KR20160003512A - 저분자 화합물로 인한 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 성장인자의 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법 - Google Patents

저분자 화합물로 인한 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 성장인자의 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제니핀(Genipin)을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물에 관한 것으로,
본 발명에서는 제니핀(Genipin)을 함유하는 배지에서 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있으며, 특히, 중간엽 줄기세포의 성장인자의 측분비 효과를 극대화하여 인간 성장인자를 대량으로 얻을 수 있다.

Description

저분자 화합물로 인한 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 성장인자의 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법{Fine controlled the expression and the production of growth factors of human bone marrow derived mesenchymal stem by small molecule}
본 발명은 저분자 화합물로 처리된 중간엽 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 저분자 화합물을 이용하여 줄기세포에서 분비되는 성장인자 중에서 특정 기능과 관련된 성장인자의 발현을 높이는 것에 관한 것이다.
줄기세포는 1960년 대에 캐나다 Ontario cancer institute의 Ernest A. McCulloch와 James E. Till에 의해 발견되었으며, 무한 자기복제 능력과 정상 염색체 유지 및 다양한 세포로의 분화능력을 갖고 있는 세포를 의미한다. 줄기세포의 유래에 따라 성체 줄기세포와 배아 줄기세포 및 그리고 최근에 개발된 역분화 줄기세포 등으로 나누어지는데 윤리적 논란이 있는 배아 줄기세포와 안전성이 확인되지 않은 역분화 줄기세포보다는 성체 줄기세포를 활용한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
성체 줄기세포는 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포활성화 물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제한다고 알려져 있다. 성체 줄기세포의 가장 중요한 생물학적 역할은 손상된 조직을 재생시키는데 있고, 평소에도 손상을 입자 않도록 꾸준히 복구하며 여러 가지 생리-생화학적인 일들을 하고 있으나 조직이 크게 손상된 경우 줄기세포들은 여러 가지 복부방법으로 손상된 부위를 빠르게 복구할 수 있다. 줄기세포를 피부에 적용하고자 하려는 아이디어는 다음 두 가지 실험에서 얻어졌는데, 쥐를 이용한 실험에서 손상된 조직에 줄기세포를 투여하면 손상된 부위가 복구될 수 있으며, 손상된 모낭은 줄기세포를 투여하면 새로운 털이 자라는 것을 볼 수 있다는 실험결과에서 줄기세포의 항노화, 항염증, 상처치유는 물론 탈모방지나 육모 등에 이용하려는 시도로 이루어지고 있다.
화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학 및 약학 등의 기초과학과 응용 기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써, 피부에 다한 안전성, 효능 및 사용 편의성 등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능뿐 아니라 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다. 이 점에서, 최근 기능성이 높은 줄기세포에서 분비되는 성장인자들을 화장품에 적용하여 기능성이 높은 제품을 개발하고자 하는 시도들이 꾸준히 화장품 업체와 관련 소재개발 바이오 기업들을 중심으로 진행되고 있다.
표피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 피부의 주름을 줄이고 상처 후 재생을 효과적으로 돕는다고 보고되었다(비특허문헌 1). 또한, 재상피화(re-epithelialization)와 결합 조직 재생(connective tissue regeneration)에도 중요하며 줄기세포의 피부조직세포로의 분화에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).
인간 형질 전환 성장인자 베타1(Transforming growth factor- β1, TGF β1)은 표피섬유아세포를 자극하여 콜라겐 타입 1과 3(Collagen type 1 and 3), 알파 평활근 엑틴(Alpha smooth muscle actin), 기질 금속단백분해효소-1, 2, 8(matrix metalloproteinase-1, 2, 8)의 mRNA와 단백질의 발현을 증가시켜 상처 후 재생을 촉진시킨다고 보고 되었다(비특허문헌 3). 특히 줄기세포에서 유래된 인간 형질 전환 성장인자 베타 1이 B16 멜라닌세포에서 멜라닌의 형성을 억제하여 미백효과를 보였다는 보고로 인하여 기능성 화장료 조성물의 핵심 인자로 알려졌다(비특허문헌 4).
간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)는 망막색소 상피세포(Retinal pigment epithelium cell)에 세포의 사멸을 유도하는 DL-buthionine-(S,R)-sulfoxinine(BSO)를 처리했을 때, 세포 내 반응성 산소종(Intracellular reactive oxygen species, iROS)의 발현감소와 Bcl-2의 발현을 증가시켜 강력한 항산화 효과를 통하여 세포사멸을 감소시킨다고 보고 되었다(비특허문헌 5).
맥관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관신생을 돕고 노화되어 피부세포 내에 증가된 과산화물 발현을 낮추어 세포의 대사활성을 회복시킨다고 다양한 연구를 통해 널리 알려져 있다.
1. Wang X, Li C, Zheng Y, Xia W, Yu Y, Ma X; Expert Opin Biol Ther 2012 sep; 12(9):1129-39 2. Huang S, Lu G, Wu Y, Jirigala E, Xu Y, Ma K, Fu X; J Dermatol Sci. 2012 Apr;66(1):29-36 3. Shi JH, Guan H, Shi S, Cai WX, Bai XZ, Hu XL, Fang XB, Liu JQ, Tao K, Zhu XX, Tang CW, Hu DH; Arch Dermatol Res. 2013 May;305(4):341-52 4. Kim WS, Park SH, Ahn SJ, Kim HK, Park JS, Lee GY, Kim KJ, Whang KK, Kang SH, Park BS, Sung JH, Biol Pharm Bull. 2008 Apr;31(4);606-10 5. Jin M, Yaung J, Kannan R, He S, Ryan SJ, Hinton DR; Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Nov; 46(11):4311-9
본 발명의 목적은 저분자 화합물로 유도된 중간엽 줄기세포의 성장인자 함유 배양액을 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001

