CN108685899A - 黄酮木脂素在制备用于治疗自身免疫炎症疾病的药物的应用 - Google Patents

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Abstract

黄酮木脂素在制备用于减少受试者的脂质代谢异常和减少炎症的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病。所述受试者可进一步患有肝病、代谢综合症、肥胖、糖尿病或高血压。进一步还有黄酮木脂素在制备用于降低受试者患上心血管疾病的风险的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病；以及黄酮木脂素和缓解疾病的抗风湿药的组合物在制备用于减少受试者的肝脏异常和减少炎症的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着肝脏异常的自身免疫炎症疾病。本发明的应用对患有自身免疫性炎性疾病(尤其是类风湿性关节炎)的患者提供有利的方案以抗炎、调节脂质和保护肝脏。

Description

黄酮木脂素在制备用于治疗自身免疫炎症疾病的药物的应用
技术领域
本发明涉及一种黄酮木脂素在制备用于减少受试者的脂质代谢异常和减少炎症的药物的应用。该受试者是哺乳动物，例如人，并患有自身免疫炎症疾病，具体地是自身免疫性关节炎，优选是(但不限于)类风湿性关节炎，并伴有脂质代谢异常。脂质代谢异常具体地可为降低的HDL胆固醇水平、正常或轻度增加的总胆固醇水平、正常或轻度增加的LDL胆固醇水平、正常或轻度增加的甘油三酯水平，和可选地进一步伴有肝脏异常。本发明的黄酮木脂素可用于患有肝病、代谢综合症、肥胖、糖尿病或高血压的受试者。另外提供的是黄酮木脂素在制备用于降低受试者患上心血管疾病的风险的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病；以及黄酮木脂素和缓解疾病的抗风湿药的组合物在制备用于减少受试者的肝脏异常和减少炎症的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着肝脏异常的自身免疫炎症疾病。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种复发性的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎症、软骨和骨骼破坏为特征，常常波及到多个器官，包括血管组织，肝脏和大脑等。RA患病率在全球范围不断增长，其发病率约为世界人口的1-2％。近三分之二的RA患者超重或肥胖，并伴有代谢异常和胰岛素抵抗。此外，研究证据表明RA疾病活动与代谢综合征(Metabolic syndrome,MetS)之间具有明确的关联性。MetS可以改变炎症环境并导致更严重的RA发生。值得注意的是，普遍可以观察到RA患者血液中变化的血脂指标和脂蛋白，被称为“脂质悖论”，是RA患者心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)患病率增加的主要危险因素。在最近的研究中，使用常规的改善病情抗风湿药物(disease-modifyingantirheumatic drugs,DMARDs)和生物制剂治疗RA均改善血脂水平。另外，在最近完成的临床试验中，作用于脂质/葡萄糖代谢的药物似乎可以改善RA患者的炎症特征。因此调节脂质代谢以及脂质相关通路可能是一种新的改善RA患者炎症状态和CVD的新治疗方法。此外，阐明RA与代谢综合征之间相互作用的分子机制，可能为发现有效的药物和开发新的药物提供关键信息。
脂质和脂蛋白代谢异常并伴有慢性炎症被认为是非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)及非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NAHS)的主要症状。胰岛素抵抗，脂肪细胞因子，促炎性细胞因子，氧化应激和脂质过氧化被认为是NAFLD进展为NASH的主要原因，这与RA的发病病理非常相似。因此，NASH和RA疾病可能同时存在于同一个患者并不奇怪。在美国，RA患者中NAFLD患病率据报道为23％，高于非RA患者合并相似病症的15％。用肝活检诊断RA患者的NAFLD或NASH是一种可靠的方法，但由于这是一种侵入性和昂贵的手术，并不是常规做法。一项随机对RA患者进行的研究显示，肝活检标本中非特异性肝炎占43％，脂质改变占22％。而患病率在RA伴有肝功能障碍患者中更高，达到79％。虽然在约50％RA患者中观察到碱性磷酸盐(Alkalinephosphate,ALP)的升高，但是血清转氨酶升高比较少见。由于上述这些原因，使得医生经常难以发现脂肪肝疾病。
总所周知，抗风湿和抗关节炎药物，如DMARDs和非甾体抗炎药物(Nonsteroidalanti-inflammatory drug,NSAIDs)已经被证实具有广泛的肝毒性。这已成为RA患者长期用药的安全性问题。几种被批准用于治疗RA的一线治疗药物如甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)和来氟米特，有肝酶升高、脂肪性肝炎和肝纤维化增加等不良作用。例如，有证据表明，MTX的使用导致RA患者伴有转氨酶升高的非酒精性脂肪肝病。由于肝脏是参与免疫反应的最大的淋巴器官之一，是脂肪生成、糖异生和胆固醇代谢的中心器官，通过调节代谢如脂质代谢来改善肝功能，有助于增强宿主的防御能力，改善RA和NAFLD的临床治疗前景。
他汀类药物在RA中的作用机制仍不明确，但是越来越多的资料表明，通过他汀类药物降脂治疗能抑制RA的炎症因子活性，降低RA和NAFLD患者死亡风险。因此，我们假设改善血脂障碍和保护肝功能可能是一种治疗类风湿性关节炎的新策略。
尽管他汀类药物已经在RA治疗中发挥了重要作用，但还不能阐明脂质代谢的改变在RA治疗中的机制以及脂质调节在RA治疗中的作用。通过研究降脂剂对代谢物的影响产生的生物效应，可以作为理解免疫炎症系统和代谢过程之间的脂质悖论和分子机制的一个重要途径。水飞蓟宾(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的50:50混合物)是水飞蓟宾的主要活性化合物，它是一种来源于乳蓟(Milk Thistle)植物的独特的黄酮类化合物，也是最著名的天然保肝保健品。水飞蓟宾对脂质代谢的调节作用和保肝作用已被广泛证实。因此，本研究选择水飞蓟宾作为降脂化合物，测试其对RA的治疗作用，探讨“脂质悖论”的内在机制以及通过调节脂质代谢治疗RA的作用机制。
迄今为止，从未研究水飞蓟宾对患有RA的患者中的脂质代谢和肝脏异常的效果。
由此，仍需要更多的化合物来有效地治疗自身免疫炎症疾病，尤其是治疗RA，该化合物能减少患有自身免疫炎症疾病的受试者中的脂质代谢异常和降低其患上心血管疾病的风险，而不产生明显的副作用，明显的副作用是用于治疗自身免疫性炎性疾病的常用治疗化合物的主要缺点。
发明内容
本发明的第一方面涉及黄酮木脂素在制备用于减少受试者的脂质代谢异常和减少炎症的药物的应用，所述受试者例如是哺乳动物，具体地是人。所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病，具体地是自身免疫性关节炎，例如类风湿性关节炎。贝体地，脂质代谢异常包括与健康受试者的参考值相比的降低的HDL胆固醇水平、正常或轻度增加的总胆固醇水平、正常或轻度增加的LDL胆固醇水平，以及正常或轻度增加的甘油三酯水平。
所述受试者可进一步具有肝脏异常和/或患有肝病或伴随有抗胰岛素性的代谢异常，诸如代谢综合症、肥胖、糖尿病或高血压。该药物可进一步降低受试者患上心血管疾病的风险，如缺血性心脏病、心力衰竭、心肌梗塞、中风或心源性猝死的风险；和/或减少受试者的肝脏异常。
黄酮木脂素具体地是脂质调节和肝保护性黄酮木脂素，即黄酮木脂素是具有肝保护功能的脂质调节剂，因此通过调节脂质代谢改善肝脏功能。
黄酮木脂素可包括一种或多种式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)和/或(IVa)的化合物或其糖苷、盐或溶剂化物：
具有式(Ia)的水飞蓟宾A；
具有式(Ib)的水飞蓟宾B；
具有式(IIa)的异水飞蓟宾A；
具有式(IIb)的异水飞蓟宾B；
具有式(IIIa)的水飞蓟亭；
具有式(IV)的水飞蓟宁。
具体地，黄酮木脂素是：
-水飞蓟宾A(即，式(Ia)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
-水飞蓟宾B(即，式(Ib)化合物)或其糖苷、溶剂化物；
或两者的混合物。
在第二个方面，本发明提供一种黄酮木脂素在制备用于降低受试者患上心血管疾病的风险的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病。所述受试者例如是人。所述自身免疫炎症疾病具体地是自身免疫性关节炎，例如类风湿性关节炎。
具体地，受试者具有增加的红细胞沉降率(ESR)，特别是显着增加的ESR。脂质代谢异常优选包括降低的HDL胆固醇水平、正常或轻度增加的总胆固醇水平、正常或轻度增加的LDL胆固醇水平，以及正常或轻度增加的甘油三酯水平。
可选地，脂质代谢异常包括降低的HDL胆固醇水平、降低的总胆固醇水平、降低的LDL胆固醇水平，以及增加的甘油三酯水平。
根据本发明的应用而制备的药物可降低由于脂质代谢异常和炎症减轻导致的缺血性心脏病的风险，包括心绞痛、心力衰竭、心肌梗塞、中风和/或心源性猝死的风险。具体地，黄酮木脂素是：
-水飞蓟宾A(即，式(Ia)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
-水飞蓟宾B(即，式(Ib)化合物)或其糖苷、溶剂化物；
或两者的混合物。
另外地，本发明提供一种黄酮木脂素在制备用于减少受试者的肝脏异常和减少炎症的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着肝脏异常的自身免疫炎症疾病。具体地，所述受试者是人，受试者还可具有脂质代谢异常。所述应用进一步包括将黄酮木脂素、缓解疾病的抗风湿药和/或非甾体抗炎药的组合物制备成药物。优选地，黄酮木脂素是具有肝保护功能的脂质调节剂，具体地是：
-水飞蓟宾A(即，式(Ia)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
-水飞蓟宾B(即，式(Ib)化合物)或其糖苷、溶剂化物；
或两者的混合物。
具体地，肝脏异常包括碱性磷酸酶(ALP)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平的增加。
本发明进一步提供一种黄酮木脂素和缓解疾病的抗风湿药的组合物在制备用于减少受试者的肝脏异常和减少炎症的药物的应用。
本发明的应用为患有自身免疫性炎症疾病(尤其是RA)的患者提供了有效的治疗手段。发明人展示了水飞蓟宾(水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的混合物)具有显着的药理学抗炎、脂质调节和肝脏保护作用，这对于患有脂肪肝疾病的RA患者特别有利。水飞蓟素的口服给药显着地减轻了AIA关节炎和MCD饮食诱导的NASH模型中的肿胀、骨糜烂、炎症和肝损伤，而没有显示出明显毒性。这表明水飞蓟宾可用于制备治疗自身免疫性炎症疾病的药物的应用，并能够保护肝。
除了具体描述的内容外，本领域技术人员将会理解到可对本文描述的发明作出改变和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中提到或指出的所有单独的或共同的步骤和特征，以及任何这些步骤或特征的组合。
本发明的其他特征和方面将通过以下详细描述和附图而变得显而易见。
附图说明
