WO2016072660A1 - 줄기세포 성분추출물 제조방법 및 이를 이용한 탈모치료제 제조방법 - Google Patents

줄기세포 성분추출물 제조방법 및 이를 이용한 탈모치료제 제조방법 Download PDF

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stem
stem cell
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김영실
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주식회사 티아라줄기세포연구소
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    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing stem cell extract and a method for preparing hair loss treatment using the same.
  • Stem cells are undifferentiated cells with the ability to differentiate into various types of body tissues, and many studies have been conducted using them because of their ability to differentiate into various tissue cells.
  • adult stem cells can be easily obtained in areas such as fat, bone marrow, re-blood, or placenta, and have fewer ethical problems than embryonic stem cells, and use the cells of the user themselves, and thus have fewer immune rejection reactions. A lot is done.
  • a culture solution obtained when culturing stem cells may be used.
  • the culture solution by stem cell culture contains an active ingredient of stem cells such as growth factors and cell activators.
  • these cultures contain other additives necessary for culturing, such as bovine serum and antibiotics, in addition to growth factors and cell activators, and when these components are injected, they may have unwanted negative effects in addition to the desired function or efficacy.
  • the culture medium in which the stem cells are cultured has a problem that the stem cell active ingredient is too low to obtain a desired effect, and excessive time and effort are required to obtain sufficient content.
  • hair loss is known as the internal factors of the body and the external factors caused by the external environment due to physiological factors. External factors include tension caused by mental stress, lack of nutrient supply due to blood vessel atrophy, hair loss due to contaminated environment, and hair loss due to drying of the scalp.
  • the internal factors of the body which are flanked by lateral factors, include 5-alpha reductase (5-alpha reductase (5-alpha), which increases testosterone and testosterone, known as a type of androgen, and dihydrotestosterone (DHT) to increase sebum secretion.
  • Increasing alpha reductase activity is a major factor.
  • hair mites living in hair follicles, Demodex is also a major factor.
  • hair loss In order to treat hair loss, it is generally a vasodilator for nourishing the hair root, supplying nutrients such as hair constituents, supplying energy sources for energy to the hair root, fungicides for killing Demodex, and excess sebum.
  • Detergents to remove, sebum secretion inhibitors, moisturizers to prevent drying of the scalp and the like are used as components of the hair loss preventing agent and hair growth agent.
  • the present invention has been made in order to solve the above problems, it is an object of the present invention to effectively extract the active ingredient of stem cells, and to provide a hair loss treatment agent excellent in efficacy and safe to the human body as a component of the hair loss treatment agent.
  • Stem cell component extract production method comprises the steps of obtaining a culture stem cells from which the medium is removed; Counting the number of stem cells by dispersing the stem cells in an isotonic carrier liquid; Removing the carrier liquid and obtaining the stem cells; Dispersing the stem cells in an amount of storage extender in consideration of the number and target concentration of the stem cells; Crushing the stem cells in the extender.
  • the step of crushing the stem cells further comprises the step of separating the cell membrane residue
  • the step of separating the cell membrane residue is preferably performed by centrifugation.
  • the step of crushing the stem cells is performed by an ultrasonic crusher, the step of crushing the stem cells is performed intermittently with a plurality of times of unit shredding between the idle time, the unit shredding is 2 seconds to 7 seconds It is preferable that the said pause time is 3 second or more.
  • the storage extender is any one of distilled water, water and saline of 0.45% or less
  • the carrier liquid is any one of physiological saline, phosphate buffer saline (PBS), heartmann solution and heartmann glucose. desirable.
  • a method for producing a hair loss treatment agent comprising a stem cell component extract according to the present invention includes the steps of culturing stem cells in a culture medium; Washing the stem cells after removing the culture solution; Counting the number of stem cells by dispersing the stem cells in an isotonic carrier liquid; Removing the carrier liquid and obtaining the stem cells; Dispersing the stem cells in an amount of storage extender in consideration of the number and target concentration of the stem cells; Crushing the stem cells in the extender; Removing cell membrane residues; And filtering only components of the molecular weight 3000 to 5000 in the stem cell extract.
  • the effective component of the stem cells can be effectively extracted, there is an effect of providing a hair loss treatment agent having a hair loss prevention and hair growth promoting function in a safer way.
  • FIG. 1 is a flow chart of a method for producing stem cell extract according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is a view showing the state of stem cells before crushing.
  • Figure 2b is a view showing the state of stem cells after crushing.
  • Figure 3a is a view confirming the state of the stem cells before disruption under a microscope.
  • Figure 3b is a view showing the state of the stem cells after disruption under a microscope.
  • Figure 4 is a photograph of a comparative example experimenting with the characteristics of the molecular weight of the stem component extract.
  • Figure 5 is a photograph of Example 1 experimented with the characteristics according to the molecular weight of the stem component extract.
  • Figure 6 is a photograph of Example 2 experimented with the properties according to the molecular weight of the stem component extract.
  • Figure 7 is a photograph of Example 3 experimented with the characteristics according to the molecular weight of the hair loss treatment agent containing a stem component extract.
  • Figure 8 is a photograph of Example 4 experimented with the characteristics according to the molecular weight of the hair loss treatment agent containing a stem component extract.
