KR20160055016A - 줄기세포 성분추출물 제조방법 - Google Patents

줄기세포 성분추출물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 성분 추출물 제조방법에 있어서, 줄기세포를 배양하고 배지를 제거하는 단계와; 배지가 제거된 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포를 저장성 증량제에 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법에 의해 달성된다. 이에 따라 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 효과를 제공한다.

Description

줄기세포 성분추출물 제조방법 {PROCESSING METHOD FOR STEM CELL CONSTITUENT EXTRACT}
본 발명은 줄기세포 성분추출물 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포 중 성체 줄기세포는 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있으며, 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하는 것이기 때문에 면역거부반응도 적기 때문에 이를 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.
성체 줄기세포를 바로 주입하는 형식은 면역거부반응 등의 이유로 본인의 것에 제한된다. 그래서 줄기세포를 주입하는 방법 대신에 줄기세포를 배양할 때 얻어진 배양액을 사용하기도 한다. 줄기세포 배양에 의한 배양액에는 성장인자 및 세포활성물질 등과 같은 줄기세포의 유효성분이 함유되어 있다.
하지만 이러한 배양액은 성장인자 및 세포활성물질 이외에도 소혈청 및 항생제 등 배양할 때 필요한 기타 첨가제들이 함유되어 있어 이러한 성분들이 주입될 경우 원하는 기능이나 효능 이외에 원하지 않는 부정적 작용을 할 수 있다.
뿐만 아니라 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포 유효성분은 원하는 효과를 얻기에는 그 함유량이 너무 낮고 충분한 함유량을 얻기에는 시간과 노력이 과도히 소요된다는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 줄기세포 성분추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은, 본 발명에 따라, 줄기세포 성분추출물 제조방법에 있어서, 배지가 제거된 배양 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와; 상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와; 상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와; 상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법에 의해 달성된다.
여기서, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계 이후에 세포막 잔여물을 분리하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포막 잔여물을 분리하는 단계는 원심분리에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 초음파 파쇄기에 의해 수행되며, 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행되는데, 상기 단위 파쇄는 2초 내지 7초이며, 상기 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.
상기 저장성 증량제는 증류수, 물 및 0.45% 이하의 식염수 중 어느 하나이며, 상기 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline), 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상술한 본 발명의 구성에 따르면, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 효과를 제공한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성분추출물 제조방법의 순서도이고,
도 2a는 파쇄 전 줄기세포의 상태를 나타낸 도면이고,
도 2b는 파쇄 후 줄기세포의 상태를 나타낸 도면이고,
도 3a는 파쇄 전 줄기세포의 상태를 현미경으로 확인한 도면이고,
도 3b는 파쇄 후 줄기세포의 상태를 현미경으로 확인한 도면이다.
이하 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성분 추출물 제조방법의 순서를 상세히 설명한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 먼저 준비된 줄기세포를 배지 내에서 배양한다(S1). 여기서 줄기세포는 인체의 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 중 어느 하나에서 추출할 수 있다. 추출되는 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것이다.
배지는 줄기세포 배양에 많이 사용되고 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium) 중 적어도 어느 하나를 사용할 수 있다. 또한 배지에는 FBS(Fetal Bovine Serum), human serum, penicillin 및 streptomycin 중 적어도 어느 하나가 첨가될 수 있으며, 필요할 때에는 추가로 비타민, 아미노산, 지질 또는 성장인자와 같은 영양분을 더 추가할 수 있다. FBS 또는 human serum은 각각 5 내지 20%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.1 내지 5% 비율로 첨가되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 비율은 FBS 또는 human serum은 각각 8 내지 15%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.5 내지 2% 이다.
배지의 배양 환경은 70 내지 95%의 습도, 20 내지 50℃의 온도 및 1~20% CO2 에서 이루어지는 것이 바람직하며, 경우에 따라서 이러한 환경은 임의로 변경 가능하다.
줄기세포를 배양하는 단계에서는 계대배양이 이루어질 수 있다. 배지가 담긴 플레이트에 줄기세포가 성장하여 80 내지 90%의 밀도를 가지면 플레이트에서 줄기세포를 일부 수득하여 다른 배지가 담긴 플레이트로 옮겨서 다시 줄기세포의 성장이 이루어지게 한다. 초대배양을 할 때 혈액을 제거하지 않았을 경우 계대배양을 하면서 상기 혈액을 제거할 수 있다.
