WO2019156252A1 - ライソゾーム病の予防及び治療剤 - Google Patents

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disease
cells
lovastatin
therapeutic agent
autophagy
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英俊 櫻井
洋平 西
太田　章
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国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for lysosomal disease. More specifically, the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for lysosomal disease comprising an HMG-CoA reductase inhibitor.
  • Lysozyme disease (hereinafter sometimes abbreviated as “LSD”) is caused by a genetic defect of an acid-degrading enzyme in lysosome or an abnormality of a gene causing lysosomal dysfunction. Due to these defects, various substrates and unwanted substances accumulate in lysosomes. As a result, liver, spleen enlargement, bone deformation, neurological disorders (convulsions, intelligence disorders, etc.), eye disorders, kidney disorders, heart failure, etc. It is a disease that presents symptoms and is designated as an intractable disease designated by the Ministry of Health, Labor and Welfare.
  • the cause of LSD is a large number of genetic defects of acid-degrading enzymes in lysosomes, which are classified into a number of diseases depending on the accumulated substrate and the type of enzyme that is lost (Gaucher disease, Fabry disease, Niemann-Pick disease, GM1). Gangliosidosis, mucopolysaccharidosis type I, etc.).
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells established by Yamanaka et al.
  • Patent Document 1 artificial pluripotent stem cells established by Yamanaka et al.
  • iPS cells derived from various patients with intractable diseases are produced by the above-described method, differentiated into target cells, and therapeutic drugs are screened.
  • the present inventors previously expressed exogeneous MyoD and Myf5 in pluripotent stem cells cultured under conditions that do not specifically induce skeletal muscle cells, and adjusted the expression period to thereby convert skeletal muscle cells from skeletal muscle cells to skeletal muscle cells.
  • Patent Document 2 A method for efficiently inducing differentiation of muscle cells has been established (Patent Document 2), and model cells of the same disease have been established from iPS cells derived from Pompe disease patients using this method (Non-Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a novel preventive and / or therapeutic drug for LSD that is more effective and has fewer side effects.
  • the present inventors established iPS cells from fibroblasts derived from patients with Pompe disease, and used the differentiation induction method developed by the present inventors (the above-mentioned Patent Document 2) to develop myocytes. Differentiation induction was performed.
  • the myocytes were brought into contact with the test compound to screen for compounds that reduce autophagosome accumulation.
  • HMGCR HMG-CoA reductase
  • the present invention is as follows.
  • a prophylactic or therapeutic agent for lysosomal disease comprising an HMG-CoA reductase inhibitor.
  • the agent according to [1], wherein the HMG-CoA reductase inhibitor is lovastatin.
  • the agent according to [1] or [2], wherein the lysosomal disease is Pompe disease or GNE myopathy.
  • a method for preventing or treating lysosomal disease in a subject comprising administering to the subject an effective amount of an HMG-CoA reductase inhibitor.
  • the method according to [4], wherein the HMG-CoA reductase inhibitor is lovastatin.
  • the agent according to [7] or [8], wherein the lysosomal disease is Pompe disease or GNE myopathy.
  • the dysfunction of autophagy that could not be intervened by conventional enzyme replacement therapy can be improved. Therefore, as an effective new preventive and / or therapeutic means of LSD Be expected.
  • FIG. 3 shows that lovastatin eliminates autophagic vacuoles in GNE myopathy specific muscle cells. It is an electron micrograph which shows the therapeutic effect of lovastatin in a GNE myopathy specific muscle cell.
  • the present invention provides a preventive and / or therapeutic agent for lysosomal disease (LSD) containing an HMG-CoA reductase (HMGCR) inhibitor (hereinafter also referred to as “prophylactic / therapeutic agent of the present invention”).
  • LSD lysosomal disease
  • HMGCR HMG-CoA reductase
  • a substance to be decomposed accumulates as a waste product due to an enzyme deficiency related to lysosome, fusion between lysosome and autophagosome is inhibited, autophagosome accumulates and autophagy
  • a substance to be decomposed accumulates as a waste product due to an enzyme deficiency related to lysosome, fusion between lysosome and autophagosome is inhibited, autophagosome accumulates and autophagy
  • Pompe disease in which glycogen accumulates due to deficiency of ⁇ -glucosidase (GAA), UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase / N-acetylmannosamine kinase Distal myopathy (GNE myopathy) with rimmed vacuoles lacking (GNE), GM1 gangliosidosis, GM2 gangliosidosis, metachromatic leukodystrophy (MLD), Fabry disease ( ⁇ -galactosidase A deficiency), Faber Disease, Gaucher disease ( ⁇ - Diseases such as Lukocerebrosidase deficiency), Niemann-Pick disease (types A, B, and C), Krabbe disease, and other sphingolipid accumulation diseases, mucopolysaccharidosis (type I-VII), Danone disease, ⁇ -mannosidosis Preferred examples include, but are not limited to, Pompe disease or GNE myopathy.
