TW201630612A - 含有以腺苷ｎ１-氧化物作為有效成分之發炎性疾病治療劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係以提供一種有效果且安全的敗血症、肝炎或發炎性腸疾病等發炎性疾病治療劑作為課題，其可由作為有效成分含有腺苷N1-氧化物或其衍生物所成的發炎性疾病治療劑解決。

Description

含有以腺苷N1-氧化物作為有效成分之發炎性疾病治療劑
本發明係關於使用於治療敗血症或肝炎等發炎性疾病之藥劑，換言之將腺苷N1-氧化物作為有效成分含有所成的發炎性疾病治療劑者。
現今對於敗血症或肝炎等發炎性疾病可達到令人滿足結果的化學療法劑尚未被開發，僅適用類固醇劑、抗發炎劑、血小板凝集抑制劑、血管擴張劑、抗生素等對症療法。該發炎性疾病大多呈現嚴重症狀，對此治療的具有效果且無副作用的安全治療劑之開發被期待者。
已知活體的發炎反應與多數細胞因子(Cytokine)相關。作為該發炎性細胞因子，已知有腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1、IL-6或IL-12等白細胞介素類(interleukin)、干擾素(IFN)-γ等多數，具有與發炎無關之各種藥理作用。其中亦以TNF-α作為具有抗腫瘤活性的細胞因子而被 發現的抗癌劑受到期待，其後被確定與惡液質誘發因子之腫瘤細胞惡液質素(Cachectin)相同。且TNF-α具有對於IL-1等其他細胞因子的產生刺激作用或纖維母細胞之增殖作用、內毒素休克(endotoxic shock)誘發作用、軟骨破壞作用等關節炎的成因作用等，發炎性疾病顯示與TNF-α的異常產生有著因果關係(例如參照特開平10-25251號公報、特表平9-505812號公報、特開平10-130149號公報、國際公開WO03/007974號說明書)。
與TNF-α的異常產生相關的發炎性疾病之中，例如因細菌感染症引起的敗血症而造成的如內毒素休克之急性循環功能不全狀態，導致心跳停止．死亡等最差的嚴重後果。又，已知如類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis；RA)、急性呼吸窘迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrom，以下簡稱為「ARDS」)、自身免疫性或病毒性肝炎的劇烈重症化、發炎性腸疾病等的急性且嚴重病態的發生或惡化亦與TNF-α有關。
近年來，作為發炎性疾病之治療劑，以抑制TNF-α的異常產生為目的，亦有提出抗TNF-α抗體(例如特開平10-25251號公報及特表平9-505812號公報參照)或TNF-α產生抑制劑(例如參照特開平10-130149號公報及國際公開WO03/007974號說明書)皆嘗試使用於發炎性疾病治療上，但這些依舊無法得到令人滿意的結果，且長期投與下亦有副作用之問題。
又，內因性嘌呤核苷之腺苷係結合於細胞表面之受 體，與種種活體反應之調節有關。已知腺苷具有抗發炎作用或缺血障礙抑制作用，但具有強烈的全身性副作用。且腺苷在血液中會快速地埋入血球或血管內皮細胞中被代謝、分解使得該作用在短時間內消失，故僅限於臨床應用。欲彌補該腺苷之缺點，以在發炎部位之腺苷濃度上昇與全身性副作用表現降低之目的，亦進行腺苷對細胞內埋入的阻礙劑之開發(例如參照『日本藥理學雑誌』、122卷、121至134頁(2003年))。
本發明係以提供有效果且安全的發炎性疾病之治療劑為課題。
本發明者欲解決上述課題，進行重複詳細研究結果，發現腺苷N1-氧化物或其衍生物可作為敗血症、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病治療劑使用。
且，本發明者發現含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分之發炎性疾病治療劑，對於稱為發炎性疾病之發病至惡化的效應子分子之發炎性細胞因子的TNF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8或IL-12等發炎性細胞因子類之產生具有抑制作用、及對於賦予發炎性疾病之抑制的抗發炎性細胞因子之IL-10的產生具有增強作用，可使用於發炎性疾病治療用之TNF-α產生抑制劑、IL-1產生抑制劑、IL-4產生抑制劑、IL-5產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-8產生抑制劑或IL-12產生抑制劑或IL-10產 生增強劑之製造上，而完成本發明。
即，本發明為藉由提供含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分之發炎性疾病治療劑而解決上述課題者。
且，本發明亦藉由提供可使用於TNF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8或IL-12之產生抑制劑或IL-10之產生增強劑的製造上的含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分的發炎性疾病治療用劑而解決上述課題者。
對於較佳一形態，本發明的含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分的發炎性疾病治療劑可在添加於以化學物質、紫外線、氧化壓力、毒素、等物理化學性刺激、細菌感染等所引起的皮膚之發炎、過敏性皮膚炎、異位性皮膚炎等皮膚發炎的改善或該發炎所產生的斑點或色素沈澱、皺紋產生等皮膚異常、皮膚粗糙或皮膚老化之抑制、改善作為目的之皮膚外用劑的形態下，使用於化妝品、醫藥部外品或醫藥品之領域中。
本發明的含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分之製劑可有效地預防或治療敗血症、風濕、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病。且，本發明的含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分之製劑可有效地抑制TNF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8或IL-12等發炎性細胞因子類之產生。且，本發明的含有將腺苷N1-氧化物或其衍生物作為有效成分之製劑可有效地增強IL-10之產生。
實施發明的最佳形態
以下，對於本發明的發炎性疾病治療劑做具體說明。
在本發明所謂的發炎性疾病為，該發病或惡化與發炎反應有關之疾病，換言之亦稱為與TNF-α或IL-6等發炎性細胞因子之異常產生有關的發炎性疾病。具體而言為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病、胰臟炎、關節炎、動脈硬化、缺血再灌流傷害、葡萄膜炎、內毒素休克、熱傷、病毒性心肌炎之急性期、特發性擴張型心肌症、SIRS(全身性發炎反應症候群)所引起的對臟器功能不全之移動、多臟器功能不全、溶血性尿毒症候群或出血性大腸炎為主的血管內皮細胞障礙所引起的疾病、高γ-球蛋白血症、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化症、單株抗體B細胞異常症、多株抗體B細胞異常症、心房黏液腫、卡斯托曼症候群(Castleman’s disease)、原發性腎絲球體腎炎、腎膈細胞增殖性腎炎、糖尿病性腎炎等腎炎、停經後骨質疏鬆症、齒肉炎、曬傷、過敏性皮膚炎、異位性皮膚炎等皮膚發炎。另外在本發明所謂的肝炎可舉出酒精性肝炎、病毒性肝炎、藥劑性肝炎、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、肝纖維化、肝硬變及急性肝炎等例示，亦含有心肌梗塞或腦梗塞等血管內皮之發炎所引起的疾病。又，作為發炎性腸疾病可舉出潰瘍性大腸炎、克隆病等例示。
在本發明所謂TNF-α之異常產生為藉由微生物之感染 或含有自身免疫之免疫反應等使得活體內的TNF-α產生亢進，濃度上升至於活體引起發熱、發炎產生．惡化、休克症狀或臟器功能不全等。
本發明的發炎性疾病治療劑含有作為有效成分之腺苷N1-氧化物(CAS No.146-92-9)或其衍生物。該腺苷N1-氧化物不論其來源，可為化學合成者。又，在本發明所謂腺苷N1-氧化物之衍生物為，具有與腺苷N1-氧化物同程度之抗發炎作用的腺苷N1-氧化物分子內之核糖的第3位或第5位羥基上結合1分子以上的葡萄糖等糖類或磷酸等的物質(以下有時稱為「腺苷N1-氧化物類」)。具體可舉出例如結合1分子或2分子以上之葡萄糖的3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物或5’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物等α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物，或結合1分子或2分子以上磷酸的腺苷N1-氧化物5’-磷酸等腺苷N1-氧化物磷酸、腺苷N1-氧化物5’-二磷酸等腺苷N1-氧化物二磷酸、腺苷N1-氧化物5’-三磷酸等腺苷N1-氧化物三磷酸等。由作用效果之觀點來看，以腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸為佳，以腺苷N1-氧化物及α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物為較佳，以腺苷N1-氧化物為特佳。作為α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物，以3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物因比5’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物更具有強抗發炎作用故較佳。又，這些化合物若為安全性、發炎性疾病之治療效果，對於TNF-α或IL-6為主的發炎性細胞因子類的產生抑制作用沒有影響者即可，可含 有來自製造原料之成分或在合成過程所產生的副產物即可，作為投與於血管內之製劑時的僅可使用高純度者，一般以固體物換算下，以純度95質量%以上為佳，以98質量%以上為較佳，以99質量%(以下若無特別限定在本說明書中的質量%以「%」表示)以上為特佳。又，注射投與以使用血管內投與時，當然使用實質上不含微生物或發熱原(發熱物質)者。
本發明的發炎性疾病治療劑一般以注射用或經口用醫藥製劑之形態提供。調製注射劑時，含有有效成分之腺苷N1-氧化物類的液劑、乳劑及懸濁劑經殺菌後實質上不含發熱原(發熱物質)，且與血液為等張者為佳。於這些形態下成形時，作為溶劑使用於此領域中慣用者即可，例如舉出純化水、生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、乳酸配合林格氏液等，亦可使用乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醯醇、聚氧化異硬脂醯醇等。
本發明的注射劑形態之發炎性疾病治療劑為提供一種同時添加一般作為有效成分之腺苷N1-氧化物類與製劑學上可被容許的1種以上的添加劑的製劑。本發明的發炎性疾病治療劑為使用該技術領域中一般被使用的添加劑。作為該製劑用添加劑，可舉出通常使用於一般注射劑的等張化劑、緩衝劑、pH調整劑、稀釋劑等。
作為等張化劑，例如可舉出葡萄糖、麥芽糖、α,α-海藻糖、山梨糖醇、甘露醇等糖類或糖醇類、甘醇、丙二 醇、聚乙二醇等多元醇類、氯化鈉等電解質等。
作為緩衝劑，例如可舉出檸檬酸緩衝劑、乙酸緩衝劑、磷酸緩衝劑、酒石酸緩衝劑等。
作為pH調節劑，可使用一般使用於注射劑之pH調節劑即可。具體可舉出乙酸、乳酸、磷酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、鹽酸、葡萄糖酸、硫酸等酸性物質或氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等鹼性物質。又，亦可使用甘胺酸或組胺酸等胺基酸類。
除上述添加劑以外，亦可添加抗菌劑、血管擴張劑、抗生素、非類固醇系抗發炎劑、類固醇系抗發炎劑、昇壓劑、血液凝固阻礙劑、無痛化劑、抗TNF-α抗體、腺嘌呤攝取阻礙劑(例如參照非專利文獻1)、維他命等對於TNF-α與發病至惡化相關的疾病之臨床症狀改善有效之醫藥成分。
本發明的注射劑形態之發炎性疾病治療劑為可依據常法製造者即可。具體為例如首先舉出於未含發熱物質(pyrogen)之溶劑中，溶解有效成分之腺苷N1-氧化物類與添加劑成分。這些成分之混合順序雖無特限定，但僅可同時混合所有含有成分即可，或先僅溶解一部份成分，其後溶解剩下成分亦可。其次將所得之溶液進行滅菌。滅菌法雖無特別限定，一般使用過濾滅菌、加壓熱滅菌、加熱滅菌等方法。經滅菌之製劑，例如僅填充於安培管等容器即可。
且，本發明的發炎性疾病治療劑亦可使用時溶解以固體製劑的形態下提供。該固形製劑為將上述溶液狀態的注射用製劑藉由凍結乾燥或減壓乾燥等公知乾燥方法進行乾燥，使其成為粉末狀或顆粒狀，封入安培管等容器中調製即可，使用時溶解於滅菌水、生理食鹽水或輸液等，將腺苷N1-氧化物類之濃度於使用時溶解至例如腺苷N1-氧化物為0.1至10%後投與即可。
本發明的發炎性疾病治療劑於注射劑時，一般例如投與於靜脈內、動脈內、腹腔內等即可，配合症狀亦可投與於肌肉內、皮下、皮內等，亦可與輸液混合後進行靜脈內投與。對於可與本發明的發炎性疾病治療劑進行混合之輸液並無特別限定，僅使用購得之輸液即可。具體可舉出葡萄糖注射液、木糖醇注射液、D-甘露醇注射液、果糖注射液、生理食鹽水、林格氏液、維他命液、胺基酸注射液、電解質液等。又，配合成為本發明之發炎性疾病治療劑的投與對象之疾病或其症狀，可隨意選擇眼藥水、點鼻、經鼻、經肺等投與途徑。
