained release granules and the like.
  • it may be formulated into an injection.
  • different pharmaceutical compositions can be added to the pharmaceutical agent according to the present invention.
  • the therapeutic pharmaceutical agent according to the present invention has an effect of increasing the amount of N-acetylneuraminic acid in cells in an individual animal. Therefore, the therapeutic pharmaceutical agent according to the present invention can be used for the treatment or prevention of any disease that develops due to a decrease in the amount of N-acetylneuraminic acid in cells, for example, a decrease in GNE protein function Diseases resulting from the above can be treated.
  • the function decrease of the GNE protein includes both cases where the function that the GNE protein should have for the target protein is completely lost or decreased. In this case, the cause is not particularly limited.
  • the protein is not expressed due to a disorder in the GNE protein expression process, or the protein after translation is denatured into a structure that cannot function normally, or a disorder such as inhibition or modification.
  • the protein may not be functioning normally, and the cause may be a genetic factor such as a mutation in the GNE gene or an external factor such as an inhibitor.
  • diseases caused by a mutation in the GNE gene include glomerulonephritis, interstitial nephritis, nephron fistula, renal dysfunction such as nephrotic syndrome, myopathy, cardiomyopathy. It is not limited to. There are no restrictions on the animal to which the pharmaceutical agent is administered, but humans or non-human vertebrates are preferred.
  • the necessary amount of the therapeutic pharmaceutical agent according to the present invention can be administered by a suitable method within the safe dosage range.
  • the dosage of the pharmaceutical agent according to the present invention is finally determined by a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, age and weight of the administration subject such as a patient, symptoms of the administration subject such as a patient, etc. As appropriate.
  • the food composition according to the present invention comprises an N-acetylneuraminic acid derivative, an N-acetylmannosamine derivative, an N-acetylneuraminic acid degrading enzyme inhibitor, an N-acetylmannoic acid described in the above “Compound”. Any one selected from the group consisting of a degrading enzyme inhibitor of samine and an intermediate degrading enzyme inhibitor produced downstream of N-acetyl mannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway, Contains a combination of two or more compounds.
  • the food composition according to the present invention can contain any desired component.
  • vitamins such as vitamin E and vitamin C, emulsifiers, tensioning agents, buffers, solubilizers, preservatives, stabilizers, antioxidants, etc. may be used, or different food compositions. May be.
  • the use of the food composition which concerns on this invention is not specifically limited, For example, it can be used as a foodstuff raw material for manufacturing a foodstuff, a dietary supplement, a supplement, etc., or as a food additive.
  • the method for producing the food containing the food composition is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the ratio of the food composition contained in these foods is not particularly limited.
  • the foodstuff containing the foodstuff composition which concerns on this invention may contain the below-mentioned food additive.
  • a food additive refers to a food additive that is added to, mixed with, infiltrated or otherwise used in a food during the production of the food or for the purpose of processing or storage.
  • the food additive according to the present invention is an intermediate product produced downstream of N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway described in the above “compound”, or Any one selected from N-acetylneuraminic acid-containing compounds, or a combination of two or more thereof.
  • These compounds contained in the food additive of the present invention are compounds purified from natural products or chemically synthesized compounds.
  • the total content of these compounds in the food additive is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and further preferably 90% or more.
  • any desired component other than the above compounds can be blended.
  • vitamins such as vitamin E and vitamin C
  • emulsifiers such as vitamin E and vitamin C
  • toning agents such as vitamin E and vitamin C
  • buffers such as buffers, solubilizers, preservatives, stabilizers, antioxidants, etc.
  • preservatives such as antioxidants, etc.
  • antioxidants such as antioxidants, etc.
  • different food additives may be used. May be.
  • ingredients that are not suitable as food additives such as ingredients that are toxic to animals that ingest the food at the concentration of the additive at the time of processing into food, cannot be added to the food additive.
  • the use of the food additive according to the present invention is not particularly limited, for example, it can be added to a food produced by the following production method to produce a food containing the food additive.
  • the food additive may be added at any stage in the food production process, and can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the type of food to be produced.
  • the amount of food additive added to the food can be determined from the necessary amount of food additive and the amount of food intake in the animal that consumes the manufactured food, and can be appropriately determined by those skilled in the art. it can.
  • the concentration of N-acetylneuraminic acid, an intermediate product produced downstream from N-acetylmannosamine in the N-acetylneuraminic acid biosynthesis pathway, or the concentration of the N-acetylneuraminic acid-containing compound is produced. It is preferable to add food additives so as to be 10% or more in the food. Moreover, the food additive-containing food according to the present invention may contain the aforementioned food composition.
  • the food according to the present invention includes nutritional supplements, functional foods, foods for specified health use, tube feedings, and the like. Moreover, you may take the same dosage form as the pharmaceutical agent which concerns on said this invention.
  • the animal ingesting the food composition according to the present invention or the food additive-containing food according to the present invention is not particularly limited, but is preferably a human or a non-human vertebrate, for example, treatment with the pharmaceutical agent according to the present invention It may be a patient suffering from a target disease.
  • the food containing the food composition according to the present invention, and the food additive-containing food according to the present invention is a range of intakes that are considered safe as folk medicines, functional foods, health foods, dietary supplements, etc. Within, a human or non-human vertebrate can ingest the required amount.
  • the amount of food intake according to the present invention can be determined in consideration of the type of food, the age and weight of the intake person, for example, if the intake person suffers from some disease, It is preferable to determine appropriately considering the type and symptoms.
  • the display may be any display that represents the effect of the food, and is not limited to these examples. .
  • N-acetylneuraminic acid (NeuAc) and N-acetylmannosamine (ManNAc) were purchased from Nacalai Tesque. Penta-0-acetyl-N-acetylneuraminic acid (Ac5NeuAc) and penta-0-acetyl-N-acetylneuraminic acid methyl ester (Ac5NeuAc-Me) were purchased from Nagara Science. Sialyl lactose (NeuAc ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4Glc) was purchased from Sigma-Aldrich. Tetra-0-acetyl-N-acetylmannosamine (Ac4ManNAc) was purchased from NZP.
  • Penta-0-acetyl N-acetylglucosaminitol (Ac5GlcNAcol) uses N-acetylglucosaminitol (purchased from Marker Gene Technologies), Luchansky et al. (J. Biol. Chem. 278, 8035-8042, 2003). It was synthesized according to the method. Specifically, 0.5 g of N-acetylglucosaminitol was dissolved in 5 ml of pyridine, 2.5 ml of acetic anhydride was added, and the mixture was allowed to react with stirring overnight.
  • the solvent was evaporated, the residue was dissolved in chloroform, and the chloroform phase was washed with 1.0 M hydrochloric acid, solid sodium hydrogen carbonate, and saturated brine.
  • the chloroform phase was evaporated to dryness and then dissolved in ethanol.
  • the product produced by HPLC was dissolved in ethanol and stored at ⁇ 20 ° C.
  • the tissue was removed by passing the tissue fluid through a nylon mesh, and the washing solution and the supernatant were combined and centrifuged to collect cells.
  • the cells thus obtained were seeded in DMEM-Ham'sF-12 medium at a density of 10 6 cells per 100 mm diameter plastic dish, and this was cultured for 4 to 7 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. Cultured.
  • Example 1 This example shows that NeuAc, NeuAc derivatives, and intermediate products produced downstream of ManNAc in the NeuAc biosynthesis pathway increase sialylated saccharide compounds in primary cultured cells of myotubes.
  • desmin positive myotube cells were WGA negative and SBA positive. That is, in these myotube cells, the modification by sialic acid in the sugar chain terminal structure is decreased, and the modification by GalNAc is increased.
  • any group of myotube cells cultured with each reagent added to the medium labeling with WGA increased compared to the untreated group, and conversely, labeling with SBA decreased. That is, sialic acid modification of myotube cells was increased.
  • any reagent compound added to the medium in this example has an effect of increasing the sialic acid modification of the sugar chain terminal structure in myotube cells derived from a DMRV model mouse. Therefore, these reagent compounds have the effect of increasing the amount of sialic acid modification in the cells.
  • Example 2 This example shows that NeuAc, NeuAc derivatives, ManNAc derivatives, and intermediate products produced downstream of ManNAc in the NeuAc biosynthetic pathway have a dose-dependent NeuAc increasing effect.
  • ManNAc, NeuAc, and Ac5NeuAc showed the effect of increasing the amount of NeuAc in the cells depending on the dose.
  • Ac4ManNAc similarly showed a dose-dependent effect of increasing NeuAc in the low concentration range.
  • Example 3 This example shows that a GalNAc2-epimerase inhibitor increases the effect of increasing the amount of NeuAc by ManNAc.
  • Example 4 This example shows that ManNAc, NeuAc, NeuAc biosynthetic pathway intermediate products, NeuAc derivatives, ManNAc derivatives, NeuAc-containing compounds improve the pathology and survival of DRVM model mice.