图1.用水飞蓟宾给药的AIA大鼠的体重(A)，关节炎评分(B)，后足体积(C)和红细胞沉降率(ESR)(D)。大鼠从造模后第0天开始，每天给药100或200mg/kg(分别称为“SB100”和“SB200”)水飞蓟宾或空白溶剂(“模型组”)或7.6mg/kg氨甲蝶呤(MTX)直到第42天，与对照组比较。大鼠血浆细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)(E)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(F)，基质金属蛋白酶9(MMP-9)(G)和TIMP金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)(H)以及前列腺素E2(PGE2)(I)的表达数据，其以平均值±标准误差(n＝10-11)表示。#，*p<0.05，##，**p<0.01，##，***p<0.001与正常大鼠或模型组大鼠相比。
图2.水飞蓟宾治疗AIA大鼠后足的组织病变。正常对照组、AIA关节炎大鼠、MTX组、100mg/kg(“SB100”)或200mg/kg(“SB200”)水飞蓟宾给药组第42天的后足照片图像(A)，X光片(B)，组织病理学图像(C)和组织学评分条形图(D)。AIA大鼠后足与对照组大鼠相比，出现严重的软组织肿胀和骨质侵蚀并伴随严重水肿和红斑，经MTX和水飞蓟宾治疗后明显减少。苏木精和伊红染色的切片(放大倍数,×40)揭示了AIA模型大鼠的胫骨关节中的组织病理学变化。
图3.用水飞蓟宾和MTX治疗42天后，AIA大鼠的肝功能和血脂谱。(A-E)MTX和水飞蓟宾治疗后与正常对照组相比，大鼠中肝功能的生物标志物的血清谱，包括丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，碱性磷酸盐(ALP)，γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和总胆红素。非酯化脂肪酸(NEFA，图F)，总胆固醇(TC，图G)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(G),低密度脂蛋白(LDL)/极低密度脂蛋白(VLDL)(G)，TC/HDL-C比率(H)和甘油三酯(TG)(I)水平。(J-M)代表苏木精和伊红染色切片(放大倍数,×40)，揭示了AIA模型大鼠的肝组织病理学变化。数据表示为平均值±标准误差(n＝10-11)。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与正常大鼠相比；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01与模型组大鼠相比。
图4.代谢组学研究AIA关节炎模型中主要代谢物的变化。图(A)的OPLS-DA评分图是基于对照组，AIA关节炎模型组和MTX组或100mg/kg或200mg/kg水飞蓟宾组血浆UPLC/MS/MS的测定结果，确定了26个血浆代谢物以区分对照组，模型组和不同治疗组。图(B-E)用OPLS-DA评分(VIP>1.0)和学生t检验(p<0.05)鉴定不同组中的目标代谢物的相对量的变化。(B)甘氨鹅脱氧胆酸，牛磺酸，溶血磷脂酰胆碱(LPC)(16:1)，LPC(22:6)，LPC(20:4)，LPC(18:0)。(C)LPC(16:0)，棕榈酸，邻-酪氨酸，L-犬尿氨酸，氨基马尿酸，谷胱甘肽，邻-酪氨酸/苯丙氨酸和柠檬酸。(D)谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物比率，琥珀酸，草酰乙酸，L-亮氨酸，黄嘌呤，尿酸，肌酸和牛磺鹅去氧胆酸。(E)尿苷，5-羟色胺，甘氨胆酸和尿囊素。#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001与正常大鼠相比；(n＝10-11)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01与模型组大鼠相比。
图5.通过RT-PCR(A-M)和免疫印迹法(N-Y)验证AIA大鼠模型肝脏中与脂质代谢相关的酶的变化。当中对LDL,G6PD,CYP7A1,aP2,CYP27A1,CD36,SREBP1,CYP2E1,SR-B1,LDLR,CPT-1α,HMGCR,ACS,ApoC2,ApoE,FXR,LXR alpha,PPAR-alpha和PPAR-gamma进行RT-PCR扩增,且结果以GAPDH作为内部对照将结果标准化。蛋白质样品在10％SDS-PAGE上电泳，然后进行免疫印迹。以内参β-actin作为对照。，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001与正常大鼠相比；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01与模型组大鼠相比(n＝6-8)。
图6.水飞蓟宾对MCD饮食诱导的NASH小鼠的组织病理学改变以及其肝脏保护活性和抗炎活性。如图所示为正常组(A)，模型组(B)和150mg/kg SB(“SB150”)(C)或300mg/kgSB(“SN300”)(D)小鼠肝脏组织病理学切片的H&E染色结果(×40)。MCD饮食诱导的NASH模型组(B)具有显着的微泡脂肪变性，肝细胞气球样变性和肝管有中性粒细胞浸润。MCD饮食诱导的NASH小鼠模型体重(E)，肝体比值(F)和肝功能生物标志物TC(G)，TG(H)，AST(I)，ALT(J)和SOD(K)以及细胞因子TNF-α(K)和IL-6(M)经水飞蓟宾给药49天后有显着的改善。*p<0.05，★★，**p<0.01，★★★，***p<0.001与正常大鼠或模型组大鼠相比(n＝6-8)。
图7.如图所示为AIA大鼠模型肝脏脂质代谢途径。实线表示反应，虚线表示运输。AIA模型和正常对照组进行比较，↑和↓分别表示肝脏基因和蛋白质表达的水平升高和降低。基因符号：ACC表示乙酰辅酶A羧化酶；CPT-I表示肉碱棕榈酰转移酶I；CPT-II表示肉碱棕榈酰转移酶II；FAS表示脂肪酸合酶；G6PD表示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；HMG-Co A Reductase羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶；LPL表示脂蛋白脂肪酶；FATP4表示脂肪酸转运蛋白4。脂肪符号：CE表示胆固醇酯；HDL表示高密度脂蛋白；IDL表示中等密度脂蛋白；LDL表示低密度脂蛋白；VLDL表示极低密度脂蛋白；TG表示甘油三酯。其他符号：CD36/FAT表示分化群36/脂肪酸移位酶；CETP表示胆固醇酯转移蛋白；LDLR表示低密度脂蛋白受体；SR-B1表示清道夫受体B类1型。
图8.正常对照组，AIA关节炎大鼠、MTX组、100mg/kg(“SB100”)或200mg/kg(“SB200”)水飞蓟宾给药组的相对器官重量比条型图。肝指数(A)，脾指数(B)，胸腺指数(C)，肾上腺指数(D)，肺指数(E)，肾指数(F)，心脏指数(G)，脑指数(H)，睾丸指数(I)。结果证实Silybin在AIA大鼠模型中逆转包括肝指数，脾指数，肾指数，肺指数等在内的相对器官重量比的变化。相对器官重量比(例如肝指数，脾指数，肾指数，肺指数)通过将每个器官的重量除以体重计算。#P<0.05,##P<0.01###P<0.001与正常大鼠相比；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.01与溶剂对照组大鼠相比(n＝10-11)。
图9.对照组、MCD饮食诱导的NASH小鼠、150mg/kg(“SB150”)或200mg/kg(“SB300”)水飞蓟宾给药组的血浆样品的OPLS-DA模型分析。
图10.饮食诱导的NASH小鼠的代谢模式。对照组，喂食MCS饲料小鼠(“C”)、MCD饮食诱导NASH小鼠模型(“M”)的溶剂对照组、100mg/kg(“SB1”)或200mg/kg(“SB2”)水飞蓟宾给药组。(A)甘氨鹅脱氧胆酸，溶血磷脂酰胆碱(LPC)(16:1)，熊去氧胆酸(UDCA)，苯乙酰甘氨酸，尿酸和尿苷。(B)LPC(18:0)，LPC(22:6)，谷胱甘肽，谷胱甘肽二硫化物，草酰乙酸和L-犬尿氨酸。(C)LPC(20:1)，葫芦巴碱，5-羟色胺，邻-酪氨酸/苯丙氨酸，脯氨酸和4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧代丁酸。(D)谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物比率和眼酸。#P<0.05,##P<0.01###P<0.001与正常大鼠相比；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.01与溶剂对照组大鼠(n＝10-11)。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
如在此所使用的，“包含”是指包含以下元素但不排除其他元素。“基本上由...组成”是指该材料由相应的元素以及通常不可避免的杂质例如通常由各自的制备或获得该材料的方法(例如痕量的其他组分或溶剂)产生的副产物和组分组成。在此使用的材料“是”某一元素的表述意味着材料基本上由所述元素组成。如本文所使用的，形式“一”、“一个”和“该”旨在包含单数和复数形式，除非上下文另有明确指示。
本发明提供一种减少受试者的脂质代谢异常和减轻炎症的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的黄酮木脂素。所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病。
本文使用的术语“自身免疫性炎症疾病”是指具有炎症性但也是自身免疫性的疾病，即受试者的免疫系统攻击自身，在临床上表现为慢性炎症症状，并导致对身体组织同时损伤。这些疾病的示例包括强直性脊柱炎、炎症性肠病，诸如克罗恩病或溃疡性结肠炎、1型糖尿病、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、牛皮癣、银屑病关节炎、多肌炎、皮肌炎、血管炎和类风湿性关节炎。
特别是，自身免疫性炎症疾病是“自身免疫性关节炎”，即原发性关节疾病具有自身免疫性成分的疾病。由于这些疾病的炎症性质，它们也可能影响结缔组织、软组织和器官。自身免疫性关节炎特别是类风湿性关节炎(RA)，其是主要涉及关节的慢性系统性自身免疫性疾病。RA可以根据种类，诸如通过28个关节的疾病活动评分(DAS28)和/或2010年美国风湿病学院(ACR)/欧洲抗风湿联盟(EULAR)的人类RA分类标准来诊断。RA可以是活性RA，例如，如果受试者是人类，则可以用DAS28得分确认。优选地，该疾病是早期阶段RA，也称为“早期RA”。早期RA的诊断标准在本领域中是已知的。
受试者可以是动物或人，特别是哺乳动物，例如人。该受试者特别是具有RA的哺乳动物，例如人类。
受试者是具有与自身免疫性炎症疾病诸如RA相关的脂质代谢异常的受试者，即其为具有自身免疫炎症疾病伴随着脂质代谢异常的受试者作为自身免疫炎症疾病患者中的特定患者组。“脂质代谢异常”是指在血清或血浆等受检者体液中可测定的脂质和/或脂蛋白水平异常的脂质和/或脂蛋白代谢发生异常的状态，其可以包括在肝脏中的脂质聚集，特别是伴随有异常水平的脂质代谢标志物，特别是与脂质和/或脂蛋白代谢有关的多肽，例如在肝脏中的多肽。脂质代谢标志物的水平可以通过本领域技术人员已知的方法测定，包括通过RT-qPCR或免疫印迹在细胞或来自受试者的组织中确定其表达，特别是在肝组织或肝细胞中。
表述“与RA等自身免疫性炎症疾病相关”是指在RA等自身免疫性炎症疾病的多个受试者中可见脂质代谢异常，因此形成特定的患者组。
术语“脂质”包括甘油三酯，其通常是指任何天然存在的脂肪酸酯和/或甘油酯和脂肪酸。“脂蛋白”通常被认为是与血浆中的脂质结合并在其中转运脂质的可溶性蛋白，包括例如HDL、LDL、VLDL等。
脂质和/或脂蛋白水平的异常可以在来自受试者的体液诸如血清或血浆中测定，并且是指在健康受试者中偏离参考值的水平，特别是一种或多种总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸和/或甘油三酯。异常可以包括HDL胆固醇水平降低，其具有总胆固醇、LDL胆固醇和与早期RA有关的甘油三酯中的一种或多种水平异常。