또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 전술한 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 생산된 줄기세포 성장인자를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 제니핀(Genipin)을 함유하는 배지에서 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있으며, 특히, 중간엽 줄기세포의 성장인자의 측분비 효과를 극대화하여 인간 성장인자를 대량으로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 배양된 배양액 중의 성장인자는 주름 개선, 미백 및 항산화 효과가 기대되어 피부 외용제 또는 화장료에 사용할 수 있다.
도 1 및 2는 본 발명의 실시예에 의해 제조된 배지 중의 특정 성장인자와 사이토카인의 발현을 측정한 분석결과 사진(도 1) 및 그래프(도 2)이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 줄기세포 성장인자의 대량 생산을 위한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, 화학식 1의 화합물이라 한다.)의 용도, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물 및 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.
여기서, 용어 ‘줄기세포 성장인자’는 줄기세포에서 분비되는 성장인자를 의미한다.
[화학식 1]
Figure pat00002

본 발명에서 줄기세포 성장인자의 대량 생산을 위한 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, 화학식 1의 화합물이라 할 수 있다.)은 제니핀(Genipin)일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 합성하여 이용하거나, 시판되고 있는 화합물을 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 ‘줄기세포’는 스스로 세포 분열을 할 수 있고, 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 이러한 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 한 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 상기 골수 또는 조직 등의 채취 대상 동물은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로 인간일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 특히 본 발명에서는 인간 골수에서 유래된 중간엽 줄기세포(이하, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포라 할 수 있다.)를 이용할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포에서는 성장인자가 세포 밖으로 분비된다. 이러한, 중간엽 줄기세포에 분비되는 성장인자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE2(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, EGF(epidermal growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 줄기세포에서 분비되는 성장인자(줄기세포 성장인자)는 주름 개선 효과, 항산화 효과 또는 미백 효과를 가지는데, 주름 개선 효과를 가지는 성장인자는 IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor) 또는 HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE2(Prostaglandin E2)일 수 있고, 미백 효과를 가지는 성장인자는 TGF-β1(Transforming growth factor beta1), SCF(stem cell growth factor), FGF(fibroblast growth factor) HGF(Hepatocyte Growth Factor) 또는 α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone)일 수 있으며, 항산화 효과를 가지는 성장인자는 IGF(Insulin-like growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), HGF(Hepatocyte Growth Factor) PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 또는 IL-6(Interleukin-6)일 수 있다.
본 발명에서는 이러한 주름 개선, 항산화 및 피부 미백과 관련된 성장인자의 세포 내 발현이 매우 높으며, 동시에 세포 밖으로 고농도로 분비할 수 있으므로, 성장인자의 발현-분비 기전에 대한 연구 및 분비된 성장인자를 이용한 관련 질환 개선-치료제 또는 화장품 원료 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에서는 전술한 줄기세포 성장인자를 대량 생산하기 위한 배지 조성물을 제공하며, 상기 배지 조성물은 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 제니핀(Genipin)일 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 특히, EGF(epidermal growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 발현 및 세포 외 분비를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물은 무혈청 배지(serum-free)일 수 있다. 무혈청 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청(동물 유래 혈청)을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 총 조성물 함량 대비 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물 유래 혈청을 함유하지 않을 수 있다.
줄기세포 성장인자를 대량 생산하기 위한 일반적인 배지는 당업계에 공지되어 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 배양 시 동물 유래 혈청을 약 5 내지 20% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 그러나, 동물 유래 혈청은 미확인된 미량성분을 포함하므로, 세포의 성장에 영향을 미치며, 분석이 어렵고, 재현성 있는 시험 및 생산공정을 확립하는데 어려움이 있었다.
본 발명에서는 줄기세포 성장인자의 대량 생산 및 배양을 위해 필요한 동물 유래 혈청 대신 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있고, 재현성 있는 시험 및 생산공정의 확립이 가능하며, 줄기세포 성장인자를 대량 생산할 수 있다.
상기 줄기세포 성장인자 대량 생산용 무혈청 배지 조성물에서 화학식 1의 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 10 uM 이하 또는 1 uM 이하의 범위로 조절될 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 0.3 uM 이상의 농도를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 배지 조성물은 하기 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 4]
Figure pat00005
[화학식 5]
Figure pat00006
[화학식 6]
Figure pat00007
[화학식 7]
Figure pat00008
[화학식 8]
Figure pat00009