且本發明的發炎性疾病治療劑如後述實驗所示，對於各種發炎性疾病，可藉由經口投與而與注射投與有著同樣效果，故可在一般經口用醫藥製劑形態下提供。該製劑係使用一般醫藥品的製造上所使用的填充劑、增量劑、結合劑、保濕劑、崩壞劑、表面活性劑、滑澤劑、賦形劑等而調製。作為該醫藥製劑，各種形態可配合治療目的而選擇，作為該代表例子，可舉出錠劑、丸劑、散劑、液劑、 懸濁劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑等。於錠劑形態下成形時，作為載體可使用在該領域中過去廣泛被使用的已知之各種形態。作為該例子，例如可隨意使用乳糖、白糖、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖等糖類、澱粉、氯化鈉、脲、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、矽酸等賦形劑、水、乙醇、丙醇、明膠溶液、羧基甲基纖維素、蟲膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等結合劑、乾燥澱粉、海藻酸鈉、寒天粉末、昆布糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚環氧乙烷山梨糖醇脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、澱粉、乳糖等崩壞劑、白糖、脂臘、可可脂、氫化油等崩壞抑制劑、第4級銨鹽基、月桂基硫酸鈉等吸收促進劑、甘醇、澱粉等保濕劑、澱粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠體狀矽酸等吸著劑、純化滑石、硬脂酸鹽、硼酸末、聚乙二醇等滑澤劑等。且錠劑可為視必要施予一般塗敷的錠劑，例如可為糖衣錠、明膠被包錠、腸溶被錠、薄膜塗敷錠或雙重錠、多層錠。於丸劑形態下成形時，作為載體可使用在該領域中過去公知者。具體而言，例如可舉出葡萄糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖等糖類、澱粉、可可脂、硬化植物油、高嶺土、滑石等賦形劑、阿拉伯樹膠粉末、黃著膠粉末、聚三葡萄糖、明膠、乙醇等結合劑、昆布糖、寒天等崩壞劑等。於塞劑形態成形時，作為載體可使用過去公知者。作為該例子，例如可舉出聚乙二醇、高級醇、高級醇的酯類、明膠、半合成甘油酯等。膠囊劑可依據一般方法，混合有效成分化合物與上述例示的各種載體後填充 於硬質明膠膠囊、軟質膠囊等而調製。進一步視必要與著色劑、保存劑、香料、風味劑、甜味劑等或其他注射劑的情況相同下將醫藥成分隨意含於醫藥製劑中。
且，本發明的發炎性疾病治療劑係以添加健康補助食品等飲食品的形態下提供。該飲食品使用腺苷N1-氧化物類與食品及食品添加物而調製。此情況的形態可依據該目的而選擇，作為該代表性者，可舉出錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸濁劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑等。又，可隨意為點心．麵包、穀類或畜肉等加工品、甜味料．調味料、清涼飲料、醇飲料、乳飲料等一般飲食品的形態。
且本發明的發炎性疾病治療劑係以添加於化妝品、醫藥部外品或醫藥品等皮膚外用劑的形態下提供。該皮膚外用劑一般添加於化妝品、醫藥部外品或醫用的皮膚外用劑之基劑成分中使用即可。具體為例如可將保濕劑、抗氧化劑、油性成分、抗紫外線劑、紫外線反射劑、界面活性劑、抗菌劑、增黏劑、緩衝劑、pH調整劑、糖類、糖醇類、粉末成分、色劑、香料、水性成分、水或醇類等溶劑、各種皮膚營養劑、動植物萃取物等基劑成分視必要適宜添加。作為添加本發明的發炎性疾病治療劑之皮膚外用劑使用時的形態，僅在皮膚可發揮抗發炎效果的形態即可，並無特別限定，例如可為乳霜、軟膏、乳液、洗劑(lotion)、化妝水、乳膠、慕斯、封包、洗髮精、潤絲精、育毛劑、沐浴劑、牙膏等。
本發明的發炎性疾病治療劑當然必須至少含有達到目 的藥效的有效量之腺苷N1-氧化物類，一般注射劑的情況時，腺苷N1-氧化物類的含有量對於腺苷N1-氧化物而言為0.01至10%，以0.1至2%為佳。經口用劑的情況時為1至90%，以10至90%為佳。錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸濁劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑等形態的飲食品之情況時以1至90%為佳，以10至90%較佳，一般飲食品形態的情況時以0.1至90%為佳，以1至10%為較佳。又，添加於皮膚外用劑時，以0.001至10%為佳，以0.01至1%為較佳。
本發明的發炎性疾病治療劑之投與量雖取決於作為對象之患者的症狀或年齡等，一般於注射投與之情況時，在1天中體重每1kg下，對於腺苷N1-氧化物為1至500mg，較佳為以10至300mg的範圍投與。又，經口攝取的情況為1天中體重每1kg下，對於腺苷N1-氧化物為1至1,000mg，較佳為30至1,000mg，較佳為100至800mg的範圍下攝取即可。又，作為皮膚外用劑的形態時，對於腺苷N1-氧化物為0.0005至5mg/cm2，較佳為0.005至0.5mg/cm2之範圍下投與即可。
且，本發明的發炎性疾病治療劑亦可含有投藥單位形態之藥劑。所謂該投藥形態之藥劑，表示本發明的有效成分之腺苷N1-氧化物類，例如含有相當於每1天的用量或其整數倍(至4倍)或約數(至1/4)的量，適合於投與之可物理性分離的劑形之意思。
本發明含有將腺苷N1-氧化物類作為有效成分所成之 發炎性疾病治療劑，可抑制具有亢進發炎反應作用的發炎性細胞因子類之TNF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12及IFN-γ的產生，故該治療劑可作為TNF-α產生抑制劑、IL-1產生抑制劑、IL-4產生抑制劑、IL-5產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-8產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IFN-γ產生抑制劑而使用發炎性疾病的治療。且本發明的發炎性疾病治療劑可增強具有抑制發炎反應的作用之IL-10的產生，故作為IL-10產生增強劑而使用於發炎性疾病的治療上。且本發明的發炎性疾病治療劑因可抑制血管內皮細胞障礙、抑制血管內皮細胞的組織因子或細胞黏著因子於細胞表面的表現，並阻礙血栓形成，故可作為血管內皮細胞障礙抑制劑、組織因子表現抑制劑、細胞黏著因子表現抑制劑或血栓形成阻礙劑而使用於發炎性疾病的治療。
本發明的含有將腺苷N1-氧化物類作為有效成分所成的發炎性疾病治療劑為抑制具有使發炎反應亢進作用之TNF-α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12及IFN-γ的產生，可增強具有抑制發炎反應作用的IL-10之產生，故不僅可作為敗血症、肝炎、發炎性腸疾病，與這些發炎性細胞因子在發病或惡化相關的類風濕關節炎、ARDS、胰臟炎、關節炎、動脈硬化、缺血再灌流傷害、葡萄膜炎、熱傷、病毒性心肌炎的急性期、特發性擴張型心肌症、DIC(播種性血管內凝固症候群)、由SIRS(全身性發炎反應症候群)至臟器功能不全之移動、多臟器功能不 全、溶血性尿毒症候群或出血性大腸炎為主的血管內皮細胞障礙所引起的疾病、高γ球蛋白血症、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化症、單株抗體B細胞異常症、多株抗體B細胞異常症、心房黏液腫、卡斯托曼症候群(Castleman’s disease)、原發性腎絲球體腎炎、腎膈細胞增殖性腎炎、糖尿病性腎炎等腎炎、化學物質、紫外線、氧化壓力等物理化學的刺激、細菌感染等所引起的皮膚發炎、過敏性皮膚炎、異位性皮膚炎等皮膚發炎、停經後骨質疏鬆症、糖尿病、齒周病等發炎性疾病或該疾病所引起的臨床症狀治療劑、改善劑有利地利用。且例如如『醫學上的癢』、236卷、4號、第243~248頁(2011年)所記載，於藉由代謝症候群的患者或該預備軍的脂肪組織或血管內皮等所認定的全身性輕度發炎，當組織接受障礙時所釋出的內在性配體，介著病原體感測器刺激誘導出代謝症候群之惡化或動脈硬化、心肌梗塞、腦梗塞等血管系疾病的病態形成之基礎病態的全身性慢性發炎反應等皆可有利地利用。
本發明的發炎性疾病治療劑不僅使用於進行中之發炎性疾病的輕減或惡化抑制的目的上，可作為使用於抑制發炎性疾病的發生之預防劑上使用。
以下對本發明之實驗做說明。
<實驗1>
<引起細菌性休克的腺苷N1-氧化物投與之影響1>
將對於敗血症之腺苷N1-氧化物投與的影響，使用作為人類敗血症所引起的細菌性休克的模型而廣泛被使用的脂多醣(LPS)誘發內毒素休克小老鼠(例如，『Circulation』、111卷、97至105頁(2005年)參照)進行調查。即，將BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性小老鼠)15隻隨意地分為各5隻一群的3群(實驗群1至3)，對於所有的小老鼠進行溶解於磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)的來自大腸菌(055：B5)之LPS(Sigma販賣)的15mg/kg體重腹腔內投與(實驗群1至3)。其中1群5隻進行LPS投與及同時進行溶解於PBS之腺苷N1-氧化物(股份有限公司林原生物化學研究所調製，以下有時簡稱為「ANO」)以靜脈內(液量：0.2mL/隻)投與至15mg/kg體重(實驗群2)。對於1群5隻進行LPS投與及同時進行溶解於PBS之腺苷N1-氧化物以靜脈內(液量：0.2mL/隻)投與至45mg/kg體重(實驗群3)。對於剩下的1群5隻進行LPS投與及同時進行PBS的0.2mL/隻靜脈內投與(實驗群1)。對於各群，以肉眼確認LPS投與後至7至43小時的小老鼠生存數，求得各群生存率(%)。結果如表1所示。且小老鼠的生存率(%)為各觀察時間中小老鼠之生存數除以實驗開始時的小老鼠之生存數並乘以100倍。即，在以下實驗所使用的腺苷N1-氧化物皆使用藉由下述方法由股份有限公司林原生物化學研究所所調製者。
<腺苷N1-氧化物的調製>
將腺苷(Aldrich販賣(商品編碼：A9251-25G))20g分散於乙酸1L，加入過氧化氫水100mL，在室溫下進行5天攪拌。加入5%鈀碳(Kawaken Fine Chemicals販賣)5g，分解過剩過氧化氫後，過濾取出鈀碳，減壓下乾燥固化，加入乙醇溶解結晶，藉由過濾得到腺苷N1-氧化物的粗結晶。將該粗結晶加熱溶解於乙醇2L，經過濾後冰使其冰冷，重複2次再結晶步驟，調製出純度99.5%的腺苷N1-氧化物8g。
由表1可得知，進行LPS之15mg/kg體重腹腔內投與及同時投與PBS的群(實驗群1)中，投與後19小時以後，經時性小老鼠的生存率會降低，過43小時後降低至40%。相對於此，進行LPS之15mg/kg體重腹腔內投與及同時進行腺苷N1-氧化物的15mg/kg體重投與之群(實驗群2)或進行45mg/kg體重投與之群(實驗群3)中，與進行LPS投與及同時投與PBS的群(實驗群1)相比，取決於腺苷N1-氧化物之投與量的生存率降低的抑制 被確認。該結果為表示腺苷N1-氧化物可作為有效抑制敗血症所引起的細菌性休克的敗血症預防劑或治療劑使用。即，對於該實驗系統，確認取決於腺苷N1-氧化物的投與量，投與LPS至誘導細菌性休克後死亡的個體的時間較為遲延。敗血症的情況下，細菌性休克至死亡的直接要因被認為因急速多臟器功能不全的進行而引起。本實驗中，藉由腺苷N1-氧化物的投與，自LPS投與至死亡個體產生的時間受到遲延之原因，被推測為多臟器功能不全的進行受到抑制，故腺苷N1-氧化物的投與對於得到使用於敗血症的治療之既存對症療法劑對於多臟器功能不全可發揮治療效果上寬裕的必要時間亦為有效。
<實驗2>
<對於小老鼠腹腔內巨噬細胞的TNF-α產生之腺苷N1-氧化物的影響1>
實驗1中，確認藉由腺苷N1-氧化物的投與可抑制LPS投與小老鼠的細菌性休克，故本實驗中對於藉由腺苷N1-氧化物的細菌性休克抑制之機制做調查。即，已知人類敗血症所引起的細菌性休克中，藉由細菌的LPS之產生所誘導的TNF-α為效應子分子(例如參照『Journal of Immunology』、187卷、3-5號、346-356頁(1993年))。而使用作為人類敗血症所引起的細菌性休克之活體內模型所使用的小老鼠腹腔內巨噬細胞(例如參照『The Journal of Immunology』、164卷、9號、1013至1019頁(2000 年))，對腺苷N1-氧化物在TNF-α產生之影響進行調查。已知小老鼠腹腔內巨噬細胞對LPS產生反應而產生TNF-α，該TNF-α之產生與IFN-γ共存下可進一步增強。推測細菌性休克不僅誘導TNF-α，亦誘導IFN-γ等其他發炎性細胞因子類，故本實驗中，在考慮與細菌性休克之病態相近的IFN-γ之共存下進行實驗。腺苷N1-氧化物對水之溶解性比腺苷高，故溶解於PBS溶解後使用。
依據常法，於BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的7至10週齡之雌性老鼠)之腹腔內投與2mL之4%硫醇乙酸鹽培養基(Thioglycollate broth)3天後，以含有10容積%牛胚胎血清(FCS)之RPMI-1640培養基(Sigma販賣之商品名『RPMI-1640 Medium』)(以下稱為「含有10%FCS之RPMI-1640培養基」)5mL洗淨腹腔內的操作重複4次，採出腹腔內浸潤細胞。將該細胞以含有10%FCS之RPMI-1640培養基進行2次洗淨，於相同培養基中懸濁。將細胞懸濁液添加於組織培養用培養皿(BD FALCON販賣之製品編碼「353003」)，於5容積%CO2恆溫培養內，在37℃進行1.5小時恆溫培養，將腹腔內浸潤巨噬細胞附著於培養皿上。除去培養液後以含有10%FCS之RPMI-1640培養基洗淨培養皿2次，除去未附著之細胞後，以Cell Scrapers回收附著於培養皿之細胞。將回收之細胞以含有10%FCS之RPMI-1640培養基進行洗淨後，懸浮於含有50μM氫硫乙醇之含有10% FCS的RPMI-1640培養基，調製出小老鼠腹腔內巨噬細胞。將小 老鼠腹腔內巨噬細胞以含有10%FCS之RPMI-1640培養基懸浮成1×106個/mL，於96微格盤(Becton Dickinson販賣之商品名『96 well組織培養用微培養皿353075』)播種至5×104個/50μL/格。在LPS(2μg/mL)與小老鼠IFN-γ(10IU/mL)之共存下，將於各格以PBS稀釋至如表2所示終濃度的腺苷N1-氧化物添加成50μL/格，繼續培養1天後，取出培養澄清液。
測定藉由固相酵素抗體法(ELISA)所採取之培養澄清液中的TNF-α量(實驗群2至5)。作為對照組，LPS與小老鼠IFN-γ之共存下，僅將含有10%FCS之RPMI-1640培養基添加成50μL/格，繼續培養2天後，取出培養澄清液，同樣地測定TNF-α量(實驗群1)。又，將各格活細胞數以螢光藍色染劑(Alamar Blue)法進行測定，計算出將對照組的活細胞數作為100(%)時的相對值作為細胞生存率(%)。將結果合併表2所示。且，試驗為對各實驗群使用3格。TNF-α之測定係將販賣的老鼠抗小老鼠TNF-α抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『老鼠抗小老鼠/老鼠TNF抗體(商品編碼：551225)』)作為固相抗體，將販賣的生物素標識老鼠抗小老鼠TNF-α抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『生物素標識老鼠抗小老鼠TNF抗體(商品編碼：554415)』)作為二次抗體，使用藉由HRPO標識鏈霉親和素進行測定之ELISA。
