CN111629765A - 复合界面生物材料促进剂基质 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种组合物，其包括衍生自界面区室的受刺激生物材料，其中当将所述组合物施用于有需要的受试者时，所述组合物能够增加天然组织的产生或愈合。

Description

复合界面生物材料促进剂基质
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月6日提交的美国临时申请第62/776,329号和于2018年1月26日提交的美国临时申请第62/622,489号的优先权。这两个申请的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及一或多种含有生物材料的组合物的开发，所述组合物通过对中间基质的作用来改变三胚层衍生的多细胞系统。
背景技术
直接或间接影响生物材料系统和/或活化、增强和/或调制靶生物材料中的功能活性的能力一直是传统生物医学工程努力的目标。生物材料和/或生物医学工程的传统方法通常是围绕经典教导的组织工程三联体设计的，凭借所述组织工程三联体，细胞类型、分子试剂和/或支架/基质以单一或组合的方式使用，以增强或增加放置试剂的组织中的过程。因此，所述试剂：细胞实体、分子试剂和/或支架/基质在涉及一或多个相互作用组的更完整系统的分离中被分离、合成和/或构建，这会导致限制、空隙和/或不足(例如，细胞衰老、分子误用、不利的微环境选择和/或支架/基质人工化)。生物材料基质开发中的这种简化的方法导致动态系统不完整。随后，这种不完整的系统固有地改变了基质的内在平衡和/或对外部系统产生影响，从而导致整个系统出现非预期后果和/或不平衡。
通常，衍生自三胚层起源的组构化生物系统由三个初级胚层发育而成，所述三个初级胚层通常称为：外胚层、中胚层和内胚层。从这些胚层中产生了组构化细胞结构、功能和生命。这种胚层的适当繁殖和由此产生的在这种胚层之间和/或内部发生的“互相”和“内部”相互作用导致更高级结构(例如，附属物、组织、器官)的形成。
在三胚层生物体中，在阶段性胚胎发育和相关的胚层繁殖期间的细胞效能的降低部分是由于一或多个细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周相互作用组的相对变化而产生的。细胞和/或亚细胞组织的这种变化导致逐渐形成一或多种更有序的结构、一或多种更复杂的基质以及一或多个更多功能的系统。这种实体和/或高级结构的相对、渐进和变化的取向以及生理极性部分是由于存在于活化剂与应答剂之间并且因此可以作用于其中之一和/或两者的有机和无机试剂的界面通量梯度而产生的。这些试剂与离散的因果机制/关系相关。
尽管细胞实体和一或多种相关材料的细胞效能和组织的状态在逐渐成熟和发育过程中转变和变化，但这种生理学的基本要素仍然保持不变。这些变化中的一些变化和/或对结构取向和功能的维持保持与位于一或多个细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周相互作用组之间或内部的相互作用试剂的效果以及这种有机和无机试剂、细胞实体和/或一或多种相关材料之间的相对界面动力学有关。
一或多种组织(功能性组构化细胞实体的基本实例)具备具有共同结构和功能的相互作用细胞的组构化组。在生理学上，哺乳动物组织被组构成四个基本类别：上皮组织(例如，皮肤)、结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、韧带、腱、软骨和骨)、肌肉组织(例如，心脏组织、平滑肌组织和骨骼组织)以及神经组织。每种类型的组织都在维持生物生命的过程中发挥着独特的作用。因此，组织破坏会导致受伤、疾病或生命损失。
当考虑到三胚层衍生的系统(例如，组织)中的有害作用和/或高级结构破坏时，产生、再生和/或新生一或多个组织结构优先于仅仅修复一或多个被破坏的结构，因为修复可能导致由于纤维化、疤痕形成和组织破坏而使结构修复不充分。对加速愈合形式的期望高于疤痕形成，因为加速愈合形式使得所产生的结构和/或相关系统具有更大的功能性能力。
皮肤是对加速愈合形式(如新生和/或再生)的期望高于疤痕形成的一种典型的组织。皮肤是至关重要的器官，其满足基本需求，包含物理和机械屏障保护、对病原体的免疫保护、体温调节和躯体感觉，以及提供外分泌和内分泌作用。必须保持皮肤的物理和结构完整性，以使表皮系统发挥作用。
在皮肤伤口愈合中，可以观察到围绕一或多个相互作用组内的关键的相互依赖元素的复杂性的另外的实例，所述皮肤伤口愈合涉及细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和细胞周事件的无数复杂的、进化上保守的一或多种级联，所述事件通常被简化为四个基本的和常规的渐进阶段：(1)止血；(2)炎症；(3)扩散；和(4)成熟。当在一或多种波动的正常范围之外损坏和/或改变时，三胚层衍生的组织系统通常通过阶段性修复过程做出反应。在这些阶段的整个发展过程中，可能会出现一系列不规则现象，部分原因是由于界面区室和/或一或多个相互作用组内部和/或之间的时间、空间和/或材料限制。这种不规则现象与天然和/或半天然结构、功能、取向、过程或下游状态的产生、再生和新生之间存在相反关系。
在疤痕形成中可以看到包含皮肤组织的表皮系统内的限制相关不规则现象的实例。一或多个疤痕组织在组成和结构上与一或多个正常皮肤组织不同。就组成而言，疤痕组织主要由不规则取向的细胞外材料、改变的细胞实体/群体的相对给量以及因此不同的界面梯度和相互作用组曲线组成。例如，通过皮肤系统的氧梯度的降低选择可以在这种环境中有效地发挥作用的细胞群。在这种环境中，肌成纤维细胞群的水平增加，并且随后有助于不规则取向的细胞外材料的合成和沉积。这些材料和相关细胞群进一步影响系统，以增加疤痕形成、收缩和更高交联、更致密、弹性更小的胶原结构。由环境、细胞实体、相对梯度、界面剂和/或相互作用组曲线的一或多种变化引起的选择性压力导致系统内的试剂、材料、基质、产物和实体的进一步选择存在。随着这些选择性压力进一步指导选择变量的组成，整个系统重新取向和/或重新指导一或多个相互作用组的元素以及细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周的区室界面。
在本领域内已阻止这种功能强大的技术的相关限制源自主要关注于三个主要独立组分的经典教导和相关算法：富集的干细胞实体、经典的固定生长因子和/或合成的支架或基质。尽管很重要，但是在不考虑在一或多个这种细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周区室中驱动动态过程和相互作用的一或多个界面和一或多个相关相互作用组的情况下，此些组分仍然是不完整的。
生物材料是已经被开发、组装和/或指导采用某种形式和/或功能的物质、试剂和/或组分，所述形式和/或功能单独或作为较大系统的一部分可以用于控制、影响和/或改变生命系统和/或动态系统的相互作用。这种生物材料可以进一步用于控制、影响和/或改变更大的系统，其可以随后对这种更大系统的下游效应作出反应。
由于与生物材料或生物系统和/或此些的子组分相关，一或多种促进剂通过驱动、增加、调制、改变和/或以其它方式影响因果关系的形式来促进所述系统内的一或多种变化。
通过对复合相互作用组和/或一或多个细胞内、细胞间和/或细胞外区室界面内的离散选择性压力在指导一或多种生物物理响应材料、一或多种物质和/或一或多种基质的取向、结构、反应性、功能和/或一或多种下游结果方面的价值的理解，目前需要改进自蔓延结构的产生、再生和新生。