  • GAA ⁇ -glu
  • HMG-CoA reductase (HMGCR) inhibitor which is an active ingredient of the preventive / therapeutic agent of the present invention, is not particularly limited as long as it is a compound having an activity that inhibits the enzyme activity of hydroxymethylglutaryl CoA reductase, and is derived from a microorganism.
  • (+)-(3R, 5R) -3,5-dihydroxy-7-[(1S, 2S, 6S, 8S, 8aR) -6-hydroxy-2-methyl-8-[(S) -2- Methylbutyryloxy] -1,2,6,7,8,8a-hexahydro-1-naphthyl] heptanoic acid see pravastatin, JP 57-2240 (USP 4346227)
  • the above-mentioned statin compound includes a lactone ring-closed compound or a pharmacologically acceptable salt thereof (preferably a sodium salt or a calcium salt).
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention is a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form obtained by mixing an HMGCR inhibitor as an active ingredient alone or with a pharmacologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like. Can be administered orally or parenterally.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • a composition for parenteral administration for example, injections, suppositories and the like are used, and injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. Dosage forms may be included.
  • excipients eg sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Gum arabic; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate and magnesium metasilicate aluminate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; Carbonates such as calcium; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate), lubricants (eg, stearic acid metal salts such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate; talc; Colloidal silica; wax like beeswax and gay wax Borax; adipic acid; sulfate such as sodium sulfate; glycol; fumedi
  • the dosage of the HMGCR inhibitor can vary depending on various conditions such as the patient's symptoms, age, weight and the like.
  • the dose varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 0.1 mg per dose, the upper limit is 1000 mg (preferably 500 mg), and in the case of parenteral administration, the lower limit is per dose. 0.01 mg and an upper limit of 100 mg (preferably 50 mg) can be administered to adults 1 to 6 times per day. The dose may be increased or decreased depending on the symptoms.
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention includes other agents such as those conventionally used in the treatment of lysosomal diseases, such as enzyme replacement therapy agents (eg, ⁇ -glucosidase (Pompe disease), ⁇ -galactosidase A (fabry Disease), Gaucher's disease ( ⁇ -glucocerebrosidase, etc.), pharmacological chaperone therapeutic agent, substrate reduction therapeutic agent and the like.
  • enzyme replacement therapy agents eg, ⁇ -glucosidase (Pompe disease), ⁇ -galactosidase A (fabry Disease), Gaucher's disease ( ⁇ -glucocerebrosidase, etc.
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention and these other agents can be administered simultaneously, sequentially or separately.
  • Example 1 Pharmacological evaluation using iPS cells established from a patient with Pompe disease (1) Fibroblast derived from a patient with Pompe disease After biopsy of 4 mm of skin for 3 weeks, as a fibroblast derived from a patient with Pompe disease Using.
  • the number of cells per well of a 96-well culture plate ranged from 3.0 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 4 .
  • the culture medium was changed to a human iPS medium without bFGF and having 10 ⁇ M Y-27632 (wako).
  • AK02N or AK03 (Ajinomoto) human iPS medium containing 1 ⁇ g / mL doxycycline (LKT Laboratories) was added.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • 50 mU / L penicillin / 50 ⁇ g / L streptomycin Invitrogen
  • 1 ⁇ g / mL doxycycline LKT Laboratories
  • 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol (2-roen) Changed to Furthermore, cell culture was continued until 5 days later to induce differentiation into skeletal muscle cells. All of these cultures were performed by incubating in a humidified atmosphere at 37 ° C., 5% CO 2 . By this method, MHC positive cells were obtained, and differentiation induction into skeletal muscle cells was confirmed.
  • the cell-stained plate was measured and analyzed using ArrayScan (Thermo Scientific).
  • ArrayScan Thermo Scientific
  • the fluorescence value of autophagy in the cell and the region were used, and the compound was evaluated in a scatter diagram (FIG. 1).
  • one group that reduces the autophagy region was the HMGCoA inhibitor group, and one of them was lovastatin.