由表2得知，在LPS與IFN-γ之共存下，僅加入含有10%FCS之RPMI-1640培養基進行培養的小老鼠腹腔內巨噬細胞中，TNF-α之產生被誘導(實驗群1)。相對於此，在LPS與IFN-γ的共存下，添加腺苷N1-氧化物之情況(實驗群2至5)，在腺苷N1-氧化物濃度在0.063μM以上時依據腺苷N1-氧化物的添加量，TNF-α之產生顯著被抑制(實驗群4及5)。本實驗所使用的腺苷N1-氧化物濃度對於細胞之生存率並未有影響。
<實驗3>
<對於小老鼠腹腔內巨噬細胞的TNF-α及IL-6產生之腺苷N1-氧化物的影響2>
已知巨噬細胞使用稱為外來病原性微生物之辨識體(Toll like receptor於以下稱為「TLR」)的受體，LPS以稱為TLR4之受體辨識。實驗2中，確認藉由成為細菌性休克之原因物質的來自革氏陰性菌之LPS刺激，由小老鼠腹腔內巨噬細胞之TNF-α產生可藉由腺苷N1-氧化物而有效地受到抑制。而本實驗中以TLR4以外的受體辨識之 革氏陰性菌以外而成為發炎性疾病之病因的來自微生物的成分之刺激，其所誘發的來自小老鼠腹腔內巨噬細胞之TNF-α產生受到腺苷N1-氧化物之影響進行調查。即，實驗2中，取代使用於巨噬細胞之刺激的LPS，添加藉由TLR1/2辨識之來自革氏陽性菌的脂蛋白之Pam3CSK4((Palmitoyl-Cys((RS)-2,3-di(palmitoyloxy)-propyl)-Ser-Lys-Lys-Lys-OH)、Bachem公司販賣)的最終濃度2.5μg/mL，將藉由TLR2辨識之酵母細胞壁成分的Zymosan A(Sigma販賣)之最終濃度100μg/mL，藉由TLR3辨識來自病毒之成分的代替品而廣泛被使用的Poly I：C(CALBIOCHEM公司販賣)之最終濃度50μg/mL，或介著出血性大腸菌或志賀氏菌(Shigella)產生之出血性大腸炎的原因物質之一的細胞表面之醯基鞘鞍醇三己糖(Gb3；globotriosyl ceramide)受體並結合，誘發出埋入細胞內的發炎性細胞因子之產生的腸毒素I(Nacalai tesque股份有限公司販賣)，刺激巨噬細胞以外，以與實驗2相同方法下將巨噬細胞在5容積%CO2恆溫培養內，進行37℃之24小時培養後，將培養澄清液中之IL-6含量以ELISA進行測定。又，IL-6的測定為將販賣的老鼠抗小老鼠IL-6抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『老鼠抗小老鼠IL-6抗體(商品編碼：554400)』)作為固相抗體，販賣的生物素標識老鼠抗小老鼠IL-6抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『生物素標識老鼠抗小老鼠IL-6抗體(商品編碼：554402)』)作為二次抗體，使用藉由 HRPO標識鏈霉親和素進行測定之ELISA。結果如表3所示。
由表3得知，在濃度0.5及1μM之腺苷N1-氧化物共存下，藉由LPS刺激之巨噬細胞與在腺苷N1-氧化物非共存下進行培養以LPS刺激的巨噬細胞相比較，IL-6及TNF-α之產生受到抑制。在濃度0.5及1μM之腺苷N1-氧化物的共存下，藉由Pam3CSK4、Zymosan A或Poly I：C 刺激之巨噬細胞亦與藉由LPS刺激的巨噬細胞同樣地，與在腺苷N1-氧化物非共存下，以各刺激物質進行刺激之巨噬細胞相比，IL-6的產生受到抑制。以Zymosan A刺激時，在腺苷N1-氧化物之濃度為0.2μM之情況下，亦確認到IL-6之產生受到抑制的傾向。以這些物質刺激時，由巨噬細胞之TNF-α的產生並未被確認。且，在濃度0.0.5或1μM的腺苷N1-氧化物共存下，藉由腸毒素I刺激之巨噬細胞亦與藉由LPS刺激之巨噬細胞同樣地，與在腺苷N1-氧化物非共存下以腸毒素I刺激的巨噬細胞相比，IL-6及TNF-α的產生受到抑制。在TNF-α的濃度0.2μM之腺苷N1-氧化物共存下產生亦受到抑制。該結果為腺苷N1-氧化物不僅受到如來自革氏陰性菌之LPS刺激，由介著TLR4受體的巨噬細胞之IL-6及TNF-α的產生受到抑制，由介著其他TLR4以外之受體的巨噬細胞之IL-6及TNF-α的產生亦受到抑制，故表示可作為介著革氏陽性菌、酵母或病毒等病原性微生物的感染所引起的TLR4以外的受體之發炎所造成的發炎性疾病之治療劑、預防劑為有用。又表示腺苷N1-氧化物亦可作為溶血性尿毒症候群或出血性大腸炎等發炎性疾病之治療劑、預防劑使用。
<實驗4>
<對小老鼠巨噬細胞樣細胞株之TNF-α產生的腺苷N1-氧化物及腺苷添加之影響>
與小老鼠腹腔內巨噬細胞同樣地，使用作為人類敗血症 中之內毒素休克的活體內模型所使用的小老鼠巨噬細胞樣細胞株(大日本住友製藥公司販賣之細胞名『RAW264.7』)(以下稱為「RAW264.7細胞」)，對於腺苷N1-氧化物之TNF-α產生的影響做調查。又，腺苷N1-氧化物為經由腺苷(以下有時簡稱為「AN」)成為肌苷(以下有時簡稱為「IN」)或經由腺苷磷酸被代謝，故對於腺苷對RAW264.7細胞中之TNF-α產生的影響做調查。且在細菌性休克之發病中，除TNF-α以外，已知與IL-6或IL-12之發炎性細胞因子有關，故本實驗中，亦對於IL-6的產生之腺苷N1-氧化物的影響做調查。RAW264.7細胞以含有10%FCS之RPMI-1640培養基(Sigma販賣之商品名『RPMI-1640 Medium』)進行繼代培養使用於試驗。回收RAW264.7細胞，以含有10%FCS之RPMI-1640培養基懸浮1×106個/mL，於96微格盤(Becton Dickinson販賣之商品名『96 well組織培養用微培養皿353075』)進行5×104個/50μL/格播種。在LPS(2μg/mL)共存下，於各格添加以PBS稀釋至表3所示最終濃度的腺苷N1-氧化物，繼續進行1天培養後，取出培養澄清液。
測定藉由ELISA取出的培養澄清液中之TNF-α(實驗群2至8)。合併之後測定培養澄清液中之IL-6。再取代腺苷N1-氧化物添加腺苷至表4所示濃度後培養RAW264.7細胞，進行TNF-α及IL-6之測定(實驗群9至15)。作為對照組，在LPS之共存下僅加入含有10%FCS之RPMI-1640培養基進行培養(實驗群1)，測定澄清液中 之TNF-α及IL-6量。且將各格的活細胞數藉由螢光藍色染劑(Alamar Blue)法進行測定，求得當對照組的活細胞數作為100(%)時的相對值作為細胞生存率(%)。這些結果合併如表4所示。且，TNF-α的測定使用與實驗2相同方法。又，IL-6的測定使用於實驗3之相同方法。
如表4所示，在LPS之共存下進行培養的RAW264.7細胞中，確認TNF-α及IL-6的產生(對照組，實驗群1)。相對於此，同時添加LPS與腺苷N1-氧化物進行培養時，確認TNF-α及IL-6的產生之抑制取決於腺苷N1-氧化物的濃度(實驗群2至8)。又，同時添加LPS與腺苷時，雖比添加腺苷N1-氧化物時更弱，但確認TNF-α及 IL-6的產生之抑制取決於腺苷之濃度(實驗群9至15)。由表4所示測定值得知，將對照之TNF-α濃度抑制至50%時，求得必要腺苷N1-氧化物或腺苷之濃度(IC50)時，腺苷N1-氧化物成為1.2μM，腺苷成為22μM。使用於試驗的濃度中，未確認到藉由添加腺苷N1-氧化物的RAW264.7細胞之細胞生存率的降低。又，添加腺苷時，依添加量而降低細胞生存率。
實驗2至4的結果顯示，在實驗1經確認的腺苷N1-氧化物投與，對於細菌性休克抑制機制之一為發炎性細胞因子之TNF-α由巨噬細胞產生之抑制可能性。且亦顯示藉由腺苷N1-氧化物之細菌性休克抑制，可能與IL-6的產生之抑制作用相關。且這些結果表示腺苷N1-氧化物可作為由LPS所誘導之巨噬細胞的TNF-α及IL-6產生之抑制劑使用。且結論為與上述IC50做比較時，腺苷N1-氧化物與腺苷相比較，具有數倍強的TNF-α及IL-6產生抑制作用。
<實驗5>
<藉由腺苷N1-氧化物之由巨噬細胞系細胞的TNF-α產生抑制之機制解析>
由實驗2至4得知，腺苷N1-氧化物可抑制由LPS所誘導之巨噬細胞的TNF-α及IL-6產生，故本實驗中，欲更詳細解析藉由腺苷N1-氧化物之巨噬細胞系細胞的TNF-α產生抑制之機制，調查腺苷N1-氧化物對於腺苷受 體A1R、A2AR、A2BR及A3R之反應性。即，將人類單球系細胞株THP-1(股份有限公司林原生物化學研究所所有)以含有10%FCS之RPMI-1640培養基懸浮至1×106個/mL，於96微格盤(Becton Dickinson販賣之商品名『96 well組織培養用微培養皿353075』)播種至1×105個/100μL/格。其後將腺苷拮抗劑之DPCPX(Sigma販賣)、ZM241385(TOCRISBioscience販賣)、MRS1754(Sigma販賣)及MRS1220(TOCRISBioscience販賣)中任一以含有10%FCS之RPMI-1640培養基進行稀釋至如表5所示濃度，添加50μL/格，於5容積%CO2恆溫培養內在37℃進行30分鐘之恆溫培養。其次，添加以PBS稀釋至如表5所示最終濃度的腺苷N1-氧化物50μl/格，再於各格添加LPS(25μg/mL)與人類IFN-γ(500IU/mL)至100μl/格，於5容積%CO2恆溫培養內在37℃進行20小時培養後，取出培養澄清液，藉由ELISA測定培養澄清液中之TNF-α量。結果合併如表5所示。且，DPCPX為對於腺苷受體A1R為專一性之拮抗劑，以8-環戊基-1,3-二丙基黃嘌呤(8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine)表示之化合物。ZM241385為對於腺苷受體A2AR為專一性之拮抗劑，以(4-(2-〔7-胺基-2-(2-呋喃基)〔1,2,4〕三唑並〔2,3-a〕〔1,3,5〕-三嗪-5-基胺基〕乙基)酚(4-(2-〔7-Amino-2-(2-furyl)〔1,2,4〕Triazolo-〔2,3-a〕〔1,3,5〕-Triazin-5-ylamino〕ethyl)phenol)表示之化合物。MRS1754為對於腺苷受體A2BR為專一性之拮抗劑， 以8-〔4-〔((4-氰苯基)胺基甲醯乙基)-醯基〕苯基〕-1,3-二(正丙基)黃嘌呤(8-〔4-〔((4-cyanophenyl)carbamylethyl)-oyl〕phenyl〕-1,3-di(n-propyl)xanthine)所示化合物。又，MRS1220為對腺苷受體A3R為專一性之拮抗劑，N-〔9-氯-2-(2-呋喃基)〔1,2,4〕三唑並〔1,5-c〕喹唑啉-5-基〕苯(N-〔9-Chloro-2-(2-furanyl)〔1,2,4〕Triazolo-〔1,5-c〕quinazolin-5-yl〕benzene)所示化合物。
由表5得知，在LPS及人類IFN-γ之共存下產生THP-1之TNF-α(實驗群1)可藉由腺苷N1-氧化物的添 加而顯著抑制其產生(實驗群2)。藉由腺苷N1-氧化物添加之TNF-α產生抑制，藉由對於腺苷受體A1R為專一性之拮抗劑的DPCX、對於腺苷受體A2AR為專一性之拮抗劑的ZM241385及對於腺苷受體A2BR為專一性的拮抗劑之MRS1754的前處理，幾乎完全回復(實驗群3至14)。在對於腺苷受體A3R為專一性之拮抗劑的MRS1220之前處理中，並無確認到藉由腺苷N1-氧化物添加之TNF-α產生抑制的回復。又，在本實驗之條件下，並無確認到對THP-1細胞之增殖的任何影響(實驗群15至18)。該結果顯示藉由腺苷N1-氧化物之TNF-α的產生抑制與介著PKA(cAMP依賴性蛋白質磷酸化酵素)的訊息傳達系統有關。且已知藉由腺苷受體中對於腺苷之親和性程度或細胞內之環狀AMP增減作用的相異，確認存在A1R、A2AR、A2BR及A3R之4種類，藉由腺苷之抗發炎作用主要與A2AR及A2BR相關，有時與A3R相關。又，已知腺苷N1-氧化物的單磷酸化合物藉由介著A2AR之訊息傳達系統作用於細胞(例如『Evid.Based Complement Alternat Med.』的第1至6頁(2007年))，得到藉由本發明的腺苷N1-氧化物之TNF-α產生抑制，與腺苷同樣地與訊息傳達系統相關的結論。在本實驗所使用的MRS1220中，未確認到腺苷N1-氧化物對於抗發炎作用之腺苷受體A3R的關係。雖無具體數據，但在其他實驗中，確認對於具有腺苷N1-氧化物之人類正常皮膚角質細胞(NHEK細胞)的增殖抑制作用與腺苷受體A3R相關，故 腺苷N1-氧化物的抗發炎作用之表現亦可能與腺苷受體A3R相關。
<實驗6>
<對人類血管內皮細胞的發炎反應之腺苷N1-氧化物及腺苷添加的影響2>
已知改為在實驗4所使用的來自小老鼠之RAW264.7細胞，在本實驗於IL-1β及IFN-γ共存下，添加LPS進行培養後誘導TNF-α產生，使用作為人類敗血症所引起的內毒素休克之活體內模型所使用的人類臍帶靜脈內皮細胞(Kurabo股份有限公司販賣之Human umbilical vein endothelial cell，以下稱為「HUVEC細胞」)，對TNF-α產生的腺苷N1-氧化物及腺苷添加之影響做調查。且亦對於發炎反應，對與成為症狀惡化的原因之一的血栓形成相關的組織因子(Tissue Factor)及細胞黏著因子(VCAM-1)的表現造成的影響做調查。即，使用塗敷去端肽膠原(atelocollagen,KOKEN公司販賣之(商品編碼IPC-50))的75cm2培養燒瓶(CORNING公司販賣)，進行培養的HUVEC細胞，使用0.05%胰蛋白酶/EDTA(GIBCO公司販賣)由燒瓶剝開後，依據常法以含有10%FCS之RPMI-1640培養基進行3次洗淨後，使用血管內皮細胞增殖用培養基(Kurabo公司販賣之商品名『HuMedia EG2 medium』，商品號碼KE-2150S)，懸浮成4×104細胞/mL，於經明膠塗敷之96格複合盤(IWAKI SCITECH公司販賣之商品名『明膠塗敷微培養皿96格附蓋子』)上播種至200μL/格，於5容積%CO2恆溫培養內，在37℃進行培養至融合(confluent)後提供於以下實驗。
<實驗6-1：對TNF-α、IL-6之產生的影響>
對於達到融合(confluent)之HUVEC細胞，各添加50μL/格的將溶解於血管內皮細胞增殖用培養基至最終濃度如表6所示的濃度之腺苷(和光純藥工業股份有限公司販賣，試藥級)或腺苷N1-氧化物溶液、與血管內皮細胞增殖用培養基中溶解至最終濃度為LPS(10μg/mL)/人類IL-1β(2ng/mL)/人類IFN-γ(500IU/mL)的溶液，於5容積%CO2恆溫培養內進行在37℃之24小時培養後，使用ELISA進行培養澄清液中之TNF-α的測定。作為對照組，取代腺苷或腺苷N1-氧化物溶液添加血管內皮細胞增殖用培養基50μL/格以外，在相同條件下培養後，回收培養澄清液，以ELISA法進行澄清液中的TNF-α之測定。結果合併於表6。
由表6的結果得知，將HUVEC細胞在IL-1β及IFN-γ共存下，添加LPS進行培養時，確認依腺苷及腺苷N1-氧化物的濃度之TNF-α的產生抑制。依據該結果，對於兩化合物之TNF-α產生抑制的IC50進行比較時，對於腺苷N1-氧化物為0.97μM而言腺苷為15.2μM，得到該TNF-α產生抑制作用係以腺苷N1-氧化物比腺苷更強約16倍的結果。
<實驗6-2：對組織因子之表現的影響>
