JP7022864B2 - 医薬品組成物及び化粧品組成物 - Google Patents
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Description
第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む。第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清の凍結乾燥物を含んでいてもよい。第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清をナノカプセル等のカプセル又はナノエマルジョン等のエマルジョン中に含んでいてもよい。
第2実施形態に係る抗紫外線物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、任意により分化誘導した皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、紫外線による皮膚細胞のダメージが少ない溶液又は紫外線を受けた皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、を含む。なお、患者はヒトに限定されず、非ヒト動物も含む。
血液細胞、上皮細胞、体性幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、及び歯髄幹細胞であるが、特に限定されない。iPS細胞は、早老症患者由来の体細胞に、OCT3/4、KLF4、c-MYC、及びSOX2等の初期化因子を導入することにより誘導される。iPS細胞から皮膚細胞を分化誘導する際には、例えば、bFGFを含まない培養液を入れた細胞低接着ディッシュにiPS細胞を播種する。その後、2日おきに培地を交換し、8日後に形成された胚様体(EB)をディッシュに播種し、細胞をディッシュに接着させ、10%FBS培地で細胞を培養する。細胞がコンフルエントになったところで、トリプシンで細胞をディッシュから剥がし、継代培養する。同様に継代培養を1か月繰り返す。その後、CD13等の線維芽細胞マーカーを用いて、細胞が線維芽細胞に分化したことを確認する。また、TRA 1-60等のiPS細胞マーカーを用いて、細胞に未分化のiPS細胞が残っていないかを確認してもよい。分化誘導される皮膚細胞は、例えば皮膚線維芽細胞であるが、特に限定されない。
第3実施形態に係る皮膚の紫外線耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線による皮膚細胞のダメージを検査することと、を含む。
第4実施形態に係る抗乾燥物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
第5実施形態に係る皮膚の乾燥耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
第6実施形態に係る抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
第7実施形態に係る皮膚の酸化ストレス耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
第8実施形態に係る保湿促進物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、複数の異なる溶液から皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、を含む。
第9実施形態に係る皮膚の保湿能力の検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を培養することと、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、を含む。
mTeSR1(登録商標、STEMCELL Technologies)又はStemFit(登録商標、Ajinomoto)を用いて、Matrigel(登録商標、コーニング)又はLaminin511でコートした接着培養用シャーレ上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ES細胞解離液(TrypLE Select、登録商標、ThermoFisher)で処理した。
増殖培地Aとして、10%FBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEM培地を用意した。次に、成人由来正常ヒト線維芽細胞(KF-4109、Strain No.01035、クラボウ)を、濃度が5×103細胞/0.1mL/ウェルとなるよう増殖培地Aで懸濁し、96ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
iPS細胞をマトリゲルコート及びラミニンコートのそれぞれの上で、Teser1、Teser2、Stem Fit、Essential8、Teser-E8、Nutri Stemのそれぞれを使用して培養をした。iPS細胞が80%コンフルエントになった段階で、トリプルセレクトを使ってiPS細胞を培養器から剥がし、剥がされたiPS細胞を含む溶液を5分間、200gで遠心して、iPS細胞を1.5mLのチューブに集めた。その後、すりこ木(Pestle in G-Tube、Thermo Fisher)でiPS細胞の細胞塊をすり潰し、すり潰されたiPS細胞のペーストを含むiPS細胞の抽出液を液体窒素で瞬間凍結した。iPS細胞の抽出液を使用するときは、5mLの培養液にiPS細胞の抽出液を懸濁し、一晩4℃でインキュベートし、翌日に懸濁液を10分間1500gで遠心して、細胞破砕片を溶液から除去した。その後、溶液をフィルターでろ過し、フィルターを通過した溶液を、iPS細胞の抽出液とした。
実施例2と同様に成人由来正常ヒト線維芽細胞を増殖培地Aを用いて培養した。また、実施例2と同様に試験培地Aを用意した。次に、実施例3に係るiPS細胞の抽出液と、試験培地Aと、を、混合し、濃度が50.0v/v%又は100.0v/v%の実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む抽出液添加培地Aを得た。線維芽細胞を培養している一部のウェル内の増殖培地Aを、抽出液添加培地Aに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン、及びiPS細胞の抽出液を添加していないDMEM培地(無添加試験培地A)に置換した。
増殖培地Bとして、専用添加剤(牛胎児血清、インスリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、牛下垂体抽出液、サイプロテロンアセテート)添加済みの毛乳頭細胞専用培地(Cat.No.TMTPGM-250、TOYOBO)を用意した。次に、正常ヒト毛乳頭細胞(Cat.No.CA60205a、Lot.No.2868、TOYOBO)を、濃度が1.2×104細胞/0.3mL/ウェルとなるよう増殖培地Bで懸濁し、typeIコラーゲンコート48ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
実施例5と同様に、増殖培地Bで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう、実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が50.0v/v%及び100.0v/v%となるよう、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した。
実施例5と同様に、増殖培地Bで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう、実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が50.0v/v%及び100.0v/v%となるよう、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した。
成人由来正常ヒト線維芽細胞を濃度が1×105から2×105細胞/ウェルとなるよう10%FBS培地で懸濁をして遊走能を測定するキット(Radius Cell Migration Assay、登録商標)のプレートに播種した。次に、10μg/mLのマイトマイシンC(Cat.No.20898-21、Nacalai tesque)でヒト線維芽細胞を2時間処理し、ヒト線維芽細胞の細胞分裂を停止させた。その後、ヒト線維芽細胞を、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
ウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞(AG04110)、色素性乾皮症患者由来の線維芽細胞(GM16684及びGM16687)、及びコケイン症候群患者由来の線維芽細胞(GM01098)をCoriell Institute for Medical Researchから購入した。これら早老症患者由来の線維芽細胞をiPS細胞に誘導した。さらにiPS細胞を、皮膚線維芽細胞に分化誘導した。
成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを、濃度が2×105細胞/ウェルとなるよう試験培地Aで懸濁し、6ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
実施例10と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Aを用いて1日間培養した。翌日、クリーンベンチの通気口内で各ウェルを40秒乾燥をさせた。次に、一部のウェル内の試験培地Aを、参考例1に係る上清添加培地Aに置換した。また、実施例1に係る上清溶液と、試験培地Aと、を、体積比で、10.00:90.00となるよう混合し、濃度が10.00v/v%の実施例1に係る上清添加培地Aを得た。一部のウェル内の試験培地Aを、実施例1に係る上清添加培地Aに置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
実施例10と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Aを用いて1日間培養した。翌日、それぞれのウェルの試験培地Aに、濃度が0.03%になるように過酸化水素を加えた。10分後、一部のウェル内の培地を過酸化水素を含まない試験培地Aに戻した。また、一部のウェル内の培地を実施例1及び参考例1に係る上清添加培地Aのそれぞれに置換した。さらに、一部のウェル内の培地を、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む培地に置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
特開2016-128396号公報に記載の実施例に準じてヒトiPS細胞を培養した。すなわち、実施例1と同じ幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトiPS細胞を、0.25%トリプシン、0.1mg/mLのコラゲナーゼIV、1mmol/LのCaCl2、及び20%のKSRを含む剥離溶液で処理した。
Claims (4)
- 多能性幹細胞の抽出物を含む、発毛剤、又は育毛剤。
- 前記多能性幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記多能性幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項1に記載の発毛剤、又は育毛剤。
- 多能性幹細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞の活性化剤。
- 前記多能性幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記多能性幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項3に記載の毛乳頭細胞の活性化剤。
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