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 전술한 종류를 사용할 수 있으며, 구체적으로 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
또한, 줄기세포 성장인자의 종류는 전술한 바와 같으며, 배지의 조성 또한 전술한 바와 같다.
상기 화학식 1의 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 배지 내에서 10 uM 이하 또는 1 uM 이하의 범위로 조절될 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 0.3 uM 이상의 농도를 가질 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법은,
(a) 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 한 구체예에서, (b)에서 배양된 배양액에서 줄기세포 성장인자를 분리하는 (c) 단계를 추가로 수행할 수 있다.
단계 (A)에서 혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 CNT-57, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용할 수 있으며, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함할 수 있다.
혈청은 0.1 내지 20％의 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.
또한, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가할 수 있다.
항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.
필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.
초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO2 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO2 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.
누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 75％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.
상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포는 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양할 수 있다(단계 (b)).
상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 무혈청 배지는 하기 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00010
[화학식 3]
Figure pat00011
[화학식 4]
Figure pat00012
[화학식 5]
Figure pat00013
[화학식 6]
Figure pat00014
[화학식 7]
Figure pat00015
[화학식 8]
Figure pat00016

또한, 상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.
상기 성장인자로 전술한 줄기세포 성장인자를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 화학식 1의 화합물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포 배양액은 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있다. 예컨대, 줄기세포 성장인자, 즉, IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE2(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자가 포함될 수 있으며, 구체적으로 EGF(epidermal growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자가 고농축으로 존재할 수 있다.
이러한 배양액 중의 성장인자는 상기 성장인자를 분리하는 단계(단계 (c))를 통해 분리될 수 있다. 상기 성장인자의 분리는 당업계에서 사용되는 일반적인 공정을 통해 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 성장인자의 분리는 배양액을 체에 거르는 공정을 통해 수행될 수 있다. 이때, 체는 성장인자의 크기보다 작고, 전술한 화학식 1의 화합물보다는 큰 구멍을 가짐으로써, 화학식 1의 화합물 등의 성분을 걸러 상기 성장인자를 용이하게 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 제조된 줄기세포 성장인자를 포함하는 배양액은 주름 개선, 항산화 또는 미백 효과를 가진다.
따라서, 본 발명의 배양액은 피부 재생, 주름개선, 항산화 또는 미백을 위한 피부 외용제 또는 화장료 등의 유효성분으로 사용할 수 있다. 상기 배양액은 분획물로 이용될 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 배양액은 전술한 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양됨으로써, 상기 배양액에는 EGF(epidermal growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)이 고농축으로 존재하며, 피부 재생, 주름개선, 항산화 또는 미백 효과를 지닐 수 있다.
상기 배양액을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
상기 배양액이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
상기 배양액을 화장품으로 사용하는 경우, 상기 배양액을 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.
또한 상기 화장품은 상기 배양액에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 배양액은 화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제 또는 세정제와 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 배양액을 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림 또는 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 화학식 1의 화합물을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 상기 배양액을 전체 조성물 중량에 대하여 0.000001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.001 중량% 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 배양액을 0.000001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 재생 또는 주름개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 참조예 1> 화합물의 물질 정보
[화학식 1]
Figure pat00017