對於達到融合之HUVEC細胞，各添加50μL/格的溶解於血管內皮細胞增殖用培養基至最終濃度如表6所示濃度的腺苷(和光純藥工業股份有限公司販賣的試藥級)或腺苷N1-氧化物，於5容積%CO2恆溫培養內進行在37℃之30分鐘培養。其後於血管內皮細胞增殖用培養基調製至最終濃度為LPS(10μg/mL)/IL-1β(2ng/mL)/IFN-γ(500IU/mL)後以50μL/格添加，於5容積%CO2恆溫培養內在37℃進行5.5小時培養。培養後以PBS將細胞洗淨2次，添加PBS至50μL/格。將該盤在-80℃重複進行3次凍結熔解，其後添加含有100mM NaCl及0.2%Triton X-100之50mM Tris緩衝液(pH7.4)至50μL/格，在4℃進行一晚培養，調製出細胞溶解液。將該細胞溶解液中之組織因子的含量以ELISA(AssayPro公司販賣之商品名『AssayMax Human Tissue Factor ELISA kit』)進行測定。結果合併於表6。
由表6之結果得知，在LPS、IL-1β及IFN-γ存在下所誘導的組織因子之表現量，取決於腺苷N1-氧化物或腺苷之濃度而受到抑制。對於兩者的抑制強度，與無添加腺苷N1-氧化物或腺苷的情況相比，顯著抑制組織因子之表現的濃度為腺苷N1-氧化物0.5μM以上，相對於此腺苷必須添加至5μM以上，故可判斷腺苷N1-氧化物比腺苷強10倍以上。過去認為因血管內皮細胞藉由細菌、酵母、 病毒等微生物感染或TNF-α為主的發炎性細胞因子而活化時，於細胞表面表現組織因子或細胞黏著因子而容易引起血栓形成。因此，該結果為腺苷N1-氧化物可抑制與血栓形成相關的組織因子或細胞黏著因子之產生，進而可阻礙血栓形成，表示可作為播種性血管內凝固症候群(DIC)、全身性發炎反應症候群(SIRS)等血栓形成成為症狀惡化的主因之一的感染症治療劑、預防劑使用。
<實驗6-3：對細胞黏著因子之表現的影響>
對於達到融合之HUVEC細胞的培養格，各添加50μL/格的溶解於血管內皮細胞增殖用培養基至最終濃度為如表6所示濃度的腺苷(和光純藥工業股份有限公司販賣，試藥級)或腺苷N1-氧化物溶液、與於血管內皮細胞增殖用培養基溶解至最終濃度為LPS(10μg/mL)/IL-1β(2ng/mL)/IFN-γ(500IU/mL)的溶液，於5容積%CO2恆溫培養內於37℃進行5.5小時培養。其後，將培養澄清液吸引除去，以PBS進行2次洗淨後，添加4%對甲醛，在室溫靜置1小時，使細胞固定。固定後將細胞以PBS洗淨3次，添加含有1%BSA及0.05%NaN3的PBS至150μL/格，在4℃進行一晚blocking。經blocking後，除去格子內液體，添加含有3%BSA之PBS調製出0.4μg/mL濃度的生物素標識羊抗人類VCAM-1多株抗體抗體(R&D公司販賣之商品名『人類VCAM-1/CD106生物素化親和純化多株抗體抗體羊IgG』)100μL/格，在室溫靜置1.5 小時。其次以PBS對細胞洗淨4次後，以含有3%BSA之PBS稀釋1000倍，添加HRPO標識鏈霉親和素(Invitrogen公司販賣之商品名『鏈霉親和素HRPconjugate』)至100μL/格，在室溫靜置1小時。最後以PBS對細胞洗淨4次後，以QuantaBlueTM Fluorogeneic Peroxidase Substrate(PIERCE公司製)進行10分鐘發色，於325-420nm測定螢光強度。作為對照組，取代腺苷或腺苷N1-氧化物溶液添加血管內皮細胞增殖用培養基至50μL/格以外，於相同條件下進行培養、螢光強度之測定。結果合併於表6所示。
由表6的結果得知，在LPS、IL-1β及IFN-γ存在下所誘導之細胞黏著因子的表現量為取決於腺苷N1-氧化物或腺苷之濃度而被抑制。對於兩者的抑制強度來看，表現量之抑制傾向於任一情況下皆確認5μM濃度以上故無差異。
<實驗6-4：腸毒素I對細胞障礙之影響>
進一步於實驗3得知，腺苷N1-氧化物可抑制藉由腸毒素刺激由巨噬細胞的發炎性細胞因子之產生，故對藉由毒素刺激由血管內皮細胞的發炎性細胞因子產生的腺苷N1-氧化物之影響做調查。即，取代LPS/IL-1β/IFN-γ刺激以外，添加至表6所示濃度的腸毒素I(Nacalai tesque販賣)以外，與實驗6-1相同方法下，測定由HUVEC細胞之TNF-α產生量。結果合併如表6所示。
由表6得知，腺苷N1-氧化物可有效果地抑制由HUVEC細胞之TNF-α產生量。
歸納實驗6的結果顯示，在實驗1確認藉由腺苷N1-氧化物投與可抑制由細菌性休克抑制機制之一為發炎性細胞因子的TNF-α之血管內皮細胞的產生、以及抑制血管內皮細胞之組織因子及細胞黏著因子的表現之可能性。又，該抑制程度比腺苷強10倍以上，與使用巨噬細胞的實驗2結果一致。且腸毒素作用於血管內皮細胞而產生發炎細胞因子，阻礙血管內皮細胞，引起出血性大腸炎或溶血性尿毒症候群，故該結果表示腺苷N1-氧化物可抑制藉由腸毒素之血管內皮細胞的障礙，可作為出血性大腸炎或溶血性尿毒症候群之預防劑、治療劑使用。
<實驗7>
<對藉由LPS投與所誘導之細胞因子類的產生之腺苷N1-氧化物投與的影響>
<試驗方法>
實驗1中確認藉由腺苷N1-氧化物投與的LPS投與可抑制細菌性休克，作為該抑制機制，其為藉由腺苷N1-氧化物經LPS抑制由巨噬細胞及血管內皮細胞之TNF-α產生之作用，其於實驗2至6已記載，故本實驗中，欲確認實際上對小老鼠投與LPS後誘導細菌性休克時，經誘導之發炎性細胞因子的產生可藉由腺苷N1-氧化物投與受到抑制而進行試驗。且因亦揭示腺苷N1-氧化物可能對TNF-α 以外的發炎性細胞因子之產生有影響，故本實驗中，對於腺苷N1-氧化物投與的發炎性細胞因子之IL-6及IL-12、抗發炎性細胞因子之IL-10的產生之影響做調查。即，將BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡之雌性老鼠)18隻，隨意每6隻一群分為3群。將來自大腸菌(055：B5)的LPS(Sigma販賣)溶解於生理食鹽水，對該3群各6隻所有小老鼠進行LPS之18mg/kg體重腹腔內投與(實驗群1至3)。該3群之小老鼠中，對於1群6隻進行LPS投與之同時將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物(ANO)以68mg/kg體重進行靜脈內(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群2)。另外對1群6隻進行LPS投與之同時將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物以135mg/kg體重進行靜脈內(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群3)。對於剩下的1群6隻進行LPS投與之同時進行PBS之0.2mL/隻靜脈內投與(實驗群1)。
對於各群小老鼠，於LPS投與2小時後採血，測定血清中之TNF-α、IL-6、IL-10及IL-12，求得各群平均值。結果如表7所示。且TNF-α量之測定與實驗2同樣地使用ELISA法，IL-6量的測定與實驗3相同使用ELISA法。又，IL-10的測定係使用將販賣的老鼠抗小老鼠IL-10抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『老鼠抗小老鼠IL-10抗體(商品編碼：554421)』)作為固相抗體，將販賣的生物素標識老鼠抗小老鼠IL-10抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『生物素標識老鼠抗小老鼠IL-10抗體(商品 編碼：554423)』)作為二次抗體，使用藉由HRPO標識鏈霉親和素測定之酵素抗體法(ELISA)。IL-12的測定係使用將販賣的老鼠抗小老鼠IL-12抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『老鼠抗小老鼠IL-12p70抗體(商品編碼：554658)』)作為固相抗體，將販賣的生物素標識老鼠抗小老鼠IL-12抗體(BD法爾勤公司販賣之商品名『生物素標識老鼠抗小老鼠IL-12p70抗體(商品編碼：51-26192E)』)作為二次抗體，藉由HRPO標識鏈霉親和素測定之酵素抗體法(ELISA)。
由表7得知，於LPS投與2小時後之小老鼠血清中，檢測到TNF-α、IL-6、IL-12，但並未檢測到IL-10(實驗群1)。相對於此，與LPS同時將腺苷N1-氧化物以68mg/kg體重或135mg/kg體重進行投與的小老鼠之血清中，與未投與腺苷N1-氧化物之情況相比較，TNF-α之產生取決於腺苷N1-氧化物投與量而顯著地被抑制(實驗群2及3)。又，與TNF-α同樣地，IL-6及IL-12取決於腺苷N1-氧化物之投與量而顯著地抑制生成，相對於此，抗 發炎性細胞因子之IL-10依據腺苷N1-氧化物的投與量而增強生成。TNF-α、IL-6及IL-12因被認為其為與細菌性休克的病態形成相關之效應子分子，由該結果與實驗2、實驗3之結果得知以下的結論，藉由LPS投與之細菌性休克為經腺苷N1-氧化物的投與，除抑制由LPS誘導之發炎性細胞因子的TNF-α之產生，亦抑制發炎性細胞因子之IL-6及IL-12的產生，進而抑制小老鼠的生存率降低。且推測藉由腺苷N1-氧化物之投與，增強抗發炎性細胞因子之IL-10的產生之同時，亦可抑制小老鼠的生存率降低。
<實驗8>
<對細菌性休克的腺苷N1-氧化物投與之影響2>
實驗1中，確認藉由LPS之投與的同時投與腺苷N1-氧化物時，可抑制細菌性休克的發病。另一方面，由細菌性休克會急速進行來看，該治療劑因可能可使用於病態進行的惡化時期，本實驗中，對於已經細菌性休克，且敗血症惡化的小老鼠，腺苷N1-氧化物投與所造成的影響做調查。即，將BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性老鼠)14隻，隨機地每7隻分為2群(實驗群1及2)。將來自大腸菌(055：BB)的LPS(Sigma販賣)溶解於PBS，對於該2群各7隻所有小老鼠進行LPS之18mg/kg體重腹腔內投與。LPS投與1小時後對於1群7隻將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物(ANO)以135mg/kg體重進行靜脈內(液量：0.2mL/ 隻)投與(實驗群2)。對於剩下的1群7隻將PBS進行0.2mL/隻靜脈內投與(實驗群1)。對於各群，確認LPS投與後7至27小時的小老鼠生存數，求得各群生存率(%)。結果如表8所示。
由表8得知，僅投與LPS之小老鼠在LPS投與22小時後生存率已經降至14%(實驗群1)。相對於此，於LPS投與1小時後對於投與腺苷N1-氧化物之小老鼠，即使LPS投與27小時後其生存率為57%(實驗群2)，經LPS投與而死亡的小老鼠比率顯著(P<0.05)減少。實驗7的結果顯示腺苷N1-氧化物可作為發病細菌性休克，敗血症惡化時的治療劑使用。
<實驗9>
<對於細菌性休克的腺苷或肌苷投與之影響>
已知腺苷N1-氧化物在活體內經由腺苷變為肌苷而被代謝。由實驗1至8之結果可確認，腺苷N1-氧化物可作為敗血症之預防劑或治療劑使用，故進行該代謝產物之腺苷或肌苷是否具有同樣效果之確認試驗。即，將BALB/c 小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性老鼠)28隻隨機地每7隻分為4群(實驗群1至4)。將來自大腸菌(055：B5)的LPS(Sigma販賣)溶解於PBS，對於該4群各7隻所有小老鼠將LPS進行18mg/kg體重腹腔內投與。對於1群7隻與LPS投與同時地將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物(ANO)以135mg/kg體重進行靜脈內(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群2)。對於2群各7隻，與LPS投與同時將溶解於PBS之腺苷(AN)或肌苷(IN)中任一以127mg/kg體重進行靜脈內(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群3及4)。對於剩下的1群7隻，作為對照組，進行PBS之0.2mL/隻靜脈內投與(實驗群1)。對於各群，確認LPS投與後7至43小時之小老鼠生存數，求得各群生存率(%)。結果如表9所示。
由表9得知，與LPS投與之同時投與腺苷的小老鼠(實驗群3)的生存率、與LPS投與之同時投與PBS(實驗群1)的小老鼠之情況相同地經時性降低。又，與LPS 投與之同時，投與肌苷之小老鼠(實驗群4)的生存率比與LPS投與之同時投與PBS(實驗群1)的小老鼠更高。相對於此，與LPS投與之同時投與腺苷N1-氧化物之小老鼠(實驗群2)的生存率，與實驗群1、3及4的小老鼠相比較，確認顯著(P<0.05)生存率之改善。由該結果得到以下結論，腺苷N1-氧化物具有比腺苷或肌苷更優良的敗血症之預防或治療效果。
<實驗10>
<對於細菌性休克的腺苷N1-氧化物之經口投與的影響>
由實驗1中判斷藉由腺苷N1-氧化物之靜脈內投與，可有效地抑制內毒素休克，故本實驗係確認將腺苷N1-氧化物進行經口投與時，是否與靜脈注射的情況具有同樣效果的試驗。即，將BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性老鼠)32隻隨意每8隻分為4群(實驗群1至4)。對於所有小老鼠，將溶解於PBS之來自大腸菌(055：B5)的LPS(Sigma販賣)進行18mg/kg體重/隻腹腔內投與(實驗群1至3)。對於其中1群8隻，於LPS投與1小時前及1小時後，將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/次使用胃管進行經口(液量：0.2mL/隻/次)投與(實驗群2)。對於1群8隻於LPS投與1小時前、1小時後及7小時後，將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/次使用胃管進行經口(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群2)。對於剩下 的1群8隻進行LPS投與1小時前及1小時後，將PBS使用胃管進行經口(液量：0.2mL/隻/次)投與(實驗群1)。對於各群，以肉眼確認LPS投與後7至46小時的小老鼠生存數，求得各群生存率(%)。結果如表10所示。且小老鼠的生存率(%)與實驗1同樣地求得。
