JP2016516811A - 神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物及びこれの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の目的は、神経幹細胞を利用した発毛促進または脱毛防止用組成物を製造する方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的及びメリットは、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明らかになる。
上述した通り、本発明に係る外胚葉由来神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物は、発毛を促進したり脱毛を予防乃至治療できる医薬(外)品開発の原料として有用に使用できる。
胎児脳の脳室領域(ventricular zone)から分離した成体神経幹細胞(neural stem cells、NSCs)を不滅化(immortal)させて細胞を得た。具体的には、14週の胎児神経細胞組織(neural cell tissue)を0.1% collagenaseと0.1% hyaluronidase溶液を37℃で1時間処理して0.05% Trypsin−EDTA 2−3分処理して、single cellsで分離した後、markers(CD45−/CD133+/CD34−)を利用してFACSで分離した。これをN−2 supplements、0.2mg/ml hlearin、20ng/ml bFGF(basic Fibroblast Growth Factors)、20ng/ml EGF(Eeielrmal Growth Factor)、そして10ng/ml LIFが添加されたヒト神経球培養培地(human neurosphere culture media)に培養した。
96−ウェルプレート(96−well plate)にタンパク質量が10〜100μgになるべく試料を入れて、全体積を100ulに合わせた。この時Blankとしては、100μlの蒸溜水だけ入れた。以後、染色剤であるクマシーブルー(Coomassie blue)を入れてマイクロプレーリーダー(microplate reader)を利用して595nmで測定した。
その結果、図1に示された通り、神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物の全体タンパク質含有量が高く測定された。
96−ウェルプレート(96−well plate)にウェル(well)当たり1X103個の細胞を接種して、その翌日神経幹細胞培養液と神経幹細胞抽出物を各々0%〜100%(培養液だけ該当する)ずつ100μlに合わせて処理した。24時間単位で、assay(WST−1)物質をウェル(well)当たり10μlずつ添加して、インキュベーターで反応させた。以後、マイクロプレーリーダー(microplate reader)を利用して440nmで測定した。
その結果、図2A及び図3に示された通り、神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物の細胞毒性及び細胞増殖が測定された。
この実験のために毛乳頭細胞を24−ウェルプレート(24−well plate)にウェル(well)当たり1.5X104個の細胞を接種して、その翌日神経幹細胞培養液と神経幹細胞抽出物を各々0%〜100%(培養液だけ該当する)ずつ処理した。72時間処理後、リン酸化緩衝溶液(PBS)で洗浄して、トリゾル試薬(Trizol reagent)を利用して全体RNA(total RNA)を得た後、逆転写酵素(reverse transcriptase)を利用してcDNAを合成してquantitative RT−PCRを行った。
その結果、図3A〜図6Bに示された通り、神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物処理群で毛髪成長に関与するVEGF、IGF、HGF、KGF成長因子または毛髪の成長期を誘導するShhの発現量が高く現れ、また、退化期を誘導するTGF−β1は少なく発現することが示された。
5週齢C57BL/6Jマウス(mice)を24±2℃で7日間順応過程を経た後、背中(back)の毛を除去して、1日1回本発明による神経幹細胞培養液(100%、v/v)と神経幹細胞抽出物(20%、v/v)を1ml処理した。対照群としては、complete culture media(DMEM+10% FBS)を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大16日後マウスの毛髪成長促進効果を確認した。
その結果、図7A及び図7Bに示された通り、神経幹細胞抽出物(20%、v/v)及び神経幹細胞培養液が対照群に比べて毛髪成長促進効果があることが示された。
1.毛の長さ及び重量分析
5週齢C57BL/6Jマウス(mice)を24±2℃で7日間順応過程を経た後、背中(back)の毛を除去して、1日1回本発明による神経幹細胞培養液(100%、v/v)と神経幹細胞抽出物(20%、v/v)を1ml処理した。対照群としては、complete culture media(DMEM+10% FBS)を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大16日後マウスを犠牲(sacrifice)させて、毛髪成長促進効果のために毛の長さと重量を確認した。
その結果、図8A〜図8Cに示された通り、発毛時期及び長さ、重量面で神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物(20%、v/v)処理群で毛髪成長促進効果があって、特に神経幹細胞抽出物処理群で効果が大きいことを確認した。
5週齢C57BL/6Jマウス(mice)を24±2℃で7日間順応過程を経た後、背中(back)の毛を除去して、1日1回本発明による神経幹細胞培養液(100%)と神経幹細胞抽出物(20%)を1ml処理した。対照群としては、complete culture media(DMEM+10% FBS)を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大16日後マウスを犠牲(sacrifice)させて、毛髪成長促進効果のために毛穴の数を確認した。