具体而言，脂质和/或脂蛋白水平的异常包括与健康受试者的参考值相比HDL胆固醇水平降低，特别是HDL胆固醇水平显著降低。更优选地，与健康受试者的参考值相比，脂质和/或脂蛋白水平的异常包括以下全部：
-降低的HDL胆固醇水平，特别是显著降低的HDL胆固醇水平；
-正常或增加的总胆固醇水平，特别是正常或轻度增加的总胆固醇水平；
-正常或增加的LDL胆固醇水平，特别是正常或轻度增加的LDL胆固醇水平；以及
-正常或增加的甘油三酯水平，特别是正常或轻度增加的甘油三酯水平。
与健康受试者的参考值相比，脂质和/或脂蛋白水平的异常可以进一步包括增加的游离脂肪酸水平。
特别地，“提高”或“增加”水平意味着显著增加，并且可以例如进一步优选地表示超过健康受试者参考值至少5％，特别是至少10％的增加。降低意味着特别显著的降低，并且可以例如优选地表示与健康受试者的参考值相比降低至少5％，特别是至少10％。如本文所使用的，术语“统计学显著的”是指通过学生t检验或其他本领域接受的统计学显著性测量确定的统计显著性。用于本文的总胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯的“轻微增加”水平通常是以超过健康受试者的参考值的水平增加至多20％至35％的水平。例如，正常血清胆固醇水平可以被认为是低于200mg/dL的水平，轻微增加的水平在约200mg/dL和240mg/dL之间。正常血清LDL胆固醇水平通常低于130mg/dL，轻微增加水平在130mg/dL和159mg/dL之间。正常血清甘油三酯水平(空腹)通常低于150mg/dL，轻微增加水平在150mg/dL和200mg/dL之间。降低的HLD胆固醇水平例如是低于40mg/dL的血清水平
涉及脂质和/或脂蛋白代谢的脂质代谢标志物，特别是多肽的水平降低或增加，即偏离健康受试者的参考值，特别是与健康受试者的参考值相比，其显著降低或显著增加，即正常值，即脂质代谢标志物的浓度未维持在健康受试者的适当范围内。
可与术语“蛋白质”互换使用的术语“多肽”是指通过氨基酸和相邻氨基酸残基的羧基之间的肽键相互连接的两个或更多氨基酸的聚合物。氨基酸残基可被修饰(例如磷酸化、糖化、糖基化等)。脂质代谢标志物尤其包括在受试者中具有酶功能的多肽或以其他方式参与脂质代谢的多肽，诸如脂肪酸的载体蛋白质。涉及脂质和/或脂蛋白代谢的表述涉及脂质和/或脂蛋白(诸如脂蛋白脂肪酶(LPL)、脂肪细胞蛋白2(aP2)、胆固醇7-α-半乳糖苷、(CYP7A1)，固醇-27-羟化酶(CYP27A1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、脂肪酸转运酶(CD-36/FAT)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、肝X受体α(LXRalpha)、清道夫受体B类成员1(SR-B1)、低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)等的合成、分解代谢、储存和转运。具有酶功能的多肽尤其包括涉及脂肪酸的从头合成、储存和转运或脂蛋白的摄取和水解的酶。
受试者可具有在健康受试者中偏离参考值的脂质代谢标志物水平，所述水平可尤其在肝脏组织或肝脏细胞中确定，所述肝脏组织或肝脏细胞包括以下的一种，特别是至少两种，最优选或全部：
-CYP7A1；
-CYP27A1；
-LPL；
-G6PD；
-aP2；
-CD-36/FAT；
-SREBP-1；
-SR-B1；
-LDLR；和/或
-LXRalpha。
进一步在本发明的实施方案中，受试者患有选自一种或多种脂肪肝疾病，诸如肝性脂肪变性、肝功能缺陷或肝功纤维变性。本领域技术人员已知的“肝性脂肪变性”是一种可逆状态，其中甘油三酯脂肪的液泡经由脂肪变性过程积聚在肝脏细胞中，即细胞中脂质的异常滞留。术语“肝功能缺陷”是指相对于健康受试者肝脏功能降低的状态，其可以通过肝功能标志物，诸如血液AST、ALT、γ-GTP、ALP、总胆红素、白蛋白、LDH(乳酸脱氢酶)、胆碱酯酶等与健康受试者的参考值，特别是与正常值相比的偏离，特别是显著地增加或减少。
在本发明的具体实施方案中，受试者进一步患有脂肪肝疾病，包括非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
另外或可选地，受试者还可能遭受伴随有抗胰岛素性的代谢异常，诸如代谢综合症，肥胖(如体重指数超过30kg/m2)、糖尿病(如收缩压超过140或以上)和/或高血压(舒张压超过90或以上)。“代谢综合症”是众所周知的一系列疾病，包括血压增加、高血糖、腰部周围体脂过多以及甘油三酯水平异常等。
“降低脂质代谢异常”特别是指降低脂质和/或脂蛋白水平的异常，尤其是包括减少脂质代谢标志物的异常，诸如涉及脂质和/或脂蛋白代谢的多肽，特别是与自身免疫性炎症疾病相关联的多肽，特别是与健康受试者的参考值相比，意味着减少异常。通常，脂质代谢异常的减少可以通过测量受试者的血浆或血清等体液或脂质代谢标志物，特别是涉及脂质和/或脂蛋白代谢的多肽中的脂质和脂蛋白的水平，特别是在肝脏组织或肝脏细胞中LPL、G6PD、aP2、CD-36/FAT、LXRα、SREBP-1、CYP27A1、CYP7A1、SR-B1以及LDLR中的一种，特别是两种，最优选地是所有。
降低脂质或脂蛋白水平的异常，优选地包括一种或多种增加，特别是HDL胆固醇水平的显著增加，甘油三酯的降低，特别是甘油三酯水平的显著降低和/或减少，特别是游离脂肪酸水平的显著降低，特别是甘油三酯水平的显著降低，与游离脂肪酸和HDL胆固醇水平的显著增加相比，伴有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者伴随有可在受试者的血清或血浆等体液中测定的脂质代谢异常。此外，其可以包括降低，特别是总胆固醇和/或LDL胆固醇水平的显著降低。
减少脂质代谢标志物的异常可以包括与具有伴随脂质代谢异常的自身免疫性炎症疾病的未治疗受试者相比降低一个或多个增加的脂质代谢标志物，尤其是显著地降低以下的一个、两个或全部：
-提高的CYP7A1，特别是至少降低约10％，进一步优选地超过约20％，进一步优选地超过约40％；
-提高的LPL，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％；
-提高的G6PD，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％；
-提高的aP2，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％，并且更优选超过约40％；
-提高的CD-36/FAT，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％；
-提高的CYP27A1，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％；
-提高的LXRalpha，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％；
-提高的SR-B1，特别是降低至少约10％，进一步优选超过约20％；
-提高的LDLR，特别是降低至少约10％。
“减轻炎症”是指减少异常的炎性标志物，其特别是伴随有一个或多个滑膜炎症减轻、肿胀减轻和/或关节和软骨损伤减少。“炎症性标志物”是那些通常表现出受试者出现炎症的物质。它们可以用本领域技术人员已知的方法被测定，例如在来自受试者的细胞、组织或体液中，特别是在受试者的血清或血浆中。炎症性标志物尤其包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、前列腺素E2(PGE2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、TIMP金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、白细胞介素17(IL-17)和红细胞沉降率(ESR)等。更优选地，减少炎症意味着与未治疗的患有自身免疫性炎症疾病的受试者相比降低增加的炎症标志物，特别是显著降低增加的炎性标志物，诸如选自TNF-α、IL-1β、PGE 2、MMP-9、TIMP-1或ESR中的一种，特别是两种，最优选全部，最优选与健康受试者中的参考值一样。炎症性标志物的水平可以通过例如市售试剂盒来确定。减少的滑膜炎症、肿胀和/或减少的关节和软骨损伤可以通过利用X射线或MRI，通过关节炎指数诸如ACR 20、50或70，或DAS 28的疾病活动评分或一些放射照相结果测定软骨和骨侵蚀来证实，特别是DAS28评分的显著改善可能表明炎症减轻。
特别地，减少炎症是指可以优选地在来自受试者体液诸如血清或血浆中测定的TNF-α、IL-1β、PGE2、MMP-9、TIMP-1水平和/或ESR的显著降低，来自受试者的血浆，降低进一步优选地选自以下一种、两种或最优选地为全部：
-与具有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者相比，ESR降低至少10％，特别是至少20％；
-与具有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者相比，IL-1β降低至少5％，特别是超过10％；
-与具有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者相比，TNF-α降低至少5％，特别是超过10％；
-与具有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者相比，MMP-9降低至少5％，特别是超过10％；
-与具有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者相比，TIMP-1降低5％，特别是超过10％；
-与具有自身免疫性炎性疾病的未经治疗的受试者相比，PGE2降低5％，特别是超过10％。
黄酮木脂素尤其是脂质调节和肝保护性黄酮木质素，即黄酮木脂素是具有肝保护功能的脂质调节剂，因此通过调节脂质代谢改善肝脏功能。如本文所用，术语“脂质调节剂”是指该化合物能够改变受试者中的脂质代谢和储存。术语“肝保护性”意指该化合物还能够防止对肝脏的损伤，即能够保护肝脏细胞。例如，化合物能够抑制由肝脏毒性物质的代谢产生的游离基，以增强肝脏谷胱甘肽，有助于肝脏的抗氧化防御和/或增加肝细胞中的蛋白质合成。典型地，可以在存在肝毒素的化合物如乙醇的情况下测定肝保护性作用。特别地，黄酮木脂素能够减少碱性磷酸酶(ALP)和/或天冬氨酸转氨酶(AST)水平的异常，特别是减少和进一步优选地显著降低增加的ALP和AST水平，诸如与具有自身免疫性炎症疾病和肝脏异常的未经治疗的受试者相比，至少降低5％和进一步优选地超过约10％，所述肝脏异常可以使用市售试剂盒在体液中诸如受试者的血浆或血清中被测定。
所述受试者可能还具有肝脏异常，肝脏异常包括碱性磷酸酶(ALP)和/或天冬氨酸转氨酶(AST)水平与健康受试者参考值相比的增加，参考值可以在受试者体液中测定，特别是与患有自身免疫性炎症疾病有关的肝脏异常的体液。在这样的实施例中的方法进一步包括减少肝脏异常，特别是包括降低，特别是与患有自身免疫性炎症疾病诸如RA和肝异常的未治疗受试者相比显著降低ALP和/或ASP的水平，特别是降低至少约5％，特别是至少约20％。
在本发明的具体实施方案中，受试者进一步具有脂肪肝疾病，诸如肝性脂肪变性形式，并且黄酮木脂素尤其进一步减少肝脏中脂质的积累，即所述方法进一步用于本发明的实施例中的减少脂质在肝脏中的积累。
该方法可以在进一步的实施例中包括降低心血管疾病诸如缺血性心脏病、心力衰竭、心肌梗塞、中风或心源性猝死的风险。
黄酮木脂素可以是单一的黄酮木脂素或黄酮木脂素的混合物。本领域技术人员已知的术语黄酮木脂素通常用于其中松柏醇与黄烷酮基本结构偶联的化合物，即：
(黄烷酮的基本结构)
在不同的位置。即松柏醇
(松柏醇)
偶联于在不同位置也称为花旗松素的3-羟基黄烷酮：
(花旗松素)
黄酮木脂素包括例如式(I)至(IV)的结构或其糖苷，其盐或溶剂合物：
式(I)包括其立体异构体及其混合物，特别是水飞蓟宾A和水飞蓟宾B；
式(II)包括其立体异构体及其混合物，特别是异水飞蓟宾A和异水飞蓟宾B；