发明内容
本发明总体上涉及生物材料促进剂基质的组合物，以及用于从多细胞系统开发活性生物材料组合物的方法及由此产生的组合物。为方便起见，本发明将被称为复合界面生物材料促进剂基质(CIBAS)。
本公开的一个方面涉及组构化结构的产生、新生和/或再生，所述组构化结构可以包含但不限于附属物、界面、组织和/或器官以及相关子组分。
本公开的另一方面涉及利用所述技术来实现一种系统，在所述系统中，CIBAS通过直接或间接效应与材料和/或物质结合，所述直接或间接效应包含但不限于更大系统的激活、增强和/或调制。
本公开的另一方面涉及将所述技术用作其它形式的物质的转移剂，所述其它形式的物质可以包含但不限于以下性质和/或功能：用于转移和/或储存的载体、载剂、介质、组合材料。
本公开的另一方面涉及将所述技术用作基质、输入、添加剂和/或对其它材料、实体、系统、配制品和/或物质形式的补充。
本公开的一方面涉及一种组合物，所述组合物包括衍生自界面区室的受刺激生物材料，其中当将所述组合物施用于有需要的受试者时，所述组合物能够增加天然组织的产生或愈合。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。在提出请求并支付必要费用后，将由专利局提供具有一或多张彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。
为了更好地理解本发明的优点，将通过参考附图中示出的具体实施例来呈现以上简要描述的本发明的更具体的描述。应理解，这些附图仅描绘了本发明的典型实施例并且因此不被认为是对其范围的限制，通过使用附图将更具体和详细地描述并解释本发明，在附图中：
图1描绘了展示本文公开的组合物的效应的实验室大鼠样本L71和L72。
图2描绘了由实例5中的兔软骨样本制备的材料的平均拉曼光谱。提供了兔软骨衍生溶液(上)和兔软骨衍生凝胶(下)的平均拉曼光谱。
图3描绘了由实例6中的兔骨样本制备的材料的平均拉曼光谱。提供了兔长骨衍生溶液(上)、兔长骨衍生冻干凝胶(中)和兔长骨衍生凝胶(下)的平均拉曼光谱。
图4描绘了由具有实例7中的周围肌肉样本的兔长骨制备的材料的平均拉曼光谱。提供了具有周围肌肉衍生溶液的兔长骨(上)、具有周围肌肉衍生冻干凝胶的兔长骨(中)以及具有周围肌肉衍生凝胶的兔长骨(下)的平均拉曼光谱。
图5描绘了由实例8中的兔腔骨(骨髓)样本制备的材料的平均拉曼光谱。
图6描绘了由实例9中的兔肌肉样本制备的材料的平均拉曼光谱。提供了兔肌肉衍生溶液(上)、兔肌肉衍生冻干凝胶(中)和兔肌肉衍生凝胶(下)的平均拉曼光谱。
图7描绘了由实例10中的兔腱结缔组织样本制备的材料的平均拉曼光谱。
图8描绘了由实例11中的兔骨椎体样本制备的材料的平均拉曼光谱。
图9描绘了如实例12中所讨论的来自具有周围肌肉衍生凝胶的兔长骨在25.121/s(橙色)、158.1 1/s(绿色)和1000 1/s(蓝色)的剪切速率下的流变数据。
图10描绘了如实例12中所讨论的由兔肌肉制备的凝胶在25.12 1/s(橙色)、158.11/s(绿色)和1000 1/s(蓝色)的剪切速率下的粘度与温度的关系。
图11描绘了如实例12中所讨论的在pH 6.5和pH 7.5下由兔椎骨制备的凝胶的粘度与剪切速率的关系。
图12描绘了本文公开的某些组合物在使用压缩测试进行冷冻干燥后的弹性模量(kPA)。数值范围表明不同孔径支架的强度差异。
图13描绘了本文公开的某些组合物在使用压缩测试进行冷冻干燥后的弹性模量(kPA)。
图14描绘了本文公开的冷冻干燥骨衍生组合物的结构表征：(上)明场显微图像、(中)示出结构的多光子共焦图像，以及(下)示出多孔结构的扫描电子显微镜(SEM)。
图15描绘了本文公开的冷冻干燥肌衍生组合物的结构表征：(上)明场显微图像、(中)示出结构的多光子共焦图像，以及(下)示出多孔结构的扫描电子显微镜(SEM)。
图16描绘了本文公开的冷冻干燥软骨衍生组合物的结构表征：(上)明场显微图像、(中)示出结构的多光子共焦图像，以及(下)示出多孔结构的扫描电子显微镜(SEM)。
图17描绘了本文公开的分馏流体组合物的某种纳米粒子表征。H#指示具有相关粒子分布和数量的部分。此些粒子是展现出某些布朗运动特性的那些粒子。
图18描绘了本文公开的组合物的某种视觉表征。
图19展示了各种相互作用组。
图20示出了根据实例15测量的组合物(例如，CIBAS)的压缩模量。
图21示出了根据实例16确定的小鼠肌肉衍生组合物(例如，CIBAS)的蛋白质浓度。
图22示出了根据实例16确定的兔骨衍生组合物(例如，CIBAS)的蛋白质浓度。
图23示出了根据实例16确定的小鼠肌肉衍生和小鼠骨衍生的组合物的对比蛋白质浓度。
图24示出了根据实例16确定的小鼠肌肉衍生和小鼠骨衍生的组合物的对比蛋白质浓度。
图25示出了根据实例16确定的小鼠骨衍生组合物的蛋白质浓度。
图26示出了根据实例17确定的小鼠肌肉/骨衍生组合物、小鼠肌肉衍生组合物和小鼠骨衍生组合物的经测量的生物标志物的浓度。
图27示出了根据实例17确定的小鼠肌肉/骨衍生组合物、小鼠肌肉衍生组合物和小鼠骨衍生组合物的骨保护素浓度。
图28示出了根据实例17确定的小鼠肌肉/骨衍生组合物、小鼠肌肉衍生组合物和小鼠骨衍生组合物的SOST浓度。
图29描绘了根据实例18测量的兔肌肉衍生组合物(例如，CIBAS)(下)和天然兔肌肉(上)的对比拉曼光谱。
图30描绘了根据实例18测量的兔脂肪衍生组合物(例如，CIBAS)(下)和天然兔脂肪(上)的对比拉曼光谱。
图31描绘了根据实例18测量的兔软骨衍生组合物(例如，CIBAS)(下)和天然兔软骨(上)的对比拉曼光谱。
图32描绘了根据实例18测量的兔骨衍生组合物(例如，CIBAS)(下)和天然兔骨(上)的对比拉曼光谱。
图33描绘了根据实例18测量的人类皮肤衍生组合物(例如，CIBAS)(下)和天然人类皮肤(上)的对比拉曼光谱。
图34示出了根据实例23的细胞活力实验的结果。
图35示出了根据实例17确定的肝衍生组合物(例如，CIBAS)的IL6、骨保护素和胰岛素的浓度。
图36示出了根据实例17确定的软骨衍生组合物(例如，CIBAS)的IL6、骨保护素、胰岛素和瘦素的浓度。
具体实施方式
在整个本说明书中对“一个实施例”、“实施例”或类似语言的引用意味着结合实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个说明书中通篇出现的短语“在一个实施例中”、“在实施例中”以及类似语言可以但不一定都指代相同的实施例。
此外，本发明的所描述特征、结构或特性可以通过任何适合的方式组合在一或多个实施例中。在以下描述中，包含了许多具体细节以提供对本发明实施例的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，可以在不具备具体细节中的一或多个具体细节的情况下或者可以使用其它方法、部件、材料等实践本发明。在其它情况下，没有示出或详细描述众所周知的结构、材料或操作，以避免模糊本发明的方面。因此，应当理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以利用其它实施例并且可以作出改变。因此，以下详细描述不应视为具有限制意义。