  • mice were run on a 7 degree gradient at a speed of 5-15 m / min for 30 minutes per day for a total of 7 days.
  • acceleration was accelerated 10 m / min every minute from an initial speed of 20 m / min, and the total distance traveled until the mouse could not run was measured.
  • the mouse was run for 60 minutes at a speed of 20 m / min at a gradient of 7 degrees, and then was run for another 3 minutes. The number of electrical stimulations that the mouse received from the stimulation grid at the end of the running lane during this 3 minutes. was measured.
  • Muscle tissue was placed in lactated Ringer's solution (95% O 2 , 5% CO 2 ), and single contraction of 400 ⁇ s was performed using an electrical stimulator (SEN-3301, Nihon Kohden) and an amplifier (PP-106H, Nihon Kohden).
  • the muscle tissue was elongated while giving a stimulus, and the length (L 0 ) at which the maximum contractile force was obtained, and the contractile force at that time (isometric contractile force: P t ) were measured.
  • the electrical stimulation was reduced to 3 ms while maintaining the muscle tissue at a length (L 0 ) at which contraction force can be obtained, and 300 to 600 repeated stimulations were given at intervals of 2 minutes or more at 10 to 1000 Hz.
  • the maximum contractile force (P 0 ) was determined. After this measurement, the average cross-sectional area (CSA: muscle weight / L 0 ) of the muscle tissue was calculated.
  • CSA average cross-sectional area
  • HE hematoxylin-eosin
  • Acid phosphatase activity see Malicdan et al. Method. Enzymol. 453, 3
  • a frozen section having a thickness of 6 ⁇ m prepared in the same manner as above was fixed with acetone, and the section was blocked with a blocking solution (5% normal goat serum or 2% casein-added PBS).
  • Anti-autophagy marker protein LC3 rabbit polyclonal antibody (NB100-2220, Novus Biologicals, diluted 100 times), anti- ⁇ amyloid rabbit polyclonal antibody (A ⁇ 1-40, AB5074P, Chemicon, diluted 100 times), anti- ⁇ amyloid rabbit polyclonal antibody (A ⁇ 1-42, AB5078P, Chemicon®, diluted 100-fold), anti-phosphorylated tau mouse monoclonal antibody (90206, Innogenetics®, diluted 100-fold), anti-amyloid mouse monoclonal antibody (6E10, Covance®, diluted 400-fold), anti p62 protein rabbit polyclonal antibody (PW9860, Biomol®, diluted 500-fold) or anti-lysosomal membrane protein 2 (Lamp2) rabbit poly
  • Alexa Fluor 488 or 568 labeled anti-rabbit / mouse IgG H + L
  • Molecular Probes Molecular Probes
  • the fringe vacuole seen in the muscle tissue of a patient suffering from myopathy is positive for acid phosphatase.
  • Amyloid protein accumulates in the skeletal muscle fibers of DMRV, and Congo Red recognizes amyloid and emits fluorescence.
  • Tau protein is phosphorylated by amyloid ⁇ protein.
  • myopathy caused by mutations in the GNE gene it is known that lysosomal vesicles in which the Lamp2 protein is localized accumulate.
  • the p62 protein recognizes polyubiquitin protein and binds directly to LC3 to induce autophagy at the accumulation site of polyubiquitinated protein. However, it is colocalized with amyloid in myopathy-affected muscle tissues. Indicates.
  • 6E10 anti-amyloid antibody
  • the survival rate of DMRV model mice was significantly increased in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups compared to the placebo group. Moreover, as shown in FIG. 5, the survival rate also increased in the DMRV model mice in the Ac4ManNAc administration group as compared with the placebo group.
  • the amount of NeuAc in muscle tissue was measured in the placebo group, ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration group. As shown in FIG. 6, the amount of NeuAc was significantly increased in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups as compared to the DMRV model mice in the placebo group.
  • the amount of NeuAc in the muscle tissue was also measured in the 40 mg / kg or 400 mg / kg Ac4ManNAc administration group. As shown in FIG. 7, the amount of NeuAc in muscle tissue in DMRV model mice was significantly increased in the 400 mg / kg Ac4ManNAc administration group compared to the DMRV model mice in the placebo group.
  • FIG. 8 shows the blood creatine kinase activity of each mouse. ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups showed a significant decrease in activity compared to the placebo group.
  • FIG. 9 and FIG. 10 show the cumulative distance traveled by each group of mice in the motor performance test. Compared to the placebo group, the cumulative mileage increased significantly in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups, indicating improved exercise capacity (FIG. 9). In addition, in the DMRV model mouse administered with 400 mg / kg of Ac4ManNAc, compared to the placebo group, the accumulated mileage significantly increased and the exercise ability was improved (FIG. 10).
  • mice As shown in FIG. 11, the hanging time of mice increased in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups compared to the placebo group.
  • the gastrocnemius muscle cross-sectional area and the gastrocnemius muscle specific contraction force (P 0 per muscle cross-sectional area) compared to the placebo group Increased significantly.
  • the gastrocnemius specific contractile force was significantly increased as compared with the placebo group.
  • P t per muscle cross-sectional area is the placebo group in the DMVR model mice of the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration group (FIG. 17) and the Ac4ManNAc 400 mg / kg administration group (FIG. 18). Increased significantly compared to
  • FIG. 19 and 20 show the results of pathological observation of the muscle tissue of DMRV model mice in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups.
  • FIG. 19A bordering vacuoles (arrows) and muscle cell atrophy (arrowheads) could be observed in the placebo group of DMRV model mice, and acid phosphatase activity staining positive sites were frequently observed in the tissues.
  • FIGS. 19E, I, M bordering vacuoles and myocyte atrophy were not observed
  • FIGS. 19F, J, N acid phosphatase activity staining was negative
  • DMRV skeletal muscle fibers are known to accumulate amyloid protein, and labeling with anti-amyloid antibodies (LC3, A ⁇ 1-40, A ⁇ 1-42) was observed in the placebo group (FIG. 19C, FIG. 20A, B) Compared with this, the label was significantly decreased in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups (FIGS. 19G, K, O, FIGS. 20D, E, G, H, J, K). Similarly, fluorescent labeling was observed only in the placebo group by Congo red staining that recognizes amyloid (FIGS. 19D, H, L, P). In addition, labeling with anti-phosphorylated tau antibody was observed only in the placebo group (FIGS. 20C, F, I, L).
  • FIG. 21 shows that in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups, the number of bordering vacuoles was significantly reduced compared to the placebo group. Moreover, as shown in FIG. 22, the number of amyloid positive cells was significantly reduced in the ManNAc, NeuAc, and sialyl lactose administration groups as compared to the placebo group.
  • FIG. 23 and 24 show the results of the pathological observation of muscle tissue in DMRV model mice in the 40 mg / kg or 400 mg / kg Ac4ManNAc administration group.
  • DMRV model mice in the placebo group rimmed vacuoles and myocyte atrophy were observed in tissues stained with HE or modified with Gomori trichrome as observed in FIG. 19A (FIGS. 23A and B).
  • acid phosphatase activity staining positive sites were frequently observed in the tissues (FIG. 23C).
  • FIG. 23C In the 40 mg / kg Ac4ManNAc administration group, marginal vacuoles and muscle atrophy were remarkably infrequent compared to the placebo group (FIGS.
  • p62 protein was negative in both DMRV model mice in the 40 and 400 mg / kg Ac4ManNAc administration groups.
  • symptoms such as fringe vacuolation, muscle cell atrophy, amyloid accumulation, fibrous structure, etc. observed in the pathological tissue of DMRV model mice improved in the Ac4ManNAc administration group.
  • a pharmaceutical agent for treating a disease caused by a decrease in GNE protein function.