  • Figure 9 is a photograph of Example 5 experimented with the characteristics according to the molecular weight of the hair loss treatment containing a stem component extract.
  • first prepared stem cells are cultured in the medium (S1).
  • Stem cells can be extracted from any one of fat, bone marrow, re-blood or placenta of the human body.
  • Stem cells to be extracted is preferably adult stem cells, more preferably adult stem cells are mesenchymal stem cells.
  • the medium may be at least one of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) and Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium) which are widely used in stem cell culture.
  • DMEM Denbecco's Modified Eagle Medium
  • Keratinocyte-SFM Keratinocyte serum free medium
  • Fetal Bovine Serum FBS
  • human serum penicillin
  • streptomycin may be added to the medium, and additional nutrients such as vitamins, amino acids, lipids, or growth factors may be added when necessary.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • penicillin penicillin
  • streptomycin additional nutrients such as vitamins, amino acids, lipids, or growth factors may be added when necessary.
  • the culture environment of the medium is preferably made at a humidity of 70 to 95%, a temperature of 20 to 50 ° C and 1 to 20% CO 2 , and if necessary, such an environment can be arbitrarily changed.
  • stem cells In the step of culturing stem cells can be subcultured. When stem cells grow on a plate containing medium and have a density of 80 to 90%, some stem cells are obtained from the plate, and the stem cells are grown again by transferring to another plate containing medium. If the blood is not removed during the initial culture, the blood may be removed during subculture.
  • the culture of the stem cells can be used to transfer to a large plate every time the subculture step is carried out, it is preferable to obtain the stem cells by removing the medium when subcultured to a plate of 10 cm or more in diameter.
  • the stem cells can be obtained even in a plate smaller than a 10 cm plate, but in a small plate, a large amount of stem cells cannot be obtained because the amount of stem cells is small. Therefore, obtaining stem cells from the plate more than 10cm is one of the ways to increase the work efficiency.
  • trypsin / EDTA After removing the medium in the plate and separated by the addition of trypsin / EDTA. Stem cells are attached to the plate in the form of a long rod, and when trypsin / EDTA is added, the stem cells are protein-bound and the stem cells fall off the plate. As shown in Fig. 2a, the stem cells away from the plate are dried in a round shape in a long rod shape. Trypsin / EDTA not only breaks the protein but also causes necrosis of the cells, so it is added to the plate and leaves 2 to 3 drops to remove trypsin / EDTA from the plate. The concentration of trypsin / EDTA is preferably 0.1 to 0.3%.
  • Stem cells are dispersed in an isotonic carrier liquid and the number of stem cells is counted while maintaining the osmotic pressure (S3).
  • Isotonic carrier liquids typically use buffers such as saline and phosphate buffer saline (PBS), as well as nutrients such as Hartmann solution and heartmann glucose used as Ringer's solution. Carrier liquids can be used.
  • an isotonic carrier liquid is added to the stem cells so that they can be broken, and the stem cells are crushed when the stem cells flow to be broken.
  • the stem cell After removing the isotonic carrier liquid, the stem cell is dispersed by adding a storage extender (S4).
  • the hypotonic extender does not use isotonic solutions, such as carrier liquids, but uses solutions with lower osmotic pressure than stem cells, such as water and distilled water. When used, stem cells expand quickly. If the stem cells need to be left for a long time according to the process conditions for treating the stem cells, a storage solution having a greater amount of salt than water or distilled water may be used, such as saline solution of 0.45% or less.
  • hypotonic extenders have lower osmotic pressure than stem cells, when an extender is added to the stem cells, the stem cells absorb the extender and swell and the cell membrane becomes thinner.
  • the extender is preferably left to swell for about 30 seconds to 2 minutes to sufficiently expand the stem cells.
  • the extender preferably contains 10 4 to 10 7 stem cells per ml.
  • the stem cells in the hypotonic extender are crushed (S5).
  • the crushing of stem cells is generally performed by an ultrasonic crusher, and when a large amount of treatment is required, a microfludizer may be used.
  • the stem cells When crushing energy such as ultrasonic waves is applied to the stem cells, the stem cells are easily broken because the cell membranes are already sufficiently expanded. Therefore, it is possible to effectively break down the cell membrane in a short time with little energy, it is possible to prevent the destruction of active ingredients such as growth factors inside the cell. At this time, the appropriate intensity of the ultrasonic waves can be obtained even at about 5 to 20 kHz, which is considerably lower than that of the normal cell disruption.
  • Stem cell crushing is performed intermittently with a plurality of unit crushing with a pause. If the stem cells are continuously crushed without a pause, the stem cells may be damaged by the heat of crushing. The downtime allows the stem cells and extender to cool down, while microscopically checking for complete lysis. When the microscope confirms that all the stem cells are broken, the disruption is terminated. Excessive crushing may destroy not only cell membranes but also growth factors and cell activators. Each unit shredding is preferably performed for 2 to 7 seconds in consideration of the shredding efficiency and overheating prevention, it is preferable that the rest time is more than 3 seconds.
  • stem cell component extracts are obtained from the crushing step (S6).
  • the hypotonic extender and stem cell disruption mixture obtained in step S5 there are cell membrane residues along with various growth factors and cell activators which are stem cell contents. Among them, growth factors and cell activators necessary for extracting stem cell components are obtained, and cell membrane residues which are not necessary are removed. In order to prevent immunorejection that may be caused by immunoglobulins, it is desirable to remove the broken cell membranes.