本发明总体上涉及衍生自三胚层多细胞系统的组合物，在所述三胚层多细胞系统中，界面区室破坏并且其中的一或多个细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周相互作用组被结合并因此被活化。本发明总体上还涉及制备这种组合物的方法和这种组合物的使用。
本公开的方面涉及将组合物与生物相容性转移剂结合，用于下游应用。
本公开的方面涉及将组合物与另外的材料、一或多种复合材料和/或物质结合。本文还公开了组合物与另外的材料、一或多种复合材料和/或物质的组合。
本公开的方面涉及增加、促进、调节和/或抑制在三胚层衍生的多细胞系统中利用的过程的组合物。
本公开的方面涉及改变在细胞实体和/或基于细胞的系统中利用的合成代谢、分解代谢和/或新陈代谢所涉及的过程的组合物。
本公开的方面涉及加速细胞和/或组织功能活动的组合物。
本公开的方面还涉及防止或减少细胞或组织结构的分解(例如，包含但不限于组织和多细胞系统内的细胞衰老、疤痕形成和纤维化过程)的组合物。
本公开的方面涉及选择性捕获和改变三胚层衍生样本的细胞周界面以及活化和分离受刺激组合物。
本文公开了包括衍生自界面区室的受刺激生物材料的组合物。当施用于有需要的受试者时，所述组合物能够增加天然组织的产生或愈合。
在一个实施例中，衍生自界面区室的受刺激生物材料是非细胞的。在一个实施例中，受刺激生物材料包括衍生自哺乳动物组织界面细胞的异质群体的生物材料。在一个实施例中，衍生自界面区室的受刺激生物材料包括与哺乳动物组织界面细胞的异质群体相关联的多个相互作用组。
在一个实施例中，受刺激生物材料包括活核心有效细胞实体和支持实体。在一个实施例中，活核心有效细胞实体表达选自由LGR4、LGR5、LGR6及其任何组合组成的群组的一或多种含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体的RNA转录物和/或多肽。在一个实施例中，活核心有效细胞实体表达Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、角蛋白15、角蛋白5、分化簇34(CD34)、Sox9、c-Kit+、Sca-1+或其任何组合中的一或多种的RNA转录物和/或多肽。在一个实施例中，支持实体包括间质衍生细胞群。在一个实施例中，支持实体包括细胞群、细胞外基质成分或其任何组合。在一个实施例中，细胞外基质成分包括透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、细胞外囊泡、酶和糖蛋白中的一或多种。
在一个实施例中，受刺激生物材料衍生自骨组织界面。在一个实施例中，骨组织界面是皮层周组织界面、板层周组织界面、小梁周组织界面、皮质-松质骨组织界面或其任何组合。在一个实施例中，受刺激生物材料衍生自三胚层组织界面。
在一个实施例中，组合物进一步包括选自由药物、酶、分子及其任何组合组成的群组的试剂。
本文还公开了一种用于制备包括衍生自界面区室的受刺激生物材料的组合物的方法，其中当将所述组合物施用于有需要的受试者时，所述组合物能够增加天然组织的产生或愈合。所述方法包括刺激组织样本的哺乳动物界面区室的至少一部分以产生受刺激生物材料，其中哺乳动物界面区室包括哺乳动物组织界面细胞的异质群体。所述方法进一步包括分离所述受刺激生物材料的一部分。在一个实施例中，受刺激生物材料的部分是非细胞部分。
在一个实施例中，使用机械刺激、化学刺激、酶刺激、能量刺激、电刺激、生物刺激或其任何组合来刺激哺乳动物界面区室的部分。在一个实施例中，刺激在生物相容性材料存在的情况下发生。在一个实施例中，生物相容性材料选自由药剂、酶、分子及其组合组成的群组。在一个实施例中，组织样本和生物相容性材料的体积比为约1:1到约3:1。
在一个实施例中，所述方法进一步包括向受刺激生物材料添加生物相容性转移剂。在一个实施例中，生物相容性转移剂选自藻酸盐、明胶、石油、胶原蛋白、矿物油、透明质酸、类晶体、硫酸软骨素、弹性蛋白、藻酸钠、硅酮、PCL/乙醇、卵磷脂、泊洛沙姆及其任何组合。
在一个实施例中，从多个供体获得组织样本。
在一个实施例中，所述方法进一步包括保存受刺激生物材料的分离部分。在一个实施例中，通过干燥或冷冻干燥保存受刺激生物材料的分离部分。
在一个实施例中，所述方法进一步包括向受刺激生物材料的分离部分添加稳定剂。
在一个实施例中，所述方法进一步包括在分离受刺激生物材料之前，将哺乳动物界面区室的受刺激部分培育约12到72小时。在一个实施例中，通过离心、过滤或其组合来分离受刺激生物材料的部分。
在一个实施例中，刺激导致哺乳动物组织界面细胞的异质群体的相互作用组发生一或多种改变。在一个实施例中，受刺激生物材料的分离部分包括选自细胞内相互作用组、细胞间相互作用组、细胞外相互作用组、跨细胞相互作用组、细胞周相互作用组及其组合的多个相互作用组。
本文公开了一种方法，所述方法包括破坏组织样本的界面区室以活化至少一个相互作用组的至少一部分；以及从被破坏的界面区室分离非细胞组合物。在一个实施例中，组织样本来自三胚层动物。
本文还公开了一种方法，所述方法包括破坏组织样本的界面区室以活化和结合多个相互作用组中的每一个的至少一部分；以及从被破坏的界面区室分离非细胞组合物。所述多个相互作用组可以选自细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和细胞周相互组合组及其组合。
在一个实施例中，组织样本是哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、兔、猪、马、人、山羊、绵羊、狗、猫、灵长类动物、奶牛、公牛、骆驼、驴、豚鼠或野牛)。组织样本可以是来自多个供体的多个组织样本。可替代地，组织样本可以是来自单一供体的一或多个组织样本。
可以保存本文公开的组合物。例如，可以通过干燥或冷冻干燥组合物来完成保存。
可以向本文公开的组合物添加表面活性剂。可以向本文公开的组合物添加稳定剂。例如，稳定剂可以选自由胶原蛋白、硫酸软骨素、羟基磷灰石、类晶体、有机溶液、分子、元素及其组合组成的群组。
本公开基于存在于分组的细胞实体内部和之间的外部和内部材料界面。这些界面是唯一的，并且动态地依赖于群体和/或亚群中的每一个细胞的完整相互作用组的集合总体性。在这种环境下，每个细胞都与其周围材料(例如，包含但不限于其它细胞、细胞外基质、基质、试剂、因子和代谢物)的复杂子网络相互作用，所述材料进一步受到非静态外部梯度、力和系统的作用。
生物材料和/或生物医学工程的传统方法忽略了细胞内和细胞间这些相互作用的复杂子网络(即，一或多个相互作用组)。存在于系统内的细胞实体中和/或细胞实体之间的通常被忽视的相互作用的复杂子网络和/或相互作用组在维持、调节、调制和/或加速细胞组织过程、途径和生态位环境中的重要性是本文公开的组合物的基础。本文公开的组合物允许这种相互作用组结合和活化。
如上所述，本文公开的组合物还可以被称为复合界面生物材料促进剂基质(CIBAS)。
CIBAS通过向不完整系统提供反应试剂来作用于响应性三胚层衍生的材料系统，以使不完整系统的试剂和/或不完整系统的部分子网络复杂和/或与其相互作用，并因此加速功能性产物形成。在整个细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周区室中，适合的和/或功能完整的一或多个界面和一或多个相互作用组的适当繁殖是一或多个功能性自繁殖结构的产生、再生和/或新生愈合和/或恢复的原因，所述功能性自繁殖结构能够与放置一或多个这种结构的更大系统整合和/或关联。
功能性产物形成可以描述为形成更组构化结构，在反应中形成产物，和/或改变材料的一或多种化学、电学、电化学和/或物理状态或状况。