  • lovastatin was evaluated as a representative compound.
  • a base (0.3% dimethylsulfoxide (DMSO)
  • a final concentration of 10, 3, 1, 0.3 ⁇ M lovastatin were added for 48 hours. Incubated. Differentiated cells were fixed with 4% paraformaldehyde (wako) / PBS at room temperature for 10 minutes, washed with PBS, and then washed with PBS (Nacalai Tesque) with 0.5% Triton X-100 (Sigma-aldrich).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Permeabilization was performed for 10 minutes at room temperature. Thereafter, the plate was washed with PBS, blocked using Blocking one (Nacalai Tesque) at 4 ° C. for 30 minutes, and washed again with PBS.
  • the primary antibody used was diluted rabbit monoclonal antibody (mAb) anti-LC3B (1: 200; Cellsignaling) in the above 10% blocking one solution. The cells were reacted at 4 ° C. for 5 hours and washed with PBS.
  • the 10% blocking one solution was diluted with Alexa fluor488-conjugated anti-rabbit IgG goat antibody (1: 500; Invitrogen) as a secondary antibody and Hoechst 33342 (1: 10000; Dojindo) for nuclear staining, The reaction was allowed to proceed for 1 hour at room temperature. After washing with PBS, measurement and analysis were performed with ArrayScan (Thermo Scientific). As a result, it was confirmed that LC3, which is a typical autophagy marker protein, was more expressed in disease-derived muscle cells than in healthy individuals, but decreased in a concentration-dependent manner in the lovastatin-treated group. (FIG. 2).
  • Example 2 Pharmacological evaluation using iPS cells established from a patient with distal myopathy (GNE myopathy) with rimmed vacuoles (1) Fibroblasts from GNE myopathy patients Biocultured 4 mm skin was cultured for 3 weeks Later, it was used as a fibroblast derived from a GNE myopathy patient.
  • the number of cells per well of a 96-well culture plate ranged from 3.0 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 4 .
  • the culture medium was changed to a human iPS medium without bFGF and having 10 ⁇ M Y-27632 (wako).
  • AK02N or AK03 (Ajinomoto) human iPS medium containing 1 ⁇ g / mL doxycycline (LKT Laboratories) was added.
  • the culture solution was added to ⁇ minimum essential medium ( ⁇ MEM) (Nacalai Tesque) with 5% Knockout Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), 50 mU / L penicillin / 50 ⁇ g / L streptomycin (Invitrogen), 1 ⁇ g / mL. Doxycycline (LKT Laboratories) and 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol (2-ME) (Invitrogen) were added. Furthermore, cell culture was continued until 5 days later to induce differentiation into skeletal muscle cells. All of these cultures were performed by incubating in a humidified atmosphere at 37 ° C., 5% CO 2 . By this method, MHC positive cells were obtained, and differentiation induction into skeletal muscle cells was confirmed.
  • ⁇ MEM Knockout Serum Replacement
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • 2-ME 2-mercaptoethanol
  • Lovastatin against GNE myopathy was evaluated. Lovastatin having a final concentration of 10 ⁇ M was added to the muscle-differentiated cells. After incubation for 48 hours, the cells were evaluated with Cyto-ID autophagy detection kit 2.0 (Enzo Life Science, Inc.), which is an autophagy detection kit. The staining method was in accordance with the method attached to Kit. The cell-stained plate was measured and analyzed using ArrayScan (Thermo Scientific). As a result, disappearance of autophagy accumulation in the lovastatin treatment group was confirmed (FIG. 5).
  • lovastatin Pharmacological evaluation using an electron microscope
  • a base (0.3% dimethylsulfoxide (DMSO)
  • a final concentration of 10 ⁇ M lovastatin were added and incubated for 48 hours.
  • the cells were then harvested and fixed with 2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde for 30 minutes. After washing three times with PBS, the sample was fixed with 2% osmium in PBS at 4 ° C. for 1 hour. Subsequently, after polymerization at 60 ° C. for 48 hours, a section was cut out and observed with a transmission electron microscope (JEOL).
  • JEOL transmission electron microscope
  • the present invention although it is a pathological condition common to LSD, it can improve the dysfunction of autophagy that could not be intervened by conventional enzyme replacement therapy. It is extremely useful in that cell death due to damage / stress of the mitochondrion and mitochondrial dysfunction is suppressed, and not only improvement of life prognosis but also improvement of skeletal muscle symptoms and central nerve symptoms can be expected.