  • Removal of cell membrane residues can be accomplished by filtering but mainly using centrifugation. Centrifugation allows the cell membrane residue, which is larger in size than the growth factor and cell activator, to settle down to recover only the growth factor and the cell activator.
  • Centrifugation is preferably performed at 800 to 1500G. If it is lower than 800G, the membrane residue does not sink and is not easy to separate. If it is higher than 1500G, not only the membrane residue but also the growth factor and the active material decrease together to reduce the amount that can be obtained.
  • Stem cell ingredient extract ingredient analysis table No. ingredient One filamin-A isoform 2 [Homo sapiens] 2 myosin-9 [Homo sapiens] 3 talin-1 [Homo sapiens] 4 filamin-C isoform b [Homo sapiens] 5 filamin-B isoform 4 [Homo sapiens] 6 alpha-actinin-1 isoform c [Homo sapiens] 7 vinculin isoform meta-VCL [Homo sapiens] 8 alpha-actinin-4 [Homo sapiens] 9 78 kDa glucose-regulated protein precursor [Homo sapiens] 10 annexin A6 isoform 2 [Homo sapiens] 11 pyruvate kinase isozymes M1 / M2 isoform f [Homo sapiens] 12 spectrin alpha chain, brain isoform 3 [Homo sapiens] 13 clathrin heavy chain 1 [Homo sapiens] 14 calreticulin
  • the extract obtained through stem cell disruption according to the present invention contains significantly more growth factors and cell activators than the stem cell culture.
  • the culture solution and the present extract has a difference as compared in the following table.
  • the culture medium contains a large amount of additives such as bovine serum, antibiotics, and preservatives, which are necessary for cultivation, and may cause side effects, and because the culture medium is cultured using stem cells, not stem cells.
  • additives such as bovine serum, antibiotics, and preservatives, which are necessary for cultivation, and may cause side effects, and because the culture medium is cultured using stem cells, not stem cells.
  • the content of the stem cell component is lower than when the cells are directly injected into the body.
  • the conventional culture medium is limited in the type of growth factor and cell activator, low concentration of growth factor and cell activator, whereas the stem cell component extract of the present invention is rich in the type of growth factor and cell activator and concentration Adjustable freely.
  • the stem cell component extract is obtained by separating based on a certain molecular weight (S7).
  • stem cell component extracts there are growth factors and cell activators having relatively high properties, and there are growth factors and cell activators having relatively low properties.
  • Figure 4 is a case where all of the growth factor and cell active material of the stem cell component extract extracted by the above-described process is applied.
  • Figure 4a before the experiment Figure 4b is 7 days after the application of the stem cell component extract
  • Figure 4c is shown after 14 days after the application of the stem cell component extract.
  • FIG. 5 is a case of applying a growth factor and a cell active material of molecular weight 5000 or more based on the molecular weight 5000 of the stem cell component extract extracted by the above-described process.
  • FIG. 5A before the experiment, in FIG. 5B, after 7 days of application, and in FIG. 5C, 14 days after the application are shown.
  • Figure 6 is a case of applying a growth factor and a cell active material having a molecular weight of 5000 or less based on the molecular weight 5000 of the stem cell component extract extracted by the above-described process.
  • FIG. 6A before the experiment, FIG. 6B is shown 7 days after the application, and FIG. 6C is shown 14 days after the application.
  • the hair growth area is small, and the growth factor and cell activator having a relatively high molecular weight have a relatively small role in actually activating cells. It can be seen.
  • Example 2 since the hair growth area is wide, a relatively small molecular weight growth factor and a cell active material actually play a larger role in cell activation.
  • the stem cell component extract is obtained by separating based on the molecular weight of 3000 to 5000 in the step (S7) obtained by separating the stem cell component based on a predetermined molecular weight.
  • the components of the molecular weight 3000 to 5000 including the growth factor and the cell active material having a relatively high characteristics of the stem cell component extracts are used to treat hair loss.
  • Example 3 is a hair loss treatment agent produced by filtering out components having a molecular weight of 3000 or less based on the method for preparing a hair loss treatment agent of the present invention.
  • Example 4 is a hair loss treatment agent produced by filtering out components having a molecular weight of 3000 to 5000 based on the method for preparing a hair loss treatment agent of the present invention.
  • Example 5 is a hair loss treatment agent produced by filtering out components having a molecular weight of 5000 or more based on the method for preparing a hair loss treatment agent of the present invention.
  • Figure 7 is a photograph showing the hair change according to the use of the hair loss treatment agent of Example 3 of the present invention, Figure 7a before use, Figure 7b is a photograph after 30 days of use.
  • Figure 8 is a photograph showing the hair change according to the use of the hair loss treatment agent of Example 4 of the present invention, Figure 8a before use, Figure 8b is a photograph after 30 days of use.
  • Figure 9 is a photograph showing the hair change according to the use of the hair loss treatment agent of Example 5 of the present invention, Figure 9a before use, Figure 9b is a photograph after 30 days of use.