CIBAS可以通过合成、改变、修饰、调制、调节、组装或破坏材料来改变环境，从而改变其部署环境，所述材料如但不限于：基因组、表观基因组、转录组、表观转录组、蛋白质组和/或表观蛋白质组材料、亚细胞细胞器或亚细胞结构以及此些结构的衍生物、细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周基质、支架、粒子、纤维和/或结构元素、合成代谢、分解代谢和/或新陈代谢过程和材料以及此些材料的衍生物、化学、电化学和/或电环境、材料力学、材料力、材料动力学和/或材料热力学、有机材料和/或活性材料、组织和/或器官系统、一或多个细胞、细胞实体和/或细胞系统以及复合系统。
CIBAS具有涵盖多个使用领域的多种用途和应用，包含但不限于医疗、健康、治疗、研究、非医疗、制造、技术相关、国防相关和营养用途。例如，CIBAS可以用于医学中的临床产品应用，如与细胞和/或组织产物、一或多种医疗设备、生物制品、治疗剂、小分子产物和/或药物产物的开发相关的应用。作为另一个实例，通过整合、组合和/或多材料合成，CIBAS可以与用于组合产品类型的其它技术或多个技术结合。作为进一步的实例，CIBAS可以用于与细胞、组织和器官系统和/或其衍生物的产生、再生、新生、增加、改变、组装和/或破坏相关的应用中。作为一个实例，本文公开的组合物在施用后可以防止或减少疤痕。
作为另一个实例，CIBAS可以用于研究应用和研究相关产品(例如，包含但不限于与临床产品类型和组合技术和/或产品类型的研究进展相关的应用、与将本发明用于研究产品、研究测试、研究和开发相关的应用、与外部生命支持、生物反应器、活性材料的培育或维护的开发相关的应用)。
作为另一个实例，CIBAS可以用于医疗和/或非医疗工作的应用中(例如，包含但不限于药理学和/或化妆品应用)。例如，某些实施例可以调节细胞迁移和增殖，从而减少炎症、加速伤口愈合、减少疤痕并最终促进所有组织中的结构和功能的修复、再生和恢复。某些实施例可以直接、作为预处理、作为预调节，与损伤同时、在损伤前或损伤后提供。某些实施例可以在美容和/或临床手术之前或之后减少瘢痕疙瘩疤痕形成。某些实施例可以用于治疗由但不限于疾病或手术对器官和组织造成的内部损伤，所述器官和组织包含但不限于心脏、骨、脑、脊髓、视网膜、外周神经和通常遭受急性和慢性损伤或疾病的其它组织和器官。
作为进一步的实例，CIBAS可以用于相关技术衍生物的开发、用于其它技术的转移剂的开发、用于其它技术的活化或调节剂的开发，和/或用于有机或无机生产的小分子、蛋白质、细胞器或亚细胞材料的制造或合成的开发。
作为另一个实例，CIBAS可以用于非活性材料的开发。
作为另一个实例，CIBAS可以用于与军事、武器和/或国防衍生物的开发相关的应用。
作为仍另一个实例，CIBAS可以用于食品、营养物、营养品、保健品和/或膳食补充剂的开发，和/或一或多个复合系统的一或多个人工智能、胜任和/或繁殖系统和/或一或多个单元的开发。
获得组合物涉及破坏界面区室以提供能够组装功能性材料(例如，组织)的界面周围反应性材料(PiRM)。组合物的一个实施例是存在于界面周围被引导离开界面进行处理的反应性细胞子代的靶向部分。
界面周围反应性材料(PiRM)的组合物包含细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周围区室内和/或之间的相互作用组的材料。在某些实施例中，组合物包含不能天然排列成单一组合物的组分：细胞到细胞内材料；细胞到细胞材料(即，细胞间)；细胞到细胞外材料；细胞到跨细胞材料；以及细胞到细胞周围材料。组合物可以衍生自组织(例如，皮肤组织)样本内的界面区室。
可以从完整的界面区室或子区室界面中的细胞组织环境和/或多细胞环境和/或一或多个工程细胞系统获得界面区室。
完整的界面区室是指位于所述区域内的内容物材料，当如本文公开的进行工程化时，所述内容物材料将或可以通过进一步的处理供应用于开发本文公开的组合物所需的那些材料。
如以下更详细描述的，对于每个感兴趣的材料基质和/或组织，完整的界面区室将包含有助于其独特功能的所述基质和/或组织的那些基本组分或具有此些功能的组分。
子区室界面也是指位于所述区域内的内容物材料，当如本文公开的进行工程化时，所述内容物材料将或可以通过进一步的处理供应用于开发本文公开的组合物所需的那些材料。子区室界面是指完整界面区室的一部分。
围绕三胚层衍生材料界面的界面区室可以用本领域普通技术人员可用的设备(例如，通过激光扫描多光子共焦显微镜)来定位。可以通过本领域普通技术人员理解的多种方法来获得界面区室，所述方法包含但不限于共同采集、活组织检查、穿孔、抽吸、分裂、限制、消化、提取、切除、分解、分隔、去除、分割和/或分离方案。当获得足够的材料以用于手边的应用(例如，治疗创口的大小所需的材料的体积/质量)时，界面的分离就完成了。
界面区室被破坏，以使这种区室和/或子区室与周围材料脱离，并改变材料的固有组织而不完全破坏材料，并获得细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周材料的最小极化。如本文所使用的，“最小极化”是指通过人工操纵能够组装功能性极化组织的组织单位所必需的生物材料而实现的极化程度。可以使用机械、化学、酶、能量、电、生物和/或其它物理方法来实现人工操纵。
本领域技术人员将理解多种破坏靶材料的方法，包含但不限于机械、化学、酶、能量、电、生物和/或物理机制。例如，来自周围物质的材料的靶向激光捕获显微技术可以产生完整的界面区室或子区室界面。在一个实施例中，通过以机械、物理、能量、化学和电学方式中的至少一种方式改变界面区室的固有组织来完成破坏。
在实施例中，破坏在存在生物相容性材料的情况下发生。生物相容性材料可以形成各种物质状态，例如，包含但不限于固态、液态和/或气态。在一个实施例中，生物相容性材料是溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)。生物相容性材料可以包含抗生素，如抗葡萄球菌抗生素(例如，用于改变微生物群体)。在一个实施例中，生物相容性材料选自由药剂、酶、分子及其组合组成的群组。组织样本和生物相容性材料的体积比可以是例如约1:1至约1:2。可替代地，组织样本和生物相容性材料的体积比可以是例如约1:1至约2:1或约1:1至约3:1。例如，体积比可以是约1:1、约2:1或约3:1。
破坏界面区室提供了能够组装功能性材料(例如，功能性极化组织)的界面周反应性材料(PiRM)。在实施例中，通过本文所述的方法生产的PiRM能够在体内组装功能性材料(例如，功能性极化组织)。
在实施例中，通过本文所述的方法生产的PiRM能够在体外组装功能性材料(例如，功能性极化组织)。
在实施例中，通过本文所述的方法生产的PiRM能够离体组装功能性材料(例如，功能性极化组织)。
在界面区室的破坏过程中，一或多个细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和/或细胞周相互作用组的非细胞组分可以用于提供组合物。
在界面区室破坏后，可以培育被破坏的界面区室。培育可以涉及搅拌被破坏的界面区室，例如，约8小时至约12小时。在某些实施例中，搅拌被破坏的界面区室可持续约8小时至约72小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时、约36小时至约72小时、约48小时至约72小时或约60小时至约72小时。示例性时间包含但不限于约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时和约72小时。