且，取代實驗群3所使用的腺苷N1-氧化物，使用α葡萄糖基-腺苷N1-氧化物以外，在與實驗群3之同一條件下對細菌性休克之影響進行調查(實驗群4)。合併結果如表10所示。α-葡萄糖基-腺苷N1-氧化物為使用以下所得之3’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及5’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物，於股份有限公司林原生物化學研究所之含有腺苷與糊精之溶液中，由使來自Bacillus stearothermophilus Tc-91株(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6所在之獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄存中心，寄存號碼FERM BP-11273)的環麥芽糖糊精葡聚糖轉移酶起作用，其次使葡萄糖澱粉酶劑(Nagase chemtex股份有限公司販賣之商品名『Glucozyme#20000』、20,000單位/g)起作用的反應液，經由含有色譜法分離法之純化步驟，各調製出純化至純度98%以上的3’-葡萄糖基腺苷及5’-葡萄糖基腺苷(特願2011-20233)，這些藉由與實驗1之相同方法，使用過氧化氫水進行氧化後，使用逆相管柱(YMC公司販賣之商品名『YMC-Pack R&D ODS-A管柱』)以管柱層析純化到純度98%以上之3’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及5’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物。
由表10得知，將腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/次進行2次投與的小老鼠之LPS投與79小時後的生存率為50%(實驗群2)。將腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/次進行3次投與的小老鼠之LPS投與79小時後的生存率為75%(實驗群3)。相對於此，僅投與PBS之小老鼠的LPS投與79小時後之生存率降至12.5%(實驗群1)。該結果表示將腺苷N1-氧化物藉由經口投與時，與該靜脈內投與之情況同樣地，可得到內毒素休克之抑制效果。又，將3’-葡萄糖基-腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/次進行3次投與之小老鼠的LPS投與79小時後的生存率為50%(實驗群5)。5’-葡萄糖基-腺苷N1-氧化物投與群(實驗群6)顯示與對照(實驗群1)幾乎相同的生存率降低、該結果表示將α-葡萄糖基-腺苷N1-氧化物經口攝取時，在腸內藉由水解生成腺苷N1-氧化物，與攝取腺苷N1-氧化物之情況同樣地，可抑制內毒素休克，3’-葡萄糖基-腺苷N1-氧化物亦可作為腺苷N1-氧化物敗血症的治療劑使用。以經時性生存率的推移及投與量進行比較時，腺苷N1-氧化物比3’-葡萄糖基-腺苷N1-氧化物更具有內毒素休克之抑制作用。
<實驗11>
<對LPS投與小老鼠的細胞因子產生之腺苷N1-氧化物經口投與的影響>
實驗10係為藉由LPS投與之內毒素休克由腺苷N1- 氧化物之經口投與而受到抑制，故由LPS投與所誘導的發炎性細胞因子之產生是否藉由腺苷N1-氧化物的經口投與而受到抑制的確認試驗。即，將BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的11週齡的雌性老鼠)28隻隨意地每7隻分為4群(實驗群1至4)。對於其中1群7隻將將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物以100mg/kg體重，使用胃管進行經口(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群2)。對於1群7隻，將溶解於PBS之腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/，使用胃管進行經口(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群3)。對於1群7隻，將溶解於PBS的3’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重/使用胃管進行經口(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群4)。對於剩下的1群7隻將PBS使用胃管，進行經口(液量：0.2mL/隻)投與(實驗群1)。其次，於腺苷N1-氧化物或PBS投與50分後，對於所有小老鼠將溶解於PBS之來自大腸菌(055：B5)的LPS(Sigma販賣)以18mg/kg體重/隻進行腹腔內投與(實驗群1至4)。對於各群，於LPS投與後90分後，由尾靜脈採血，將含有血清中之TNF-α、IL-6、IL-10的濃度藉由與實驗11之相同方法進行測定。結果如表11所示。
由表11得知，將腺苷N1-氧化物或3’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物以200mg/kg體重進行投與之小老鼠(實驗群3及4)，與將PBS進行經口投與的小老鼠(實驗群1)相比，血清中之TNF-α濃度及IL-6濃度顯著降低，IL-10的濃度顯著上昇。將腺苷N1-氧化物以100mg/kg體重進行投與之小老鼠(實驗群2)與將PBS進行經口投與的小老鼠(實驗群1)相比，血清中之TNF-α濃度及IL-6濃度顯示降低傾向，IL-10的濃度顯著上昇。該結果表示藉由腺苷N1-氧化物及3’-葡萄糖基腺苷N1-氧化物的經口投與之內毒素休克抑制的作用機制之一與靜脈內投與之情況相同，可抑制發炎性細胞因子之TNF-α或IL-6之產生的同時，亦可增強抗發炎性細胞因子之IL-10的產生。
<實驗12>
<對於肝炎之腺苷N1-氧化物投與的影響>
本實驗中，將對於有關TNF-α之肝障礙的腺苷N1-氧化物投與之影響，使用作為人類自身免疫性肝炎及病毒性肝炎模型動物而廣泛被使用的刀豆素A(ConA)誘發肝 障礙小老鼠進行調查(例如參照『Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America』、97卷，第10號，第5498至5503頁(2000年))。即，將BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性老鼠)30隻隨意地每5隻分6群(實驗群1至6)。將ConA(Sigma販賣之型IV)溶解於生理食鹽水，對於該6群各5隻的所有小老鼠進行15mg/0.2mL之靜脈內投與。對於3群各5隻的小老鼠與ConA投與之同時將溶解於生理食鹽水的腺苷N1-氧化物以45mg、75mg或135mg/kg體重之任一量進行靜脈內投與(實驗群2至4)。對於2群各5隻的小老鼠，與ConA投與之同時，將溶解於生理食鹽水之腺苷(AN)(實驗群5)或肌苷(IN)(實驗群6)的任一以127mg/kg體重進行靜脈內投與。對於剩下的1群5隻，作為對照組，與ConA投與之同時將生理食鹽水以0.2mL/隻進行靜脈內投與(實驗群1)。
對於各群小老鼠，ConA投與後20小時進行採血，將血清中之GPT及GOT活性以販賣的測定套組(和光純藥股份有限公司販賣之商品名『轉胺酶CII-Test Wako』)進行測定，作為因肝炎所引起的肝障礙之指標。結果如表12所示。對於對照(實驗群1)、將腺苷N1-氧化物以45mg/kg體重(實驗群2)或135mg/kg體重進行投與(實驗群4)、及、將腺苷或肌苷以127mg/kg體重進行投與之小老鼠(實驗群5及6)經採血後解剖，取出肝臟依據 常法製作出組織標本。將組織標本進行蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin & Eosin stain)，由藉由顯微鏡觀察判斷之肝臟組織壞死狀態的分數計算其平均值，作為肝障礙之指標。結果合併如表12所示。且，肝臟組織的壞死狀態藉由顯微鏡觀察，以壞死較少(1)、中程度(2)、較多(3)之三段階進行評估，藉由分數化求得各群平均值。
由表12得知，藉由ConA投與所誘發之肝炎引起的肝功能障礙(GOT、GPT值上昇)與僅投與ConA的對照組小老鼠(實驗群1)相比較，依據腺苷N1-氧化物之投與量顯著被抑制(實驗群2至4)。又，肝臟組織之壞死亦依據腺苷N1-氧化物的投與量而被抑制。對於投與腺苷之小老鼠(實驗群5)及投與肌苷之小老鼠(實驗群6)，比投與腺苷N1-氧化物時更弱，但確認有肝組織之狀態及肝功能障礙的改善傾向，投與腺苷時，與僅投與 ConA的對照組小老鼠(實驗群1)做比較，GOT有顯著降低。此結果表示腺苷N1-氧化物比腺苷或肌苷更可作為因肝炎所引起的肝障礙之預防劑至治療劑使用。
<實驗13>
<對於發炎性腸疾病之腺苷N1-氧化物投與的影響>
本實驗中對於與TNF-α相關的發炎性腸疾病之腺苷N1-氧化物投與的影響，使用作為人類發炎性腸疾病模型動物而廣泛被使用的小老鼠的葡聚糖硫酸鈉誘發大腸炎進行調查(例如參照『American Journal of Physiology』、274卷、G544至G551頁(1998年))。即，將C57BL/6小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性老鼠)45隻，隨意地每8隻分5群(實驗群2至5)與1群5隻(實驗群1)。將葡聚糖硫酸鈉(MP Biomedicals公司販賣的分子量36,000~50,000)溶解於自來水，對於其中5群各8隻的所有小老鼠進行5天的自由攝取水分(實驗群2至5)。對於攝取該葡聚糖硫酸鈉之小老鼠中之2群各8隻的小老鼠，由葡聚糖硫酸鈉攝取開始日(攝取0日)至第11天(攝取10日)將腺苷N1-氧化物溶解於PBS中至33或100mg/kg體重，使用胃管進行1天1次，0.2mL/隻之投與(實驗群3、4)。對於2群各8隻的小老鼠，由葡聚糖硫酸鈉攝取開始日(攝取0日)至第11天(攝取10日)，將腺苷(AN)或肌苷(IN)之任一溶解於PBS至94mg/kg體重，使用胃管進 行1天1次，0.2mL/隻之投與(實驗群5、6)。對於剩下的1群8隻之小老鼠，由葡聚糖硫酸鈉攝取開始日至第11天，將PBS使用胃管進行1天1次，0.2mL/隻之投與(實驗群2)。未攝取葡聚糖硫酸鈉之1群5隻的小老鼠，直接使用一般飲食，並自由攝取自來水而飼養11天(實驗群1)。
葡聚糖硫酸鈉攝取開始日至第11天，每日測定小老鼠的體重與肉眼觀察腹瀉及血便之程度。葡聚糖硫酸鈉攝取開始後第11天的小老鼠體重除以葡聚糖硫酸鈉攝取開始時之小老鼠體重後乘以100倍，減去100求得體重減少率(%)。各小老鼠的腹瀉及血便分數及體重減少率依據表13所示基準進行分數化。自葡聚糖硫酸鈉攝取開始日(攝取0日)至第11天(攝取10日)的腹瀉及血便之分數合計的平均數由每各群求得如表14所示。算出自葡聚糖硫酸鈉攝取開始至第11天(攝取10日)的各小老鼠之腹瀉、血便及體重減少率的分數合計，作為大腸炎程度之指標使用的Disease Activity Index(DAI)，該平均由每各群求得，如表14所示。且自葡聚糖硫酸鈉攝取開始日至第11天，取出各小老鼠的血液，將作為發炎指標之急性期蛋白的肝球蛋白使用販賣的ELISA套組(Life Diagonostics公司販賣)進行測定，求得每各群之平均值。結果合併於表14所示。且自葡聚糖硫酸鈉攝取開始至第11天，僅攝取葡聚糖硫酸鈉的實驗群2的小老鼠1隻因死亡，故自葡聚糖硫酸鈉攝取開始日至第11天(攝 取10日)的實驗群2之結果如7隻小老鼠的平均值。
由表14得知，經葡聚糖硫酸鈉攝取所誘發之大腸炎的腹瀉分數與血便分數之合計與僅攝取葡聚糖硫酸鈉的老鼠(實驗群2)相比較，依腺苷N1-氧化物的投與量而降低，自硫酸葡聚糖攝取開始日至第6天(攝取5日)以後確認顯著(P<0.05)降低(實驗群3及4)。又，這些實驗群中，自葡聚糖硫酸鈉攝取開始日至第11天(攝取10日)的腹瀉及血便之分數加上體重減少分數的DAI及肝球蛋白量亦與僅攝取葡聚糖硫酸鈉之老鼠(實驗群2)相比較，確認顯著(P<0.05)降低。於腺苷投與群(實驗群5)中，腹瀉便分數與血便分數之合計、DAI及肝球蛋白量中任一項與僅攝取葡聚糖硫酸鈉之小老鼠(實驗群2)並無差異。對於肌苷投與群(實驗群6)，腹瀉便分數與血便分數之合計、DAI及肝球蛋白量中任一項，與僅攝取葡聚糖硫酸鈉的小老鼠(實驗群2)相比較，未確認到有降低傾向之顯著差。該結果表示腺苷N1-氧化物比腺苷或肌苷更可作為發炎性腸疾病之預防劑至治療劑使用。
<實驗14>
<對腎炎之腺苷N1-氧化物投與的影響>
已知腎炎會因種種原因而發病，隨著症狀進行會有腎絲球體改性發生。本實驗中，對於腎炎之腺苷N1-氧化物投與的影響使用作為II型糖尿病之模型動物而廣泛被使用的可自然患II型糖尿病之KK-Ay小老鼠進行調查(例如參照『Experimental Animals』，51卷，2號，第191 至196頁(2002年))。
<試驗方法>
將KK-Ay小老鼠(日本CLEA股份有限公司販賣的5週齡的雄性老鼠)50隻，以CE-2飼料(日本CLEA股份有限公司販賣)預備飼養1週後，測定體重與自尾靜脈採血之血液中的血糖值，欲均等各測定值，隨意地每10隻分為5群。5群中之1群作為對照組，使其自由飲水，進行10週飼育(實驗群1)。對於剩下的4群之2群的小老鼠將溶解於飲水的腺苷N1-氧化物以每天、30mg/kg/日或100mg/kg/日中任一用量，自由攝取並再各飼養10週(實驗群2及實驗3)。對於剩下的2群小老鼠，將溶解於飲水之腺苷或肌苷中任一以每日、94mg/kg/日、自由攝取，各再飼養10週(實驗4及實驗5)。小老鼠經過預備飼育及試驗期間，使其自由攝取CE-2飼料，在22±2℃以12小時之明暗循環(點灯7：00~19：00)飼育。評估試驗終了時之體重、腎臟質量比、血糖值、血紅蛋白A1c值(HbA1c)、經解剖後腎障礙之病理所見現象，對於各群若腎絲球體的硬化為全絲球體之50%以上的(++)小老鼠所占比率如表15所示。腎臟質量比為腎臟質量除以體重而求得。又，血糖值、HbA1c值、及腎絲球體之改性分數由下述方法求得。
<臨床檢查值之測定方法及病理所見現象分數化之方法>
<血糖值>
試驗終了時於解剖前進行16小時絕食後，由後大靜脈採血，測定空腹時的血糖值。血糖值使用販賣的血糖值測定試藥(和光純藥工業股份有限公司販賣之商品名「葡萄糖CIITest Wako」)進行測定。
<HbA1c值>
試驗終了時於解剖前進行16小時絕食後，由後大靜脈採血，測定空腹時之HbA1c值。測定委託民間臨床檢查機關(股份有限公司Falcobiosystems)進行。
<病理組織評估>
解剖時取出各小老鼠的腎臟，以中性緩衝福馬林固定後，依據常法製作病理組織切片，施予蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin & Eosin stain)(H-E染色)及PAS染色。對於經染色之各小老鼠的病理組織切片，欲與對照群進行比較，將顯微鏡觀察所見到的病理現象依據以下基準進行判定並分數化，作為經腎炎之腎障礙改性的指標。
<腎臟的病理所見現象的分數化方法>