  • the hairs are grown in the case of FIGS. 7B, 8B, and 9B as compared to FIGS. 7A, 8A, and 9A, and thus, hair loss prevention effects can be confirmed.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 성분추출물 제조방법 및 이를 이용한 탈모치료제 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 성분추출물 제조방법은, 배지가 제거된 배양 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 줄기세포 성분추출물을 포함하는 탈모치료제 제조방법은, 배양액에 줄기세포를 배양하는 단계와; 상기 배양액을 제거한 후 줄기세포를 세척하는 단계와; 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계와; 세포막 잔여물을 제거하는 단계; 및 상기 줄기세포 추출물 중 분자량이 3000 내지 5000의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.

Description

줄기세포 성분추출물 제조방법 및 이를 이용한 탈모치료제 제조방법
본 발명은 줄기세포 성분추출물 제조방법 및 이를 이용한 탈모치료제 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포 중 성체 줄기세포는 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있으며, 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하는 것이기 때문에 면역거부반응도 적기 때문에 이를 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.
성체 줄기세포를 바로 주입하는 형식은 면역거부반응 등의 이유로 본인의 것에 제한된다. 그래서 줄기세포를 주입하는 방법 대신에 줄기세포를 배양할 때 얻어진 배양액을 사용하기도 한다. 줄기세포 배양에 의한 배양액에는 성장인자 및 세포활성물질 등과 같은 줄기세포의 유효성분이 함유되어 있다.
하지만 이러한 배양액은 성장인자 및 세포활성물질 이외에도 소혈청 및 항생제 등 배양할 때 필요한 기타 첨가제들이 함유되어 있어 이러한 성분들이 주입될 경우 원하는 기능이나 효능 이외에 원하지 않는 부정적 작용을 할 수 있다.
뿐만 아니라 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포 유효성분은 원하는 효과를 얻기에는 그 함유량이 너무 낮고 충분한 함유량을 얻기에는 시간과 노력이 과도히 소요된다는 문제점이 있다.
한편, 탈모는 생리적 측면을 요인으로 하는 신체의 내적인 요인과 외부환경에 의한 외적인 요인으로 알려져 있다. 외적인 요인으로는 정신적인 스트레스에 의해 야기되는 긴장으로 혈액의 순환이 원만하지 못하여 발생되는 혈관의 위축에 따른 영양공급의 부족과 오염된 환경에 의한 탈모, 두피의 건조에 의한 탈모 등이 있으며, 생리적 측면을 요인으로 하는 신체의 내적인 요인으로는 남성호르몬(androgen)의 일종으로 알려져 있는 테스토스테론 (testosterone)과 테스토스테론을 DHT (dihydrotestosterone)로 변환 시켜 피지의 분비를 증가시키는 5-알파 환원효소 (5-alpha reductase)의 활성증가 등이 주요 요인이다. 이 외에도 모낭에 살고 있는 털 진드기인 모낭충도 주요 요인으로 지목되고 있다.
이러한 탈모를 치료하기 위해 일반적으로 모근에 영양을 공급하기 위한 혈관 확장제, 모발의 구성성분과 같은 영양성분 공급, 모근에 에너지를 공급하기 위한 에너지원의 공급, 모낭충을 죽이기 위한 살균제, 과잉의 피지를 제거하기 위한 세정제 및 피지분비 억제제, 두피의 건조를 막기 위한 보습제 등이 탈모 방지제 및 육모제의 구성성분으로 사용되고 있다.
그러나, 탈모 방지제 및 육모제의 경우 화학적 물질이 다수 포함되어 오히려 두피에 자극을 주거나, 모근의 영양을 해치는 경우가 발생할 수 있는 문제점이 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출하고, 이를 탈모치료제의 성분으로 하여 효능이 우수하며 인체에 안전한 탈모치료제를 제공하는 데 그 목적이 있다.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 줄기세포 성분추출물 제조방법은, 배지가 제거된 배양 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계 이후에 세포막 잔여물을 분리하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포막 잔여물을 분리하는 단계는 원심분리에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 초음파 파쇄기에 의해 수행되며, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행되는데, 상기 단위 파쇄는 2초 내지 7초이며, 상기 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.
상기 저장성 증량제는 증류수, 물 및 0.45% 이하의 식염수 중 어느 하나이며, 상기 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline), 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 줄기세포 성분추출물을 포함하는 탈모치료제 제조방법은, 배양액에 줄기세포를 배양하는 단계와; 상기 배양액을 제거한 후 줄기세포를 세척하는 단계와; 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계와; 세포막 잔여물을 제거하는 단계; 및 상기 줄기세포 추출물 중 분자량이 3000 내지 5000의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상술한 본 발명의 구성에 따르면, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있으며, 보다 안전한 방법으로 탈모 예방 및 육모 촉진 기능이 있는 탈모치료제를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성분추출물 제조방법의 순서도이다.
도 2a는 파쇄 전 줄기세포의 상태를 나타낸 도면이다.
도 2b는 파쇄 후 줄기세포의 상태를 나타낸 도면이다.
도 3a는 파쇄 전 줄기세포의 상태를 현미경으로 확인한 도면이다.
도 3b는 파쇄 후 줄기세포의 상태를 현미경으로 확인한 도면이다.
도 4는 줄기성분 추출물의 분자량에 따른 특성을 실험한 비교예의 사진이다.
도 5는 줄기성분 추출물의 분자량에 따른 특성을 실험한 실시예 1의 사진이다.