组合物可以通过本领域普通技术人员已知的多种方式进行分离，所述方式包含但不限于功能性外渗、过滤、分馏、选择性捕获、选择、离心、富集、辅助还原、分隔、分级、分割、加压、裂解、消化、乳化、质子化和/或沉淀。作为一个实例，分离组合物可以涉及如通过离心进行的组合物的机械分离。作为另一个实例，分离还可以涉及如离心后的组合物过滤。例如，过滤可以涉及使组合物通过约10μm至约100μm过滤器。过滤可以涉及使组合物通过约1μm过滤器、约5μm过滤器、约10μm过滤器、约15μm过滤器、约20μm过滤器、约30μm过滤器、约40μm过滤器、约50μm过滤器、约60μm过滤器、约70μm过滤器和约85μm过滤器、约100μm过滤器、约200μm过滤器、约300μm过滤器、约400μm过滤器或约500μm过滤器。
如本文所使用的，术语“促进剂”应被理解为意指用于加速过程的物质。
如本文所使用的，术语“非细胞”应被理解为意指基本上不含完整细胞，但可以包含生物学上不显著水平的完整细胞和/或剩余细胞残余物，使得细胞和/或残余物不干扰组合物的性质。细胞完全去除的程度将取决于用于制备组合物的确切来源和方法，以及组合物的最终用途和期望状态。
如本文所使用的，向受试者“施用”组合物包含向受试者引入或递送组合物以发挥其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径来进行施用，包含但不限于通过移植、口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内或局部施用。施用包含自我施用和他人施用。示例性施用方法包含但不限于注射、局部施用、包衣和浸渍。
术语“生物材料”应被理解为意指除药物以外的任何合成的或天然的、可用于任何时期、部分或全部增加或替代身体的任何组织、器官或功能以维持或改善个体的生活质量的物质或物质组合。
除非另有说明，否则如本文所使用的，术语“复合”应被理解为意指由多个部分或元素组成。
如本文所使用的，“核心有效细胞实体”是指能够进行细胞间通信、迁移、趋化、增殖、分化、转分化、去分化、瞬时扩增、不对称分裂的细胞实体，并且包含干细胞、祖细胞和转运扩增细胞。核心有效细胞实体可以通过例如分析某些亚细胞生物标记(即，DNA、RNA和蛋白质)来标记或建立。在一些实施例中，核心有效细胞实体表达一或多种含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(LGR)的RNA转录物和/或多肽，如LGR4、LGR5、LGR6或其组合。另外地或可替代地，在一些实施例中，核心有效细胞实体表达Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、角蛋白15、角蛋白5、分化簇34(CD34)、Sox9、c-Kit+、Sca-1+及其任何组合中的一种或多种的RNA转录物和/或多肽。核心有效细胞实体的生物标记物的另外的实例描述于Wong等人的《国际生物材料杂志(International Journal of Biomaterials)》,第2012卷,文章ID 926059,第8页,2012。
如本文所使用的，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致本文所述疾病或病症或与本文所述疾病或病症相关联的一或多种体征或症状得到预防或减轻的量。在治疗或预防应用的上下文中，施用于受试者的组合物的量将根据组合物、疾病或病症的程度、类型和严重性以及个体的特性(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。本领域技术人员将能够根据这些和其它因素确定合适的剂量。组合物还可以与一或多种另外的治疗化合物结合施用。在本文所述的方法中，可以向具有本文所述疾病或病症的一或多种体征或症状的受试者施用治疗组合物。
如本文所使用的，“细胞外基质”和“细胞外基质成分”是指被组织成三维网络以为周围细胞提供结构和生物化学支持的细胞外大分子，如透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、细胞外囊泡、酶和糖蛋白。
如本文所使用的，术语“功能性材料”、“功能性组织”和“功能性极化组织”是指具有相同起源并且执行与天然对应组织中观察到的类似的生物学功能的细胞及其细胞外基质的集合。在一些实施例中，“功能性材料”、“功能性组织”或“功能性极化组织”表现出类似于在天然对应组织中观察到的如极性、密度、柔韧性等特征。
如本文所使用的，术语“相互作用组”是指发生在细胞或细胞材料内部和/或之间的一组分子相互作用。相互作用组的实例包含但不限于细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和细胞周相互作用组。
术语“界面”应被理解为意指活性材料和/或有机材料与其它生物材料或有机/无机材料之间的接触区域。
如本文所使用的，术语“界面区室”是指包含组织界面的组织样本的一部分。
如本文所使用的，术语“材料界面”是指两个或更多个不同或可区分的细胞在可以或可以不包含其它材料、基质或因子的环境和/或系统中彼此接近、接触、合并、整合、并入、联合、汇聚、结合、混合、融合、邻接、触碰、毗邻、融合、通信、突触、接合、相互作用、共享、聚集、连接、穿透、环绕或形成的区域、区和/或位置。此一或多个其它环境和/或一或多个系统可以用于与本文公开的组合物相互作用。
如本文所使用的，“受刺激”是指活化(例如，改变)存在于组织界面的异种哺乳动物组织/细胞的生理状态，这可以通过一或多种信号的结合来执行，所述信号包含电刺激、氧梯度、趋化因子受体结合、旁分泌受体结合、细胞膜改变、细胞骨架改变、细胞的物理操纵、生理梯度改变、温度改变、小分子相互作用、核苷酸和核糖核苷酸(如抑制性小RNA)的引入，所述信号足以诱导以下表型/结果中的一或多种：改变基因表达、改变蛋白质翻译、改变细胞内和细胞间信号、改变囊泡与膜的结合、改变ATP产生和消耗以及改变细胞流动性。
术语“基质”应被理解为意指生物体生存、生长或获得其营养的表面或材料。
如本文所使用的，“支持实体”是指为核心有效细胞实体提供结构和生物化学支持的非干细胞群体(例如，支持性细胞实)体和/或细胞外基质材料。在一些实施例中，支持性细胞实体可以包括增殖和/或分化细胞。另外地或可替代地，在一些实施例中，支持性细胞实体可以通过如BMPr1a、BMP2、BMP6、FGF、刻痕受体(Notch receptor)、δ配体、CXCL12、Sonic Hedge Hog、VEGF、TGFβ、Wnt、HGF、NG2和α平滑肌肌动蛋白等生物标志物的表达来标识。在一些实施例中，支持性细胞实体包括间质衍生的细胞群体。
如本文所使用的，“组织界面”是指独立的和任选地不相关的组织系统相互作用和相互通信的位置。在一些实施例中，组织界面的组分目前促进/促进了组织发生和细胞发育和/或新陈代谢，包含但不限于增殖、分化、迁移、合成代谢、分解代谢、刺激或细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和细胞周通信中的至少一种或其任何组合。