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Abstract

　本発明は、ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤、食品組成物、および食品添加物を提供することを目的とする。　本発明に係る治療用医薬剤は、細胞におけるＮ－アセチルノイラミン酸量を増加させる効果のある化合物を含むことを特徴とする。治療用医薬剤に含有される化合物として、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、前記中間生成物の分解酵素阻害物質等が挙げられる。

Description

ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤、食品組成物、食品添加物
　本発明はＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤、食品組成物、食品添加物に関する。
　ミオパチー（筋疾患）の中でも、遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入型ミオパチー（ＨＩＢＭ）等はＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異により生じることが知られ、１５～４０歳で発症する常染色体劣性の疾患である。
　ＧＮＥ遺伝子は、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路の律速酵素ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ２－エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃ－キナーゼをコードし（例えば、非特許文献１、２参照）、この酵素は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃ、および、ＭａｎＮＡｃからＭａｎＮＡｃ６－リン酸への２つの酵素反応を担っている。このため、ミオパチーに罹患した骨格筋細胞やその初代培養細胞においてはＮ－アセチルノイラミン酸量が減少することが報告されている（例えば、Noguchi, S. et al., J. Biol. Chem. 279 (12), 11402-11407, 2004; Nonaka, I. et al., Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 5 (1), 61-65, 2005 参照）。
　このようなＧＮＥ遺伝子の変異に起因するミオパチーに罹患した筋組織における病理学的特徴としては、縁取り空胞の形成、筋繊維の大小不同、核内封入体形成、βアミロイドタンパク質の沈着等が挙げられる。臨床病理学的には、前脛骨筋が特に侵されやすく、頸部屈筋群、傍脊柱筋、大腿後面の膝屈筋群も侵されやすい。症状が進行するにつれ、下腿後面の筋群や上肢筋も侵されるが、比較的後期まで大腿四頭筋が保たれる。
　ＧＮＥ遺伝子の変異に起因するミオパチーの筋萎縮に至るプロセスは明らかでなく、その解明と共に、効果的な治療法や治療薬の開発が待ち望まれている。
　しかしながら、Ｎ－アセチルノイラミン酸を治療のために患者に投与することについては、その可能性を否定する知見が多く報告されている。例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸分子が酸性であるために、ＧＮＥ遺伝子変異動物および正常動物において、細胞に取り込まれにくいことが報告されている（例えば、Datta, Biochemistry 13, 3987-3991, 1978; Harms and Reutter, Cancer Res. 34, 3165-3172, 1974; Hirschberg et al., Biochemistry 15, 3591-3599, 1976; Diaz and Varki, Anal. Biochem. 150, 32-46, 1985; Ferwerda et al., Biochem. Soc. Transactions 17, 744-745, 1989
参照）。さらに、Ｎ－アセチルノイラミン酸の動物個体血中における半減期が大変短いこと（例えば、Nohle, U. et al., Eur. J. Biochem. 126, 543-548, 1982 参照）、そして、遊離Ｎ－アセチルノイラミン酸を投与した場合にガングリオシドにおけるＮ－アセチルノイラミン酸増加に特別の効果がないこと（例えば、Carlson, S. E. and House, S. G., J. Neutr. 116, 881-886, 2009 参照）等が報告されており、Ｎ－アセチルノイラミン酸を薬剤として投与して臨床学的効果を得ることは難しいと考えられている。そのため、医薬剤の有効物質として、Ｎ－アセチルノイラミン酸自体が検討されることはなかった（例えば、ＷＯ２００８／１５０４７７　Ａ２公報参照）。
　本発明は、ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因するミオパチーの治療用医薬剤、食品組成物、および、食品添加物を提供することを目的とする。
　本発明に係る医薬剤は、ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤であって、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、前記中間生成物の分解酵素阻害物質からなる群より選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の化合物の組み合わせを含有する。
　ここで、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体は下記式１で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
式中、ＸＰ（Ｐは１から６までの整数）はＯあるいはＳであり、ＲＰ（Ｐは２から６までの整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、アルカノイル、または、アルキルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、アルカノイル、または、アルキルであり、Ｒ1は、Ｘ１がＯの時、水素、アルキル、または、アルカノイルアルキルであり、Ｘ１がＳの時、アルキル、または、アルカノイルアルキルであり、Ｒ７は水素、アルカノイル、または、ヒドロキシアルカノイルである。
　また、前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体は下記式２で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
式中、ＸＰ（Ｐは１から４までの整数）はＯあるいはＳであり、ＲＰ（Ｐは１、３、４、５から選択される整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、アルキル、アルカノイルアルキル、または、アルカノイルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、アルキル、アルカノイルアルキル、または、アルカノイルであり、Ｒ２は水素、または、アルカノイルである。
　なお、式１および２における、アルカノイル、アルキル、アルカノイルアルキル、および、ヒドロキシアルカノイルは低級であることが好ましい。
　ここで、ＧＮＥタンパク質の機能低下が、ＧＮＥ遺伝子の変異によることがより好ましく、疾患が腎機能障害またはミオパチーであることがさらに好ましい。
　なお、前記中間生成物がＮ－アセチルマンノサミン－６リン酸、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸－９リン酸であることが好ましい。
　また、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体がＡｃ５ＮｅｕＡｃあるいはＡｃ５ＮｅｕＡｃ－Ｍｅであることが好ましく、前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体がＡｃ４ＭａｎＮＡｃであることが好ましい。
　さらに、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物がシアリルラクトースであることが好ましい。
　前記中間生成物分解酵素阻害物質がＧｌｃＮＡｃｏｌ、あるいは、ＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃｏｌの誘導体がＡｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌであることがより好ましい。
　本発明に係る食品組成物は、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物の分解酵素阻害物質からなる群より選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の化合物の組み合わせを含有する。
　ここで、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体は下記式１で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
式中、ＸＰ（Ｐは１から６までの整数）はＯあるいはＳであり、ＲＰ（Ｐは２から６までの整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、アルカノイル、または、アルキルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、アルカノイル、または、アルキルであり、Ｒ1は、Ｘ１がＯの時、水素、アルキル、または、アルカノイルアルキルであり、Ｘ１がＳの時、アルキル、または、アルカノイルアルキルであり、Ｒ７は水素、アルカノイル、または、ヒドロキシアルカノイルである。
　また、前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体は下記式２で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
式中、ＸＰ（Ｐは１から４までの整数）はＯあるいはＳであり、ＲＰ（Ｐは１、３、４、５から選択される整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、アルキル、アルカノイルアルキル、または、アルカノイルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、アルキル、アルカノイルアルキル、または、アルカノイルであり、Ｒ２は水素、または、アルカノイルである。
　なお、式１および２における、アルカノイル、アルキル、アルカノイルアルキル、および、ヒドロキシアルカノイルは低級であることが好ましい。
　ここで、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体がＡｃ５ＮｅｕＡｃあるいはＡｃ５ＮｅｕＡｃ－Ｍｅであることが好ましく、前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体がＡｃ４ＭａｎＮＡｃであることが好ましい。
　また、前記中間生成物の分解酵素阻害物質がＧｌｃＮＡｃｏｌ、あるいは、ＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃｏｌの誘導体がＡｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌであることがより好ましい。
　本発明に係る食品は、上記いずれかの食品組成物を含有することを特徴とする。
　本発明に係る食品添加物は、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物から選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の組み合わせを含有し、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、および、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物が天然物から精製された化合物、あるいは化学的に合成された化合物であることを特徴とする。
　ここで、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物の総含有量が５０％以上であることが好ましい。
　本発明に係る食品添加物含有食品の製造方法は、上記いずれかの食品添加物を添加する工程を含むことを特徴とする。