도 6은 줄기성분 추출물의 분자량에 따른 특성을 실험한 실시예 2의 사진이다.
도 7은 줄기성분 추출물을 포함하는 탈모치료제의 분자량에 따른 특성을 실험한 실시예 3의 사진이다.
도 8은 줄기성분 추출물을 포함하는 탈모치료제의 분자량에 따른 특성을 실험한 실시예 4의 사진이다.
도 9는 줄기성분 추출물을 포함하는 탈모치료제의 분자량에 따른 특성을 실험한 실시예 5의 사진이다.
이하 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성분 추출물 제조방법의 순서를 상세히 설명한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 먼저 준비된 줄기세포를 배지 내에서 배양한다(S1). 여기서 줄기세포는 인체의 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 중 어느 하나에서 추출할 수 있다. 추출되는 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것이다.
배지는 줄기세포 배양에 많이 사용되고 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium) 중 적어도 어느 하나를 사용할 수 있다. 또한 배지에는 FBS(Fetal Bovine Serum), human serum, penicillin 및 streptomycin 중 적어도 어느 하나가 첨가될 수 있으며, 필요할 때에는 추가로 비타민, 아미노산, 지질 또는 성장인자와 같은 영양분을 더 추가할 수 있다. FBS 또는 human serum은 각각 5 내지 20%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.1 내지 5% 비율로 첨가되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 비율은 FBS 또는 human serum은 각각 8 내지 15%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.5 내지 2% 이다.
배지의 배양 환경은 70 내지 95%의 습도, 20 내지 50℃의 온도 및 1~20% CO2 에서 이루어지는 것이 바람직하며, 경우에 따라서 이러한 환경은 임의로 변경 가능하다.
줄기세포를 배양하는 단계에서는 계대배양이 이루어질 수 있다. 배지가 담긴 플레이트에 줄기세포가 성장하여 80 내지 90%의 밀도를 가지면 플레이트에서 줄기세포를 일부 수득하여 다른 배지가 담긴 플레이트로 옮겨서 다시 줄기세포의 성장이 이루어지게 한다. 초대배양을 할 때 혈액을 제거하지 않았을 경우 계대배양을 하면서 상기 혈액을 제거할 수 있다.
줄기세포를 얻기 위해 배지를 제거한다(S2). 줄기세포의 배양은 계대배양 단계가 이루어질 때마다 큰 플레이트(plate)로 옮겨 사용할 수 있으며 지름이 10cm 이상의 플레이트에 계대배양이 되면 배지를 제거하여 줄기세포를 수득하는 것이 바람직하다. 10cm 플레이트보다 작은 플레이트에서도 상기 줄기세포를 수득할 수 있지만 작은 플레이트에서는 줄기세포가 배양되는 양이 적기 때문에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 없다. 따라서 10cm 이상의 플레이트에서 줄기세포를 얻는 것이 작업 효율을 높이는 방법 중 하나이다.
플레이트 내의 배지를 제거한 후 trypsin/EDTA를 첨가하여 분리한다. 줄기세포는 플레이트 내에 긴 막대형상으로 부착되어 있는데 여기에 trypsin/EDTA를 첨가할 경우 줄기세포의 단백질 결합을 끊어 줄기세포가 플레이트에서 떨어진다. 도 2a에 도시된 바와 같이 플레이트에서 떨어진 줄기세포는 긴 막대형상에서 동그란 형상으로 말리게 된다. trypsin/EDTA는 단백질의 결합을 끊을 뿐만 아니라 세포를 괴사를 일으키기 때문에 플레이트에 첨가한 다음 2~3방울 남기고 trypsin/EDTA를 플레이트에서 제거한 후 줄기세포만을 획득한다. trypsin/EDTA의 농도는 0.1 내지 0.3%인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 trypsin/EDTA 대신 스크래퍼로 긁어서 직접 회수할 수도 있다. 플레이트에서 분리된 줄기세포를 trypsin/EDTA를 완전히 제거하여 순수하게 얻기 위해 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 여러 번 워싱한다.
줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 삼투압을 유지한 상태에서 줄기세포의 수를 카운팅한다(S3). 등장성 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline)와 같은 버퍼(buffer)를 사용하는 것이 일반적이며 이들뿐만 아니라 링거액으로 사용되는 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 등 영양분이 함유되어 있는 캐리어 액체를 사용 가능하다.
배양된 줄기세포를 플레이트에서 분리한 후, 파쇄가 가능하도록 줄기세포에 등장성 캐리어 액체를 첨가한 후, 줄기세포가 파쇄 가능하도록 유동되면 줄기세포를 파쇄한다.
등장성 캐리어 액체를 제거한 후 저장성 증량제를 첨가하여 줄기기세포를 분산시킨다(S4). 저장성 증량제는 캐리어 액체처럼 등장성 용액을 사용하지 않고 물, 증류수와 같이 줄기세포에 비해 삼투압이 낮은 용액을 사용한다. 이들을 사용할 경우 빠른 시간 내에 줄기세포가 팽창한다. 줄기세포를 처리하는 프로세스상의 조건에 따라서 줄기세포를 오래 방치해 두어야 하는 경우 0.45% 이하의 식염수 등과 같이 물 또는 증류수보다 염분의 양이 많은 저장성 용액을 사용할 수 있다.