示例性组织界面包含但不限于卵裂球顶端细胞界面、卵裂球侧面细胞界面、卵裂球基底细胞界面、外胚层顶端细胞界面、外胚层侧面细胞界面、外胚层基底细胞界面、中胚层顶端细胞界面、中胚层侧面细胞界面、中胚层基底细胞界面、内胚层侧面细胞界面、内胚层基底细胞界面、皮肤组织界面、骨组织界面、肌肉骨骼组织界面、平滑肌组织界面、心肌组织界面、软骨组织界面、脂肪组织界面、胃肠组织界面、肺组织界面、食管组织界面、胃组织界面、肾组织界面、肝组织界面、胰腺组织界面、血管组织界面、淋巴组织界面、中枢神经组织界面、泌尿生殖组织界面、腺组织界面、牙组织界面、外周神经组织界面、出生组织界面和光学组织界面。
皮肤组织界面可以包含上皮-真皮组织界面、乳头状真皮-网状真皮组织界面、真皮-皮下界面、皮下-皮下界面或其任何组合。
骨组织界面可以包含皮层周组织界面、板层周组织界面、小梁周组织界面、皮质-松质骨组织界面或其任何组合。
肌肉骨骼组织界面可以包含肌-肌外膜组织界面、肌-肌束膜组织界面、肌-肌内膜组织界面、肌-筋膜组织界面、腱-肌肉组织界面、腱-骨组织界面、韧带-骨组织界面或其任何组合。
平滑肌组织界面可以包含血管周围组织界面、内脏周组织界面、神经周组织界面或其任何组合。
心肌组织界面可以包含心内膜-心肌组织界面、心肌-心外膜组织界面、心外膜-心包组织界面、心包-脂肪组织界面或其任何组合。
软骨组织界面可以包括软骨-软骨膜组织界面、软骨-软骨内组织界面、软骨内-软骨下骨界面、软骨-软骨内骨界面、软骨内-软骨下骨界面或其任何组合。
脂肪组织界面可以包含脂肪-血管周组织界面、脂肪-基质周组织界面或其任何组合。
胃肠组织(小肠和大肠)界面可以包含粘膜-粘膜下层组织界面、粘膜下-肌层组织界面、肌层-浆膜组织界面、浆膜-肠系膜组织界面、肌-神经组织界面、粘膜下层-神经组织界面或其任何组合。
肺组织界面可以包含粘膜-粘膜下层组织界面、粘膜下-肌层组织界面、粘膜下-软骨组织界面、肌肉-外膜组织界面、导管-外膜组织界面、实质-浆膜组织界面、浆膜-肠系膜组织界面、肌-神经组织界面、粘膜下层-神经组织界面或其任何组合。
食管组织界面可包含粘膜-粘膜下层组织界面、粘膜下-肌层组织界面、肌层-外膜组织界面、肌-神经组织界面、粘膜下层-神经组织界面或其任何组合。
胃组织界面可以包含粘膜-粘膜下层组织界面、粘膜下-肌层组织界面、肌层-浆膜组织界面、肌-神经组织界面、粘膜下层-神经组织界面或其任何组合。
肾组织界面可以包含包膜-皮层组织界面、皮层-髓质组织界面、神经-实质组织界面或其任何组合。
肝组织界面可以包含导管上皮-实质组织界面。
胰腺组织界面可以包含导管上皮-实质组织界面、腺上皮-实质组织界面或其任何组合。
血管组织界面可以包含内皮-被膜组织界面、被膜-被膜组织界面或其任何组合。
淋巴组织(淋巴结、脾脏、胸腺)界面可以包含皮质-髓质组织界面、髓质-包膜组织界面、包膜-牙髓组织界面或其任何组合。
中枢神经组织界面可以包含硬脑膜-皮质组织界面、皮层灰质-髓质白质组织界面、脑膜-神经组织界面或其任何组合。
泌尿生殖组织界面可以包含上皮-粘膜组织界面、粘膜-肌肉组织界面、肌肉-外膜组织界面、身体-血管组织界面、身体-肌肉组织界面或其任何组合。
腺组织界面可以包含上皮-实质组织界面。
牙组织界面可以包含牙本质-牙髓组织界面。
外周神经组织界面可以包含神经外膜-神经周围组织界面、神经周围-神经内组织界面、神经内-轴突组织界面或其任何组合。
出生组织界面可以包含羊膜-流体组织界面、上皮-上皮下组织界面、上皮-基质组织界面、致密-成纤维细胞组织界面、成纤维细胞-中间组织界面、中间-网状组织界面、羊膜-绒膜组织界面、网状-滋养层组织界面、滋养层-子宫组织界面、滋养层-蜕膜组织界面或其任何组合。
光学组织界面可以包含上皮-膜组织界面、膜-基质组织界面、基质-膜组织界面、膜-内皮组织界面、内皮-流体组织界面、巩膜-脉络膜组织界面、脉络膜-上皮组织界面、上皮-节段光受体组织界面、节段光受体组织-膜组织界面、膜-外核层组织界面、外核层-外丛状组织界面、外丛状-内丛状组织界面、内丛状-神经节组织界面、神经节-神经纤维组织界面、神经纤维组织界面-膜组织界面或其任何组合。
在实施例中，CIBAS是分离的组合物。在其它实施例中，分离的组合物被修饰成提供CIBAS。
可以向组合物添加生物相容性转移剂。例如，可以将组合物与生物相容性转移剂一起配制成例如包含但不限于注射配制品、外用液体配制品、局部凝胶配制品、血清、软膏、泡沫、乳膏、糊剂、洗液或粉末。示例性生物相容性转移剂包含藻酸盐、明胶、石油、胶原蛋白、矿物油、透明质酸、类晶体、硫酸软骨素、弹性蛋白、藻酸钠、硅酮、PCL/乙醇、卵磷脂、泊洛沙姆、1x HBSS、10x HBSS、1x PBS/DPBS、10x PBS/DPBS、10x DMEM、RPMI、盐水、柠檬酸钠盐水、柠檬酸钠、柠檬酸及其任何组合。组合物可以与药学上可接受的表面活性剂(例如，润湿剂、乳化剂、悬浮剂等)结合。
生物相容性转移剂可以包含一或多种有机材料可以生存和/或存在于其中的组分。如此，生物相容性转移剂可以包含但不限于有机材料可以放置和生存和/或存在于其中的固体、液体、气体。
在实施例中，组合物可以包括衍生自单一组织类型的材料，例如，脂肪、骨、脑、脊髓、软骨、心脏、肝脏、肌肉、胰腺、皮肤或腱。
在某些实施例中，组合物可以包括衍生自多种不同组织类型的材料，例如，骨和肌肉，以及血凝块/血清和骨等。
在某些实施例中，组合物可以经受进一步的一或多种处理(例如，冷干、透析、冲洗、热固化、交联(例如，与EDC/NHS、戊二醛或氯化钙交联)、脱水、模塑/纹理化、静电纺丝或其任何组合)。作为另一个实例，组合物可以进行干燥或冷冻干燥(即，冻干)。脱水和冷冻干燥是典型的保存方法。作为另一个实例，组合物可以包含另外的治疗剂(例如，小分子)。作为另一个实例，组合物(分离的或配制的)可以添加到可吸收伤口敷料(例如，网、纱布、棉布、泡沫、胶带、胶原、海绵、基质或绷带)中。组合物还可以包含在含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体家族(LGR)或与此序列家族相互作用的试剂中识别的序列。
作为另一个实例，组合物(分离的或配制的)可以添加到生物相容性基质中。例如，可以将3D打印骨支架浸泡在分离的组合物中。此外，例如，可以将静电纺丝骨支架浸泡在组合物中。静电纺丝是通过将聚合物溶液或“熔体”的带电线(通常直径为几百纳米)用力拉长以拉成丝的方式来产生纤维结构的过程。将生物活性组分并入到一或多个静电纺丝纤维结构上可以包含将静电纺丝纤维物理浸泡在包括生物活性组分的溶液中。
本文公开的组合物可以用作支架或空隙填充剂的替代物，或与其它装置结合使用，以促进组织愈合、填充空隙、维持基本结构，并通过其生物和机械特性桥接分离的组织表面。因此，本文公开的组合物可以用于移植手术，包含但不限于整形外科手术、神经外科手术、整形手术、牙科手术和皮肤外科手术。
本文公开的组合物可以用作支持离体或体外细胞或组织培育中细胞增殖的培养基。本文公开的稳定组合物可以用作离体或体外细胞或组织培育的支架或基质。作为细胞或组织培育的培养基或稳定组合物，本文公开的组合物可用于组织工程和再生医学的研究和开发。
本文公开的组合物可以是自体的。可替代地，本文公开的组合物可以是异体的。可替代地，本文公开的组合物可以是异种的。
在实施例中，本文公开的组合物表征于纳米粒子直方图分析。直方图通常示出纳米粒子群体的分布和大小，包含如外来体等天然存在的纳米粒子，以及特定范围内纳米粒子大小的浓度。直方图可以包括无模式、一种模式或多种模式。直方图“峰值”或“模式”通常代表给定曲线中出现频率(浓度)最高的一或多个值或一或多个数据范围。