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Abstract

本発明は、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含有してなるライソゾーム病の予防又は治療剤を提供する。

Description

ライソゾーム病の予防及び治療剤
　本発明は、ライソゾーム病の予防又は治療剤に関する。より詳細には、本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含有してなるライソゾーム病の予防又は治療剤に関する。
　ライソゾーム病（以下、「ＬＳＤ」と略記する場合がある）はライソゾーム内の酸性分解酵素の遺伝的欠損又はライソゾームの機能障害を来たす遺伝子の異常により発症する。それらの欠損によりライソゾーム内に様々な基質や不要物質が蓄積し、その結果、肝臓、脾臓の腫大、骨変形、神経障害（痙攣、知能障害など）、眼障害、腎障害、心不全など種々の症状を呈する疾患であり、厚生労働省の指定難病に指定されている。
　ＬＳＤの原因は、ライソゾーム内の酸性分解酵素の遺伝的欠損が多数であり、蓄積する基質や欠損する酵素の種類により数多くの疾患に分類される（ゴーシェ病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ムコ多糖症Ｉ型など）。
　現在、ＬＳＤの治療薬としていくつかの酵素補充療法が施行されいる。例えば、ファブリー病なら、リプレガルＴＭ（大日本住友製薬）やファブラザイムＴＭ（ＪＣＲファーマ）が、ポンペ病ではマイオザイムＴＭ（サノフィ）が上市され、施行されている。しかしながら、これらの酵素補充療法は臨床症状の改善や生存期間の延長など一定の効果を示すが、１）中枢神経症状や骨格筋症状に効果がない、２）自己抗体の出現、３）アレルギー反応、４）オートファジーの機能不全など問題点がある。特に、マイオザイムＴＭを用いた酵素補充療法において、生命予後が改善される一方で、骨格筋症状に対する効果は認められず運動機能は改善しない。また、中枢神経症状も改善しない。その原因として、オートファジービルドアップと呼ばれる過剰のオートファゴソームの蓄積を原因とするオートファジーの機能不全が報告されている（非特許文献１）。
　ところで、Ｙａｍａｎａｋａらが樹立した人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」という）（特許文献１）は、各組織の細胞へと分化させることができるため、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで病態の再現をすることが可能と考えられている。実際、上記の方法で、様々な難病患者由来のｉＰＳ細胞が作製され、目的の細胞へ分化させ治療薬のスクリーンングが行われている。本発明者らは以前、骨格筋細胞を特異的に誘導しない条件で培養した多能性幹細胞において外因性のＭｙｏＤやＭｙｆ５を発現させ、その発現期間を調節することにより、多能性幹細胞から骨格筋細胞を効率よく分化誘導させる方法を確立し（特許文献２）、当該方法を用いてポンペ病患者由来ｉＰＳ細胞から同疾患のモデル細胞を樹立している（非特許文献２）。
ＷＯ　２００８／１１８８２０　Ａ２ ＷＯ　２０１３／０７３２４６　Ａ１
Ｆｕｋｕｄａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｈ．Ｓｕｇｉｅ．Ｂｒａｉｎ　ａｎｄ　ｎｅｒｖｅ＝Ｓｈｉｎｋｅｉｋｅｎｋｙｕ　ｎｏ　ｓｈｉｎｐｏ　６７．９（２０１５）：１０９１−１０９８． Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，７：１３４７３（２０１７）
　本発明の目的は、より有効かつ副作用の少ないＬＳＤの新規な予防及び／又は治療薬を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、ポンペ病患者由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を樹立し、本発明者らが開発した分化誘導法（上記特許文献２）を用いて筋細胞へ分化誘導を行った。ここで、得られた筋細胞においてオートファゴソームが蓄積していることに着目し、当該筋細胞と試験化合物を接触させ、オートファゴソームの蓄積を低下させる化合物をスクリーニングした。その結果、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（以下、「ＨＭＧＣＲ」ともいう）阻害薬がオートファゴソームの蓄積を低下させることを見出した。さらに、別のＬＳＤである縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＧＮＥミオパチー）患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた筋細胞を用いた実験でも、ＨＭＧＣＲ阻害薬によるオートファゴソームの蓄積減少を確認した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいて、ＨＭＧＣＲ阻害薬がＬＳＤの予防及び／又は治療に有効であると結論し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含有してなるライソゾーム病の予防又は治療剤。
［２］ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬がロバスタチンである、［１］に記載の剤。
［３］ライソゾーム病がポンペ病又はＧＮＥミオパチーである、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］対象におけるライソゾーム病の予防又は治療方法であって、該対象に有効量のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を投与することを含む、方法。
［５］ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬がロバスタチンである、［４］に記載の方法。