저장성 증량제는 줄기세포에 비해 삼투압이 낮기 때문에 줄기세포에 증량제를 첨가할 경우 줄기세포는 증량제를 흡수하여 부풀게 되고 세포막이 얇아진다. 증량제는 종류에 따라서 30초 내지 2분정도 방치하여 줄기세포를 충분히 팽창시키는 것이 바람직하다. 증량제에는 1ml 당 줄기세포의 수가 104 내지 107개 함유되는 것이 바람직하다.
저장성 증량제 내의 줄기세포를 파쇄한다(S5). 줄기세포의 파쇄는 대체로 초음파 파쇄기(sonicate)에 의해 수행되며, 대량의 처리가 필요한 경우에는 마이크로플루다이저(Microfludizer)를 이용할 수도 있다.
초음파 등의 파쇄 에너지가 줄기세포에 가해지면 이미 세포막이 충분히 팽창해 있으므로 줄기세포는 용이하게 파쇄된다. 그러므로 적은 에너지로 단시간 내 효과적인 세포막 파쇄가 가능하며, 세포 내부의 성장인자 등 유효성분이 파괴되는 것을 방지할 수 있다. 이 때 적합한 초음파의 강도는 통상의 세포파쇄의 경우에 비해 현저히 낮은 5 내지 20 kHz 정도로도 적절한 결과를 얻을 수 있다.
줄기세포의 파쇄과정은 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행된다. 휴지시간을 사이에 두지 않고 연속적으로 줄기세포를 파쇄할 경우 파쇄 열에 의해 줄기세포가 손상될 수 있다. 휴지시간은 줄기세포와 증량제가 냉각되게 하며, 그 동안 파쇄가 완전히 이루어졌는지 현미경을 통해 확인할 수 있다. 현미경을 통해 줄기세포가 전부 파쇄된 것을 확인하면 파쇄를 종료한다. 과도한 파쇄는 세포막뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질까지 파괴시킬 우려가 있다. 각 단위파쇄는 파쇄효율과 과열방지를 고려하여 2 내지 7초 동안 수행되는 것이 바람직하며, 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.
파쇄 단계로부터 최종적으로 줄기세포 성분 추출물을 분리하여 얻는다(S6). S5 단계에서 얻어지는 저장성 증량제와 줄기세포 파쇄 혼합물에는 줄기세포 내용물인 다양한 성장인자, 세포활성물질과 함께 세포막 잔여물이 존재한다. 그 중 줄기세포 성분 추출물에 필요한 성장인자 및 세포활성물질은 수득하고, 필요하지 않은 세포막 잔여물은 제거한다. 면역글로불린(immunoglobulin)에 의해 발생할 수 있는 면역거부반응을 방지하기 위해서는 파괴된 세포막은 제거하는 것이 바람직하다.
세포막 잔여물의 제거는 필터링에 의해 이루어질 수 있지만 주로 원심분리를 이용한다. 원심분리는 성장인자 및 세포활성물질에 비해 크기가 큰 세포막 잔여물을 하부에 가라앉게 하여 상부의 성장인자 및 세포활성물질만을 회수 가능하다.
원심분리는 800 내지 1500G에서 수행되는 것이 바람직하다. 800G보다 낮을 경우에는 세포막 잔여물이 가라앉지 않아 분리가 용이하지 못하며, 1500G보다 높을 경우에는 세포막 잔여물뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질이 함께 가라앉아 수득할 수 있는 양이 줄어든다.
이와 같은 방법으로 얻은 줄기세포 성분 추출물을 분석해본 결과 표 1과 같이 성장인자 및 세포활성물질을 포함한 959가지의 성분들이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
줄기세포 성분 추출물 성분 분석표
No. 성분
1 filamin-A isoform 2 [Homo sapiens]
2 myosin-9 [Homo sapiens]
3 talin-1 [Homo sapiens]
4 filamin-C isoform b [Homo sapiens]
5 filamin-B isoform 4 [Homo sapiens]
6 alpha-actinin-1 isoform c [Homo sapiens]
7 vinculin isoform meta-VCL [Homo sapiens]
8 alpha-actinin-4 [Homo sapiens]
9 78 kDa glucose-regulated protein precursor [Homo sapiens]
10 annexin A6 isoform 2 [Homo sapiens]
11 pyruvate kinase isozymes M1/M2 isoform f [Homo sapiens]
12 spectrin alpha chain, brain isoform 3 [Homo sapiens]
13 clathrin heavy chain 1 [Homo sapiens]
14 calreticulin precursor [Homo sapiens]
15 protein disulfide-isomerase precursor [Homo sapiens]
16 elongation factor 2 [Homo sapiens]
17 annexin A2 isoform 2 [Homo sapiens]
18 protein disulfide-isomerase A3 precursor [Homo sapiens]
19 endoplasmin precursor [Homo sapiens]
20 heat shock cognate 71 kDa protein isoform 2 [Homo sapiens]
21 actin, cytoplasmic 2 [Homo sapiens]
22 alpha-enolase isoform 1 [Homo sapiens]
23 annexin A5 [Homo sapiens]
24 plectin isoform 1b [Homo sapiens]
25 collagen alpha-1(XII) chain short isoform precursor [Homo sapiens]
26 protein disulfide-isomerase A4 precursor [Homo sapiens]
27 ribosome-binding protein 1 [Homo sapiens]
28 ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 [Homo sapiens]
29 fructose-bisphosphate aldolase A [Homo sapiens]
30 thioredoxin reductase 1, cytoplasmic isoform 3 [Homo sapiens]
31 early endosome antigen 1 [Homo sapiens]
32 collagen alpha-1(XII) chain long isoform precursor [Homo sapiens]
33 plastin-3 isoform 1 [Homo sapiens]
34 rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 2 [Homo sapiens]
35 adenylyl cyclase-associated protein 1 [Homo sapiens]
36 importin-5 [Homo sapiens]
37 gelsolin isoform c [Homo sapiens]
38 heat shock protein HSP 90-alpha isoform 2 [Homo sapiens]
39 moesin [Homo sapiens]
40 phosphoglycerate kinase 1 [Homo sapiens]
중략
957 family with sequence similarity 49, member A
958 nucleolar complex protein 2 homolog [Homo sapiens]
959 UDP-GalNAc:beta-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1
그러나 줄기세포 파쇄 이전의 배양액에서는 표 2에 도시된 바와 같이 비교적 제한된 수의 성장인자 및 세포활성물질의 수가 확인되었다.