式(III)包括其立体异构体及其混合物，特别是水飞蓟亭；
式(IV)包括其立体异构体及其混合物，特别是水飞蓟宁。
黄酮木脂素特别包括一种或多种式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)和/或(IVa)的化合物或其糖苷、盐或溶剂化物：
式(Ia)，即水飞蓟宾A；
式(Ib)，即水飞蓟宾B；
式(IIa)，即异水飞蓟宾A；
式(IIb)，即异水飞蓟宾B；
式(IIIa)，即水飞蓟亭；
式(IV)，即水飞蓟宁。
本发明还涵盖上述给出的化合物的任何盐、溶剂化物以及立体异构体和它们的混合物。立体异构体是与原子的顺序相同但原子的三维排列不同的异构体，包括非对映异构体和光学异构体(对映异构体)。如本文所用，术语“溶剂化物”是指由溶质(即黄酮木脂素)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。如果溶剂是水，形成的溶剂化物是水合物。合适的盐是适合给予受试者，特别是哺乳动物如人的那些，并且可以足够的纯度制备。
本发明的黄酮木脂素特别包含式(I)的化合物或其糖苷、盐或溶剂化物，其包括式(Ia)和/或(Ib)的立体异构体，即本发明的黄酮木脂素更优选包含水飞蓟宾A和/或水飞蓟宾B，其包括糖苷、盐或溶剂化物，以及可选的其它黄酮木脂素。另外的黄酮木脂素可以特别地包括如式(IIa)、(IIb)、(IIIa)和/或(IVa)的式(II)、(III)和/或(IV)的化合物。例如，水飞蓟素可以用作包含式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)和(IVa)的化合物的本发明的黄酮木脂素。在最优选的实施例中，本发明的黄酮木脂素是：
-水飞蓟宾A(即，式(Ia)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
-水飞蓟宾B(即，式(Ib)化合物)或其糖苷、溶剂化物；
或两者的混合物，特别优选地两者的混合物，诸如水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的50:50(w/w)混合物。
特别是水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的混合物的本发明的黄酮木脂素可以通过从水飞蓟提取获得或者可以市售获得。技术人员知道从水飞蓟获得黄酮木脂素的合适提取方法。
表述“有效量”通常表示足以产生治疗所需结果的量，其中结果的确切性质取决于所治疗的具体病症而变化。在本发明中，意指黄酮木脂素的量至少能够降低患有自身免疫性关节炎的受试者中的脂质代谢异常并减轻炎症，即能够减少，更优选显著减少脂质代谢标志物和炎症标志物的异常。有效量可以取决于受试者的种类、体重、年龄和个体状况，并且可以通过标准程序如细胞培养或实验动物来确定。例如，本发明的黄酮木脂素的有效量可以在每天约0.5mg/kg和500mg/kg体重之间，例如约200mg/kg体重。黄酮木脂素可以固体、半固体或液体形式存在，通过口服或胃肠外途径给予受试者，优选通过口服途径施药。
治疗可以进行至少约12天，特别是至少约42天。
黄酮木脂素可以药物组合物的形式施药，所述药物组合物包含黄酮木脂素和药学可接受的赋形剂，诸如选自药学可接受的载体、盐、缓冲液、水、稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、表面活性剂或防腐剂或其组合。
技术人员能够根据药物组合物的形式选择合适的药学上可耐受的赋形剂，并且了解制备药物组合物的方法以及能够根据药学上可容许的赋形剂的种类和药物组合物的形式选择用于制备药物组合物的合适方法。药物组合物可以固体、半固体或液体形式存在，通过口服或胃肠外途径给予受试者，优选地通过口服途径施药。
黄酮木脂素可以与用于治疗自身免疫性炎症疾病的其它化合物，诸如非类固醇的抗炎药(NSAID)或疾病缓解抗风湿药(DMARD)诸如甲氨蝶呤(MTX)或来氟米特联合施药。
本发明进一步提供了用于降低受试者中心血管疾病风险的方法，其包括向所述受试者施用有效量的黄酮木脂素，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫性炎症疾病。
受试者尤其具有增加的ESR，特别是显著增加的ESR。
脂质代谢异常尤其包括在健康受试者中偏离参考值的水平，特别是总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸和/或甘油三酯中的一个或多个。
脂质代谢异常优选包括与健康受试者的参考值相比HDL胆固醇水平降低，特别是HDL胆固醇水平显著降低。更优选地，脂质和/或脂蛋白水平的异常包括以下全部：
-HDL胆固醇水平降低，特别是HDL胆固醇水平显著降低；
-总胆固醇水平正常或增加，特别是总胆固醇水平正常或轻微增加；
-LDL胆固醇水平正常或增加，特别是LDL胆固醇水平正常或轻微增加；以及
-甘油三酯水平正常或增加，特别是甘油三酯水平正常或轻微增加；
与健康受试者的参考值进行比较。
与健康受试者的参考值相比，脂质和/或脂蛋白水平的异常可以进一步包括游离脂肪酸水平的增加。
在替代性实施例中，脂质代谢异常可包括HDL胆固醇水平、总胆固醇水平和LDL胆固醇水平的降低，特别是与健康受试者的参考值相比，HDL胆固醇、总胆固醇和LDL胆固醇的水平显著降低。异常可进一步包括游离脂肪酸和/或甘油三酯水平的增加，特别是与健康受试者中的参考值相比，游离脂肪酸和/或甘油三酯水平的显著增加。
所述方法特别包括由于通过施加有效量的黄酮木脂素来降低由于脂质代谢异常和炎症减轻导致的缺血性心脏病的风险，包括心绞痛、心力衰竭、心肌梗塞、中风和/或心源性猝死的风险。
黄酮木脂素特别是脂质调节和肝保护性黄酮木脂素。所述疾病特别是自身免疫性关节炎，特别是RA，并且所述受试者优选是哺乳动物，例如人。受试者可进一步具有高血压、肥胖症、糖尿病或代谢综合征中的一种或多种，特别是受试者患有代谢综合征。
黄酮木脂素可以是单一的黄酮木脂素或黄酮木脂素的混合物。黄酮木脂素特别包含式(I)化合物或其糖苷、盐或溶剂化物，包括式(Ia)和/或(Ib)的立体异构体。即，本发明的黄酮木脂素更优选地包含水飞蓟宾A和/或水飞蓟宾B，即式(Ia)和(Ib)的化合物
已知具有式(Ia)的水飞蓟宾A；和/或
已知具有式(Ib)的水飞蓟宾B；
以及任选的其它黄酮木脂素，特别是包含式(II)、(IIIa)和/或(IV)，诸如(IIa)、(IIb)、(IIIa)和/或(IVa)的化合物：
式(II)诸如异水飞蓟宾A和异水飞蓟宾B，即，式(IIa)和/或(IIb)的化合物：
式(IIa)，即，异水飞蓟宾A；
式(IIb)，即，异水飞蓟宾B；
包括其立体异构体及其混合物的式(III)，特别是水飞蓟亭，即式(IIIa)的化合物：
式(IV)包括其立体异构体及其混合物，特别是水飞蓟宁，即式(IVa)的化合物：
例如，水飞蓟素可以用作黄酮木脂素。在最优选的实施例中，本发明的黄酮木脂素是：
-水飞蓟宾A(即式(Ia)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
-水飞蓟宾B(即式(Ib)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
或两者的混合物，特别优选地两者的混合物，例如水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的50:50(w/w)混合物。
黄酮木脂素的有效量可以在每天约0.5mg/kg和约500mg/kg体重之间，例如约200mg/kg体重。黄酮木脂素可以固体、半固体或液体形式存在，通过口服或胃肠外途径给予受试者，优选地通过口服途径施用至少约12天，特别是至少约42天。黄酮木脂素可以药物组合物的形式施药。
本发明还提供了一种减少受试者肝脏异常和减轻炎症的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的黄酮木脂素和疾病缓解抗风湿药的组合。所述受试者患有伴随肝脏异常的自身免疫性炎症疾病，特别是另外伴随脂质代谢异常。
黄酮木脂素特别是脂质调节和肝保护性黄酮木脂素。所述疾病特别是自身免疫性关节炎，特别是RA，并且所述受试者优选是哺乳动物，例如人。
黄酮木脂素可以是单一的黄酮木脂素或黄酮木脂素的混合物。黄酮木脂素特别包含式(I)化合物或其糖苷、盐或溶剂化物，包括式(Ia)和/或(Ib)的立体异构体。即，本发明的黄酮木脂素更优选地包含水飞蓟宾A和/或水飞蓟宾B
式(Ia)是水飞蓟宾A；和/或
式(Ib)是水飞蓟宾B；
以及任选的其它黄酮木脂素，特别是包含式(II)、(III)和/或(IV)，诸如(IIa)、(IIb)、(IIIa)和/或(IVa)的化合物：
式(II)诸如异水飞蓟宾A和异水飞蓟宾B，即式(IIa)和/或(IIb)的化合物：
式(IIa)，即，异水飞蓟宾A；
式(IIb)，即，异水飞蓟宾B；
包括其立体异构体及其混合物的式(III)，特别是水飞蓟亭，即式(IIIa)的化合物：
式(IV)包括其立体异构体及其混合物，特别是水飞蓟宁，即式(IVa)的化合物：
或上述化合物的糖苷、盐或溶剂化物。
例如，水飞蓟素可以用作黄酮木脂素。在最优选的实施例中，本发明的黄酮木脂素是：
-水飞蓟宾A(即式(Ia)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
-水飞蓟宾B(即式(Ib)化合物)或其糖苷、盐或溶剂化物；
或两者的混合物，特别优选地是两者的混合物，诸如水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的50:50(w/w)混合物。
黄酮木脂素的有效量可以在每天约0.5mg/kg和约500mg/kg体重之间，例如约200mg/kg体重。黄酮木脂素可以固体、半固体或液体形式存在，通过口服或胃肠外途径给予受试者，优选地通过口服途径施用至少约12天，特别是至少约42天。黄酮木脂素可以药物组合物的形式施药。
缓解疾病的抗风湿药(DMARDs)是一组通常用于治疗自身免疫性关节炎诸如RA的药，对于本领域技术人员已知用于改善症状、减少关节损伤和改善整体功能的能力。它们特别包括甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、TNF-α抑制剂(妥尔单抗、英夫利昔单抗和依那西普)、阿巴西普和阿那白滞素、利妥昔单抗和托珠单抗。与黄酮木酚素组合使用的DMARD尤其是甲氨蝶呤(MTX)，诸如1mg至100mg MTX的剂量，诸如1mg至50mg MTX/天，或者例如0.1mg/kg至10mg/kg MTX每体重每天，其取决于受试者的种类、体重、年龄和个体状况。黄酮木脂素和MTX特别是通过口服途径施药。
肝脏异常尤其包括碱性磷酸酶(ALP)和/或天冬氨酸转氨酶(AST)的水平与健康受试者参考值相比的增加，所述参考值可以在来自受试者的体液中测定，并且特别与自身免疫性炎症疾病和/或DMARD治疗相关，特别是与自身免疫性炎症疾病和DMARD诸如MTX治疗相关。
在这样的实施例中，与未经治疗的患有自身免疫性炎症疾病(诸如伴有肝异常的RA)的受试者相比较，减少肝脏异常尤其包括降低，尤其是显著降低ALP和/或ASP的水平，特别是降低至少约5％，特别是降低至少约20％。
本发明进一步提供了一种减少由于用DMARD或NSAID治疗类风湿性关节炎而引起的肝脏损伤的方法。所述方法包括在DMARD或NSAID之前、之后或同时向所述受试者施用有效量的黄酮木脂素，特别是与DMARD同时施用。
实施例
化合物和试剂