腎障礙程度以腎絲球體之硬化程度進行判定。以確認腎絲球體的硬化為全絲球體的50%以上時為(++)，25%以上未達50%時為(+)，未達25%為(±)，未確認到為(-)之四段階做判定。且，腎臟的病理所見現象依據病 理組織評估基準(例如Andrea Hartner們的『American Journal of Pathology』、160卷，3號，第861至867頁(參照2002年)的第862頁右欄第12至21行)進行判定。
由表15得知，小老鼠中腎絲球體硬化顯示50%以上的小老鼠比率在將腺苷N1-氧化物以每日30mg/kg體重進行投與的群(實驗群2)中為50%，在以每日100mg/kg體重進行投與的群中(實驗群3)為30%，僅投與CE-2飼料之群中(實驗群1)為100%，與此相比為顯著降低。將腺苷以每日94mg/kg體重進行投與的群中(實驗群4)，腎絲球體硬化顯示50%以上的小老鼠比率為100%，未見到與僅給予CE-2飼料的群(實驗群1)之間的差異。將肌苷以每日94mg/kg體重進行投與的群中(實驗群5)，顯示腎絲球體硬化為50%以上之小老鼠的比率降低至80%。體重、腎臟質量比、血糖值在任一實驗群間中亦未見到差異。該結果表示腺苷N1-氧化物可作為抑制因腎炎所引起的腎絲球體硬化(改性)的腎炎治療劑使用。又，將腺苷N1-氧化物以每日100mg/kg體重進行投與的群中(實驗群3)，HbA1c值為5.40%，對於僅給予CE-2飼料的實驗群(實驗群1)之6.75%而言顯著降低，及在腺苷N1-氧化物投與群(實驗群2及3)中，與其他實驗群相比，因血糖值亦顯示降低傾向，故表示腺苷N1-氧化物可作為糖尿病的治療劑使用。
<實驗15>
<對於胰臟炎之腺苷N1-氧化物投與的影響>
在本實驗中，對於與TNF-α相關的胰臟障礙的腺苷N1-氧化物投與之影響，使用作為人類的胰臟炎模型動物 而廣泛被使用的膽鹼不完整與甲硫胺酸(Choline-deficient with ethionine)添加食誘發重症急性胰臟炎小老鼠進行調查(例如參照『Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics』、328卷，1號，第256至262頁(2009年))。即，將CD1(ICR)小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣之雌性3週齡老鼠)40隻，隨意地每8隻分為5群。經7天預備飼育後，進行1天絕食，自第二天進行3天自由攝取添加膽鹼欠缺的甲硫胺酸飼料(Oriental酵母工業股份有限公司製造)。其後回復至一般食後，攝取添加膽鹼欠缺的甲硫胺酸飼料。對於1群8隻於絕食時，每日早上與下午之2次將溶解於蒸餾水的腺苷N1-氧化物以46mg/kg體重/次使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)。對於1群8隻，於絕食時，每日早上與下午之2次將溶解於蒸餾水之腺苷N1-氧化物以139mg/kg體重/次，使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)。對於2群8隻，於絕食時，每日早上與下午之2次將溶解於蒸餾水之腺苷或肌苷以124mg/kg體重/次，使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)。對於剩下的群8隻，作為對照，於絕食時，每日早上與下午之2次將蒸餾水使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)(實驗群1)。自添加膽鹼欠缺的甲硫胺酸飼料攝取開始至第7天的小老鼠之生存數藉由肉眼確認，求得各群之生存率(%)。結果如表16所示。且小老鼠之生存率(%)與實驗1同樣地求得。
由表16得知，每日早上與下午之2次將溶解於蒸餾水之腺苷N1-氧化物以139mg/kg體重/次，使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)時，患有藉由添加膽鹼欠缺的甲硫胺酸飼料攝取所誘發的急性胰臟炎之小老鼠的生存率降低，與僅投與蒸餾水之對照組小老鼠(實驗群1)相比較顯著被抑制，未確認到78小時以後至144小時的死亡。又，將腺苷N1-氧化物以46mg/kg體重/次或將腺苷以124mg/kg體重/次，使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)之小老鼠的生存率與僅投與蒸餾水之對照組小老鼠(實驗群1)相同皆為經時性地降低。將肌苷以124mg/kg體重/次，使用胃管進行經口投與(液量：0.2mL/隻/次)的小老鼠之生存率，與僅投與蒸餾水之小老鼠(實驗群1)相比顯示降低受到抑制，但自添加膽鹼欠缺的甲硫胺酸飼料攝取開始144小時後，降低至與僅投與蒸餾水之小老鼠相同生存率。其結果腺苷N1-氧化物可作為對於胰臟炎之預防劑至治療劑使用，該治療效果比肌苷更優良。
<實驗16>
<對於異位性皮膚炎之腺苷N1-氧化物的影響>
本實驗中，對異位性皮膚炎的腺苷N1-氧化物投與之影響，使用作為人類的異位性皮膚炎之模型動物，廣泛被使用的2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)敏化小老鼠進行調查。皮膚發炎狀之惹起依據日本Charles River股份 有限公司的說明書進行。2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)使用購得之市販品(東京化成股份有限公司販賣)，依據日本Charles River股份有限公司的說明書，使用溶解於乙醇之再結晶化者。
<試驗方法>
將NC/Nga小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的雌性6週齡老鼠)48隻的腹部，使用剃刀經剃毛後，隨意地每8隻分為6群。對於5群各8隻之小老鼠，將乙醇與丙酮以4：1的容積比進行混合的溶液中，溶解2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)(東京化成股份有限公司)至5%的濃度之溶液，於經剃毛之腹部皮膚、及4個腳墊合計為150μL/小老鼠的量滴入，使用定量吸管(pipette)的薄片腹部進行塗佈延展使其2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)敏化(以下有時簡稱為「敏化」)。敏化4天後將溶解於橄欖油(和光純藥工業股份有限公司販賣)至1%濃度的2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)，同樣使用微定量吸管(pipette)至150μL/小老鼠，塗佈於塗佈前日使用剃刀進行剃毛的背部皮膚，惹起皮膚炎後，間隔1週間進行同樣操作重複5次，進行合計6次的皮膚炎惹起(以下有時簡稱為「惹起」)。對於1群8隻的小老鼠，由藉由2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)之敏化後前3天，將腺苷N1-氧化物的2.2%溶液與水溶性羧基乙烯聚合物(和光純藥工業股份有限公司販賣之商品名 『HIVISWAKO』)混合所調製的凝膠(腺苷N1-氧化物含量14mg/mL凝膠)，使用微定量吸管(pipette)，同樣地以100μL/小老鼠，一天早晚2次，連續塗佈5天，2天連續塗佈休止的循環中，至第6次惹起的4天後，於惹起皮膚炎之背部皮膚部位進行塗佈(實驗群2)。含有腺苷N1-氧化物之凝膠的塗佈自星期一的早上開始。對於2群各8隻的小老鼠，將混合腺苷或肌苷之2.1%溶液與前述水溶性羧基乙烯聚合物而調製之凝膠(腺苷或肌苷含量為13mg/mL凝膠)，以與腺苷N1-氧化物相同塗佈時間表，塗佈於惹起皮膚炎之背部皮膚部位(實驗群3及4)。對於以2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)敏化之剩下1群8隻，作為陽性對照組，將Prednisolone 21-磷酸二鈉(東京化成工業股份有限公司販賣，以下簡稱「Prednisolone」)溶液與前述水溶性羧基乙烯聚合物混合所調製之凝膠(Prednisolone含量為6.7mg/mL凝膠)，自第3次惹起週的星期一(塗佈開始第17天)的早上，1天中早上及下午的2次進行5天連續塗佈，2天連續塗佈休止的循環中，至第6次惹起的4天後，塗佈於惹起皮膚炎的背部皮膚部位(實驗群5)。塗佈2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)的剩下1群作為對照組，將於前述羧基乙烯聚合物加入純化水所調製之凝膠，以與腺苷N1-氧化物的相同時間表進行塗佈(實驗群1)。剩下的1群8隻作為正常群，於試驗開始時將腹部及背部以剃刀進行剃毛後，無須進行2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)或凝膠之塗佈下飼育(實驗群6)。
於進行第6次惹起的星期五(塗佈開始第46)，殺死所有小老鼠後摘出脾臟，依據常法取出脾細胞。脾細胞懸浮於含有10%FCS之RPMI-1640培養基，播種於24孔盤至5×106細胞/0.5mL/格。於各格添加2μg/mL之抗CD3抗體(CosmoBio販賣之商品名『純化小老鼠CD3ε單株抗體』)，在5容積%CO2恆溫培養內於37℃進行3天培養，測定該培養澄清液中之細胞因子量。
<評估方法>
經過實驗期間，每週測定一次小老鼠之體重。皮膚之發炎狀態的判定，自惹起第3次之星期二與星期五的2次，對於發紅．出血、浮腫(耳翼的水腫)、擦傷．組織缺失、痂皮形成．乾燥之程度的4項目，依據表17所示判定基準，以0(無症狀)、1(輕度)、2(中程度)、3(重度)的4段階做分數化。求得對於各群之各評估項目的分數合計之平均值，並作為皮膚分數。藉由2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)進行敏化的實驗群1至5的皮膚分數如表18所示。各小老鼠的脾細胞之抗CD3抗體刺激培養澄清液中之IL-4、IL-5、IL-6及IFN-γ濃度以對各細胞因子為專一性之ELISA進行測定，求得各群小老鼠的脾細胞中之各細胞因子的產生量平均值。結果合併如表19所示。
由表18得知，塗佈含有腺苷N1-氧化物之凝膠的小老鼠(實驗群2)之皮膚分數，自2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)敏化第21天以經時性地增加，雖顯示有皮膚發炎進行之傾向，但與塗佈加入純化水所調製的凝膠的小老鼠(實驗群1)之皮膚分數的增加相比，敏化第39天以後，皮膚的發炎顯著地被抑制。又，發炎惹起部位的一部份皮膚觀察到發毛，確認因發炎所引起的創傷得到治癒．改善。塗佈含有腺苷或肌苷之凝膠的小老鼠(實驗群3及4)之皮膚分數，與塗佈加入純化水並調製的凝膠之小老鼠(實驗群1)的皮膚分數之增加為同程度，藉由這些物質之塗佈未確認可改善皮膚分數。塗佈含有作為抗發炎劑使用的Prednisolone之凝膠的小老鼠(實驗群5)之皮膚分數為，敏化第28日以後，與塗佈加入純化水並調製之凝膠的小老鼠(實驗群1)之皮膚分數的增加做比較，雖抑制至優良程度，但以腺苷N1-氧化物的塗佈被確認的發炎惹起部位的皮膚創傷之回復並未被確認。且由小老鼠之體重來看，塗佈含有腺苷N1-氧化物之凝膠的小老鼠，經過試驗期間，顯示與塗佈加入純化水並調製之凝膠的對照群小老鼠(實驗群1)為相同體重增加率，並未確認到發炎惹起所引起的影響。相對於此，對於塗佈含有腺苷或肌苷的凝膠之小老鼠(實驗群3及4)，第2次惹起週(塗佈開始第12天)以後，與僅進行剃毛的正常群(實驗群6)相比較，確認到藉由惹起發炎部位的搔癢感引起的壓力的體重增加率之減少。又，對於塗佈Prednisolone 的陽性對照群之小老鼠(實驗群5)，與自惹起第5次的週，僅進行腹部及背部皮膚的剃毛之正常群小老鼠(實驗群6)相比較，確認到視為Prednisolone的塗佈之副作用的體重減少為顯著。該結果表示腺苷N1-氧化物可作為對於皮膚炎的預防劑至治療劑或發炎的惹起所引起的創傷之預防．治療劑使用。
由表19得知，將塗佈加入腺苷N1-氧化物所調製之凝膠的小老鼠(實驗群2)之脾細胞藉由抗CD3抗體刺激時的IL-4、IL-5、IL-6及IFN-γ之產生皆與將塗佈加入純化水所調製之凝膠的小老鼠(實驗群1)之脾細胞藉由抗CD3抗體刺激時的IL-4、IL-6及IFN-γ的產生量相比有顯著低，IL-5亦有降低傾向。並未確認到塗佈含有腺苷或肌苷之凝膠的小老鼠(實驗群3及4)之脾細胞藉由抗CD3抗體刺激時的IL-4、IL-5、IL-6及IFN-γ的產生皆與塗佈加入純化水所調製之凝膠的小老鼠(實驗群1)之脾細胞藉由抗CD3抗體刺激時的產生量有著差距。又，與由僅進行剃毛的正常群小老鼠(實驗群6)與經2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)敏化後塗佈加入純化水所調製之凝膠的小老鼠(實驗群1)所調製並藉由抗CD3抗體刺激的脾細胞所產生的IL-4/IFN-γ之產生量比進行比較時，2,4,6-三硝基氯苯(picryl chloride)敏化小老鼠顯示較高值，確認成為以異位性疾病為特徵的Th2優位狀態。將塗佈腺苷N1-氧化物的小老鼠(實驗群2)之脾細胞，藉由抗CD3抗體刺激所產生的IL-4/IFN-γ之產生量比，因接 近僅進行剃毛的正常群小老鼠(實驗群6)的比率，故表示腺苷N1-氧化物之塗佈為具有將Th2優位之免疫擔任細胞構成回復至正常的作用。且對於塗佈腺苷N1-氧化物之小老鼠(實驗群2)的脾細胞，其IFN-γ的產生與塗佈加入純化水所調製之凝膠的小老鼠(實驗群1)相比較為減少，故確認腺苷N1-氧化物中亦具有Th1細胞所產生之發炎性細胞因子的產生抑制作用。因此，藉由腺苷N1-氧化物之塗佈的皮膚之異位性發炎抑制，判斷為組合這些機制者。
<實驗17>
<對角質細胞的發炎反應之腺苷N1-氧化物的影響>
因於實驗11中確認腺苷N1-氧化物對於異位性皮膚炎之治療效果，本實驗中，對表皮細胞的發炎反應之腺苷N1-氧化物的影響進行調查。表皮細胞接受紫外線等刺激時，產生TNF-α或IL-1等發炎性細胞因子，於皮膚引起發炎，其結果會誘發斑點或皺紋等皮膚障礙並惡化。因此，使用作為人類皮膚模型而廣泛被使用的人類正常角質細胞，檢討以紫外線刺激時對發炎性細胞因子產生的腺苷N1-氧化物之影響。
<實驗方法1>