줄기세포를 얻기 위해 배지를 제거한다(S2). 줄기세포의 배양은 계대배양 단계가 이루어질 때마다 큰 플레이트(plate)로 옮겨 사용할 수 있으며 지름이 10cm 이상의 플레이트에 계대배양이 되면 배지를 제거하여 줄기세포를 수득하는 것이 바람직하다. 10cm 플레이트보다 작은 플레이트에서도 상기 줄기세포를 수득할 수 있지만 작은 플레이트에서는 줄기세포가 배양되는 양이 적기 때문에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 없다. 따라서 10cm 이상의 플레이트에서 줄기세포를 얻는 것이 작업 효율을 높이는 방법 중 하나이다.
플레이트 내의 배지를 제거한 후 trypsin/EDTA를 첨가하여 분리한다. 줄기세포는 플레이트 내에 긴 막대형상으로 부착되어 있는데 여기에 trypsin/EDTA를 첨가할 경우 줄기세포의 단백질 결합을 끊어 줄기세포가 플레이트에서 떨어진다. 도 2a에 도시된 바와 같이 플레이트에서 떨어진 줄기세포는 긴 막대형상에서 동그란 형상으로 말리게 된다. trypsin/EDTA는 단백질의 결합을 끊을 뿐만 아니라 세포를 괴사를 일으키기 때문에 플레이트에 첨가한 다음 2~3방울 남기고 trypsin/EDTA를 플레이트에서 제거한 후 줄기세포만을 획득한다. trypsin/EDTA의 농도는 0.1 내지 0.3%인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 trypsin/EDTA 대신 스크래퍼로 긁어서 직접 회수할 수도 있다. 플레이트에서 분리된 줄기세포를 trypsin/EDTA를 완전히 제거하여 순수하게 얻기 위해 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 여러 번 워싱한다.
줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 삼투압을 유지한 상태에서 줄기세포의 수를 카운팅한다(S3). 등장성 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline)와 같은 버퍼(buffer)를 사용하는 것이 일반적이며 이들뿐만 아니라 링거액으로 사용되는 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 등 영양분이 함유되어 있는 캐리어 액체를 사용 가능하다.
배양된 줄기세포를 플레이트에서 분리한 후, 파쇄가 가능하도록 줄기세포에 등장성 캐리어 액체를 첨가한 후, 줄기세포가 파쇄 가능하도록 유동되면 줄기세포를 파쇄한다.
등장성 캐리어 액체를 제거한 후 저장성 증량제를 첨가하여 줄기기세포를 분산시킨다(S4). 저장성 증량제는 캐리어 액체처럼 등장성 용액을 사용하지 않고 물, 증류수와 같이 줄기세포에 비해 삼투압이 낮은 용액을 사용한다. 이들을 사용할 경우 빠른 시간 내에 줄기세포가 팽창한다. 줄기세포를 처리하는 프로세스상의 조건에 따라서 줄기세포를 오래 방치해 두어야 하는 경우 0.45% 이하의 식염수 등과 같이 물 또는 증류수보다 염분의 양이 많은 저장성 용액을 사용할 수 있다.
저장성 증량제는 줄기세포에 비해 삼투압이 낮기 때문에 줄기세포에 증량제를 첨가할 경우 줄기세포는 증량제를 흡수하여 부풀게 되고 세포막이 얇아진다. 증량제는 종류에 따라서 30초 내지 2분정도 방치하여 줄기세포를 충분히 팽창시키는 것이 바람직하다. 증량제에는 1ml 당 줄기세포의 수가 104 내지 107개 함유되는 것이 바람직하다.
저장성 증량제 내의 줄기세포를 파쇄한다(S5). 줄기세포의 파쇄는 대체로 초음파 파쇄기(sonicate)에 의해 수행되며, 대량의 처리가 필요한 경우에는 마이크로플루다이저(Microfludizer)를 이용할 수도 있다.