명칭: Genipin; Methyl (1S,2R,6S)-2-hydroxy-9-(hydroxymethyl)-3-oxabicyclo[4.3.0]nona-4,8-diene-5-carboxylate
CAS No.: 6902-77-8
[화학식 2]
Figure pat00018
명칭: NS 1619, 1,3-Dihydro-1-[2-hydroxy-5-(trifluoromethyl)phenyl]-5-(trifluoromethyl)-2H-benzimidazol-2-one
CAS No.: 153587-01-0
[화학식 3]
Figure pat00019
명칭: N-Phenylanthranilic acid, 2-(Phenylamino)benzoic acid, Diphenylamine-2-carboxylic acid
CAS No.: 91-40-7
[화학식 4]
Figure pat00020
명칭: Isoliquiritigenin, (E)-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propen-1-one, 4,2′,4′-Trihydroxychalcone
CAS No.: 961-29-5
[화학식 5]
Figure pat00021
명칭: Glipizide, 1-Cyclohexyl-3-{4-[2-(5-methylpyrazine-2-carboxamido)ethyl]phenylsulfonyl}urea
CAS No.: 29094-61-9
[화학식 6]
Figure pat00022
명칭: 8-Bromoguanosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt
CAS No.: 51116-01-9
[화학식 7]
Figure pat00023
명칭: Retinoic acid, ATRA, Tretinoin, Vitamin A acid, all-trans-Retinoic acid
CAS No.: 302-79-4
[화학식 8]
Figure pat00024
명칭: (±)-Norepinephrine (+)-bitartrate salt, (±)-Arterenol (+)-bitartrate salt, (±)-Noradrenalin (+)-bitartrate salt, 1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-aminoethanol (+)-bitartrate salt, 3,4-Dihydroxyphenylethanolamine (+)-bitartrate salt
CAS No.: 3414-63-9
실시예
실시예 1
1. 골수 유래 중간엽 줄기세포 수득
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 공여자의 골수를 분리 및 정제하여 수득하였다. 상기 과정은 국내외 특허 및 논문에 자세히 소개되어 있으며, 간단히 설명하면 하기와 같다.
공여자의 골수에서 Ficoll-paque 시약을 이용, 밀도차 원심분리하여 단핵세포군을 분리한 후, 세포배양접시에서 혈청배지로 유착세포만을 배양한 후, 분자생물학적 방법으로 확인하여 사용하였다.
2. 줄기세포의 배양
골수 유래 중간엽 줄기세포를 60 mm 배양 플레이트(3.2 x 105 cells/plate)에, PBS 10% 첨가된 low glucose DMEM 배지를 이용하여 1일 동안 5% CO2 및 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.
그 후, 배양액을 흡입관을 통하여 제거한 다음, PBS 용액을 이용하여 배지 성분을 제거하고, PBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 화학식 1의 화합물 1 uM을 처리하여 5％ CO2 및 37℃ 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
비교예 1
화학식 1의 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법으로 배양액을 제조하였다.
비교예 2
화학식 1의 화합물을 사용하지 않고, 1% O2의 저산소에서 배양한 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법으로 배양액을 제조하였다.
비교예 3 내지 9
화학식 1의 화합물 대신 각각 화학식 2 내지 8의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법으로 배양액을 제조하였다.
구체적으로, 비교예 3은 화학식 2의 화합물, 비교예 4는 화학식 3의 화합물, 비교예 5는 화학식 4의 화합물, 비교예 6은 화학식 5의 화합물, 비교예 7은 화학식 6의 화합물, 비교예 7은 화학식 7의 화합물, 및 비교예 8은 화학식 8의 화합물을 나타낸다.
실험예 1. 사이토카인 발현 측정
사이코카인의 발현 측정은 Human Cytokine Arrays(RayBiotech, Inc.)을 이용하여 측정하였다.
측정 방법은 하기와 같다.
냉동 보관된 키트를 실온에 두어 실온과 동일한 온도를 만들어준다. Antibody Arrays를 조심스럽게 제거하고 # 마킹 부분이 위로 올라오도록 well에 넣는다. 2ml의 blocking buffer를 각 well에 넣고 30분 실온에서 배양한다. Blocking buffer를 제거하고 1 ml의 샘플(MSC 배양액만 농축하여 사용)을 각 well에 넣고 2시간 실온에서 배양한다. 샘플을 제거한 뒤 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. 1ml biotin-conjugated antibody cocktail을 넣고 실온에서 2시간 배양한다. Biotinylated antibody cocktail을 제거한 뒤 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. 2 mL의 HRP-Streptavidin을 각 well에 넣고 실온에서 2시간 배양한다. HRP-Streptavidin을 제거하고 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. Detection buffer C와 D를 1:1로 섞은 뒤, 500 μl씩 각 well에 넣고 실온에서 2 분 배양한 뒤 X-ray film을 사용하여 각 멤브레인 마다 spot을 얻는다.
본 발명에서 도 1 및 2는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지의 특정 성장인자와 사이토카인의 발현을 측정하고자 실시된 사이토카인 분석결과 사진(도 1) 및 그래프(도 2)이다.
상기 도에서 비교예 1의 배양액이 control, 비교예 2의 배양액이 Hypoxia, 비교예 3의 배양액이 15, 비교예 4의 배양액이 38, 비교예 5의 배양액이 54, 비교예 6의 배양액이 65, 비교예 7의 배양액이 102, 비교예 8의 배양액이 122, 비교예 9의 배양액이 140, 및 실시예 1의 배양액이 141을 나타낸다.
상기 도에 나타나듯이, 화학식 1의 화합물을 사용한 141번이 표피세포 성장인자(Epidermal growth factor, EGF), 인간 형질 전환 성장인자 베타 1(Transforming growth factor-β1, TGF β1), 맥관내피세포 성정인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)의 발현을 가장 효과적으로 높였으며, 이로 인하여 항주름, 미백, 항산화 효과 기능성 조성물을 획득할 수 있다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00025