水飞蓟宾和桔红素购买于迈瑞尔(上海迈瑞尔化学技术有限公司)；谷胱甘肽(GSH)，L-亮氨酸，L-犬尿氨酸，L-色氨酸，5-羟色氨酸(5-HTP)，胆酸，苯乙酰甘氨酸，5-羟色胺(5-HT)购自美仑生物(大连美仑生物技术有限公司)；N-乙基马来酰亚胺(≥98％，HPLC)，L-谷胱甘肽(GSSG，≥98％，HPLC)购自Sigma(Sigma-Aldrich,Co.Ltd.,圣路易斯,美国)。L-苯丙氨酸(环-D5，98％，DLM-1258-5)购自Cambridge Isotope Laboratories(CambridgeIsotope Laboratories,Inc.,麻省,美国)；聚乙二醇400(PEG400)购自TCI(Tokyochemical industry Co.,Ltd.,东京,日本)；聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)购自Aladdin(Aladdin Industrial Corporation,上海,中国)；薄荷脑和乙腈购自ACS(Anaquachemicals supply,休斯敦,美国)。LPL，PPARα，CYP7A1，FXR，LXR，AP2/FABP4，CYP27A1，CD36，CYP2E1抗体从Abcam(Abcam,剑桥,英国)购买，SRBP1从Santa Cruz(Santa Cruz,加州,美国)购买；G6PD从Danvers(Danvers,麻省,美国)购买；TNF-α，IL-1β和TIMP-1ELISA试剂盒购自RayBiotech,Inc.,Norcross,乔治亚州,美国；IL-6，IL-17，IL-33，MMP9和PGE2ELISA试剂盒购自Bio-techne,明尼苏达州,美国；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)来自美国Bioassay公司。血清游离脂肪酸，丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒从南京建成生物工程研究所购买。
动物
采用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重180-220g)进行AIA模型实验。雄性野生型(WT)C57Bl/6小鼠通过MCD饮食诱导进行NASH实验(广东医学实验动物中心)。将所有动物饲养在24±1℃和12小时光照/黑暗循环的恒温动物房中，食物和水自由饮用。所有涉及动物及其护理的程序均经过广州中医药大学动物伦理委员会的批准和监管。
统计分析
数据表示为平均值±标准误差。采用Kolmogorov-Smirnov检验进行高斯分布评估，采用单因素方差分析对差异进行统计分析。在所有分析中，P<0.05被认为是具有统计学差异的最低水平。用GraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc.，圣地亚哥，加州)进行统计分析。
实施例1
AIA的诱导
在第0天通过动物尾部皮下单次注射0.1ml新鲜制备的含有62.5μg的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MT)H37Ra(BD，Sparks，USA)悬浮液诱导AIA模型。对照组大鼠注射等量生理盐水代替MT悬液。在持续42天的实验中，AIA大鼠(n＝10-12)每天给以100、200mg/kg的水飞蓟宾(20％PEG400：15％Cremophor EL：5％乙醇：60％盐水溶解)，或7.6mg/kg MTX或者空白溶剂(20％PEG400：15％Cremophor EL：5％乙醇：60％盐水)的口服给药。
评估关节炎的严重程度以及水飞蓟宾的治疗效果
在诱导关节炎后的每两天或三天用体积描记器和精密天平测量两个后足的体积和体重来评估疾病的严重程度和进展。为了精确评估关节炎得分，将每只大鼠足的损伤(即关节炎症状)由两个单独的研究者用半定量方法进行评分：0(正常)，4-8(轻度改变)，8-12(中度变化)，12-16(显着变化)。血细胞沉降速率(ESR)采用ICSH(血液学国际标准化委员会)选定的方法作稍微改动进行评价。简单地说，将120μL血液样品放入30μL柠檬酸钠0.109mol/L中混匀，然后转入1.0mm×100mm的毛细管。将管倾斜45°，并在15分钟记录红细胞沉降率。根据生产商的说明，使用市售的ELISA试剂盒测定血清中的细胞因子水平，包括IL-1β，TNF-α，IL-17，IL-33，MMP9，TIMP-1和PGE2。在实验结束时，使用IVIS Lumina XRMS系列(PerkinElmer，美国)测量大鼠膝关节图像(3个读数的平均值，Meinaite digitalcalliper，中国上海)。在第42天进行X射线检查后收集关节进行组织病理学评估，用磷酸盐缓冲液(PBS)配制的10％福尔马林固定，并在甲酸中脱钙3天。用石蜡包埋的组织切片用苏木精和伊红(H&E)进行染色。所获得的血浆储存在-70℃用于代谢组学研究。通过将每个器官的重量除以体重计算相对器官重量比(例如肝指数，脾指数，肾指数，肺指数)。
AIA模型肝脏异常的评估
血清ALT，AST，ALP，GGT和总胆红素用全自动生化分析仪(Toshiba Corporation，东京，日本)测定。测量血清中血脂指标包括TG，TC，HDL-C，LDL-C/VLDL-C和游离脂肪酸。处死动物后，将肝脏组织在10％福尔马林溶液中固定，用二甲苯清洗，包埋在石蜡块中，得到5微米厚的切片。用H&E染料将切片染色，并在光学显微镜下检查样品的病理学变化。
基于LC-MS/MS的代谢组学研究
在样品制备之前，将血浆样品(200μL)在冰上融化5分钟，并与200μL N-乙基马来酰亚胺(NEM)PBS缓冲液(10mM)和1000μL内标Phe-d5(IS)的甲醇溶液(10ng/ml)混合。将该混合物在-20℃下孵育20分钟，然后在4℃以12000rpm离心10分钟。用氮气吹干并用超纯水复溶。
在Waters 4000ACQUITY UPLC和4000Q-TRAP质谱仪上进行LC-MS/M分析。色谱分离采用Waters XBridgeTM BEH C18分析柱(2.5μm，3.0×100mm；Waters，CA)，流动相为0.1％甲酸水溶液A和甲醇溶剂B，采用梯度洗脱：0-3.0分钟(0％-1％B)；3.0-10.0分钟(1-3％B)；10.0-14.0分钟(3-50％B)；14.0-18.0分钟(50-95％B)；18.0-22.0分钟(95-0％B)；接着进行3分钟的再平衡。进样器温度设置4℃，进样量为10μL，流速为0.6ml/min。电喷雾源(ESI)采用正离子和负离子模式。源参数设置如下：气体温度：450℃；离子喷雾电压：±4500V；离子源气体1(雾化器气体)：40psi(N2)；离子源气体2(辅助气体)：40psi(N2)。MS/MS分析采用MRM模式，碰撞能量范围为10-40V。所有UPLC-MS数据均由AB Analyst软件(版本1.6.2)获得。表1列出了从AIA和MCD饮食诱导的NASH动物的血浆样品中鉴定出的72种代谢物。再对每个色谱图进行多元统计分析之前，每个离子的强度对I.S.的峰面积进行归一化。
表1通过LC-MS/MS方法确定的生物标记信息
向大鼠血浆中加入6g/100mL木炭活化粉末(Actived CharcoalNorit，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)吸附内源性物质，制备空白血浆的质控(QC)样本。将该悬浮液在室温下搅拌2小时，并在4℃以135,00rpm离心20分钟。用0.22μm滤膜过滤上清液。通过LC-MS/MS确认获得的“吸附的”血浆不含生物标志物。通过向“已吸附”血浆中加入L-色氨酸(Try)，L-犬尿氨酸(Kyn)，谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，苯基乙酰甘氨酸(N-Phe)，5-羟色氨酸(5-HTP)，L-亮氨酸(Leu)，5-羟色氨(5-HT)，胆酸(CA)和谷胱甘肽(GSH)标准溶液来制备三个不同浓度的QC样品，然后按照与体内样品给药相同的方法进行给药。Try，Kyn，GSSG，N-Phe，5-HTP，5-HT，Leu，CA储备液(1mg/ml)在100％甲醇中制备，GSH储备液(0.5mg/ml)在10mM NEM的PBS缓冲液中制备。与QC样品相同的方式配制八种不同浓度的标准曲线，并通过1/X加权最小二乘线性回归分析。同时使用另一种QC方法对于方法学验证研究，即从模型组中的每个样品中取50μL血浆以获得QC样品，然后进行给药，反复进样，根据其差异判定仪器和样本的稳定性和重复性。每分析50个样品就分析一个QC样品以及标准曲线。
代谢组学数据分析和生物标志物的鉴定
归一化的数据导入多变量分析软件包SIMCA-P(Umea，瑞典)并通过PCA和PLS-DA进一步给药。根据R2和Q2的相关值评估模型。从PLS-DA分析中得到可变的重要性值(VIP>1)提取潜在的标志物。P值从学生t-检验(P<0.05)中获得。使用生物信息学软件MultiExperiment Viewer(美国马萨诸塞州基因组研究所)用于可视化和组织代谢物谱进行分层聚类分析(HCA)。
实时定量(RT)-PCR分析
使用TRIzol试剂(Life technology，美国)从AIA模型的冷冻肝脏中分离总RNA。Dynabeads mRNA DIRECTTM试剂盒(Life technology，挪威)的poly(dT)磁珠结合来纯化mRNA，按照制造商所述使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen，加洲,美国)进行逆转录。使用SYBR Green(Sigma-Aldrich，路易斯，美国)在ViiATM 7实时PCR系统(AppliedBiosystems，福斯特城，美国)上进行实时定量PCR分析。从循环阈值(Ct)计算基因表达水平并用对照基因GAPDH标准化。引物序列详见表2。
表2用于RT-PCR的引物
免疫印迹分析
将AIA和MCD动物模型的肝组织在含蛋白酶抑制剂(罗氏生命科学，美国)的RIPA缓冲液(50mM pH 7.4Tris，150mM NaCl，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，原钒酸钠，氟化钠和EDTA)中匀浆裂解。使用BCA蛋白测定试剂盒(BIO-RAD，美国)测定蛋白浓度。用SDS-PAGE分离等量的总蛋白，并转移到PVDF膜(Millipore，达姆施塔特，德国)上。在含有5％(w/v)脱脂奶粉(雀巢康乃馨，新西兰)的TBST缓冲液(10mM tris-缓冲盐水和0.1％吐温20)中封闭1小时，与抗体4℃孵育过夜。用1×TBST溶液将膜洗涤三次，并在室温下与适当的二抗一起孵育45分钟，随后用增强型化学发光检测试剂盒(SuperSignalTM West PicoChemiluminescent Substrate，Thermo Scientific，美国)显影。使用β-actin作为对照进行实验分析。
结果
水飞蓟宾能显着改善佐剂诱导的大鼠关节炎(AIA)
由于AIA是一种全身性疾病，体重减轻是主要临床表现，因此在实验期间测量了这一指标。在第12天至第42天期间，AIA组大鼠体重比溶剂对照组大鼠轻，而通过MTX治疗后，体重进一步减少，表明有明显的副作用(图1A)。水飞蓟宾(200mg/kg)给药组大鼠体重与AIA模型组比较显著增加(P<0.001)，表明水飞蓟宾有很好的改善作用并且没有毒性反应。另外，水飞蓟宾逆转AIA大鼠模型中相对器官重量比(如肝指数，脾指数，肾指数，肺指数)的变化，如图8A至8I所示，表明水飞蓟宾可能对多种器官具有有益的保护作用(同时参见表3至11)。在关节炎诱导后第12天，总关节炎评分和发炎的足体积显着增加(图1B和1C)。MTX治疗组与AIA模型组相比，单独MTX治疗显着改善了足肿涨和关节炎评分(p<0.001)。在第42天，200mg/kg水飞蓟宾给药组显示抗肿胀作用，关节炎评分和足体积显着降低，与M TX作用相当，分别达到7.60和3.02mL(图1B和1C)。如图1D和表12所示，MTX或200mg/kg水飞蓟宾给药组与溶剂对照组比较ESR值显着降低(P<0.001)。酶联免疫吸附测定结果显示，水飞蓟宾给药组大鼠血清中除了IL-33以外TNF-α，IL-1β，MMP-9，TIMP-1和PGE2水平显着下降(图1E-I)。
表3相对器官重量比(肝指数)
表4相对器官重量比(脾指数)
表5相对器官重量比(胸腺指数)
表6相对器官重量比(肾上腺指数)
表7相对器官重量比(肺指数)
表8相对器官重量比(肾指数)
表9相对器官重量比(心脏指数)
表10相对器官重量比(脑指数)
表11相对器官重量比的变化(睾丸指数)
表12用水飞蓟素处理的AIA大鼠的红细胞沉降率
#,*p<0.05,##,**p<0.01,###,***p<0.001与正常大鼠或与溶剂对照组大鼠相比.