초음파 등의 파쇄 에너지가 줄기세포에 가해지면 이미 세포막이 충분히 팽창해 있으므로 줄기세포는 용이하게 파쇄된다. 그러므로 적은 에너지로 단시간 내 효과적인 세포막 파쇄가 가능하며, 세포 내부의 성장인자 등 유효성분이 파괴되는 것을 방지할 수 있다. 이 때 적합한 초음파의 강도는 통상의 세포파쇄의 경우에 비해 현저히 낮은 5 내지 20 kHz 정도로도 적절한 결과를 얻을 수 있다.
줄기세포의 파쇄과정은 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행된다. 휴지시간을 사이에 두지 않고 연속적으로 줄기세포를 파쇄할 경우 파쇄 열에 의해 줄기세포가 손상될 수 있다. 휴지시간은 줄기세포와 증량제가 냉각되게 하며, 그 동안 파쇄가 완전히 이루어졌는지 현미경을 통해 확인할 수 있다. 현미경을 통해 줄기세포가 전부 파쇄된 것을 확인하면 파쇄를 종료한다. 과도한 파쇄는 세포막뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질까지 파괴시킬 우려가 있다. 각 단위파쇄는 파쇄효율과 과열방지를 고려하여 2 내지 7초 동안 수행되는 것이 바람직하며, 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.
파쇄 단계로부터 최종적으로 줄기세포 성분 추출물을 분리하여 얻는다(S6). S5 단계에서 얻어지는 저장성 증량제와 줄기세포 파쇄 혼합물에는 줄기세포 내용물인 다양한 성장인자, 세포활성물질과 함께 세포막 잔여물이 존재한다. 그 중 줄기세포 성분 추출물에 필요한 성장인자 및 세포활성물질은 수득하고, 필요하지 않은 세포막 잔여물은 제거한다. 면역글로불린(immunoglobulin)에 의해 발생할 수 있는 면역거부반응을 방지하기 위해서는 파괴된 세포막은 제거하는 것이 바람직하다.
세포막 잔여물의 제거는 필터링에 의해 이루어질 수 있지만 주로 원심분리를 이용한다. 원심분리는 성장인자 및 세포활성물질에 비해 크기가 큰 세포막 잔여물을 하부에 가라앉게 하여 상부의 성장인자 및 세포활성물질만을 회수 가능하다.
원심분리는 800 내지 1500G에서 수행되는 것이 바람직하다. 800G보다 낮을 경우에는 세포막 잔여물이 가라앉지 않아 분리가 용이하지 못하며, 1500G보다 높을 경우에는 세포막 잔여물뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질이 함께 가라앉아 수득할 수 있는 양이 줄어든다.
이와 같은 방법으로 얻은 줄기세포 성분 추출물을 분석해본 결과 표 1과 같이 성장인자 및 세포활성물질을 포함한 959가지의 성분들이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
줄기세포 성분 추출물 성분 분석표
No. 성분
1 filamin-A isoform 2 [Homo sapiens]
2 myosin-9 [Homo sapiens]
3 talin-1 [Homo sapiens]
4 filamin-C isoform b [Homo sapiens]
5 filamin-B isoform 4 [Homo sapiens]
6 alpha-actinin-1 isoform c [Homo sapiens]
7 vinculin isoform meta-VCL [Homo sapiens]
8 alpha-actinin-4 [Homo sapiens]
9 78 kDa glucose-regulated protein precursor [Homo sapiens]
10 annexin A6 isoform 2 [Homo sapiens]
11 pyruvate kinase isozymes M1/M2 isoform f [Homo sapiens]
12 spectrin alpha chain, brain isoform 3 [Homo sapiens]
13 clathrin heavy chain 1 [Homo sapiens]
14 calreticulin precursor [Homo sapiens]
15 protein disulfide-isomerase precursor [Homo sapiens]
16 elongation factor 2 [Homo sapiens]
17 annexin A2 isoform 2 [Homo sapiens]
18 protein disulfide-isomerase A3 precursor [Homo sapiens]
19 endoplasmin precursor [Homo sapiens]
20 heat shock cognate 71 kDa protein isoform 2 [Homo sapiens]
21 actin, cytoplasmic 2 [Homo sapiens]
22 alpha-enolase isoform 1 [Homo sapiens]
23 annexin A5 [Homo sapiens]
24 plectin isoform 1b [Homo sapiens]
25 collagen alpha-1(XII) chain short isoform precursor [Homo sapiens]
26 protein disulfide-isomerase A4 precursor [Homo sapiens]
27 ribosome-binding protein 1 [Homo sapiens]
28 ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 [Homo sapiens]
29 fructose-bisphosphate aldolase A [Homo sapiens]