줄기세포 배양액 성분 분석표
No. 성분
1 alpha-2-macroglobulin precursor [Homo sapiens]
2 fibronectin isoform 1 preproprotein [Homo sapiens]
3 gelsolin isoform c [Homo sapiens]
4 actin, cytoplasmic 2 [Homo sapiens]
5 hemoglobin subunit beta [Homo sapiens]
6 collagen alpha-2(I) chain precursor [Homo sapiens]
7 collagen alpha-1(I) chain preproprotein [Homo sapiens]
8 inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 [Homo sapiens]
9 serum albumin preproprotein [Homo sapiens]
10 complement C3 precursor [Homo sapiens]
11 annexin A2 isoform 2 [Homo sapiens]
12 apolipoprotein B-100 precursor [Homo sapiens]
13 thrombospondin-1 precursor [Homo sapiens]
14 vitamin D-binding protein isoform 3 precursor [Homo sapiens]
15 collagen alpha-1(VI) chain precursor [Homo sapiens]
16 hemoglobin subunit alpha [Homo sapiens]
17 plasminogen isoform 1 precursor [Homo sapiens]
18 cartilage oligomeric matrix protein precursor [Homo sapiens]
19 tetranectin precursor [Homo sapiens]
20 SPARC precursor [Homo sapiens]
21 complement C4-B-like preproprotein [Homo sapiens]
22 periostin isoform 4 [Homo sapiens]
23 antithrombin-III precursor [Homo sapiens]
24 serotransferrin precursor [Homo sapiens]
25 fibulin-1 isoform D precursor [Homo sapiens]
중략
404 protein spire homolog 2 [Homo sapiens]
405 chromosome 9 open reading frame 172 [Homo sapiens]
406 PREDICTED: hypothetical protein LOC100510554 [Homo sapiens]
이와 같이 본 발명에 따라 얻어진 줄기세포 파쇄를 통한 성분추출물은 줄기세포 배양액에 비해 현저히 많은 성장인자와 세포활성물질을 포함하고 있다. 이외에도 배양액과 본 성분추출물은 다음 표에서 대비되는 바와 같은 차이를 가진다.
줄기세포 배양액과 줄기세포 성분 추출물의 비교
줄기세포 배양액 본 발명에 따른 줄기세포 성분추출물
성장인자 및세포 활성 물질개수 406개 959개
항생제 배양시 항생제 다량투여 배지성분 제거로 항생제가 존재하지 않음
소혈청 배양시 소혈청을 영양분으로 사용함 배지성분 제거로 인해 소혈청이 제거됨
보존제 배지성분 함유로 인해 보존제를 투여해야 함 보존제가 필요하지 않음
표 3에 도시된 바와 같이 상기 배양액에는 배양할 때 필요한 소혈청, 항생제 및 보존제 등의 첨가제가 대량 함유되어 있어 부작용이 발생할 우려가 있으며, 줄기세포가 아닌 줄기세포를 배양한 배양액을 사용하기 때문에 줄기세포를 바로 신체에 주입하는 경우보다 줄기세포 성분의 함유량이 낮은 단점이 있다.
이러한 종래의 배양액은 성장인자 및 세포활성물질의 종류가 제한적이며, 성장인자 및 세포활성물질의 농도가 낮은데 반해, 본 발명의 줄기세포 성분추출물은 성장인자 및 세포활성물질의 종류가 풍부하며 농도를 자유로이 조절 가능하다.
그리고, 상기 줄기세포 성분 추출물을 일정한 분자량을 기준으로 분리하여 얻는다(S7).
상기 줄기세포 성분추출물 중 상대적으로 높은 특성을 가지는 성장인자 및 세포활성물질이 있고, 상대적으로 낮은 특성을 가지는 성장인자 및 세포활성물질이 있다.
아래 표에서와 바와 같이, 일정한 분자량을 기준으로 걸러낼 수 있는 필터를 이용하여 실험한 결과이다.