　本発明に係る食品添加物含有食品は、上記いずれかの食品添加物含有食品の製造方法によって製造されることを特徴とする。
＝＝クロスリファレンス＝＝
　本出願は、２００９年５月１５日付で出願した日本国特許出願２００９－１１９２７２に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施形態において、各種試薬存在下でＤＭＲＶモデルマウス由来筋管細胞を培養した場合のデスミン、ＷＧＡ、ＳＢＡ標識を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態において、濃度の異なる各種試薬存在下でヒトＤＭＲＶ患者由来筋管細胞を培養した場合のＮｅｕＡｃ量を示したグラフである。 本発明の一実施形態において、各種試薬存在下でＤＭＲＶモデルマウス由来筋管細胞を培養した場合のＮｅｕＡｃ量を示したグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の生存率を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の生存率を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の筋組織中のＮｅｕＡｃ量を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに４０または４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃを投与した場合の、筋組織中のＮｅｕＡｃ量を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の血中クレアチンキナーゼ活性を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の走行距離を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の走行距離を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合のぶら下がり時間を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の、持久力テスト中にマウスが受けた電気刺激回数を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の、持久力テスト中にマウスが受けた電気刺激回数を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の腓腹筋断面積を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の腓腹筋比収縮力を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の腓腹筋比収縮力を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合のＰｔ（等尺性収縮力）／筋断面積を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合のＰｔ（等尺性収縮力）／筋断面積を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の、ヘマトキシリン－エオシン染色（Ｈ－Ｅ）、酸性ホスファターゼ活性染色、抗アミロイド抗体（ＬＣ３）標識、コンゴーレッド染色した筋組織の顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の抗βアミロイド抗体（Ａβ１－４０、Ａβ１－４２）標識、抗リン酸化タウ抗体標識した筋組織の顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の、筋組織中の縁取り空胞数を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに各種試薬を投与した場合の、筋組織中のアミロイド含有縁取り空胞数を示すグラフである。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに４０または４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃを投与した場合の、ヘマトキシリン－エオシン染色（Ｈ－Ｅ）、Ｇｏｍｏｒｉトリクローム変法染色、あるいは酸性ホスファターゼ活性染色した筋組織の顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態において、ＤＭＲＶモデルマウスに４０または４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃを投与した場合の、抗Ｌａｍｐ２抗体標識、抗βアミロイド抗体（Ａβ１－４２）標識、抗ｐ６２タンパク質抗体標識した筋組織の顕微鏡写真である。
　以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
　実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
　なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝化合物＝＝
　まず、本発明に係る医薬剤、食品組成物、または食品添加物の製造に用いる化合物について詳細に説明する。
（１）Ｎ－アセチルノイラミン酸
　Ｎ－アセチルノイラミン酸の由来は制限されず、例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸を含む動物組織、培養細胞、哺乳動物のミルク、鶏卵等から周知の方法で単離、精製された天然由来のＮ－アセチルノイラミン酸であっても、化学的に合成されたＮ－アセチルノイラミン酸であってもよい。
（２）Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物
　Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物は、Ｎ－アセチルマンノサミン－６リン酸、あるいはＮ－アセチルノイラミン酸－９リン酸であることが好ましい。これらの中間生成物の由来は制限されず、例えば、動物組織や培養細胞等から当業者に周知の方法で単離、精製した天然由来の中間生成物であっても、化学的に合成した中間生成物であってもよい。
（３）Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体及びＮ－アセチルマンノサミン誘導体
　Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体は、下記式１で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
式中、ＸＰ（Ｐは１から６までの整数）はＯあるいはＳであり、ＲＰ（Ｐは２から６までの整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、アルカノイル、または、アルキルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、アルカノイル、または、アルキルであり、Ｒ1は、Ｘ１がＯの時、水素、アルキル、または、アルカノイルアルキルであり、Ｘ１がＳの時、アルキル、または、アルカノイルアルキルであり、Ｒ７は水素、アルカノイル、または、ヒドロキシアルカノイルである。ここで、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰとは、具体的にはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６に対してそれぞれＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６である。なお、ＸＰ（Ｐは１から６までの整数）およびＲＰ（Ｐは１から７までの整数）はそれぞれ独立に選択される。
　Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体は下記式２で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
式中、ＸＰ（Ｐは１から４までの整数）はＯあるいはＳであり、ＲＰ（Ｐは１、３、４、５から選択される整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、アルキル、アルカノイルアルキル、または、アルカノイルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、アルキル、アルカノイルアルキル、または、アルカノイルであり、Ｒ２は水素、または、アルカノイルである。ここで、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰとは、具体的にはＲ１に対してＸ１、Ｒ３に対してＸ２、Ｒ４に対してＸ３、Ｒ５に対してＸ４である。なお、ＸＰ（Ｐは１から４までの整数）およびＲＰ（Ｐは１から５までの整数）はそれぞれ独立に選択される。
　なお、式１および２における、アルカノイル、アルキル、アルカノイルアルキル、および、ヒドロキシアルカノイルは低級であることが好ましい。
　特記しない限り、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル等は直鎖および側鎖の両方を含む。「プロピル」のような分岐しない基は直鎖のみを含む。
　以下に各Ｒ基の具体例を示すが、これらに限定されない。低級アルキルは、例えば（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであることが好ましく、そのような低級アルキルまたは（Ｃ１－Ｃ６）アルキルは、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、セク（sec-）ブチル、ペンチル、３－ペンチル、ヘキシルが例示できる。（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、あるいはシクロヘキシルが例示できる。（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、２－シクロプロピルエチル、２－シクロブチルエチル、２－シクロペンチルエチル、２－シクロヘキシルエチルが例示できる。（Ｃ２－Ｃ６）アルケニルは、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニルが例示できる。（Ｃ２－Ｃ６）アルキニルは、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、３－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－ペンチニル、４－ペンチニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、４－ヘキシニル、５－ヘキシニルが例示できる。低級アルカノイルは、例えば、直鎖または分枝鎖（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルであることが好ましく、具体的には、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルが例示できる。ハロ（Ｃ１－Ｃ６）アルキルはヨードメチル、ブロモメチル、クロロメチル、フルオロメチル、トリフルオロメチル、２－クロロエチル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチルが例示できる。ヒドロキシ（Ｃ１－Ｃ６）アルキルはヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル、１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル、１－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル、１－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル、１－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシルが例示できる。（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル、ヘキシルカルボニルが例示できる。（Ｃ２－Ｃ６）ヒドロキシアルカノイルは、グリコリル、ラクチル、ヒドロキシブタノイル、ヒドロキシペンタノイル、ヒドロキシヘキサノイルが例示できる。