［６］ライソゾーム病がポンペ病又はＧＮＥミオパチーである、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］ライソゾーム病の予防又は治療における使用のためのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬。
［８］ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬がロバスタチンである、［７］に記載の阻害薬。
［９］ライソゾーム病がポンペ病又はＧＮＥミオパチーである、［７］又は［８］に記載の剤。
　本発明によれば、ＬＳＤに共通する病態でありながら、従来の酵素補充療法では介入できなかったオートファジーの機能不全を改善することができるので、ＬＳＤの有効な新規予防及び／又は治療手段として期待される。
ＬＳＤ予防／治療薬のスクリーニング結果を示す図である。横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞内のオートファジー小胞の面積を、それぞれ示す。 ロバスタチンがポンペ病特異的筋細胞におけるオートファジーマーカーＬＳ３の発現を抑制することを示す図である。 ポンペ病特異的筋細胞におけるロバスタチンの治療効果を示す電子顕微鏡写真である。 ポンペ病特異的筋細胞におけるロバスタチンの治療効果を示す電子顕微鏡写真である。 ロバスタチンがＧＮＥミオパチー特異的筋細胞におけるオートファジー空胞を消失させることを示す図である。 ＧＮＥミオパチー特異的筋細胞におけるロバスタチンの治療効果を示す電子顕微鏡写真である。
　本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）阻害薬を含有してなるライソゾーム病（ＬＳＤ）の予防及び／又は治療剤（以下、「本発明の予防／治療剤」ともいう）を提供する。
　本発明において治療対象となるＬＳＤは、ライソゾームに関連する酵素の欠損により分解されるべき物質が老廃物として蓄積し、ライソゾームとオートファゴソームとの融合が阻害され、オートファゴソームが蓄積してオートファジーの機能不全の病態を呈する疾患であれば特に制限はなく、例えば、α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によりグリコーゲンが蓄積するポンペ病、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン　２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）を欠損する縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＧＮＥミオパチー）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼＡ欠損）、ファーバー病、ゴーシェ病（β−グルコセレブロシダーゼ欠損）、ニーマン・ピック病（Ａ，Ｂ，Ｃ型）、クラッベ病等のスフィンゴ脂質が蓄積する疾患、ムコ多糖症（Ｉ−ＶＩＩ型）、ダノン病、α−マンノーシドーシスなどが挙げられるが、それらに限定されない、好ましくは、ポンペ病又はＧＮＥミオパチーである。
　本発明の予防／治療剤の有効成分であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）阻害薬は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの酵素活性を阻害する活性を有する化合物であれば特に制限はなく、微生物由来の天然物質、それから誘導される半合成物質、及び全合成化合物のすべてが含まれ、例えば、（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル（Ｓ）−２−メチルブチレート（ロバスタチン、特開昭５７−１６３３７４号公報（ＵＳＰ４２３１９３８）参照）、（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル　２，２−ジメチルブチレート（シンバスタチン、特開昭５６−１２２３７５号公報（ＵＳＰ４４４４７８４）参照）、（±）（３Ｒ＊，５Ｓ＊，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−インド−ル−２−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（フルバスタチン、特表昭６０−５０００１５号公報（ＵＳＰ４７３９０７３）参照）、（３Ｒ，５Ｓ）−７−［２−（４−フルオロフェニル）−５−（１−メチルエチル）−３−フェニル−４−フェニルアミノカルボニル−１Ｈ−ピロ−ル−１−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプタン酸（アトルバスタチン、特開平３−５８９６７号公報（ＵＳＰ５２７３９９５）参照）、（１Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，８ａＲ）−８−｛２−［（２Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル｝−７−メチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロナフタレン−１−イル（２Ｓ）−２−メチルブタノエート（メバスタチン、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｔｏｋｙｏ）２９（１２）：１３４６−８（１９７６））、（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（メトキシメチル）−２，６−ビス（プロパン−２−イル）ピリジン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エノイン酸（セリバスタチン、Ｂｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９　Ｆｅｂ；１２６（４）：９６１−９６８．）