[ 비교예 ]
도 4는 상술한 과정으로 추출된 줄기세포 성분추출물의 성장인자와 세포활성물질 전부를 적용한 경우이다. 도 4a 에는 실험전, 도 4b 에는 상기 줄기세포 성분추출물 적용 후 7일 후, 도 4c 에는 상기 줄기세포 성분추출물 적용 후 14일 후를 나타내고 있다.
[ 실시예 1 ]
도 5는 상술한 과정으로 추출된 줄기세포 성분추출물 중 분자량 5000을 기준으로 분자량 5000 이상의 성장인자 및 세포활성물질을 적용한 경우이다. 도 5a 에는 실험 전, 도 5b 에는 적용 후 7일 후, 도 5c 에는 적용 후 14일 후를 나타내고 있다.
[ 실시예 2 ]
도 6은 상술한 과정으로 추출된 줄기세포 성분추출물 중 분자량 5000을 기준으로 분자량 5000 이하의 성장인자 및 세포활성물질을 적용한 경우이다. 도 6a 에는 실험 전, 도 6b 에는 적용 후 7일 후, 도 6c 에는 적용 후 14일 후를 나타내고 있다.
도 4 내지 도 6을 참조하면, 상기 비교예에 비해, 실시예 1의 경우 털이 자란 면적이 작아, 상대적으로 분자량이 큰 성장인자 및 세포활성물질의 경우 실제로 세포가 활성하는데 있어 상대적으로 역할이 적음을 알 수 있다.
그리고, 상기 비교예에 비해, 실시예 2이 경우 털이 자란 면적이 넓으므로 상대적으로 작은 분자량의 성장인자 및 세포활성물질의 경우 실제로 세포가 활성하는데 있어 상대적으로 역할을 더 큼을 알 수 있다.
본 발명의 줄기세포 성분추출물을 포함하는 탈모치료제 제조방법에서는 상기 줄기세포 성분추출물을 일정한 분자량 기준으로 분리하여 얻는 단계(S7)에서 3000 내지 5000의 분자량을 기준으로 분리하여 얻는다.
구체적으로, 상기 줄기세포 성분추출물 중 상대적으로 높은 특성을 가지는 성장 인자 및 세포활성물질을 포함하는 분자량 3000 내지 5000의 성분을 걸러내어 이를 탈모치료제로 사용한다.
하기에서는 본 발명에서의 탈모치료제에 포함되는 줄기세포 추출물의 분자량에 대한 효과를 입증하기 위해 줄기세포 추출물의 분자량을 달리하여 제조한 탈모치료제의 실험 내용을 상세하게 설명한다.
[ 실시예 3 ]
실시예 3은 본 발명의 탈모치료제 제조방법을 바탕으로 분자량이 3000 이하인 성분을 걸러내어 제조한 탈모치료제이다.
[ 실시예 4 ]
실시예 4는 본 발명의 탈모치료제 제조방법을 바탕으로 분자량이 3000 내지 5000인 성분을 걸러내어 제조한 탈모치료제이다.
[ 실시예 5 ]
실시예 5는 본 발명의 탈모치료제 제조방법을 바탕으로 분자량이 5000 이상인 성분을 걸러내어 제조한 탈모치료제이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3인 탈모치료제 사용유무에 따른 모발 변화를 나타낸 사진으로, 도 7a는 사용 전, 도 7b는 사용 30일 후의 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4인 탈모치료제 사용유무에 따른 모발 변화를 나타낸 사진으로, 도 8a는 사용 전, 도 8b는 사용 30일 후의 사진이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5인 탈모치료제 사용유무에 따른 모발 변화를 나타낸 사진으로, 도 9a는 사용 전, 도 9b는 사용 30일 후의 사진이다.
상기 도 7 내지 도 9를 각각 비교해 보면, 도 7a, 8a, 9a에 비해 도 7b, 8b, 9b의 경우 모발이 성장했음을 알 수 있으므로, 탈모 예방 효과가 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도 8b의 변화가 가장 뚜렷하게 나타나므로 분자량에 따른 줄기세포 성분 특성의 차이가 있으며, 분자량이 3000 내지 5000의 성분을 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 줄기세포에서 유효물질을 추출하는 단계; 및
    상기 유효물질 중 분자량이 5000이하의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  2. 배양액에 줄기세포를 배양하는 단계와;
    상기 배양액을 제거한 후 줄기세포를 세척하는 단계와;
    상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와;
    상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와;
    상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와;
    상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계와;
    세포막 잔여물을 제거하는 단계; 및
    상기 줄기세포 추출물 중 분자량이 5000이하의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 세포막 잔여물을 제거하는 단계는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 초음파 파쇄기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 단위 파쇄는 2초 내지 7초이며, 상기 휴지시간은 3초 이상인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 저장성 증량제는 증류수, 물 및 0.45% 이하의 식염수 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline), 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  9. 줄기세포에서 유효물질을 추출하는 단계; 및
    상기 유효물질 중 분자량이 3000 내지 5000의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물을 포함하는 탈모치료제 제조방법.
  10. 배양액에 줄기세포를 배양하는 단계와;
    상기 배양액을 제거한 후 줄기세포를 세척하는 단계와;
    상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와;
    상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와;
    상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와;
    상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계와;
    세포막 잔여물을 제거하는 단계; 및
    상기 줄기세포 추출물 중 분자량이 3000 내지 5000의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물을 포함하는 탈모치료제 제조방법.
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