　これらのＮ－アセチルノイラミン酸誘導体およびＮ－アセチルマンノサミン誘導体の由来は特に制限されず、天然由来であっても、あるいは当業者に周知の方法で合成された各誘導体であってもよい。合成Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体である場合、合成に用いられる原料化合物は、所望のＮ－アセチルノイラミン酸誘導体が合成できる範囲内で特に制限されず、例えば、前述したいずれかのＮ－アセチルノイラミン酸を用いても、あるいは既に周知の方法で合成された他種のＮ－アセチルノイラミン酸誘導体を用いてもよい。また、合成Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体である場合、合成に用いられる原材料化合物は、所望のＮ－アセチルマンノサミン誘導体が合成できる範囲内で特に制限されず、例えば、Ｎ－アセチルマンノサミンを用いても、あるいは既に周知の方法で合成された他種のＮ－アセチルマンノサミン誘導体を用いてもよい。
（４）Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン含有化合物、および、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体含有化合物
　Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン含有化合物、および、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体含有化合物は、上記のＮ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン、あるいは、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体のいずれかを、その構造の一部として含む化合物であれば制限がなく、例えば天然由来のＮ－アセチルノイラミン酸含有糖であるシアリルラクトースや、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有ペプチドであるカゼイングリコマクロペプチドやムチン、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有糖脂質であるガングリオシド等が挙げられる。これらの化合物は、天然由来化合物であっても、あるいは、当業者に周知の方法で人工的に合成された化合物であってもよい。
（５）分解酵素阻害物質
　Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物の分解酵素阻害物質は、細胞内に存在するＮ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルマンノサミンや中間生成物の分解酵素の機能を阻害する物質であれば制限されない。Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素としては、例えばＮ－アセチルノイラミン酸ピルビン酸リアーゼが挙げられる。また、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素としては、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２－エピメラーゼが挙げられる。Ｎ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物として、例えばＮ－アセチルマンノサミン－６リン酸、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸－９リン酸が挙げられる。分解酵素阻害物質は、酵素の機能阻害作用を有する範囲内で制限されず、例えば、酵素をコードするＤＮＡの配列に特異的なsiＲＮＡのような、発現抑制物質であってもよい。siＲＮＡの場合、当業者に周知の方法によって所望のsiＲＮＡを合成することができる。あるいは、阻害物質は、酵素に結合することで機能を阻害する化合物であってもよく、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素の場合、例えばＮ－アセチルグルコサミニトール（ＧｌｃＮＡｃｏｌ）やＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体のような化合物であってもよい。ＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体の好適な例として、アセチル化Ｎ－アセチルグルコサミニトール（Ａｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌ）のような細胞透過性を有する誘導体が挙げられる。ＧｌｃＮＡｃｏｌやＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体は当業者に周知の方法で合成することができ、その由来は限定されない。また、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素である細菌由来のアセチルノイラミン酸リアーゼ(ほ乳類では、Ｎ－アセチルノイラミン酸ピルビン酸リアーゼと呼ばれる)に対する阻害物質として、例えばＮ－アセチル－４－オキソ－ノイラミン酸が挙げられる。
＝＝医薬剤の製造方法＝＝
　本発明に係る医薬剤は、上記「化合物」に記載の、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン含有化合物、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、前記中間生成物の分解酵素阻害物質からなる群より選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の化合物の組み合わせを含有する。
　本発明に係る医薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を患者の患部に送達するために適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよい。あるいは、シップ剤、軟膏等の外用薬に剤形化してもよい。本発明に係る医薬剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
＝＝治療用医薬剤の使用方法＝＝
　本発明に係る治療用医薬剤は、動物個体内で、細胞におけるＮ－アセチルノイラミン酸量を増加させる効果を有する。従って、本発明に係る治療用医薬剤は、細胞におけるＮ－アセチルノイラミン酸量が低下するために発症するいずれの疾患の治療あるいは予防のために用いることもでき、例えば、ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患を治療対象とすることができる。ここで、ＧＮＥタンパク質の機能低下とは、ＧＮＥタンパク質が、その標的タンパク質に対して持つべき機能が完全に失われている、あるいは、低下している場合の両方を含む。この場合、その原因は特に制限されず、例えば、ＧＮＥタンパク質発現過程の障害によってタンパク質が発現しなかったり、または翻訳後のタンパク質が正常に機能できない構造に変性していたり、阻害や修飾等の障害によってタンパク質が正常に機能していなくてもよく、その原因は、ＧＮＥ遺伝子の変異が生じているような遺伝的要因であっても、阻害物質などによる外部要因であってもよい。このような、ＧＮＥ遺伝子の変異に起因して生じる疾患として、例えば、糸球体腎炎、間質性腎炎、ネフロンろう、ネフローゼ症候群をはじめとする腎機能障害、ミオパチー、心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本医薬剤の投与対象となる動物に制限はないが、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物であることが好ましい。
　本発明に係る治療用医薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、必要量を、適した方法で投与することができる。本発明に係る医薬剤の投与量は、剤形の種類、投与方法、患者等投与対象の年齢や体重、患者等投与対象の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
＝＝食品組成物＝＝
　本発明に係る食品組成物は、上記「化合物」に記載の、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物の分解酵素阻害物質からなる群より選択されるいずれか一つあるいは２つ以上の化合物の組み合わせを含有する。
　本発明に係る食品組成物は、任意の所望成分を配合することができる。例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ等のビタミン類、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等であってもよく、あるいは、異なる食品組成物であってもよい。本発明に係る食品組成物の用途は特に限定されないが、例えば、食品、栄養補助食品、サプリメントなどを製造するための食品原料として、あるいは、食品添加物として使用することができる。この際、本食品組成物を含有する食品の製造方法は特に制限されず、当業者が適宜選択することができる。なお、これらの食品に含まれる食品組成物の割合は特に制限されない。また、本発明に係る食品組成物を含む食品は、後述の食品添加物を含んでいてもよい。
＝＝食品添加物＝＝
　食品添加物とは、食品の製造の過程において又は加工若しくは保存の目的で、食品に添加、混和、浸潤その他の方法によって使用するものをいう。本発明に係る食品添加物は、上記「化合物」に記載の、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物から選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の組み合わせを含有する。本発明の食品添加物に含有されるこれらの化合物は、天然物から精製された化合物、あるいは化学的に合成された化合物である。本食品添加物中のこれらの化合物の総含有量は５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。
　本発明に係る食品添加物には、上記化合物以外に任意の所望成分を配合することができる。例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ等のビタミン類、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等であってもよく、あるいは、異なる食品添加物であってもよい。ただし、食品添加物として適さない成分、例えば、食品に加工した時点での添加物濃度において、その食品を摂取する動物に対して毒性を有する成分等は、本食品添加物には配合できない。
　本発明に係る食品添加物の用途は特に限定されないが、例えば、下記製造方法によって製造される食品などに添加し、食品添加物を含有する食品を製造することができる。
＝＝食品添加物含有食品の製造方法＝＝
　本発明に係る食品添加物含有食品は、製造工程で本発明に係る食品添加物が添加されて製造される。食品添加物を添加するのは、食品製造工程において、どの段階でも良く、製造する食品の種類に応じて当業者が適宜決定できる。また、食品に添加する食品添加物の量は、製造された食品を摂取する動物における、食品添加物の必要量とその食品の摂取量とから割り出すことができ、当業者が適宜決定することができる。ただし、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物の濃度が、製造された食品中１０％以上になるように食品添加物を添加することが好ましい。また、本発明に係る食品添加物含有食品は、前述の食品組成物を含んでいてもよい。
＝＝食品組成物を含有する食品および食品添加物含有食品＝＝
　本発明に係る、食品組成物を含有する食品、あるいは、食品添加物含有食品の形態として、菓子類、調味料、嗜好性食品、飲料等の一般的な食品を例示できる。具体的形態としては、クッキー、ビスケット、キャンディ、ガム、ゼリー等の固形または半固形嗜好食品類、果汁、茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料類、パン、麺類等の主食系食品類、スープ、カレー、シチュー、各種ソース等の副食系食品類、各種風味、調味料類とすることができる。ここで、本発明に係る食品には、栄養補助食品、機能性食品、特定保健用食品、経管栄養剤等も含まれる。また、上記の本発明に係る医薬剤と同様の剤形をとってもよい。
　本発明に係る食品組成物あるいは本発明に係る食品添加物含有食品を摂取する動物は特に制限されないが、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物であることが好ましく、例えば、本発明に係る医薬剤による治療対象となる疾患に罹患する患者であってもよい。