、（＋）−（３Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２−メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフチル］ヘプタン酸（プラバスタチン、特開昭５７−２２４０号公報（ＵＳＰ４３４６２２７）参照）、（＋）−（３Ｒ，５Ｓ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メタンスルフォニルアミノ）ピリミジン−５−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６（Ｅ）−ヘプテン酸（ロスバスタチン、特開平５−１７８８４１号公報（ＵＳＰ５２６０４４０）参照）又は（Ｅ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［４’−（４’’−フルオロフェニル）−２’−シクロプロピルキノリン−３’−イル］−６−ヘプテン酸（ピタバスタチン、特開平１−２７９８６６号公報（ＵＳＰ５８５４２５９及びＵＳＰ５８５６３３６）参照）のようなスタチン化合物である。好ましいＨＭＧＣＲ阻害薬としては、ロバスタチンである。
　上記のスタチン化合物は、そのラクトン閉環体又はその薬理上許容される塩（好適には、ナトリウム塩又はカルシウム塩等）を包含する。
　本発明の予防／治療剤は、有効成分であるＨＭＧＣＲ阻害薬をそのまま単独で、または薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等と混合し、適当な剤型の医薬組成物として経口的又は非経口的に投与することができる。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。一方、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤である）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体である）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物である）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類である）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤である）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸である）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等である）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　ＨＭＧＣＲ阻害薬の投与量は、患者の症状、年齢、体重等の種々の条件により変化し得る。
　その投与量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当たり下限０．１ｍｇ、上限１０００ｍｇ（好適には５００ｍｇ）を、非経口的投与の場合には、１回当たり下限０．０１ｍｇ、上限１００ｍｇ（好適には５０ｍｇ）を、成人に対して１日当たり１乃至６回投与することができる。症状に応じて増量もしくは減量してもよい。
　本発明の予防／治療剤は、他の薬剤、例えば、ライソゾーム病の治療に従来使用されている薬剤、例えば、酵素補充療法剤（例、α−グルコシダーゼ（ポンペ病）、α−ガラクトシダーゼＡ（ファブリー病）、ゴーシェ病（β−グルコセレブロシダーゼ）等）、薬理学的シャペロン療法剤、基質低減療法剤などと併用してもよい。本発明の予防／治療剤及びこれらの他の薬剤は、同時に、順次又は別個に投与することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１：ポンペ病患者から樹立したｉＰＳ細胞を用いた薬理評価
（１）ポンペ病患者由来の線維芽細胞
　生検した４ｍｍの皮膚を３週間の培養後、ポンペ病患者由来の線維芽細胞として用いた。
（２）ｉＰＳ細胞誘導
　ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−Ｍｙｃに対するヒトｃＤＮＡを、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　１３１（５），８６１，２００７に記載の方法に従って、レトロウィルスを用いて前記線維芽細胞へ導入した。導入後６日目に、線維芽細胞をＳＮＬフィーダー細胞上に移し、翌日に４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培養液へ培地を交換した。培地は、１日おきに交換し、遺伝子導入後３０日目に、コロニーをピックアップした。
（３）骨格筋細胞分化誘導
　上記のポンペ病患者由来ｉＰＳ細胞に、テトラサイクリン応答性のＭｙｏＤ発現ベクターを導入し（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌｏｓ　Ｏｎｅ，２０１３）、筋分化良好なクローン（ＭｙｏＤ−ｈｉＰＳＣ）を選別した。
　ＭｙｏＤ−ｈｉＰＳＣを、フィーダー細胞の不在下、マトリゲル（ＢＤ）コートディッシュ又はｉ−ｍａｔｒｉｘ（ニッキ）に播種した。マトリゲルは、霊長類ＥＳ培地で１：５０に希釈した。ＭｙｏＤ−ｈｉＰＳＣをトリプシン処理し、単一の細胞に解離した。９６ウェル培養プレート１ウェルに対する細胞数は３．０×１０３~１．０×１０４の範囲であった。培養液を、ｂＦＧＦを有さず、１０μＭ　Ｙ−２７６３２（ｗａｋｏ）を有するヒトｉＰＳ培地に変更した。２４時間後、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＡＫ０２ＮもしくはＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）ヒトｉＰＳ培養液に添加した。Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｍＵ／Ｌペニシリン／５０μｇ／Ｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１００μＭ　２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したものに変更した。さらに５日後まで細胞培養を継続し骨格筋細胞へ分化誘導させた。これらの培養は、すべて３７℃、５％　ＣＯ２、加湿雰囲気下でインキュベートすることで行った。この方法により、ＭＨＣ陽性の細胞が得られ、骨格筋細胞への分化誘導が確認された。