水飞蓟宾可防止AIA大鼠软骨损伤和骨破坏
在实验结束时，通过X放射组织病理学检查来评估大鼠足骨和软骨的破坏。正常组，在AIA组，MTX给药组和水飞蓟宾给药组大鼠后足的代表性照片详见图2A。在X光片结果中，与正常大鼠的关节相比，AIA组大鼠关节周围有严重软组织肿胀和骨侵蚀(图2B)。水飞蓟宾(100或200mg/kg)以及MTX可以改善关节的软骨肿胀和关节破坏(图2)。
组织学评分结果进一步证实了水飞蓟宾的抗关节炎作用。正常组(0级)、AIA组(2/3级)，MTX给药组(0级)和水飞蓟宾给药组(0级)大鼠踝关节的代表性组织切片详见图2C。与正常大鼠相比，AIA模型组大鼠的切片显示滑膜有显着性增厚和扩大，并有大量炎性细胞浸润、增生，软骨突出、血管翳增生、骨侵蚀和关节间隙变窄等情况。用水飞蓟宾或MTX治疗后可减少炎性细胞浸润，滑膜增生，只见少量软骨和骨侵蚀(图2C)。这些组织病理学发现与组织学评分结果相符(图2D)。
水飞蓟宾保护AIA大鼠的肝功能
与正常大鼠(图3B，C)相比，AIA模型组大鼠的ALP水平(P<0.001)和AST水平(P<0.05)显着增加，这与临床中观察到的现象一致。如图3A-D所示，甲氨蝶呤单独给药显着增加了血清ALT和GGT水平，表明MTX损害了动物的肝功能，这与MTX在临床上治疗RA患者的副作用一致。然而，用200mg/kg的水飞蓟宾给药AIA关节炎大鼠，可显着降低AST(P<0.05)和ALP(P<0.001)水平。100mg/kg水飞蓟宾给药组(P<0.05图3A-E)也有明确作用。
通过肝组织的组织病理学检测,进一步评估水飞蓟宾组的肝脏保护作用。正常大鼠中央静脉组织学结构正常，周围肝细胞正常。AIA模型组关节炎大鼠的肝切片中观察到大量脂肪变化，门静脉阻塞、细胞边界模糊并失去正常结构(图3J-M)，而在MTX给药的大鼠在肝细胞中表现出轻度的退行性变化。水飞蓟宾给药组肝细胞出现轻中度静脉充血，但保留了肝细胞的正常结构，没有明显的脂肪病变和门静脉阻塞。
脂质代谢产物在AIA大鼠发病及治疗机制中发挥重要作用
升高的总胆固醇和甘油三酯水平和降低的HDL-C是RA患者后期发生动脉粥样硬化的普遍原因。与正常组(49.72±6.30)相比，AIA关节炎模型组的HDL-C水平则明显下降(32.57±4.87)(图3H)，同时AIA组TC，TG，LDL-C/VLDL-C比值高于正常组(P<0.001)和治疗组(P<0.01)，这与早期RA疾病中所见的现象一致。另外，AIA组的游离脂肪酸(FA)比正常组显著升高(P<0.05)。有趣的是，用MTX和200mg/kg剂量的水飞蓟宾治疗可以改善血脂异常和关节炎，如图3所示。
代谢组学分析不仅有助于揭示水飞蓟宾发挥治疗作用的科学依据，而且有助于了解RA疾病的发病机制。因此，通过LC-MS/MS分析AIA模型大鼠的血浆以评估水飞蓟宾治疗后代谢产物群的改变。首先LC-MS/MS分析方法进行验证，结果表明：低，中，高浓度QC样品的相对标准偏差(RSD)<10％(n＝6)；而低，中，高浓度QC样品的平均精确度分别为87.22-110.21％(如表13所示)；低，中，高浓度QC样品的动物血浆的RSD小于15％(n＝8)。这些结果表明该检测系统具有可靠的稳定性和重复性。本方法最终共确定了72个生物标志物(见表1)。
表13以空白血浆加标准溶液(方法1,n＝6)或通过混合动物血浆(方法2,n＝8)检测QC样品中Try,Kyn,谷胱甘肽,谷胱甘肽二硫化物,5-羟色氨,5-羟色氨酸,苯基乙酰甘氨酸和胆酸的精密度和准确度的值
a:正常样品；
b:正常样品以1：1的比例加入模型样品；
c:模型样品.
所有样本采用主成分分析(PCA)和OPLS-DA分析，其中OPLS-DA(R2X＝0.953，Q2＝0.865)分析可以更成功分离正常组，模型组和治疗组，如图4所示。在OPLS-DA模型中，VIP用于发现潜在的生物标志物。VIP值高于1.0和或p值(t检验)低于0.05时被认为是潜在的生物标志物。通过比较水飞蓟宾与对照组大鼠的治疗效果，血浆中25种内源性代谢物被认为是AIA关节炎模型中与发病相关的潜在生物标志物。我们发现，在AIA关节炎模型中发生的代谢紊乱涉及脂肪酸(FA)，磷脂，氨基酸和三羧酸循环(TCA循环)。在AIA关节炎模型中，显著变化的代谢标志物包括如甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，牛磺酸，LPC(16：1)，LPC(22：6)，棕榈酸，黄嘌呤，尿酸，尿苷，邻酪氨酸，柠檬酸，琥珀酸。图4和表14显示水飞蓟宾给药后LPC(20：4)，LPC(18：0)，LPC(16：0)，N-苯基乙酰甘氨酸，氨基马尿酸，GSH，L-犬尿氨酸，草酰乙酸降低，表明水飞蓟宾有效修复代谢紊乱，缓解代谢产物对免疫应答和炎症反应产生的不良影响，从而改善AIA模型中RA发病过程中免疫系统功能障碍和多器官炎症反应，抑制RA的进展。
表14根据代谢途径鉴定的代谢物分类以及代谢物相对水平的比较。(n＝10-11AIA，n＝6-8NASH)
*使用学生t检验确定P-值，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.01与模型组或对照组相比。
大鼠脂质代谢紊乱的机制研究
根据代谢组学的结果，我们发现脂质代谢是与AIA模型中关节炎发病及治疗有关的主要途径之一。为了研究水飞蓟宾降低肝脏脂质积累的机制，我们检测了参与脂质代谢的基因的表达水平。基于潜在生物标志物的信息，我们在水飞蓟宾给药后的AIA模型的肝组织中检测了与脂质代谢密切相关的22种酶。用RT-PCR法验证了正常大鼠组、AIA大鼠组、水飞蓟宾给药组中17种酶mRNA的表达,并进一步用免疫印迹法验证了其中12种蛋白的表达。
RT-PCR结果显示，与正常大鼠相比，关节炎大鼠的肝组织中，脂蛋白脂酶(LPL)，胆固醇27-α-羟化酶(CYP27A1)，固醇调节组件结合蛋白1(SREBP1)，B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BI)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)，脂肪细胞蛋白2(aP2)，分化簇36/脂肪酸转位酶(CD36/FAT)，细胞色素P450 2E1(CYP2E1)，FAT/CD36肝X受体(LXR)和法尼醇X受体(FXR)蛋白表达升高，而HMG-CoA还原酶(HMGCR)，酰基辅酶A(CoA)合成酶(ACS)，肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)，过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPAR-α)和γ(PPAR-γ)降低(图5)，而水飞蓟宾给药能显着调节脂质代谢途径的这些酶。
肝脏中的脂肪过量积累可能是由于增加了脂肪输送、增加脂肪合成，降低脂肪氧化或以VLDL形式减少脂肪输出而发生的。我们首先研究了脂肪代谢在关节炎肝脏中的变化。AIA组发生肝脏脂肪堆积和血脂水平降低。如图5所示，包括G6PD，aP2和CD36/FAT在内的参与脂肪酸合成和转运的关键脂肪生成酶的基因表达水平发生显着上调，而乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和FA合成酶(FAS)没有改变(数据未显示)。在AIA关节炎组中，FAs氧化和FAs活化的限速酶基因CPT-1和ACS的mRNA水平显着降低。因此，这些结果表明在AIA关节炎模型中脂肪分解代谢减少，而脂肪酸合成增加，导致肝脏中的脂质积累。
接下来，我们比较AIA关节炎组、正常组和水飞蓟宾给药组中胆固醇代谢涉及的关键脂肪生成酶的基因表达水平。在AIA关节炎模型组中，甘油三酯水解成脂肪酸过程中的限速酶LPL的mRNA水平显着增加，被水飞蓟宾给药后发生逆转。但是LPL激活剂ApoC-II和ApoE的基因表达没有改变。与对照组相比，在AIA关节炎模型组中，负责摄取脂蛋白颗粒进入细胞的SR-BI和LDLR的mRNA水平均显着上调(图5)。此外，肝脏胆固醇分解代谢和排泄的重要酶CYP7A1和CYP27A1的mRNA水平也显着增加。基于这些数据我们得出，AIA关节炎模型增强了脂蛋白的吸收以及脂蛋白的水解，这可以显着增加肝脏中的脂质积累。
核激素受体PPAR，LXR和FXR负责调节大量参与脂质和脂蛋白代谢酶的基因的转录[38]。我们发现，与SREBP1，LXR和FXR等肝脂肪生成转录因子有关的mRNA水平显着升高(p<0.001)，而PPAR-a和PPAR-γ降低(图5)。用水飞蓟宾或MTX进行治疗后减弱了增加的幅度，但是没有减弱ACS，CPT-1和HMGCR基因的表达水平，如图5所示。这些结果表明在AIA关节炎模型脂肪酸的合成和运输中，或在脂蛋白的摄取和水解中，脂肪生成转录因子及其下游酶被改变并且随治疗而减弱。在确认涉及脂质代谢的关键脂肪生成酶基因表达的差异之后，进一步进行免疫印迹分析以验证基因测定结果。免疫印迹分析显示LPL，G6PD，CYP7A1，CYP27A1，aP2，CD36/FAT，SREBP1，LXR蛋白在AIA关节炎模型中上调，而CYP2E1和FXR蛋白水平没有变化。综上所述，水飞蓟宾的治疗改善了主要脂肪生成酶基因和蛋白质水平的变化(图5)。
实施例2
MCD饮食诱导小鼠NASH模型