在其它实施例中，本文公开的组合物表征于拉曼光谱。拉曼光谱通常由绘制峰值拉曼强度与峰值拉曼位移关系的图来表示。拉曼光谱的“峰值”也被称为“吸收带”。给定拉曼光谱的特性峰可以根据峰的位置和其相对强度来选择。
本领域的普通技术人员认识到，给定组合物的拉曼峰位移和/或强度的测量结果将在误差范围内变化。用倒数波数(cm-1)表示的峰值偏移值允许适当的误差范围。通常，误差范围由“±”表示。例如，约“1310±10”的拉曼位移表示从约1310+10(即约1320)到约1310-10(即约1300)的范围。取决于样本制备技术、应用于仪器的校准技术、人类操作变化等，本领域的普通技术人员认识到，拉曼位移的适当的容限误差可以是±12；±10；±8；±5；±4、±3、±1或更小。
用于拉曼光谱分析的方法和设备的另外的细节在实例部分中描述。
在实施例中，组合物表现出包括约856±4cm-1、约965±4cm-1、约1446±4cm-1、约1656±4cm-1和约2900±4cm-1的峰值的拉曼光谱。在实施例中，组合物表现出包括约856±12cm-1、约965±12cm-1、约1446±12cm-1、约1656±12cm-1和约2900±12cm-1的峰值的拉曼光谱。在实施例中，组合物表现出包括约856±10cm-1、约965±10cm-1、约1446±10cm-1、约1656±10cm-1和约2900±10cm-1的峰值的拉曼光谱。在实施例中，组合物表现出包括约856±8cm-1、约965±8cm-1、约1446±8cm-1、约1656±8cm-1和约2900±8cm-1的峰值的拉曼光谱。在实施例中，组合物表现出包括约856±5cm-1、约965±5cm-1、约1446±5cm-1、约1656±5cm-1和约2900±5cm-1的峰值的拉曼光谱。在实施例中，组合物表现出包括约856±3cm-1、约965±3cm-1、约1446±3cm-1、约1656±3cm-1和约2900±3cm-1的峰值的拉曼光谱。在实施例中，组合物表现出包括约856±1cm-1、约965±1cm-1、约1446±1cm-1、约1656±1cm-1和约2900±1cm-1的峰值的拉曼光谱。
在实施例中，组合物具有包含列于表1A、1B、1C、1D、1E、1F或1G中的峰值的拉曼光谱。
Figure BDA0002585266590000191
Figure BDA0002585266590000201
在实施例中，组合物具有包含列于表2A、2B、2C、2D、2E、2F或2G中的峰值的拉曼光谱。
Figure BDA0002585266590000202
在实施例中，组合物具有包含列于表3A、3B、3C、3D、3E、3F或3G中的峰值的拉曼光谱。
Figure BDA0002585266590000203
在实施例中，组合物具有包含列于表4A、4B、4C、4D、4E、4F或4G中的峰值的拉曼光谱。
Figure BDA0002585266590000204
Figure BDA0002585266590000211
在实施例中，组合物表现出与图2、图3、图4、图5、图6、图7和图8的拉曼光谱中一个基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图2的拉曼光谱中一个基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图3的拉曼光谱中一个基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图4的拉曼光谱中的一个基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图5的拉曼光谱基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图6的拉曼光谱中一个基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图7的拉曼光谱基本类似的拉曼光谱。在一个实施例中，组合物表现出与图8的拉曼光谱中一个基本类似的拉曼光谱。
本文还公开了包括本文所公开的组合物和使用说明书的试剂盒。
本文进一步公开了用于增加有需要的受试者的组织再生的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的组合物。
本文另外公开了用于增加有需要的受试者的天然组织愈合的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的组合物。在一个实施例中，天然组织是皮肤，并且施用所述组合物防止或减少受试者的疤痕。
在一个实施例中，受试者患有退行性骨病。在一个实施例中，退行性骨病是骨关节炎或骨质疏松症。在一个实施例中，受试者患有骨折或骨裂。在一个实施例中，骨折是稳定性骨折、开放性复合骨折、横向骨折、倾斜骨折或粉碎性骨折。
示例性实施例
1.一种工艺，其包括以下步骤：
破坏组织样本的界面区室以活化和结合多个相互作用组中的每一个的至少一部分；以及
从所述被破坏的界面区室分离非细胞组合物。
2.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述破坏在存在生物相容性材料的情况下发生。
3.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述生物相容性材料选自由药剂、酶、分子及其组合组成的群组。
4.根据任一前述技术方案所述的工艺，其进一步包括向所述组合物添加生物相容性转移剂的步骤。
5.根据任一前述技术方案所述的工艺，其进一步包括保存所述组合物的步骤。
6.根据任一前述技术方案所述的工艺，其进一步包括培育所述被破坏的界面区室的步骤。
7.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述组织样本是哺乳动物。
8.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述组织样本包括来自多个供体的多个组织样本。
9.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述组织样本和所述生物相容性材料的体积比为约1:1到约1:2。
10.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述体积比为约1:1。
11.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中通过以机械、物理、能量、化学和电学方式中的至少一种方式改变所述界面区室的固有组织来完成所述破坏。
12.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中通过干燥或冷冻干燥所述组合物来完成所述保存。
13.根据任一前述技术方案所述的工艺，其进一步包括向所述组合物添加表面活性剂的步骤。
14.根据任一前述技术方案所述的工艺，其进一步包括向所述组合物添加稳定剂的步骤。
15.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述稳定剂选自由胶原蛋白、硫酸软骨素、羟基磷灰石、类晶体、有机溶液、分子、元素及其组合组成的群组。
16.根据任一前述技术方案所述的工艺，其中所述多个相互作用组选自细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和细胞周相互组合组及其组合。