30 thioredoxin reductase 1, cytoplasmic isoform 3 [Homo sapiens]
31 early endosome antigen 1 [Homo sapiens]
32 collagen alpha-1(XII) chain long isoform precursor [Homo sapiens]
33 plastin-3 isoform 1 [Homo sapiens]
34 rab GDP dissociation inhibitor beta isoform 2 [Homo sapiens]
35 adenylyl cyclase-associated protein 1 [Homo sapiens]
36 importin-5 [Homo sapiens]
37 gelsolin isoform c [Homo sapiens]
38 heat shock protein HSP 90-alpha isoform 2 [Homo sapiens]
39 moesin [Homo sapiens]
40 phosphoglycerate kinase 1 [Homo sapiens]
중략
957 family with sequence similarity 49, member A
958 nucleolar complex protein 2 homolog [Homo sapiens]
959 UDP-GalNAc:beta-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1
그러나 줄기세포 파쇄 이전의 배양액에서는 표 2에 도시된 바와 같이 비교적 제한된 수의 성장인자 및 세포활성물질의 수가 확인되었다.
줄기세포 배양액 성분 분석표
No. 성분
1 alpha-2-macroglobulin precursor [Homo sapiens]
2 fibronectin isoform 1 preproprotein [Homo sapiens]
3 gelsolin isoform c [Homo sapiens]
4 actin, cytoplasmic 2 [Homo sapiens]
5 hemoglobin subunit beta [Homo sapiens]
6 collagen alpha-2(I) chain precursor [Homo sapiens]
7 collagen alpha-1(I) chain preproprotein [Homo sapiens]
8 inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 [Homo sapiens]
9 serum albumin preproprotein [Homo sapiens]
10 complement C3 precursor [Homo sapiens]
11 annexin A2 isoform 2 [Homo sapiens]
12 apolipoprotein B-100 precursor [Homo sapiens]
13 thrombospondin-1 precursor [Homo sapiens]
14 vitamin D-binding protein isoform 3 precursor [Homo sapiens]
15 collagen alpha-1(VI) chain precursor [Homo sapiens]
16 hemoglobin subunit alpha [Homo sapiens]
17 plasminogen isoform 1 precursor [Homo sapiens]
18 cartilage oligomeric matrix protein precursor [Homo sapiens]
19 tetranectin precursor [Homo sapiens]
20 SPARC precursor [Homo sapiens]
21 complement C4-B-like preproprotein [Homo sapiens]
22 periostin isoform 4 [Homo sapiens]
23 antithrombin-III precursor [Homo sapiens]
24 serotransferrin precursor [Homo sapiens]
25 fibulin-1 isoform D precursor [Homo sapiens]
중략
404 protein spire homolog 2 [Homo sapiens]
405 chromosome 9 open reading frame 172 [Homo sapiens]
406 PREDICTED: hypothetical protein LOC100510554 [Homo sapiens]
이와 같이 본 발명에 따라 얻어진 줄기세포 파쇄를 통한 성분추출물은 줄기세포 배양액에 비해 현저히 많은 성장인자와 세포활성물질을 포함하고 있다. 이외에도 배양액과 본 성분추출물은 다음 표에서 대비되는 바와 같은 차이를 가진다.
줄기세포 배양액과 줄기세포 성분 추출물의 비교
줄기세포 배양액 본 발명에 따른 줄기세포 성분추출물
성장인자 및
세포 활성 물질
개수
406개
959개
항생제 배양시 항생제 다량투여 배지성분 제거로 항생제가 존재하지 않음
소혈청 배양시 소혈청을 영양분으로 사용함 배지성분 제거로 인해 소혈청이 제거됨
보존제 배지성분 함유로 인해 보존제를 투여해야 함 보존제가 필요하지 않음
표 3에 도시된 바와 같이 상기 배양액에는 배양할 때 필요한 소혈청, 항생제 및 보존제 등의 첨가제가 대량 함유되어 있어 부작용이 발생할 우려가 있으며, 줄기세포가 아닌 줄기세포를 배양한 배양액을 사용하기 때문에 줄기세포를 바로 신체에 주입하는 경우보다 줄기세포 성분의 함유량이 낮은 단점이 있다.