（４）オートファジーを指標としたＬＳＤ予防／治療薬のスクリーニング方法及び薬理評価
　上記（３）で得られた疾患ｉＰＳ細胞由来の骨格筋細胞に、それぞれ基剤（０．３％　ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ））、スクリーニングの場合は終濃度３μＭの各種化合物、薬理評価の場合は終濃度１０，３，１，０．３，０．１，０．０３，０．０１，０．００３μＭのどちらかを加えて４８時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、オートファジーを検出できるＫｉｔ、Ｃｙｔｏ−ＩＤ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，）を用いて細胞染色した。また、染色の方法は、Ｋｉｔ添付の方法に従った。細胞染色したプレートをＡｒｒａｙＳｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定・解析した。評価に用いた指標として、細胞内のオートファジーの蛍光値と領域の２つを用い、散布図にて化合物の評価を実施した（図１）。その中でオートファジーの領域を減少させる一群がＨＭＧＣｏＡ阻害剤群であり、その一つが、ロバスタチンであった。
（５）ＬＣ３を指標としたＬＳＤ予防／治療薬の薬理評価法
　ＨＴＳスクリーニングにより見出されたスタチン類の中で、代表的な化合物としてロバスタチンを評価した。上記（３）で得られた疾患ｉＰＳ細胞由来の骨格筋細胞に、それぞれ基剤（０．３％　ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ））、終濃度１０，３，１，０．３μＭのロバスタチンを加えて４８時間インキュベートした。分化した細胞を、４％パラフォルムアルデヒド（ｗａｋｏ）／ＰＢＳを用いて室温で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ（ナカライテスク）に０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたものでｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎを室温で１０分間行った。その後、ＰＢＳで洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｏｎｅ（ナカライテスク）を用いて４℃、３０分間ブロッキングを行った後、再度ＰＢＳで洗浄した。一次抗体は、上記１０％　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｏｎｅ液中に、ウサギモノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ＬＣ３Ｂ（１：２００；Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を希釈して使用した。４℃、５時間細胞を反応させ、ＰＢＳで洗浄した。次いで、上記１０％　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｏｎｅ液中に、二次抗体としてＡｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ４８８結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および核染色用のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：１００００；Ｄｏｊｉｎｄｏ）をそれぞれ希釈したものを、室温で１時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄した後、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて測定・解析した。その結果、オートファジーの代表的なマーカータンパク質であるＬＣ３が健常者由来の筋細胞より、疾患由来の筋細胞では多く発現されていたが、ロバスタチン処置群では濃度依存的に減少することが確認できた（図２）。
（６）ＬＳＤ予防／治療薬の電子顕微鏡を用いた薬理評価
　ロバスタチンの効果を電子顕微鏡によっても評価した。上記（３）で得られた疾患ｉＰＳ細胞由来の骨格筋細胞に、それぞれ基剤（０．３％　ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ））、終濃度１０μＭのロバスタチンを加えて４８時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、２％パラフォルムアルデヒドと２％のグルタルアルデヒドで３０分間、固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、サンプルを、ＰＢＳ中の２％のオスミウムで４℃、１時間固定化した。次いで６０℃で４８時間重合化後、切片を切り出し、透過型電子顕微鏡（日本電子）にて観察した。その結果、ロバスタチン無処置群では、ポンペ病の病態であるグリコーゲン顆粒が多数蓄積したオートファジー空胞（図３　黒矢印）が観察されたが、ロバスタチン処置群ではオートファジー空胞が消失しており、より健常者由来の筋分化細胞と近い電子顕微鏡像が得られた（図４）。以上より、オートファジー機能の制御不全による細胞への影響について数多くの知見（Ｇａｌｌｕｚｚｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　１６：４８７−５１１，２０１７およびＰａｒｅｎｔｉ　ｅｔ　ａｌ．Ａｎｎｕａｌ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　６６：４７１−４８６，２０１５）を考慮すると、ロバスタチンはＬＳＤにおけるライソゾーム機能不全と、それに伴うオートファジーの過剰蓄積の予防及び治療に有用であることが示唆された。