　本発明に係る食品組成物を含有する食品、および、本発明に係る食品添加物含有食品は、民間薬、機能性食品、健康食品、栄養補助食品などとして、安全とされている摂取量の範囲内において、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物が、必要量を摂取することができる。本発明に係る食品の摂取量は、食品の種類、摂取者の年齢や体重を考慮して決定することができるが、例えば、摂取者が何らかの疾患に罹患している場合には、その疾患の種類や症状等を考慮して、適宜決定することが好ましい。なお、この食品用途では、食品に、その効果を有する旨の表示を付すことが好ましく、その表示例として、細胞におけるＮ－アセチルノイラミン酸量を上昇させるために用いられるものである旨、あるいはＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の症状を改善するために用いられるものである旨、などが挙げられるが、その表示は食品の効果を表す表示であればよく、これらの例には限定されない。
[実験方法]
＝＝ＤＭＲＶヒト患者＝＝
　ＤＭＲＶヒト患者は、ＧＮＥ遺伝子変異検索によってＤＭＲＶに罹患していることが確認された成人患者である。（患者の人数：４２例、発症年齢：２０～３０歳、性別：男女）国立精神・神経センターで承認されたプロトコールに従って、インフォームドコンセントを行ったこれらの患者ボランティアに局所麻酔を施し、骨格筋（上腕二頭筋、前頚骨筋）をバイオプシにより採取した。
＝＝ＤＭＲＶモデルマウス＝＝
　ＤＭＲＶモデルマウスは、特開２００７－３１２６４１に記載されているＧＮＥ（－／－）ｈＧＮＥＤ１７６Ｖ－Ｔｇを用いた。また、対照として、ＧＮＥ遺伝子変異を有さない同腹正常個体を用いた。本実施例に用いたマウスは、水と餌を自由に摂取し、餌に含まれる、平均１４ｍｇ／ｋｇ体重／日のＮ－アセチルノイラミン酸化合物を摂取している。
＝＝試薬＝＝
　Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）およびＮ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）はナカライテスク社より購入した。ペンタ－０－アセチル－Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ａｃ５ＮｅｕＡｃ）、ペンタ－０－アセチル－Ｎ－アセチルノイラミン酸メチルエステル（Ａｃ５ＮｅｕＡｃ－Ｍｅ）は長良サイエンス社より購入した。シアリルラクトース（ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）はSigma-Aldrich 社より購入した。テトラ－０－アセチル－Ｎ－アセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ）はＮＺＰ社より購入した。ペンタ－０－アセチルＮ－アセチルグルコサミニトール（Ａｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌ）は、Ｎ－アセチルグルコサミニトール（Marker Gene Technologies 社より購入）を用い、Luchanskyら（J. Biol. Chem. 278, 8035-8042, 2003）の方法に従い合成した。具体的には、０．５gのＮ－アセチルグルコサミニトールを５ｍｌのピリジンに溶解後、２．５ｍｌの無水酢酸を加えて、一晩、撹拌して反応させた。溶媒を蒸発させ、残渣をクロロホルムに溶解後、クロロホルム相を１．０Ｍ塩酸、固体炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗った。クロロホルム相を蒸発乾固した後、エタノールに溶解し、ＨＰＬＣにて生成した生成物をエタノールに溶解し、－２０℃で保存した。
＝＝筋管細胞の初代培養細胞の調製＝＝
　上記ＤＭＲＶヒト患者、あるいは、モデルマウスから採取した骨格筋組織をＰＢＳまたはＨａｎｋ’ｓ平衡塩中で、軽く洗浄した後、０．２５％トリプシンで５分間処理した。眼科用ハサミを用いて組織を数ミリ大に細かく刻み、０．４％コラゲナーゼII/０．２５％トリプシンで３０分間３７℃で消化した後静置し、上清を回収した。沈殿を再び上記酵素液で処理した。静置後、沈殿をＤＭＥＭ-Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地に十分懸濁させた。この組織液をナイロンメッシュに通すことにより組織を除去し、洗液と上記上清を合わせて、遠心し、細胞を回収した。このようにして得られた細胞を、１００ｍｍ径プラスチックディッシュあたり１０６個の細胞密度でＤＭＥＭ－Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地に播種し、これを３７℃、５％ＣＯ２環境下で４～７日培養した。
＝＝ＨＰＬＣ法によるＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃ量測定＝＝
　試料が培養細胞である場合、細胞をＰＢＳにて３回洗浄した後、４００μｌの５０ｍＭ 硫酸を加え、８０℃、６０分間インキュベートし、加水分解によってＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃを遊離させた。試料が組織片である場合、組織を凍結後、エアハンマーを用いて粉砕し、ＫＣｌ－トリス溶液中でホモジナイズした。沈殿を、再度ＫＣｌ－トリス溶液で洗浄後、５０ｍＭ 硫酸中で１時間８０℃に加熱することにより加水分解し、ＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃを遊離させた。このようにＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃを遊離させた試料中に、７ｍｍｏｌ 1,2-Diamino-4,5-methylenedioxybenzene, dihydrochloride（ＭＤＢ、同人化学社）溶液（１５．８ ｍｇ ＭＤＢ、４８．８ ｍｇ Ｎａ２Ｓ２Ｏ４、７３５ μｌ ２－メルカプトエタノールを蒸留水に溶解し、１０ｍｌとした）を４００μｌ添加し、６０℃で２．５時間反応させた。このようにして生成した蛍光誘導体をＨＰＬＣ（日本分光）で測定した。この際、標準として、０．０５～５ｎｍｏｌ／μｌのＮｅｕ５ＡｃとＮｅｕ５Ｇｃスタンダードを用いた。組織からのタンパク質量は、Bio-Rad Protein Assayキット（Bio-Rad Laboratories 社）を用いて測定した。
[実施例１]
　本実施例では、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＡｃ誘導体、ＮｅｕＡｃ生合成経路においてＭａｎＮＡｃより下流で生成する中間生成物が筋管細胞の初代培養細胞においてシアリル化糖化合物を増加させることを示す。
＝＝試薬の投与＝＝
　上記ＤＭＲＶモデルマウス由来筋管細胞の初代培養細胞の培地に、試薬を加え、それぞれ最終濃度が５ｍＭ ＭａｎＮＡｃ、５ｍＭ ＮｅｕＡｃ、５ｍＭ Ａｃ５ＮｅｕＡｃ、０．５ｍＭ Ａｃ５ＮｅｕＡｃ－Ｍｅ、０．２ｍＭ Ａｃ４ＭａｎＮＡｃになるよう調製した。その後、さらに３日間培養を続けた。
＝＝組織学的ＮｅｕＡｃ検出方法＝＝
　各試薬の存在下で培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１５分間、室温で固定し、氷上で３０分間０．０５％サポニン処理した。処理後の細胞を、筋管細胞のマーカーである抗デスミン抗体（カタログ番号６９－１８１、ICN Pharmaceuticals 社）で検出し、ＤＡＰＩ（和光純薬）で対比染色した。二次抗体として、Alexa Fluor 568 標識抗体（Invitrogen 社）を用い、３０分間室温でインキュベートした。さらに、ビオチン標識ＳＢＡレクチン（生化学工業株式会社）、あるいは、ビオチン標識ＷＧＡレクチン（生化学工業株式会社）で標識した。さらに、ＦＩＴＣ標識アビジン（Vector 社）で３０分間室温でインキュベートし、ビオチン標識各レクチンを蛍光標識した。なお、ＳＢＡは糖鎖末端構造におけるＧａｌＮＡｃ構造を認識し、ＷＧＡはシアル酸クラスター構造を認識し、このシアル酸にはＮｅｕＡｃが含まれる。これらの標識した初代培養細胞は、共焦点レーザースキャン蛍光顕微鏡（Olympus 社）で観察した。
　図１に示すように、未処理群の初代培養細胞においては、デスミン陽性筋管細胞は、ＷＧＡ陰性、ＳＢＡ陽性であった。すなわち、これらの筋管細胞では、糖鎖末端構造におけるシアル酸による修飾が減少し、ＧａｌＮＡｃによる修飾が増加していることを示す。一方、各試薬を培地に加えて培養したいずれの群の筋管細胞においても、未処理群と比較してＷＧＡによる標識が増加し、逆に、ＳＢＡによる標識が減少した。すなわち、筋管細胞のシアル酸修飾が増加していた。
　以上の結果は、本実施例で培地に加えたいずれの試薬化合物も、ＤＭＲＶモデルマウス由来の筋管細胞における糖鎖末端構造のシアル酸修飾を増加させる効果のあることを示している。よって、これらの試薬化合物は、細胞におけるシアル酸修飾量を増加させる効果がある。
[実施例２]
　本実施例は、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＡｃ誘導体、ＭａｎＮＡｃ誘導体、ＮｅｕＡｃ生合成経路においてＭａｎＮＡｃより下流で生成する中間生成物が投与量依存的なＮｅｕＡｃ増加効果を有することを示す。
＝＝試薬の投与＝＝
　上記ＤＭＲＶヒト患者由来筋管細胞の初代培養細胞の培地に、最終濃度が、０．００５、０．０５、０．５、あるいは、５ｍＭになるように、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、あるいは、Ａｃ５ＮｅｕＡｃを加えた。また、高濃度で細胞毒性を有するＡｃ４ＭａｎＮＡｃは、最終濃度が０．０００２、０．００２、０．０２あるいは０．２ｍＭになるように加えた。陰性コントロール群の細胞には、ＧａｌＮＡｃを０．００５、０．０５、０．５、あるいは、５ｍＭになるように加えた。その後、さらに３日間培養を続けた。上記ＨＰＬＣ法に従い、この培養細胞のＮｅｕＡｃ量を測定した（Ｎ＝３）。
　図２に示すように、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、および、Ａｃ５ＮｅｕＡｃはその用量に依存して、細胞のＮｅｕＡｃ量を増加させる効果を示した。また、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃは、低濃度域で同様に、用量依存的なＮｅｕＡｃ量増加効果を示した。
　以上の結果は、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、Ａｃ５ＮｅｕＡｃ、および、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃの、ＤＭＲＶ筋管細胞におけるＮｅｕＡｃ量増加効果が用量依存的であることを示す。
[実施例３]
　本実施例は、ＧａｌＮＡｃ２－エピメラーゼ阻害剤がＭａｎＮＡｃによるＮｅｕＡｃ量増加効果を増大させることを示す。
＝＝試薬の投与＝＝
　上記ＤＭＲＶモデルマウス由来筋管細胞の初代培養細胞の培地に、ＭａｎＮＡｃを最終濃度１０ｍＭ、および、Ａｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌを最終濃度１００μＭあるいは５００μＭになるように添加し、３日間培養した。対照群の培養細胞の培地には、１０ｍＭグルコース（Ｇｌｃ）のみを添加した。上記ＨＰＬＣ法に従い、この培養細胞のＮｅｕＡｃ量を測定した（Ｎ＝３）。
　図３に示すように、ＤＭＲＶモデルマウス由来筋管細胞では、対照群と比較して、ＭａｎＮＡｃを添加した場合にＮｅｕＡｃ量が増加し、ＭａｎＮＡｃに加えて１００あるいは５００μＭ Ａｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌを添加した場合にＮｅｕＡｃ量はさらに増加した。
　以上の結果は、ＮｅｕＡｃ生合成の中間生成物、および、その中間生成物の分解酵素阻害剤が筋管細胞のＮｅｕＡｃ量を増加させる効果を有することを示す。さらに、中間生成物と、その分解酵素阻害剤を共に用いると、そのＮｅｕＡｃ増加効果が増大することを示す。
[実施例４]
　本実施例は、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＡｃ生合成経路の中間生成物、ＮｅｕＡｃ誘導体、ＭａｎＮＡｃ誘導体、ＮｅｕＡｃ含有化合物がＤＲＶＭモデルマウスの病状および生存率を改善することを示す。
＝＝薬剤投与＝＝
　１１～１５週齢から５６～５８週齢にかけて、ＤＭＲＶモデルマウスに対し、飲水に溶解したＭａｎＮＡｃ（Ｎ＝６）、ＮｅｕＡｃ（Ｎ＝５）またはシアリルラクトース（Ｎ＝７）を２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で４３～４５週間投与した。また、同年齢のＤＭＲＶモデルマウスに対し、飲水に溶解したＡｃ４ＭａｎＮＡｃを４０ｍｇ（Ｎ＝５）あるいは４００ｍｇ／ｋｇ体重／日（Ｎ＝４）の用量で４３～４７週間投与した。プラセボ群のマウスには、薬剤無添加の飲水を与えた。