その結果、図9A〜図9Bに示された通り、発毛時期及び毛穴の数で神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物(20%、v/v)処理群で毛髪成長促進効果があって、特に神経幹細胞抽出物処理群で効果が大きいことを確認した。
5週齢C57BL/6Jマウス(mice)を24±2℃で7日間順応過程を経た後、背中(back)の毛を除去して、1日1回本発明による神経幹細胞培養液(100%、v/v)と神経幹細胞抽出物(20%、v/v)を1ml処理した。対照群としては、complete culture media(DMEM+10% FBS)を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大16日後マウスを犠牲(sacrifice)させて、その皮膚組織を4%ホルムアルデヒドに固定して、組織のパラフィン製作後、3um厚さで切断した組織をスライドに付けてパラフィン除去及び再水和過程(deparaffinize and rehydrate)を実施した。その後、抗体回収(antigen retrieval;citrate buffer、pH6.0)と、0.1%トリトン(Triton)X−100を処理して正常ロバ血清(normal donkey serum)をブロッキング(blocking)を経て1次抗体を1:250で24時間処理した。以後、2次抗体を利用して1時間処理してDAPI染色を5分間進めた。ベクタシールドマウンティング(vectashield mounting medium)剤を利用してスライドに固定させた後、共焦点顕微鏡(Confocal Microscope)で結果を確認した。
その結果、図10A及び図10Bに示された通り、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物(20%、v/v)で細胞成長を示すマーカーであるKi−67が増加することを確認した。
5週齢C57BL/6Jマウス(mice)を24±2℃で7日間順応過程を経た後、背中(back)の毛を除去して、1日1回本発明による神経幹細胞培養液(100%、v/v)と神経幹細胞抽出物(20%、v/v)を1ml処理した。対照群としては、complete culture media(DMEM+10% FBS)を用いて、処理後一定期間毎に毛髪を確認して、最大16日後マウスを犠牲(sacrifice)させて、その皮膚組織をトリゾル試薬(Trizol reagent)を利用して全体RNA(total RNA)を得た後に、逆転写酵素(reverse transcriptase)を利用してcDNAを合成してquantitative RT−PCRを行った。
その結果、図11及び図14に示された通り、神経幹細胞培養液または神経幹細胞抽出物(20%)で毛乳頭細胞マーカーであるalkaline phosphatase増加及び毛穴内増加したTmeff1及びTGFβ−2を介して幹細胞の分化を抑制するBMPs発現が減少させて、幹細胞(CD34+)が活性化したことを確認した。
Claims (13)
- 神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記神経幹細胞は、脳の脳室領域(ventricular zone)から抽出された神経幹細胞であることを特徴とする請求項1に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記神経細胞抽出物は、15〜25%(v/v)の濃度で含まれることを特徴とする請求項1に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記神経幹細胞抽出物は、毛乳頭細胞で成長因子、レプチン(leptin)及びShh(Sonic hedgehog)の発現を促進させることを特徴とする請求項1に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、インショリン様成長因子(IGF)、肝細胞成長因子(HGF)、及びケラチノサイト成長因子(KGF)からなる群で選択される一つ以上を含むことを特徴とする請求項4に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記神経幹細胞抽出物は、毛乳頭細胞でTGF−β1またはIL−6の発現を抑制するることを特徴とする請求項1に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記神経幹細胞抽出物は、毛嚢内幹細胞を活性化させることを特徴とする請求項1に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記幹細胞の活性化は、BMP2、BMP4またはBMP6の発現抑制及びTmeff1またはTGF−2の発現増加を介して行われることを特徴とする請求項7に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 前記組成物は、薬学組成物であることを特徴とする請求項1に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物。
- 請求項1から請求項9のいずれかに記載の組成物を有効性分として含有する脱毛治療剤。
- (a)神経幹細胞を培養する工程及び(b)前記神経幹細胞培養液から神経幹細胞抽出物を分離する工程を含む、発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法。
- 前記工程(a)の神経幹細胞は、脳の脳室領域(ventricular zone)から抽出された神経幹細胞であることを特徴とする請求項11に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法。
- 前記工程(a)は、N−2添加剤、ヘパリン、繊維芽細胞成長因子(bFGF)、表皮成長因子(EGF)、及び白血病抑制因子(LIF)が含まれたヒト神経球培養培地(human neurosphere culture media)で10〜14日間培養後、不滅化して得た細胞をDMEM(Dulbecco's Moeifiee Eagle's Meeium)、10% FBS(fetal bovine serum)、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地で培養することを特徴とする請求項11に記載の発毛促進または脱毛防止用組成物の製造方法。
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