実施例２：縁取り空胞をともなう遠位型ミオパチー（ＧＮＥミオパチー）患者から樹立したｉＰＳ細胞を用いた薬理評価
（１）ＧＮＥミオパチー患者由来の線維芽細胞
　生検した４ｍｍの皮膚を３週間の培養後、ＧＮＥミオパチー患者由来の線維芽細胞として用いた。
（２）ｉＰＳ細胞誘導
　ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｌ−Ｍｙｃ，ＬＩＮ２８に対するヒトｃＤＮＡと，ｓｈＲＮＡ−ｐ５３を、Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載の方法に従って、エピゾーマルベクターを用いて前記線維芽細胞へ導入した。導入後６日目に、線維芽細胞をＳＮＬフィーダー細胞上に移し、翌日に４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培養液へ培地を交換した。培地は、１日おきに交換し、遺伝子導入後３０日目に、コロニーをピックアップした。
（３）骨格筋細胞分化誘導
　上記のＧＮＥミオパチー患者由来ｉＰＳ細胞に、テトラサイクリン応答性のＭｙｏＤ発現ベクターを導入し（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌｏｓ　Ｏｎｅ，２０１３）、筋分化良好なクローン（ＭｙｏＤ−ｈｉＰＳＣ）を選別した。
　ＭｙｏＤ−ｈｉＰＳＣを、フィーダー細胞の不在下、マトリゲル（ＢＤ）コートディッシュ又はｉ−ｍａｔｒｉｘ（ニッキ）に播種した。マトリゲルは、霊長類ＥＳ培地で１：５０に希釈した。ＭｙｏＤ−ｈｉＰＳＣをトリプシン処理し、単一の細胞に解離した。９６ウェル培養プレート１ウェルに対する細胞数は３．０×１０３~１．０×１０４の範囲であった。培養液を、ｂＦＧＦを有さず、１０μＭ　Ｙ−２７６３２（ｗａｋｏ）を有するヒトｉＰＳ培地に変更した。２４時間後、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＡＫ０２ＮもしくはＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）ヒトｉＰＳ培養液に添加した。さらに２４時間後、培養液を、α最小必須培地（αＭＥＭ）（ナカライテスク）に５％　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｍＵ／Ｌペニシリン／５０μｇ／Ｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１００μＭ　２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したものに変更した。さらに５日後まで細胞培養を継続し骨格筋細胞へ分化誘導させた。これらの培養は、すべて３７℃、５％　ＣＯ２、加湿雰囲気下でインキュベートすることで行った。この方法により、ＭＨＣ陽性の細胞が得られ、骨格筋細胞への分化誘導が確認された。
（４）オートファジーを指標とした薬理評価
　ＧＮＥミオパチーに対するロバスタチンを評価した。筋分化させた細胞に終濃度、１０μＭのロバスタチンを加え、４８時間インキュベート後、オートファジー検出ＫｉｔであるＣｙｔｏ−ＩＤ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　２．０（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，）により評価した。染色の方法は、Ｋｉｔ添付の方法に従った。細胞染色したプレートはＡｒｒａｙＳｃａｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定・解析した。その結果、ロバスタチン処置群のオートファジー蓄積の消失が確認された（図５）。
（５）電子顕微鏡を用いた薬理評価
　ロバスタチンの効果を電子顕微鏡によっても評価した。上記（３）で得られた疾患ｉＰＳ細胞由来の骨格筋細胞に、それぞれ基剤（０．３％　ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ））、終濃度１０μＭのロバスタチンを加えて４８時間インキュベートした。その後、細胞を回収し、２％パラフォルムアルデヒドと２％のグルタルアルデヒドで３０分間、固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、サンプルを、ＰＢＳ中の２％のオスミウムで４℃、１時間固定化した。次いで、６０℃で４８時間重合化後、切片を切り出し、透過型電子顕微鏡（日本電子）にて観察した。その結果、ロバスタチン無処置群では、凝集体が多数蓄積した小胞（図６上パネル　黒矢印）が観察されたが、ロバスタチン処置群ではその小胞が消失した（図６下パネル）。
　本発明によれば、ＬＳＤに共通する病態でありながら、従来の酵素補充療法では介入できなかったオートファジーの機能不全を改善することができるので、オートファジーの機能不全による毒性物質の蓄積による細胞の損傷／ストレスや、ミトコンドリアの機能不全等による細胞死が抑制され、生命予後の改善のみならず、骨格筋症状や中枢神経症状の改善も期待できる点で極めて有用である。
　本出願は、２０１８年２月６日付で日本国に出願された特願２０１８−０１９６９８を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含されるものである。

Claims (3)

  1. 　ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬を含有してなるライソゾーム病の予防又は治療剤。
  2. 　ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬がロバスタチンである、請求項１に記載の剤。
  3. 　ライソゾーム病がポンペ病又はＧＮＥミオパチーである、請求項１又は２に記載の剤。
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