預先對於35mm培養皿(Becton Dickinson販賣之商品名『Falcon 35-3001』)，將以PBS(K-)稀釋至10倍的組 織培養用膠原(新田明膠公司販賣之商品名『Cellmatrix Type IV』)添加至1ml/plate，在室溫靜置10分鐘後，除去Cellmatrix，並使其風乾，以PBS(K-)進行3次洗淨。於該培養皿中，將懸浮於含有正常人類表皮角化細胞用增殖添加劑(Kurabo股份有限公司販賣之商品名『EDGS』，含有最終濃度30μg/ml之牛血清白蛋白、5μg/ml之來自牛運鐵蛋白、11ng/ml之副腎皮質荷爾蒙、10ng/ml之人類重組型胰島素樣成長因子I型、1ng/ml之人類重組型上皮成長因子、18ng/ml之前列腺素E2)(以下稱為「EDGS」)之表皮角化細胞．角膜上皮細胞基礎培養基(Kurabo股份有限公司販賣之商品名『EpiLife』)(以下稱為EpiLife培養基」)的正常人類表皮角化細胞NHEK細胞(Kurabo股份有限公司販賣的細胞名「NHEK」)(以下稱為「NHEK細胞」)以5×104個/1.5ml/培養皿進行播種。在5容積%CO2恆溫培養於37℃進行培養。於播種後第2天及第4天，換成未含EDGS之EpiLife培養基(1ml/plate)。於細胞播種後第5天，除去培養澄清液，添加漢克斯平衡鹽緩衝液(以下稱為「HBSS(-)緩衝液」)至1ml/培養皿，進行2次洗淨。進一步添加HBSS(-)緩衝液至2ml/培養皿後，於距離紫外線光源約15cm之位置上靜置，以40mJ/cm2的B波紫外線照射。照射後馬上除去HBSS(-)緩衝液，將溶解於未含EDGS之EpiLife培養基至表20所示濃度的腺苷N1-氧化物添加至1.5ml/培養皿，再次於5容積%CO2恆溫培 養內，於37℃進行培養。添加含有腺苷N1-氧化物之培養基4小時及6小時後取出培養澄清液做試品，將對於4小時後的澄清液，藉由販賣的細胞障礙性檢測套組(Roche Diagnostics股份有限公司販賣之商品名『細胞障礙性檢測套組(LDH)』)的乳酸脫氫酵素(以下稱為「LDH」)對細胞外的釋出量作為指標的細胞障礙性，對於6小時後的澄清液，藉由ELISA法測定作為發炎性細胞因子的TNF-α、IL-1α及IL-8量。結果如表20所示。作為對照組，除溶解於未含腺苷N1-氧化物之EpiLife培養基(未含有EDGS)以外，同樣地照射B波紫外線(UVB)，同樣地測定細胞障礙性及細胞因子類之產生量。且作為紫外線光源，使用於實用光源裝置(股份有限公司三和Medical公司販賣的NS-8F型)裝上B波紫外光者，光線量係以紫外線強度計(股份有限公司TOPCON販賣之UVR-305/365D(II))測定。又，TNF-α以與實驗2之相同進行測定。其他細胞因子各使用販賣的IL-1α測定套組(R&D SYSTEMS公司販賣)及IL-8測定套組(BioLegend公司販賣)進行測定。
由表20得知，腺苷N1-氧化物對於由藉由紫外線刺激所誘導的NHEK細胞之TNF-α及IL-8的產生係取決於其濃度而被抑制。又，腺苷N1-氧化物對於由藉由紫外線刺激而增強的NHEK細胞之IL-1α的產生係取決於其濃度而被抑制(實驗群3至5)。相對於此，腺苷及肌苷之使用於該實驗的濃度並未對由藉由紫外線誘導至增強的NHEK細胞的這些發炎性細胞因子的產生造成影響(實驗群6至10)。該結果表示，對於腺苷N1-氧化物的皮膚發炎之抑制作用的機制之一，其係由藉由紫外線刺激的表皮細胞之發炎性細胞因子類的抑制所成。又，腺苷N1-氧化物與腺苷或肌苷相異，將藉由紫外線刺激由NHEK細胞所釋出的LDH依據濃度進行抑制來看，得知腺苷N1-氧化物亦具有對於藉由紫外線所造成之細胞障礙的保護作用。且藉由紫外線刺激，NHEK細胞抑制細胞增殖，但未確認到腺苷N1-氧化物對藉由腺苷或肌苷之添加的細胞增殖造成影響。
<實驗18>
<對於纖維母細胞之氧化壓力的腺苷N1-氧化物之影響>
由實驗17得知腺苷N1-氧化物可減低對於皮膚上皮細胞的紫外線之細胞障礙性，抑制發炎性細胞因子的產生，故本實驗係對於受到藉由紫外線照射的發炎反應之影響的纖維母細胞的細胞障礙所造成的腺苷N1-氧化物之影響進行調查實驗。接受紫外線照射的細胞會生成過剩自由 基，對於周圍細胞產生氧化壓力，故可考慮為發炎反應進一步被增強，作為對細胞施予障礙的氧化壓力使用過氧化氫。
<實驗方法>
於含有10%FCS之D-MEM培養基中，將調製至6×104個/mL濃度之正常人類纖維芽細胞(Kurabo股份有限公司販賣)(以下稱為「NHDF細胞」)，添加於96穴微培養皿(Becton Dickinson販賣)至100μL/格，於CO2恆溫培養內在37℃進行72小時培養。培養後添加以漢克斯液稀釋至400μM濃度的過氧化氫(和光純藥工業股份有限公司販賣)100μL/格(過氧化氫終濃度：200μM)，於CO2恆溫培養在37℃進行2小時培養。且對於無過氧化氫處理者僅添加漢克斯液100μL/格。培養後將培養澄清液全量吸取除去，於含有10%FCS之D-MEM培養基中，添加稀釋至最終濃度至如表21所示濃度的腺苷N1-氧化物100μL/格，並進行24小時培養。其後將培養澄清液全量吸取除去，於含有10%FCS之D-MEM培養基中添加稀釋至20倍的販賣活細胞數計測用試藥溶液(同仁化學股份有限公司販賣之商品名『Cell Counting kit-8』)100μL/格，再於5容積%CO2恆溫培養內在37℃進行2小時反應。最後以盤式分析儀測定450nm之吸光度。求得僅添加培養基進行培養之NHDF細胞的吸光度作為100時的吸光度相對值，作為細胞之生存率(%)表示於表 21。
由表21得知，藉由過氧化氫之添加(實驗群2)NHDF細胞受到障礙之生存率與無添加時(實驗群1)相比較，降至30%。相對於此，添加過氧化氫後，以含有腺苷N1-氧化物之培養基進行培養的細胞(實驗群3至6)中，依據腺苷N1-氧化物濃度的生存率會上昇，在25μM濃度，該生存率回復至89%。又，確認到在該實驗所使用的腺苷N1-氧化物的濃度並未對NHDF細胞之生存率產生影響(實驗群7至10)。該結果表示腺苷N1-氧化物具有由隨著發炎產生的氧化壓力保護細胞的作用，可抑制發炎惡化，不僅可作為紫外線造成的皮膚發炎之預防劑或治療劑，亦可作為心肌梗塞或腦梗塞等血管系統的發炎反應之惡化所造成的種種疾病之預防劑或治療劑使用。
<實驗19>
<對於藉由巨噬細胞之發炎性細胞因子產生的核酸、核酸衍生物之影響>
由實驗1至118判斷出腺苷N1-氧化物與腺苷或肌苷等相比較，顯示優良抗發炎作用，作為該機制之一係在由發炎部位之細胞的TNF-α為主之發炎性細胞因子的產生之抑制上。因此在本實驗對於各種腺嘌呤衍生物的發炎性細胞因子產生之抑制作用強度進行檢討。欲比較對於作為醫藥部外品之抗發炎成分廣泛被使用的甘草酸類於發炎性細胞因子類產生的影響亦進行檢討。
<試驗方法及被驗試料>
使用與實驗2之相同方法所調製的小老鼠巨噬細胞，與實驗2同樣地在LPS(2μg/mL)與小老鼠IFN-γ(10IU/mL)之共存下，作為核酸衍生物，將作為腺苷類使用的腺苷N1-氧化物、腺嘌呤、腺苷、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物、5’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物、腺苷N1-氧化物5’-磷酸(CAS No.4061-78-3)、腺苷、腺苷5’-磷酸、腺嘌呤N1-氧化物(MP Biomedical公司販賣)、肌苷、作為鳥嘌呤類使用的鳥嘌呤、鳥苷、鳥苷5’-磷酸、8-OH-去氧鳥嘌呤或8-OH-鳥苷在各PBS中稀釋至最終濃度為0.05至200μM，添加至50μL/格，在5容積%CO2恆溫培養於37℃，進行20小時培養。又，作為腺嘌呤之衍生物其臨床開發正進行的IB-MECA(1-脫氧-1-〔6- 〔〔(3-碘苯基-)甲基〕胺〕-9H-嘌呤-9-基1〕-N-甲基-β-D-核呋喃糖醛醯胺，Sigma販賣)及作為醫藥部外品的抗發炎成分而廣泛被使用的作為甘草酸類之甘草酸酸二鉀與18β-甘草次酸使用含有10%FCS之RPMI-1640培養基，稀釋至最終濃度為0.05至200μM以50μL/格添加，於5容積%CO2恆溫培養在37℃進行20小時培養。培養終了後，回收各格的培養澄清液，使用ELISA法，依據測定細胞因子及前列腺素E2(以下稱為「PGE2」)之結果，求得在LPS與小老鼠IFN-γ之共存下，將未添加核酸衍生物進行培養時的各細胞因子產生量抑制至50%的核衍生物或抗發炎劑之濃度(以下稱為「IC50濃度」)如表22所示。且使用於IC50之鑑定的核酸衍生物之濃度，以使用於實驗18之相同販賣的活細胞數計測用試藥溶液進行測定而求得，在LPS與小老鼠IFN-γ共存下，未添加核酸衍生物進行培養時的細胞之生存率作為100%時，採用生存率不會降至90%之情況。結果如表22所示。
由表22得知，對於由以LPS與小老鼠IFN-γ刺激的小老鼠腹腔內巨噬細胞的TNF-α產生之抑制，在使用於實驗之核酸衍生物中，腺苷N1-氧化物及IB-MECA顯示最低濃度之IC50，其次3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸顯示次強之TNF-α產生抑制效果。這 些以外的腺嘌呤衍生物或鳥嘌呤類或甘草酸類僅顯示弱TNF-α產生抑制。又，對於腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸可強烈抑制IL-6的產生，在IB-MECA並未確認到IL-6之產生抑制。且腺苷N1-氧化物及3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物對於發炎性介質之PGE2及IL-12的產生顯示抑制作用。該結果表示腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸可作為發炎性疾病之預防劑或治療劑使用，腺苷N1-氧化物顯示更佳結果。又，腺嘌呤類中，亦以腺嘌呤或腺苷、腺苷5’-磷酸、腺嘌呤N1-氧化物等較為弱，僅具有發炎性細胞因子產生抑制作用，故腺苷N1-氧化物部分顯示強抗發炎作用。另外，5’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物的作用效果比3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物弱之理由推測為，於活體內存在之α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物難受到可分解成腺苷N1-氧化物與葡萄糖的葡萄糖苷酶的作用之故。
<實驗20>
<急性毒性試驗>
將腺苷N1-氧化物2g、3’-α-葡萄糖基N1-氧化物2g或腺苷N1-氧化物5’-磷酸2g，各溶解於100mL的PBS中，於BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的6週齡的雌性老鼠，平均體重20g)10隻之腹腔內，投與1mL/隻，該經過進行24小時觀察。作為對照 組，於BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的6週齡的雌性老鼠，平均體重20g)10隻之腹腔內，僅投與PBS至1mL/隻，該經過進行24小時觀察。僅投與腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基N1-氧化物、腺苷N1-氧化物5’-磷酸或PBS後24小時，取出血液及尿，進行作為腎功能及肝功能之指標的臨床檢查。對於投與腺苷N1-氧化物或其衍生物之小老鼠皆自投與後至觀察終了，並無確認到外觀變化，對於作為腎功能及肝功能之指標的臨床檢查值，與對照組的小老鼠並無確認到差異。該結果表示腺苷N1-氧化物或其衍生物的LD50為1,000mg/kg以上，對於人類之投與亦顯示高安全性。且，腺苷N1-氧化物對於PBS之溶解度為20mg/mL程度，故對於小老鼠進行腺苷N1-氧化物之1,000mg/kg以上投與時，該溶液之投與量超過1mL，投與量過多而使小老鼠產生負荷，故無實施1,000mg/kg以上之投與試驗。
以下舉出實施例對本發明做進一步詳細說明，但本發明並未受到這些實施例任何限定。且以下實施例中皆以實驗1所記載之方法為準，使用由股份有限公司林原生物化學研究所所製造之腺苷N1-氧化物(腺苷N1-氧化物純度約99.5%，無發熱物質)。
[實施例1]
<注射用劑>
將腺苷N1-氧化物3.5g溶解於適量之注射用純化水。於該腺苷N1-氧化物溶液溶解氯化鈣0.1g、氯化鉀0.15g、氯化鈉3.0g及乳酸鈉1.55g、α,α-海藻糖25g，加入注射用水至全量500mL。將此經過濾滅菌後各100mL填充於塑膠袋中並密封，調製出無發熱物質的注射用發炎性疾病治療劑。本品可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
對於由上述所調製的注射劑之安定性進行評估。作為對照組，取代腺苷N1-氧化物使用腺苷3.5g以外，使用與上述同樣地調製的標品。即，將由上述所調製的製劑，使用未含有人類血清的D-MEM培養基(實驗群1)或含有10%(v/v)人類血清之D-MEM培養基(實驗群2)，溶解腺苷N1-氧化物的濃度至100μM，在37℃進行7或24小時恆溫培養。恆溫培養終了後，於兩培養基中將殘存腺苷N1-氧化物量藉由下述條件以HPLC測定波峰面積，求得以未含血清的培養基稀釋後(0小時)的腺苷N1-氧化物之波峰面積作為100之相對值(%)，腺苷N1-氧化物的殘存率如表23所示。對於對照標品亦同樣底使用未含有人類血清之D-MEM培養基(實驗群3)或含有10%(v/v)人類血清之D-MEM培養基(實驗群4)，溶解至腺苷的濃度至100μM，在37℃進行24小時恆溫培養。將 於恆溫培養終了後的培養基中所殘存之腺苷量藉由下述條件以HPLC進行測定。測定HPLC之溶離波峰面積，求得以未含血清之培養基稀釋後(0小時)的腺苷之波峰面積作為100之相對值(%)，腺苷N1-氧化物或腺苷之殘存率合併如表23所示。且對於腺苷，取出在恆溫培養開始培養7小時的培養基一部份，測定所含之腺苷量。結果合併如表23所示。
<HPLC條件>
HPLC裝置：SHIMADZU UV-VIS DETECTOR SPD-10AV
LC-10AT(幫浦)
C-R8A(記錄計)
SIL-20AC(自動取樣器)
分析用管柱：ODS管柱(YMC公司製之製品名『YMC-Pack ODS-A』4.6×250mm)
移動相：0.1%乙酸水溶液：甲醇=96：4
檢測感度(AUFS)：0.01
檢測波長：260nm
流速：1mL/分
測定用取樣注入量：20μL
管柱溫度：40℃
由表23得知腺苷(AN)及腺苷N1-氧化物(ANO)在非存在人類血清下即使進行24小時恆溫培養後亦100%殘存(實驗群1及實驗群3)。相對於此，腺苷在人類血清的存在下，經7小時恆溫培養後完全消失(實驗群4)，相對於此腺苷N1-氧化物在人類血清存在下，即使進行24小時恆溫培養後亦100%殘存(實驗群2)。該結果表示與在人類血液中會快速分解的腺苷(例如參照『The European Journal of Pharmacology』、93卷、21頁(1983年))相異，將腺苷N1-氧化物投與於人類時，在血清中亦不容易被分解，可發揮長期間發炎性疾病治療劑的效果。
[實施例2]
<注射用劑>
將腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸各溶解於2gPBS100mL。將此各經無菌過濾後分別5mL填充於玻璃製Vial瓶，經凍結乾燥 後成為粉末狀，再經密封而作為用時溶解型的無發熱物質之注射用發炎性疾病治療劑。本品亦可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