雄性野生型C57Bl/6小鼠对照正常饲料MCS喂养(中国营养动物饲料高科技股份有限公司，中国，#TP 3005GS)及MCD喂养(中国营养动物饲料高科技股份有限公司，#TP3005G)8周。表15和16分别给出所述饲料的组成。动物随机分为四组(n＝10)：1)对照组，喂食MCS饲料；2)喂食高脂肪MCD饲料；3)喂食MCD饲料并口服给药150mg/kg水飞蓟宾；4)喂食MCD饲料并口服给药300mg/kg水飞蓟宾。水飞蓟宾用35％PEG400：15％Cremophor EL：5％乙醇：45％盐水溶解。在诱导期间和干预期间每两天或三天测量体重。
在第8周结束时，乙醚麻醉处死小鼠。立即取出肝脏并称重，将大部分肝脏在液氮中速冻，其余组织在10％福尔马林中固定，并包埋在石蜡中进行H&E染色后进行组织学检查。根据制造商的试剂盒说明书测定ALT，AST，TG和TC。此外，由病理学专家进行组织学标准评估。使用市售的ELISA试剂盒测量血清中的TNF-α和IL-6以及SOD水平。
表15用于喂食NASH动物模型的MCD饲料的组成
表16对照组MCS饲料的组成
水飞蓟宾改善MCD饮食诱导的NASH小鼠的肝损伤
为了评估水飞蓟宾的脂质代谢调节作用是否有助于其保肝作用，我们进一步评估了MCD饮食诱导的NASH小鼠模型中的脂质谱及水飞蓟宾的治疗效果。由于MCD饮食更好地模拟了人类NAFLD发展为晚期NASH的病理生物学机制，因此我们选择了MCD饮食诱导的NASH模型来研究水飞蓟宾对RA和NASH发病机制中的共同危险因素的影响，如细胞因子、氧化应激和脂质代谢等。如图6所示，经8周MCD饮食喂养的小鼠模型的体重和肝脏重量显着降低，但增加了肝/体重比(P<0.001)，而用300mg/kg水飞蓟宾给药后对体重没有影响，肝/体重比降低(P<0.05)。图6A-D和表17显示了8周后对照组、MCD饮食组、水飞蓟宾给药组肝脏标本H&E染色的组织学分析，MCD饮食组表现出显著的微泡和大泡状脂肪变性，指示脂质代谢紊乱，并伴有炎症和气球样变性(图6B)；用水飞蓟宾给药的小鼠表现出较低的脂肪变性以及炎症和气球样病变(图6C，D)(P<0.01)。与对照组相比,经8周MCD饮食诱导的C57BL/6NASH小鼠血清中TC，TG，ALT，AST和肝脏TNF-α，IL-6水平明显升高，而SOD水平降低(P<0.001),出现明显的肝细胞损伤、炎症和脂质过氧化。而与MCD饮食模型组相比，水飞蓟宾给药组的血清转氨酶，细胞因子水平，脂质谱和氧化应激水平得到显着改善(图6F-M)。
表17水飞蓟宾对MCD饮食诱导的NASH小鼠组织病理学改变的影响
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与正常大鼠或与溶剂对照组大鼠相比(n＝6-8)
脂质相关代谢物在NASH的发病机制中发挥关键作用
通过LC-MS/MS代谢组学分析MCD饮食模型小鼠的血浆样本中的代谢产物，以更好地了解水飞蓟宾治疗NASH的机制。基于血浆中的代谢物，PCA清楚分开了对照组，MCD饮食诱导组和水飞蓟宾治疗组小鼠。OPLS-DA(R2X＝0.877，Q2＝0.749)多被用于鉴定和评价标志性代谢物，以VIP评分或P值来解释对照组、模型组和治疗组之间大部份代谢产物的差异(图9)。利用阶层式分群分析,用代谢物组以100％的准确度区分NASH组与对照组小鼠这两个队列。在表18中,根据VIP评分(VIP>1.0)排名，列出了对照组，模型组和水飞蓟宾给药组差异的前15种代谢标志物(p<0.05)。这15个标志物包括胆汁酸(GCDCA，UDCA)，脂质(LPC(18:0)，LPC(22:6)，LPC(20:1)，LPC(16:1)，脂肪酸(苯乙酰甘氨酸)，TCA循环代谢物(草酰乙酸)，氨基酸(L-犬尿氨酸，5-羟色胺)和嘌呤核苷酸代谢物(尿酸，尿苷，葫芦巴碱)，表明众多代谢的改变也发生在NASH疾病中，如图10。
表18根据代谢途径鉴定的代谢物分类以及代谢物相对水平的比较(n＝6-8,P<0.05和VIP>1)
*使用学生t检验确定P-值*P<0.05,**P<0.01and***P<0.01与模型组或对照组相比
鉴于RA人群中脂肪肝疾病的高发病率以及慢性炎症与脂肪营养不良，肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗增加的相关性，我们接下来比较了AIA组与MCD饮食诱导的NASH模型的血浆代谢组标志物。结果发现这两个数据集之间有许多重迭，包括溶血磷脂酰胆碱(LPC)，胆汁酸(BAs)，氨基酸(AA)，核酸和柠檬酸循环代谢物。其中RA和NASH模型中大部分脂质代谢产物发生改变，包括LPC(16：1)，LPC(22：6)，LPC(18：0)和GCDCA。在最近的一些研究中，血清胆汁酸浓度升高与肝脏疾病密切相关，但是，我们首次发现AIA关节炎模型中胆汁酸含量显着增加，并与水飞蓟宾的治疗相关。总的来说，这些改变与NAFLD和NASH(即胆汁酸，LPC，FA，尿酸)中报导的结果重迭，提高了发生NAFLD的几率(即脂质积聚，脂质过氧化和线粒体功能障碍)，同时也是导致RA患者的肝脏异常的原因。
氧化应激生物标志物GSH/GSSG，尿酸和尿苷水平在模型组也显着升高(图4和10)。众所周知，氧化应激与NASH和RA的发病机制有很大关联。此外，在RA和NASH动物模型样品中均发现氨基酸显着增加，例如邻-酪氨酸/苯丙氨酸和L-犬尿氨酸(图4和10)。许多研究表明，色氨酸通过犬尿氨酸途径的代谢与免疫系统和炎症有关。另一方面，已知色氨酸降解的犬尿氨酸途径调节脂质代谢。因此，犬尿氨酸途径的改变可能是RA和NASH模型中肝脏自身免疫紊乱和炎症反应肝脏脂质谱改变的原因之一，而水飞蓟宾则可以调节犬尿氨酸途径。
与对照组相比，AIA关节炎模型中与TCA循环相关的代谢物如柠檬酸，草酰乙酸和琥珀酸也发生改变，而在MCD饮食诱导的NASH模型中观察到类似的改变。据报导，肝脏脂肪含量与TCA循环代谢活跃有关，这与本研究中的观察结果一致。说明RA和NASH模型大鼠肝脏脂质蓄积与发病密切相关，这与代谢组学研究中的代谢物变化有关。
蓟宾蓟宾蓟宾蓟宾蓟宾
讨论
研究表明代谢物在生物系统以及炎症和疾病引起的代谢途径的紊乱中起重要作用。RA患者血液中血脂指标的变化称为“脂质悖论”，这些变化在临床已经被广泛观察到。其中TC，LDL-C和HDL-C水平的降低不仅与RA患者的活动性炎症相关，而且使RA患者具有更高的心血管疾病的风险。RA患者血脂指标的这种改变也常见于败血症，癌症和其他慢性炎症疾病中，表明炎症与脂质水平相关。这与DMARDs和生物制剂抑制炎症并提高脂质水平的结果是一致的。然而，血脂异常的分子机制及其与RA发病机制及治疗的关系尚不清楚。在这项研究中，使用代谢组学技术分析了水飞蓟宾在关节炎AIA模型和MCD饮食诱导的NASH模型中引起的代谢物的主要变化。两个数据集之间存在一些的重叠，比如游离脂肪酸(FFA)，溶血磷脂酰胆碱(LPC)，胆汁酸(BAs)和胺酸(AA)等，表明有一些共同的代谢途径在这两种疾病模型中发生了变化。
根据代谢组学分析结果，在关节炎AIA模型和MCD饮食模型中，主要代谢变化发生在脂质代谢物上。为了探讨脂质变化与疾病的内在机制，本研究评估了脂质代谢关键酶的水平。实时PCR结果显示，AIA大鼠肝脏组织中LPL，CYP7A1，LDLR，SREBP1，SR-BI，G6PD，LXR和FXR的表达升高，HMG-COA，PPAR-α和PPAR-γ表达降低。这些结果与免疫印迹实验获得的结果一致。有利于阐明关于RA的发病机理和治疗相关的脂质代谢的机理。
肝脏脂肪酸(FA)，被认为在脂质损伤诱导中最具伤害力的代谢物，其水平在MCD饮食组和关节炎AIA组较高。我们发现在关节炎AIA模型中LPL水平显着增加，这可能部分解释了肝脏脂肪积累的机制，因为LPL是将脂蛋白中的甘油三酯水解成游离脂肪酸和甘油的主要酶，如图7所示。LPL通常不在成年人和动物的肝脏中表达，但在肥胖患者的肝脏中检测到高表达的LPL水平[45]。与前面的研究一致，我们的数据显示，与正常和治疗的大鼠相比，关节炎AIA大鼠的肝脏呈现相对高表达的LPL。然后与对照组不同的是，这种酶还可以在肝脏中合成，因为它还表达LPL mRNA。因此，肝脏中LPL的组织特异性过度表达增加了TG和其他脂质的细胞储存，并导致RA患者中常观察到脂肪变性。
此外，在本研究中，脂肪酸合成脂肪的蛋白(如G6PD)和转运蛋白(如aP2和CD-36/FAT)在关节炎AIA模型组显著上调(图7)。CD36在肝脂肪变性中的致病作用已被明确定义，降低CD36可明确减轻脂肪肝。尽管G6PD是脂肪生成所必需的，但是对于G6PD在脂肪肝疾病以及其他慢性疾病中的作用知之甚少。Park等人报道，在脂肪细胞中，G6PD过表达刺激了大多数脂肪细胞标记基因的表达，并提高了细胞游离脂肪酸和TG的水平。因此，G6PD和CD36的过度表达可能部分作用于RA的代谢和炎症的改变。此外，脂肪细胞中脂肪酸结合蛋白(FABP4/aP2)在脂肪酸的合成，储存和分解以及胆固醇和磷脂代谢方面显示出重要作用。最近的研究表明，FABP4/aP2的缺失可以减少巨噬细胞炎症，并强调其作为一系列相关疾病如肥胖，糖尿病和动脉粥样硬化的治疗靶点。有趣的是，关节炎AIA模型的肝脏中aP2水平显着升高，而用MTX和水飞蓟宾治疗后其表达降低。因此，aP2可能成为RA的潜在治疗靶点，而aP2涉及的机制尚需进一步研究。