이러한 종래의 배양액은 성장인자 및 세포활성물질의 종류가 제한적이며, 성장인자 및 세포활성물질의 농도가 낮은데 반해, 본 발명의 줄기세포 성분추출물은 성장인자 및 세포활성물질의 종류가 풍부하며 농도를 자유로이 조절 가능하다.
그리고, 상기 줄기세포 성분 추출물을 일정한 분자량을 기준으로 분리하여 얻는다(S7).
상기 줄기세포 성분추출물 중 상대적으로 높은 특성을 가지는 성장인자 및 세포활성물질이 있고, 상대적으로 낮은 특성을 가지는 성장인자 및 세포활성물질이 있다.
아래 표에서와 바와 같이, 일정한 분자량을 기준으로 걸러낼 수 있는 필터를 이용하여 실험한 결과이다.
[ 비교예 ]
도 4는 상술한 과정으로 추출된 줄기세포 성분추출물의 성장인자와 세포활성물질 전부를 적용한 경우이다. 도 4a 에는 실험전, 도 4b 에는 상기 줄기세포 성분추출물 적용 후 7일 후, 도 4c 에는 상기 줄기세포 성분추출물 적용 후 14일 후를 나타내고 있다.
[ 실시예 1 ]
도 5는 상술한 과정으로 추출된 줄기세포 성분추출물 중 분자량 5000을 기준으로 분자량 5000 이상의 성장인자 및 세포활성물질을 적용한 경우이다. 도 5a 에는 실험 전, 도 5b 에는 적용 후 7일 후, 도 5c 에는 적용 후 14일 후를 나타내고 있다.
[ 실시예 2 ]
도 6은 상술한 과정으로 추출된 줄기세포 성분추출물 중 분자량 5000을 기준으로 분자량 5000 이하의 성장인자 및 세포활성물질을 적용한 경우이다. 도 6a 에는 실험 전, 도 6b 에는 적용 후 7일 후, 도 6c 에는 적용 후 14일 후를 나타내고 있다.
도 4 내지 도 6을 참조하면, 상기 비교예에 비해, 실시예 1의 경우 털이 자란 면적이 작아, 상대적으로 분자량이 큰 성장인자 및 세포활성물질의 경우 실제로 세포가 활성하는데 있어 상대적으로 역할이 적음을 알 수 있다.
그리고, 상기 비교예에 비해, 실시예 2이 경우 털이 자란 면적이 넓으므로 상대적으로 작은 분자량의 성장인자 및 세포활성물질의 경우 실제로 세포가 활성하는데 잇어 상대적으로 역할을 더 큼을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 줄기세포에서 유효물질을 추출하는 단계; 및
    상기 유효물질 중 분자량이 5000이하의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  2. 배양액에 줄기세포를 배양하는 단계와;
    상기 배양액을 제거한 후 줄기세포를 세척하는 단계와;
    상기 줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 상기 줄기세포의 수를 카운팅하는 단계와;
    상기 캐리어 액체를 제거하고 상기 줄기세포를 얻는 단계와;
    상기 줄기세포의 수와 목표농도를 고려한 양의 저장성 증량제에 상기 줄기세포를 분산시키는 단계와;
    상기 증량제 내의 상기 줄기세포를 파쇄하는 단계와;
    세포막 잔여물을 제거하는 단계; 및
    상기 줄기세포 추출물 중 분자량이 5000이하의 성분만 걸러내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 세포막 잔여물을 제거하는 단계는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 초음파 파쇄기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 줄기세포를 파쇄하는 단계는 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 단위 파쇄는 2초 내지 7초이며, 상기 휴지시간은 3초 이상인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 저장성 증량제는 증류수, 물 및 0.45% 이하의 식염수 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline), 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성분추출물 제조방법.
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