　上記薬剤投与期間中、定期的に体重測定、生存率確認、血液採取（投与開始０、２５、４９日後、およびその後２８日毎）、ぶら下がりテスト（投与開始０、４９日後、およびその後５６日毎）を行い、投与終了時に生存していた個体（ＭａｎＮＡｃ投与群：Ｎ＝５、ＮｅｕＡｃ投与群：Ｎ＝５、シアリルラクトース群：Ｎ＝６）にはトレッドミルテストを行った後、筋組織を摘出し、筋収縮テスト、ＮｅｕＡｃ量測定、筋組織病理観察を行った。
＝＝血中クレアチンキナーゼ活性測定＝＝
　薬剤投与期間中、マウスの尾から定期的に血液採取を行った。この血液から遠心分離によって血清を調製し、デタミナーＣＰＫ―Ｌキット（協和メデックス 社）によって血中クレアチン活性を測定した。また、Ｔｉｔａｎ　Ｇｅｌ　Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ　ｋｉｔ（Helen Laboratories 社）を用いて血清を電気泳動し、クレアチンキナーゼを確認した。なお、クレアチンキナーゼは、激しい運動や筋疾患によって筋繊維が障害を受けた際に血中に流出し、血中濃度が上昇することが知られている。
＝＝ぶら下がりテスト＝＝
　高さ５０ｃｍの筒の上に、直径約０．５ｍｍの針金でできた６ｍｍ格子の金網を載せた。この金網にマウスを逆さにつかまらせ、落下するまでの時間を計測した。一個体につき３回ずつ試験した。
＝＝トレッドミルテスト＝＝
　マウスを装置に馴化させるため、一週間前からトレーニングを開始した。この馴化期間中、７度の勾配を５～１５ｍ／分の速度で１日当たり３０分、合計７日間、マウスを走行させた。本試験においては、運動能力テストとして、初速度２０ｍ／分から１分毎に１０ｍ／分ずつ加速していき、マウスが走行できなくなるまでの積算走行距離を測定した。持久力テストとして、７度の勾配を２０ｍ／分の速度でマウスを６０分間走行させた後、さらに３分間走行させ、この３分間にマウスが走行レーン最後部の刺激グリッドから受けた電気刺激数を計測した。
＝＝筋収縮テスト＝＝
　マウスにペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔し、前脛骨筋と腓腹筋の連続した筋組織を単離した。この単離筋組織の、末端の腱と脛骨を糸で縛り、各糸の端をそれぞれ糸吊管（筋長制御装置）と、アイソトニックトランスデューサ（ＴＢ－６５１Ｔ（腓腹筋用）、ＴＢ－６５３ＴＤ－１１２Ｓ（前脛骨筋用）、日本光電社）に垂直に接続した。筋組織を乳酸リンガー液（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）中に設置し、電気刺激装置（ＳＥＮ－３３０１、日本光電）および増幅器（ＰＰ－１０６Ｈ、日本光電）を用いて４００μｓの単収縮刺激を与えながら筋組織を伸長させ、最大収縮力が得られる長さ（Ｌ０）、および、その時の収縮力（等尺性収縮力：Ｐｔ）を測定した。さらに、筋組織を収縮力の得られる長さ（Ｌ０）に保ったまま電気刺激を３ｍｓに低下させた上で、１０～１０００Ｈｚで３００～６００回の反復刺激を２分以上の間隔で与えた際の最大収縮力（Ｐ０）を決定した。この測定後、筋組織の平均断面積（ＣＳＡ：筋重量／Ｌ０）を算出した。
＝＝筋組織病理観察＝＝
　上記筋収縮テストに用いた腓腹筋を液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させ、クリオスタッドで６μｍ厚の凍結切片を作製した。この切片をスライドガラスにマウントし、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ－Ｅ）染色、酸性ホスファターゼ活性染色（Malicdan et al. Method. Enzymol. 453, 379-396, 2009 参照）、あるいはＧｏｍｏｒｉトリクローム変法染色（Malicdan et al. Method. Enzymol. 453, 379-396, 2009 参照）を隣接切片において行った。これらの切片を光学顕微鏡下で観察した。また、同様にして作製した１０μｍ厚の凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで固定後、コンゴーレッド染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
　また、上記と同様に作成した６μｍ厚の凍結切片をアセトンで固定し、切片をブロッキング溶液（５％正常ヤギ血清または２％カゼイン添加ＰＢＳ）でブロックした。抗オートファジーマーカータンパク質ＬＣ３ウサギポリクローナル抗体（NB100-2220、Novus Biologicals 社、１００倍希釈）、抗βアミロイドウサギポリクローナル抗体（Ａβ１－４０、AB5074P、Chemicon 社、１００倍希釈）、抗βアミロイドウサギポリクローナル抗体（Ａβ１－４２、AB5078P、Chemicon 社、１００倍希釈）、抗リン酸化タウマウスモノクローナル抗体（90206、Innogenetics 社、１００倍希釈）、抗アミロイドマウスモノクローナル抗体（６Ｅ１０、Covance 社、４００倍希釈）、抗ｐ６２タンパク質ウサギポリクローナル抗体（PW9860、Biomol 社、５００倍希釈）、または、抗リソソーム膜タンパク質２（Ｌａｍｐ２）ウサギポリクローナル抗体（ABL-93、Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowaより入手、１００倍希釈）と１時間、室温でインキュベートした。二次抗体としてAlexa Fluor 488または568標識抗ウサギ／マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Molecular Probes 社）を適宜用いた。これらの免疫染色プレパラートは蛍光顕微鏡下で観察した。なお、コンゴーレッド染色とＬＣ３による標識は隣接切片において行った。
　なお、ミオパチーに罹患した患者の筋組織で見られる縁取り空胞は酸性ホスファターゼ陽性であることが知られる。ＤＭＲＶの骨格筋繊維内にはアミロイドタンパク質が蓄積し、コンゴーレッドはアミロイドを認識して蛍光を発する。タウタンパク質はアミロイドβタンパク質によってリン酸化される。ＧＮＥ遺伝子の変異に起因するミオパチーでは、Ｌａｍｐ２タンパク質が局在するリソソーム性の小胞が蓄積することが知られる。また、ｐ６２タンパク質はポリユビキチン蛋白質を認識するとともに、ＬＣ３に直接結合して、ポリユビキチン化蛋白質の蓄積部位でオートファジーを誘導することが知られるが、ミオパチー罹患筋組織ではアミロイドとの共局在を示す。
＝＝縁取り空胞形成計数＝＝
　１００μｍ間隔で作製した１０μｍ厚のＨ－Ｅ染色した病理切片６枚において、筋肉組織断面全体に観察される縁取り空胞数を計数した。また、アミロイド陽性タンパク質デポジットの計数のために、１００μｍ間隔で作製した１０μｍ厚切片６枚における、筋肉組織断面全体に観察される抗アミロイド抗体（６Ｅ１０）標識デポジットが存在する細胞数を計数した。
　図４に示すように、ＤＭＲＶモデルマウスの生存率は、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群において、プラセボ群と比較して有意に上昇した。また、図５に示すように、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群のＤＭＲＶモデルマウスにおいても、プラセボ群と比較して生存率が上昇した。
　筋組織のＮｅｕＡｃ量は、プラセボ群、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群で測定した。図６に示すように、プラセボ群のＤＭＲＶモデルマウスと比較し、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群においてＮｅｕＡｃ量が有意に増加していた。
　また、４０ｍｇ／ｋｇまたは４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群においても筋組織のＮｅｕＡｃ量を測定した。図７に示すように、ＤＭＲＶモデルマウスにおける筋組織のＮｅｕＡｃ量は、プラセボ群のＤＭＲＶモデルマウスに比較し、４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群において有意に増加していた。
　図８は各マウスの血中クレアチンキナーゼ活性を示す。ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群において、プラセボ群と比較し、有意な活性低下が示された。
　また、図９および図１０は、運動能力テストにおける各群マウスの積算走行距離を示す。プラセボ群と比較し、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群で、積算走行距離が有意に増加し、運動能力の改善を示した（図９）。また、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃを４００ｍｇ／ｋｇ投与したＤＭＲＶモデルマウスでは、プラセボ群と比較して、有意に積算走行距離が増加し、運動能力の改善を示した（図１０）。
　図１１に示すように、プラセボ群と比較し、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群で、マウスのぶら下がり時間が増加した。
　図１２、図１３は持久力テストにおける、３分間の電気刺激数を示している。ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群のＤＭＲＶモデルマウスでは、プラセボ群と比較して有意に電気刺激数が減少し、持久力の改善を示した（図１２）。さらに、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃを４０ｍｇあるいは４００ｍｇ／ｋｇ投与した群のＤＭＲＶモデルマウスにおいても、プラセボ群と比較して、有意に電気刺激数が減少し、持久力の改善を示した（図１３）。
　図１４、図１５に示すように、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群のＤＭＲＶモデルマウスにおいては、プラセボ群と比較して、腓腹筋断面積および腓腹筋比収縮力（筋断面積当たりのＰ０）が有意に増加した。また、図１６に示すように、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ４０ｍｇおよび４００ｍｇ／ｋｇ投与群のＤＭＲＶモデルマウスにおいても、プラセボ群と比較して腓腹筋比収縮力が有意に増加した。さらに、図１７および図１８に示すように、筋断面積当たりのＰｔは、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群（図１７）Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ４００ｍｇ／ｋｇ投与群（図１８）のＤＭＶＲモデルマウスにおいてプラセボ群と比較して有意に増加した。
　ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群のＤＭＲＶモデルマウス筋組織の病理観察の結果を図１９および２０に示す。図１９Ａに示すように、プラセボ群のＤＭＲＶモデルマウスにおいては、縁取り空胞（矢印）および筋細胞萎縮（矢じり）が観察でき、組織中で高頻度に酸性ホスファターゼ活性染色陽性部位が認められた。一方で、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群においては、縁取り空胞や筋細胞萎縮は観察されず（図１９Ｅ、Ｉ、Ｍ）、酸性ホスファターゼ活性染色は陰性であった（図１９Ｆ、Ｊ、Ｎ）。さらに、ＤＭＲＶの骨格筋繊維はアミロイドタンパク質を蓄積することが知られ、プラセボ群では各抗アミロイド抗体（ＬＣ３、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２）による標識が観察されたが（図１９Ｃ、図２０Ａ、Ｂ）、これに比較して、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群では顕著に標識が減少した（図１９Ｇ、Ｋ、Ｏ、図２０Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ）。同様に、アミロイドを認識するコンゴーレッド染色によって、プラセボ群にのみ蛍光標識が認められた（図１９Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｐ）。また、抗リン酸化タウ抗体による標識は、プラセボ群のみで観察された（図２０Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。以上の病理観察の結果は、ＤＭＲＶモデルマウスの病理組織に認められる、縁取り空胞形成、筋細胞萎縮、アミロイド蓄積等の症状が、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群において改善したことを示している。