在肝细胞中，脂肪酸分别与甘油和胆固醇氧化或酯化形成TG和胆固醇酯(CE)。我们注意到在关节炎AIA模型中，作为FAs氧化和FAs活化的限速酶的CPT-1和ACS的基因水平显着降低，而TG合成的关键酶ACC1没有改变。因此，脂肪酸的积累可能进一步导致TG和CE在肝脏中的积累而不是氧化(图7)。此外，与对照组相比，主要介导胆固醇的摄取的高密度脂蛋白受体SR-BI和低密度脂蛋白受体LDLR在关节炎AIA模型组均显着上调。SR-BI和LDLR的肝脏过度表达显着增加了HDL-C，LDL-C和VLDL水平，促进了肝脏循环中胆固醇的选择性摄取，从而导致活动期RA患者的血浆中脂肪酸和胆固醇的减少。我们还观察到CYP7A1和CYP27A1水平显着升高，这与AIA模型中血清胆汁酸浓度升高相一致，并与RA的治疗相关。胆汁酸限速合成酶CYP7A1和CYP27A1的过度表达，导致胆汁酸在肝脏中积累。
脂肪合成通路的变化可以由多种机制触发，包括由几种特定的转录因子调节。已有研究表明LXR-α的活化可诱导肝脏脂肪变性，并上调LPL，CYP7A1和SREBP1的靶基因。本研究观察到的LXR活化可能是RA患者肝脂肪酸合成增加和肝脂肪变性的机制之一。此外，已有报道显示LXR通路为RA滑膜巨噬细胞中上调的通路，LXRs的激活显着增强了Toll样受体(TLR)驱动的细胞因子的分泌。因此，根据我们的研究，LXR有可能是是RA中炎症与脂质代谢紊乱之间的主要联系之一。此外，用MTX和水飞蓟宾治疗后抑制了关节炎AIA模型肝脏中LPL，CYP7A1和SREBP1的mRNA和/或蛋白质表达。SREBP1也是转录因子，在哺乳动物细胞中被鉴定为细胞脂质水平的关键调节因子。然而，在AIA大鼠中观察到的SREBP1的过度表达没有被MTX和水飞蓟宾所调节。SREBP1正向调节胆固醇和脂肪酸合成相关基因(包括脂肪酸合成酶(FAS)和HMG CoA还原酶(HMGCR))的表达，在我们的研究中的也没有显着改变。因此，SREBP-1可能与AIA模型中脂质代谢的变化部分相关，而不是主要途径。FXR(调节脂质代谢的另一重要核受体)调节胆汁酸摄入肝细胞和胆汁酸生物合成以及脂肪酸β-氧化。然而，考虑到胆汁酸的升高，FXR水平在我们的关节炎AIA模型中没有变化，表明它可能不涉及RA的发病机制。
与LXR类似，PPAR的核受体家族已经成为代谢，炎症和免疫信号的重要调节因子，并由三种相关蛋白PPARα,PPARβ/δ,PPARγ组成。PPARγ转录调控涉及脂质代谢的基因和能量学，包括aP2，G6PD，CD36和LXRα，而最近的研究表明PPARγ是一种重要的免疫调节剂，可抑制炎性细胞因子的产生以及促炎基因的表达。另一发现指透过Ad-PPARγ传递的PPARγ的过度表达可以通过增强脂肪组织中的脂肪酸摄取基因(aP2，LPL，CD36和SREBP1)的表达，将脂肪酸从肝脏重新分布到脂肪组织中来减少在肝脏中的累积。有趣的是，我们的检测得到一个相反的结果：肝脏中PPARγmRNA和蛋白水平在关节炎AIA大鼠中特异性下降，而CD36，G6PD和aP2的肝脏mRNA水平明显升高。因此，PPARγ可能对于调节脂质代谢和导致脂肪变性发挥重要作用。我们还发现PPARα及其靶基因CPT-1的表达下调，这表明脂肪酸未经β-氧化途径消耗而是被存储。
原发性药物性肝损伤在RA中很常见，而在非甾体类抗炎药(NSAID)和甲氨蝶呤的治疗中也会出现药物导致的肝脏损伤，这比在原发性肝脏疾病中更加普遍。考虑到风湿性疾病范围广泛，对肝脏有不同程度的影响，迫切需要寻找一种能同时治疗RA患者关节炎和肝脏异常的候选化合物。正如我们所知的，首次用水飞蓟宾给药后观察到脂质显着减少及相关的炎症标志物的改善。在MCD饮食诱导的NASH模型中进一步证实脂肪肝保护作用以及水飞蓟宾的脂质调节功能。有趣的是，我们观察到类似的代谢物在NASH和AIA模型中都改变了。
总之，我们已经证明，AIA的模型改变了代谢，尤其是肝脏中的脂质分布。导致代谢改变的参与的机制主要有脂质和脂蛋白代谢酶包括LXR，LPL，G6PD，aP2，CD36和CYP7A1等。由于这些酶的变化与急性期炎症反应引起的的变化相反，可部分解释RA患者“脂质悖论”现象。此外，RA患者脂质和脂蛋白的变化是先天性免疫和炎症反应的一部分，用水飞蓟宾治疗疾病导致炎症减轻和血脂谱调节趋向正常以及对肝功能的保护作用。因此水飞蓟宾有可能成为治疗关节炎和脂质紊乱一种新的治疗剂。
序列表
<110> 澳门科技大学
<120> 黄酮木脂素在制备用于治疗自身免疫炎症疾病的药物的应用
<130> I50617LLO
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (20)

1.黄酮木脂素在制备用于减少受试者的脂质代谢异常和减少炎症的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述自身免疫炎症疾病是自身免疫性关节炎，以及受试者是哺乳动物。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述自身免疫炎症疾病是类风湿性关节炎，以及所述脂质代谢异常包括偏离健康受试者的参考值的高密度脂蛋白胆固醇水平。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述脂质代谢异常包括与健康受试者的参考值相比的降低的HDL胆固醇水平、正常或轻度增加的总胆固醇水平、正常或轻度增加的LDL胆固醇水平，以及正常或轻度增加的甘油三酯水平。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述脂质代谢异常包括脂质代谢标志物的异常，脂质代谢标志物的异常具有偏离健康受试者的参考值的水平，其为两个或多个选自脂蛋白脂肪酶、脂肪细胞蛋白2、胆固醇7-α-半乳糖苷、固醇-27-羟化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、脂肪酸转运酶、固醇调节元件结合蛋白1、低密度脂蛋白受体、清道夫受体B类成员1，和肝X受体α的脂质代谢标志物的水平，以及其中降低脂质代谢的异常包括与未治疗的的受试者相比降低两种或以上的所述脂质代谢标志物的异常。
6.根据权利要求1所述的应用，其中减少脂质代谢异常包括与未治疗的的受试者相比，一种或多种HDL胆固醇水平的增加、甘油三酯的降低和游离脂肪酸水平的降低。
7.根据权利要求1所述的应用，其中受试者还患有肝病。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述肝病是脂肪肝病。
9.根据权利要求1所述的应用，其中所述受试者还患有代谢综合症、肥胖、糖尿病或高血压。
10.根据权利要求1所述的应用，其中减少炎症包括减少与未治疗的受试者相比增加的炎症标志物，所述炎症标志物选自TNF-α、IL-1β、PGE 2、MMP-9、TIMP-1和ESR中的两种或多种。
11.根据权利要求1所述的应用，其中所述受试者还具有肝脏异常，所述肝脏异常包括碱性磷酸酶和天冬氨酸转氨酶水平的增加，以及所述药物进一步包括通过，与健康受试者参考值相比，减少碱性磷酸酶和天冬氨酸转氨酶水平来减少肝脏异常。
12.根据权利要求1所述的应用，其中所述黄酮木脂素包括一种或多种：
-具有式(Ia)的水飞蓟宾A:
-具有式(Ib)的水飞蓟宾B:
或其糖苷、盐或溶剂化物。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述黄酮木脂素还包括一种或多种：
-具有式(IIa)的异水飞蓟宾A：
-具有式(IIb)的异水飞蓟宾B：
-具有式(IIIa)的水飞蓟亭：
-具有式(IVa)的水飞蓟宁：
或其糖苷、盐或溶剂化物。
14.根据权利要求12所述的应用，其中所述黄酮木脂素是水飞蓟宾A或其糖苷、盐或溶剂化物；水飞蓟宾B或其糖苷、溶剂化物；或两者的混合物；以及所述黄酮木脂素通过口服途径施药。
15.黄酮木脂素在制备用于降低受试者患上心血管疾病的风险的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着脂质代谢异常的自身免疫炎症疾病。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述自身免疫炎症疾病是类风湿性关节炎并且所述脂质代谢异常包括与健康受试者的参考值相比降低的高密度脂蛋白胆固醇水平。
17.根据权利要求15所述的应用，其中所述受试者还患有代谢综合症、肥胖、糖尿病和高血压中的一种或多种。
18.根据权利要求15所述的应用，其中所述黄酮木脂素是水飞蓟宾A或其糖苷、盐或溶剂化物；水飞蓟宾B或其糖苷、溶剂化物；或两者的混合物；以及所述黄酮木脂素通过口服途径施药。
19.黄酮木脂素和缓解疾病的抗风湿药的组合物在制备用于减少受试者的肝脏异常和减少炎症的药物的应用，其中所述受试者患有伴随着肝脏异常的自身免疫炎症疾病。
20.根据权利要求19所述的应用，其中所述黄酮木脂素由具有式(Ia)的水飞蓟宾A或其糖苷、盐或溶剂化物；具有式(Ib)的水飞蓟宾B或其糖苷、溶剂化物；或两者的混合物组成；以及所述黄酮木脂素通过口服途径施药；以及其中所述缓解疾病的抗风湿药是甲氨蝶呤，和其中所述肝脏异常包括与健康受试者参考值相比的碱性磷酸酶和天冬氨酸转氨酶水平的增加，以及所述减少受试者的肝脏异常包括通过减少碱性磷酸酶和天冬氨酸转氨酶水平来减少肝脏异常。
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