  2. 제 1 항에 있어서,
    줄기세포는 중간엽 줄기세포인 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 유래되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    줄기세포 성장인자는 IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE2(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    줄기세포 성장인자는 EGF(epidermal growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    화학식 1로 표시되는 화합물은 10 uM 이하의 농도로 포함되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물을 추가로 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
    [화학식 2]
    Figure pat00026

    [화학식 3]
    Figure pat00027

    [화학식 4]
    Figure pat00028

    [화학식 5]
    Figure pat00029

    [화학식 6]
    Figure pat00030

    [화학식 7]
    Figure pat00031

    [화학식 8]
    Figure pat00032

  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00033

  9. 제 8 항에 있어서,
    줄기세포를 배양하는 단계는 (a) 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포를 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    (c) 단계 (b)에서 배양된 배양액에서 줄기세포 성장인자를 분리하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    줄기세포는 중간엽 줄기세포인 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 유래되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
  13. 제 8 항에 있어서,
    줄기세포 성장인자는 EGF(epidermal growth factor), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 및 HGF(Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
  14. 제 8 항에 있어서,
    화학식 1로 표시되는 화합물은 10 uM 이하의 농도로 포함되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
  15. 제 8 항에 있어서,
    하기 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물을 추가로 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
    [화학식 2]
    Figure pat00034

    [화학식 3]
    Figure pat00035

    [화학식 4]
    Figure pat00036

    [화학식 5]
    Figure pat00037

    [화학식 6]
    Figure pat00038

    [화학식 7]
    Figure pat00039

    [화학식 8]
    Figure pat00040

  16. 제 8 항에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 배양된 배양액을 포함하는 피부재생 또는 주름개선용 화장료 조성물.
  17. 제 8 항에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 배양된 배양액을 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
  18. 제 8 항에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 배양된 배양액을 포함하는 미백용 화장료 조성물.
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