　図２１は、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群においては、プラセボ群と比較して、有意に縁取り空胞数が減少したことを示す。また、図２２に示すように、アミロイド陽性細胞数は、プラセボ群と比較して、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、およびシアリルラクトース投与群において有意に減少した。
　４０ｍｇ／ｋｇまたは４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群のＤＭＲＶモデルマウスにおける筋組織の病理観察の結果を図２３および２４に示す。プラセボ群のＤＭＲＶモデルマウスにおいては、図１９Ａで観察されたのと同様に、Ｈ－Ｅ染色またはＧｏｍｏｒｉトリクローム変法染色した組織で縁取り空胞および筋細胞萎縮が認められた（図２３Ａ、Ｂ）。また、組織中に高頻度で酸性ホスファターゼ活性染色陽性部位が認められた（図２３Ｃ）。４０ｍｇ／ｋｇＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群では、プラセボ群に比較して縁取り空胞や筋委縮は著しく低頻度であったが（図２３Ｄ、Ｆ）、酸性ホスファターゼ活性染色陽性部位が散在的に認められた（図２３Ｅ）。一方、４００ｍｇ／ｋｇＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群では、縁取り空胞および筋細胞萎縮は認められず（図２３Ｇ、Ｈ）、酸性ホスファターゼ活性染色は陰性であった（図２３Ｉ）。プラセボ群のＤＭＲＶモデルマウスの骨格筋では、Ｌａｍｐ２、βアミロイド（Ａβ１－４２）、およびｐ６２タンパク質が陽性であった（図２４Ａ、Ｂ、Ｃ）。Ｌａｍｐ２については、４０ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群のＤＭＲＶモデルマウスにおいて大変弱い染色が認められたが、４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群では陰性であった。Ａβ１－４２、ｐ６２タンパク質は、４０および４００ｍｇ／ｋｇのＡｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群のいずれのＤＭＲＶモデルマウスにおいても陰性であった。このように、ＤＭＲＶモデルマウスの病理組織に認められる、縁取り空胞形成、筋細胞萎縮、アミロイド蓄積、繊維状構造等の症状が、Ａｃ４ＭａｎＮＡｃ投与群において改善したことが示された。
　以上の結果は、ＤＭＲＶに罹患する個体に、ＭａｎＮＡｃ、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＡｃ生合成経路の中間生成物、ＮｅｕＡｃ誘導体、ＭａｎＮＡｃ誘導体、ＮｅｕＡｃ含有化合物を投与することによって、疾患を有する筋組織の症状改善、個体の運動能力回復、および、致死率改善の効果が得られることを示している。
　本発明により、ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤、食品組成物、および食品添加物を提供することができる。

Claims (19)

  1. 　ＧＮＥタンパク質の機能低下に起因する疾患の治療用医薬剤であって、
    　Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、前記中間生成物の分解酵素阻害物質からなる群より選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の化合物の組み合わせを含有し、
    　前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体が下記式１で表わされ、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    　式中、ＸＰ（Ｐは１から６までの整数）はＯあるいはＳであり、
    　ＲＰ（Ｐは２から６までの整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、低級アルカノイル、または、低級アルキルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、低級アルカノイル、または、低級アルキルであり、
    　Ｒ1は、Ｘ１がＯの時、水素、低級アルキル、または、低級アルカノイルアルキルであり、Ｘ１がＳの時、低級アルキル、または、低級アルカノイルアルキルであり、
    　Ｒ７は水素、低級アルカノイル、または、低級ヒドロキシアルカノイルであり、
    　前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体は下記式２で表わされ、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    　式中、ＸＰ（Ｐは１から４までの整数）はＯあるいはＳであり、
     ＲＰ（Ｐは１、３、４、５から選択される整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、低級アルキル、低級アルカノイルアルキル、または、低級アルカノイルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、低級アルキル、低級アルカノイルアルキル、または、低級アルカノイルであり、
    　Ｒ２は水素、または、低級アルカノイルであることを特徴とする、医薬剤。
  2. 　請求項１に記載の医薬剤であって、
    　前記ＧＮＥタンパク質の機能低下が、ＧＮＥ遺伝子の変異によることを特徴とする、医薬剤。
  3. 　請求項１または２に記載の医薬剤であって、
    　前記疾患が腎機能障害またはミオパチーであることを特徴とする、医薬剤。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載の医薬剤であって、
    前記中間生成物がＮ－アセチルマンノサミン－６リン酸、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸－９リン酸であることを特徴とする、医薬剤。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の医薬剤であって、
    　前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体がＡｃ５ＮｅｕＡｃあるいはＡｃ５ＮｅｕＡｃ－Ｍｅであることを特徴とする、医薬剤。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の医薬剤であって、
    　前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体がＡｃ４ＭａｎＮＡｃであることを特徴とする、医薬剤。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の医薬剤であって、
    　前記Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物がシアリルラクトースであることを特徴とする、医薬剤。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載の医薬剤であって、
    　前記中間生成物の分解酵素阻害物質がＧｌｃＮＡｃｏｌ、あるいは、ＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体であることを特徴とする、医薬剤。
  9. 　請求項８に記載の医薬剤であって、
    　前記ＧｌｃＮＡｃｏｌの誘導体がＡｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌであることを特徴とする、医薬剤。
  10. 　Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体、Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体、Ｎ－アセチルノイラミン酸の分解酵素阻害物質、Ｎ－アセチルマンノサミンの分解酵素阻害物質、および、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物の分解酵素阻害物質からなる群より選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の化合物の組み合わせを含有し、
    　前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体が下記式１で表わされ、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    　式中、ＸＰ（Ｐは１から６までの整数）はＯあるいはＳであり、
    　ＲＰ（Ｐは２から６までの整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、低級アルカノイル、または、低級アルキルであり、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、低級アルカノイル、または、低級アルキルであり、
    　Ｒ1は、Ｘ１がＯの時、水素、低級アルキル、または、低級アルカノイルアルキルであり、Ｘ１がＳの時、低級アルキル、または、低級アルカノイルアルキルであり、
    　Ｒ７は水素、低級アルカノイル、または、低級ヒドロキシアルカノイルであり、
    　前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体は下記式２で表わされ、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    　式中、ＸＰ（Ｐは１から４までの整数）はＯあるいはＳであり、
    　ＲＰ（Ｐは１、３、４、５から選択される整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＯの時、水素、低級アルキル、低級アルカノイルアルキル、または、低級アルカノイルであり、
    　ＲＰ（Ｐは１、３、４、５から選択される整数）は、当該ＲＰに隣接して結合するＸＰがＳの時、低級アルキル、低級アルカノイルアルキル、または、低級アルカノイルであり、
    　Ｒ２は水素、または、低級アルカノイルであることを特徴とする、食品組成物。
  11. 　請求項１０に記載の食品組成物であって、
    　前記Ｎ－アセチルノイラミン酸誘導体がＡｃ５ＮｅｕＡｃあるいはＡｃ５ＮｅｕＡｃ－Ｍｅであることを特徴とする食品組成物。
  12. 　請求項１０または１１に記載の食品組成物であって、
    　前記Ｎ－アセチルマンノサミン誘導体がＡｃ４ＭａｎＮＡｃであることを特徴とする食品組成物。
  13. 　請求項１０～１２のいずれかに記載の食品組成物であって、
    　前記中間生成物の分解酵素阻害物質がＧｌｃＮＡｃｏｌ、あるいは、ＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体であることを特徴とする食品組成物。
  14. 　請求項１３に記載の食品組成物であって、
    　前記ＧｌｃＮＡｃｏｌ誘導体がＡｃ５ＧｌｃＮＡｃｏｌであることを特徴とする、食品組成物。
  15. 　請求項１０～１４のいずれかに記載の食品組成物を含有する食品。
  16. 　Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物から選択されるいずれか一つ、あるいは２つ以上の組み合わせを含有し、
    　前記Ｎ－アセチルノイラミン酸、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、および、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物が天然物から精製された化合物、あるいは化学的に合成された化合物であることを特徴とする、食品添加物。
  17. 　請求項１６に記載の食品添加物であって、前記Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路においてＮ－アセチルマンノサミンより下流で生成する中間生成物、あるいは、Ｎ－アセチルノイラミン酸含有化合物の総含有量が５０％以上であることを特徴とする、食品添加物。
  18. 　請求項１６または１７に記載のいずれかの食品添加物を添加する工程を含むことを特徴とする、食品添加物含有食品の製造方法。
  19. 　請求項１８に記載の製造方法によって製造された食品添加物含有食品。
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