評估上述所調製之製劑的安全性。即，於上述調製之各製劑中加入注射用純化水5mL並溶解，對於BALB/c小老鼠(日本Charles River股份有限公司販賣的9週齡的雌性老鼠)各10隻，以0.3mL/隻進行1天1次，每日7天之靜脈內投與。投與開始至2星期間，每天測定體重，並觀察其過程，對於10隻BALB/c小老鼠將PBS溶液以0.3mL/隻進行1天1次、每日7天之靜脈內投與，與觀察過程的情況相比較，對於投與任一製劑之情況，並未確認到體重之顯著變化，亦無確認到其他外觀之變化。且於投與開始2週後取出血液與尿，進行作為腎功能及肝功能之指標的臨床檢查值之測定後，確認與僅投與PBS之情況並無差異。該結果表示含有腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物或腺苷N1-氧化物5’-磷酸之製劑皆對人類投與時顯示高安全性。
[實施例3]
<注射用劑>
將腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及 腺苷N1-氧化物5’-磷酸各溶解於2g注射用生理食鹽水100mL，將此經過濾滅菌後經凍結乾燥成為粉末化。將此填充於各下室填充純化水100mL的塑質製複室容器的上室中，調製出無發熱物質的發炎性疾病治療劑。本品可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
評估在上述所調製之各製劑的溶血性之有無。即，由BALB/c小老鼠之心臟在肝素存在下採血的血液以PBS洗淨3次後，懸浮於PBS，作為5×1010個/mL之紅血球懸濁液。將該紅血球懸濁液與上述所調製之各製劑溶解於下室之生理食鹽水的溶液做等量混合，在37℃處理30分鐘後經離心，測定澄清液之580nm的吸光度。將相同紅血球懸濁液與注射用生理食鹽水做等量混合，在37℃經30分鐘處理後離心，測定澄清液的580nm之吸光度，比較兩者。並未確認到兩者吸光度之差異，故判斷這些製劑皆無顯示紅血球溶血作用。
[實施例4]
<注射用劑>
各2g的腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸與各氯化鈣0.02g、氯化鉀0.03g及氯化鈉0.6g、α,α-海藻糖1g溶解於注射用水 85mL，加入注射用水至全量為100mL。將此於過濾滅菌後塑膠袋填充並密封後調製出無發熱物質之發炎性疾病治療劑。本品調製為發炎性疾病治療劑。本品可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
[實施例5]
<注射用劑>
將各2g的腺苷N1-氧化物3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸溶解於磷酸緩衝生理食鹽水100mL。經無菌過濾後以凍結乾燥進行乾燥成為粉末狀，將此各2mL於玻璃製Vial瓶填充並密封後，調製出用時溶解型之注射用發炎性疾病治療劑。本品可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
[實施例6]
<經口用劑>
將腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸之任一10質量份與α,α-海藻糖90 質量份、硬脂酸鎂0.2質量份混合，依據常法對各0.5g進行打錠，調製出經口用發炎性疾病治療劑。本品可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病的預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
[實施例7]
<經口用劑>
將腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物及腺苷N1-氧化物5’-磷酸中任一1質量份與無水結晶麥芽糖(林原商事販賣之商品名「芳因多司」)30質量份、硫酸鎂0.4質量份攪拌混合至均勻。將此混合物各依據常法進行各0.2g打錠，調製出經口攝取用發炎性疾病治療劑。本品可作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。
[實施例8]
<粉末劑>
對於純化水20質量份，於腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物或腺苷N1-氧化物5’-磷酸之任一1質量份中，各添加α-葡萄糖基橙皮苷或α-葡萄糖基芸香 苷2質量份、環亞硝醯基黑曲霉糖(環狀四糖：股份有限公司林原生物化學研究所製造)1質量份，各攪拌溶解後依據常法進行噴霧乾燥調製出3種類抗發炎性疾病治療劑。本品可直接或加入其他食品、化妝品、醫藥部外品及/或醫藥品用之可經口攝取的添加劑等組成物的形態進行經口攝取，作為敗血症、類風濕關節炎、ARDS、肝炎、發炎性腸疾病等發炎性疾病之預防劑或治療劑利用。又，本品亦可作為TNF-α產生抑制劑、IL-6產生抑制劑、IL-12產生抑制劑或IL-10產生增強劑使用。又，將本品溶解於水或加入化妝品或醫藥品用添加劑的皮膚外用劑之形態下塗佈於皮膚，可改善異位性皮膚炎或因日曬引起的皮膚炎為主的皮膚發炎，維持良好的皮膚狀態之同時，亦可減輕對皮膚之黑色素沈澱。
<配合例1：對於發炎性疾病治療之乳霜形態的組成物之配合例>
加入純化水使全量至100質量%。
欲確認含有腺苷N1-氧化物之皮膚改善劑的有效性，使用上述配合組成之乳霜，實施義工試驗。即藉由問診選出有著慢性皮膚粗糙煩惱的30至50歳的女性40名作為被驗者，隨意各10名分為4群。對於1群10名將上述乳霜(腺苷N1-氧化物配合：乳霜1)於皮膚粗糙部分以1天3次(早、午、晚)，進行1個月期間之每日塗佈。對於1群10名將上述乳霜(3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物配合：乳霜2)於皮膚粗糙部分以1天3次(早、午、晚)，進行1個月期間之每日塗佈。對於1群10名，取代腺苷N1-氧化物或3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物，添加1質量%之腺苷以外，將與上述相同配合之乳霜(腺苷配合：乳霜3)於皮膚粗糙部分以1天3次(早、午、晚)，進行1個月期間之每日塗佈。對於剩下的1群10名，除未含本發明之皮膚改善劑或腺苷以外，將與上述相同配合之乳霜(乳霜4)於皮膚粗糙部分以1天3次(早、午、晚)，進行1個月期間之每日塗佈。藉由下述方法，測定皮膚之水分量的同時，將皺紋狀態作為皺紋分 數進行評估，判定皮膚粗糙之狀態。且藉由該方法，皮膚粗糙狀態與塗佈被驗試料前相比較，顯示塗佈後的皮膚水分量提高，皺紋分數變低之程度改善。
<肌的水分量之測定方法>
於乳霜的塗前日及塗佈終了第二天，測定乳霜塗佈部位之皮膚的水分含量及皺紋分數。皮膚之水分含量使用水分含量測定裝置(IBS公司販賣之商品名『SKICON-200EX』)進行測定，塗佈各乳霜之被驗者10名的水分含量之平均值如表24所示。
<皺紋分數的判定方法>
皺紋分數的判定為對於各被驗者，由判定者5名之目視，依據化妝品功能評估指導(參照『日本香粧品學会誌』，30卷，4號，第316至332頁(2006年))，以表25所示8段階的皺紋分數(0至7等級)進行評估。將對於各被驗者之判定者5名的平均值，作為該被驗者之皺紋分數，塗佈各乳霜之被驗者10名的皺紋分數平均值合併如表24所示。
如表24所記載，塗佈添加腺苷N1-氧化物的乳霜(乳霜1)及添加3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物之乳霜 (乳霜2)的情況中，與塗佈前比較，塗佈後的皮膚水分量及皺紋分數有顯著改善，改善皮膚粗糙。在改善效果之強度點上，添加腺苷N1-氧化物的乳霜具有較強傾向。相對於此，取代腺苷N1-氧化物或3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物，添加腺苷的乳霜(乳霜3)、及未添加腺苷N1-氧化物、3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物或腺苷之乳霜(乳霜4)中，皮膚水分量及皺紋分數亦於塗佈後，與塗佈前比較並未有顯著改善，並未改善皮膚粗糙。塗佈添加腺苷N1-氧化物之乳霜(乳霜1)及添加3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物之乳霜(乳霜2)的期間中及試驗終了後，並未有被驗者對於乳霜塗佈引起的異常，故可判斷腺苷N1-氧化物具有優良安全性。
且使用上述乳霜，對於藉由曬傷(紫外線)所誘發之發炎及黑色素生成的影響由義工進行評估。
<被驗者>
將年齡為22至45歳之男女性合計20名(男性10名、女10名)作為對象。被驗者藉由預先問診，在夏天之戸外進行30至45分鐘程度的日光浴時，非常容易曬傷(變紅)中除去絕對不會曬黑的人類、及絕對不會曬傷(不會變紅)、變的非常黑之人類。
<紫外線照射裝置>
光源裝置(三和Medical公司販賣的NS-8F型)
紫外線螢光燈(東芝公司販賣的FL-20SE)5根
<最小紅斑線量的測定>
對於預先確認各被驗者的右上腕內側部無斑點或傷，幾乎均勻皮膚色的部位上，將25、50、75、100、125及150mJ/cm2之任一紫外線(UVB)，於各1×1cm之範圍進行照射。於照射24小時後以目視觀察照射部位，確認紅斑之紫外線最小照射量作為被驗者之最小紅斑線量。
<炎反應症程度之測定>
記錄至各被驗者之紫外線照射部位的紅斑藉由目視及數位照相機之影像無法確認及開始色素沈澱的期間。
<黑色素指數測定>
藉由分光測色計(Konicaminolta販賣之CM-700d)測定黑色素指數。
<試驗方法>
確認被驗者之左上腕內側部上無斑點或傷。於試驗開始日於各被驗者之被驗部位4處，各照射最小紅斑線量之1.5倍量紫外線(UVB)。照射部位係以各被驗試料塗佈部位之1×1cm的範圍。藉由最初UVB照射後，以1天3次(朝、午、夜)進行每日28天，將乳霜1至4的任一各以約0.3g/被驗試料/次由指尖取出塗佈於被驗部位。此 時，注意乳霜不與其他乳霜混合。試驗期間中乳霜塗佈後30分鐘不要洗掉塗佈部位。日常生活中，被驗試料塗佈部位或其周邊不要曝曬於日光等強紫外線。且試驗以雙盲法實施。
<評估方法>
自紫外線照射開始日至照射開始第7天，每日被驗部位由目視進行觀察及數位照相機進行撮影，確認沒有紫外線照射部位的紅斑之日子，對於各乳霜，求得確認無紅斑之日子平均值，如表26所示。又，經紫外線照射24小時後，塗佈各乳霜之部位的紅斑程度，與塗佈乳霜3之部位做比較，以強(2)、無差異(0)、弱(-2)之3段階做分數化，對於各乳霜合計分數求得平均。藉由目視之效果判定由5名實施，求得該分數平均。求得無法確認之日子平均值並合併於表26所示。且，自紫外線照射開始日至第28天，進行紫外線照射部位之目視的判定與黑色素指數之測定，確認色素沈澱之程度。塗佈各乳霜之部位的20名結果平均合併於表26所示。且，藉由目視之色素沈澱的程度與乳霜塗佈部位相比，被驗試料1、2或3塗佈部位之色素沈澱以明顯較多(-2)、稍多(-1)、無差異(0)、稍少(1)、明顯較少(2)之5段階進行分數化，對於各乳霜合計分數求得平均。以目視之效果判定由5名實施，求得該分數之平均。又，黑色素指數係將乳霜4的測定值作為100(%)，求得其他乳霜塗佈部位之相 對值，求得其平均值。本試驗藉由目視之分數越高，色素沈澱抑制(黑色素生成抑制)效果越高，黑色素指數之比率(%)越低，色素沈澱抑制(黑色素生成抑制)效果越高。
如表26所示，塗佈含有腺苷N1-氧化物之乳霜(乳霜1)及添加3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物之乳霜(乳霜2)的部位，與塗佈未含有此等化合物之乳霜基劑(乳霜4)的部位做比較，藉由目視由分數及黑色素指數任一來看，色素沈澱顯著被抑制。由抑制強度之觀點來看，添加腺苷N1-氧化物之乳霜具有較強傾向。塗佈含有腺苷之乳霜(乳霜3)的部位，與塗佈乳霜4的部位在色素沈澱之程度上並無差異。該結果及前述水分量及皺紋之結果表示，腺苷N1-氧化物或3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物具有優良的改善皮膚狀態的作用。又，合併上述實驗結果時， 藉由腺苷N1-氧化物或3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物之該皮膚狀態之改善效果推測為，藉由老化或紫外線照射等所產生之皮膚發炎可有效地抑制之作用。且於被驗者之被驗試料塗佈部位，除確認到藉由紫外線照射之紅斑及色素沈澱以外，並未確認到發紅或濕疹等異常產生。又對於被驗者之健康狀態亦無任何問題產生，故推測腺苷N1-氧化物或3’-α-葡萄糖基腺苷N1-氧化物即使塗佈於皮膚上亦無安全性問題。
<配合例2：對本發明的發炎性疾病治療劑之溶液形態的組成物之配合例>
加入純化水後使全量成為100質量%。
本配合例之組成物藉由該典型使用形態，改善皮膚發炎，可維持良好皮膚狀態。又，本配合例之皮膚外用劑亦具有優良美白效果。
<配合例3：對本發明之發炎性疾病治療劑的封包形態之皮膚外用劑的配合例>
加入純化水至全量成100質量%。
本配合例之組成物藉由該典型使用形態，改善皮膚發炎，可維持良好皮膚狀態。又，本配合例之皮膚外用劑亦具有優良美白效果。
<配合例4：對於本發明之發炎性疾病治療劑的膏狀牙膏形態之皮膚外用劑的配合例>
加入純化水使全量成為100質量%。
本配合例之組成物藉由該典型使用形態，可改善齒周病等引起的牙根或口腔內發炎，無持良好之口腔內狀態。又，本配合例的皮膚外用劑亦具有優良的牙根的暗沈改善效果。
產業上可利用性
本發明的含有作為有效成分的腺苷N1-氧化物類之發炎性疾病治療劑，可作為敗血症、肝炎、發炎性腸疾病、溶血性尿毒症、胰臟炎、腎炎、皮膚炎為主的各種發炎性疾病的預防劑或治療劑，而利用於醫藥品、食品、化妝品、醫藥部外品之領域上。

Claims (6)

  1. 一種使用於抑制或改善斑點、色素沈澱、皺紋、粗糙或皮膚老化之組成物，其特徵為作為有效成分含有選自腺苷N1-氧化物、3’-α-糖基腺苷N1-氧化物、5’-α-糖基腺苷N1-氧化物、腺苷N1-氧化物5’-磷酸、腺苷N1-氧化物5’-二磷酸、及腺苷N1-氧化物5’-三磷酸的1種或2種以上者。
  2. 如請求項1之組成物，其中以腺苷N1-氧化物換算時含有0.01至10質量%。
  3. 如請求項1或2之組成物，其為食品或化妝品之形態。
  4. 如請求項1至3中任一項之組成物，其為錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸濁劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑之形態者。
  5. 如請求項3之組成物，其中化妝品為皮膚外用劑之形態者。
  6. 如請求項5之組成物，其中皮膚外用劑為乳霜、軟膏、乳液、洗劑(lotion)、化妝水、乳膠、慕斯、封包或沐浴劑。
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