17.通过根据任一前述技术方案所述的工艺制备的所述组合物。
18.一种方法，其包括施用所述通过任一前述技术方案所述的工艺制备的所述组合物。
19.根据任一前述技术方案所述的方法，其中所述组合物在施用后防止或减少疤痕。
20.一种组合物，其包括衍生自三胚层组织界面的选自细胞内、细胞间、细胞外、跨细胞和细胞周相互作用组及其组合的受刺激非细胞材料。
实例
实例1
从系统、材料、基质和/或组织中采集、提取、切除、去除、活组织检查、穿孔、分解、消化、分裂、收回、分隔、分割或分离一种形式的复合外皮组织。这种作用可以通过一或多种机械、化学、酶、电、生物和/或物理机制发生。
将复合外皮组织置于溶液A[等渗的生物相容性溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)+/-一或多种抗菌剂]中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
将复合外皮组织置于溶液B[等渗的生物相容性溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)]中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
将复合外皮组织置于溶液A中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
将复合外皮组织置于溶液B中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
从溶液B中去除复合外皮组织，并置于溶液C[等渗的生物相容性溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)]中，并定位界面。可以使用设备和/或支持系统来定位界面。
如果不存在完整的界面，则定位存在或可能存在界面的子区室或子集的区域。
采集、提取、切除、去除、活组织检查、穿孔、分解、消化、分裂、收回、分离、分割或分隔界面区室。
通过以下各项获得非细胞组合物：
a.通过搅拌、加压、剪切和/或其它形式的非物质化，以机械、物理和/或能量方式改变界面；
b.以化学和/或电学方式改变离子材料；或者
c.以能量方式破坏界面；并且然后分离非细胞组合物。
实例2
从系统、材料、基质和/或组织中采集、提取、切除、去除、活组织检查、穿孔、分解、消化、分裂、收回、分隔、分割或分离一种形式的复合外皮组织。这种作用可以通过一或多种机械、化学、酶、电、生物和/或物理机制发生。
将复合外皮组织置于溶液A[等渗的生物相容性溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)+/-一或多种抗菌剂]中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
将复合外皮组织置于溶液B[等渗的生物相容性溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)]中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
将复合外皮组织置于溶液A中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
将复合外皮组织置于溶液B中5分钟，并轻轻搅拌、摇晃、摇动或搅动。
从溶液B中去除复合外皮组织，并置于溶液C[等渗的生物相容性溶液(例如，0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液、3.2％柠檬酸钠)]中，并定位界面。可以使用设备和/或支持系统来定位界面。
如果不存在完整的界面，则定位存在或可能存在界面的子区室或子集的区域。
采集、提取、切除、去除、活组织检查、穿孔、分解、消化、分裂、收回、分离、分割或分隔界面区室。
通过以下各项获得非细胞组合物：
d.通过搅拌、加压、剪切和/或其它形式的非物质化，以机械、物理和/或能量方式改变界面；
e.以化学和/或电学方式改变离子材料；或者
f.以能量方式破坏界面；并且然后分离非细胞组合物。
配制组合物。
将配制的组合物添加到生物相容性载体中，以供储存、运输、保存、使用、部署或改变。可替代地，也可以将一或多种材料直接放入生命系统、部分生命系统和/或允许所述一或多种材料持续存在和/或繁殖的合成支持系统中。
一或多种材料可以直接和/或间接地更改、改变、调节、操纵、调整、修饰、转换、转化、突变、重构、进化、适配、整合和/或从一或多种其它材料中减去和/或添加到一或多种其它材料中，以改变一或多个这种系统和/或一或多种环境中的主要材料的功能、外观、结构、组成、行为和/或存在。
通过利用可以涵盖以下中的一种或组合的载体将配制的组合物根据需要部署在靶向环境和/或系统中，用作初级产物：固体、半固体、液体、半液体、颗粒、纤维、支架、基质、分子、基质、材料、细胞实体、组织实体、装置、生物制剂、治疗剂、大分子、化学品、试剂、生物体、介质和/或合成物质。
实例3：皮肤衍生组合物的制备
从12周大的路易斯(Lewis)大鼠背部取出皮肤组织样本，并储存在冷冻的HBSS中，并且随后在无菌样本杯中在HBSS和0.1mg/mL庆大霉素溶液中冲洗5分钟。
在层流罩中，将组织从样本容器中单独取出并放置在培养皿中。然后，将HBSS+分散酶5U/μL以等同于组织样本的体积添加到每个培养皿中。
然后，在37℃+5％CO2下将样本在振荡器上放置6小时。然后，将材料放入50cc的锥形管中。向样本中添加另外的体积相等的终止剂。
将等量的RPMI添加到材料中，并在4℃下在振荡器上放置一夜。
摇晃后，混合物以10,000rpm经受离心10分钟，从而产生上清液和剩余组织碎片的团块。在层流罩中，从每个皮肤组织样本中取出上清液，用40μm过滤器过滤。
将滤液以1:1的比例添加在由含有800mL蒸馏水+10x[8g NaCl、400mg KCl、140mgCaCl2、100mg MgSO4-7H2O、100mg MgCl2-6H2O、60mg Na2HPO4、60mg KH2PO4、1g葡萄糖和350mg NaHCO3]的碱基制成的储备溶液中。然后，将组合的溶液放置在离心管中，并在4℃下储存。
将半固体材料(离心后从顶部分离)从管中取出，并放置在模具中冷冻干燥。模具在使用前用硅酮脱模剂喷涂。冷干机的设置包含：真空为500-600mTorr之间，升温速率为1.7℃/分钟，在-29℃下冷冻2小时，在-18℃下初步干燥40小时，在29℃下二次干燥1小时。
实例4：拉曼光谱实验条件
使用具有10×物镜(N.A.0.25)的共焦拉曼显微镜(赛默飞世尔(Thermo Fisher)拉曼DXR)和785nm的激光波长(采样点的功率为28mW)来收集光谱。样品上的估计光斑大小为2.1μm，并且分辨率为2.3-4.3cm-1。所用的共焦孔径为25μm狭缝，并且收集波数在500-3500cm-1之间的光谱。在深耗尽电荷耦合装置(CCD)探测器上记录拉曼光谱。记录的拉曼光谱被数字化并使用OMNIC软件在个人计算机上示出。从跨表面的4个不同点收集了总共3-4个光谱。使用用于色散型拉曼的OMNIC软件进行拉曼光谱分析。使用OMNIC(赛默科技(Thermo Scientific))软件中提供的专有特征，以使用多项式基线拟合(6阶)从所有光谱中去除背景荧光，并对光谱进行归一化。从特定样本上的不同位置收集的光谱被平均，以代表单个样本。使用信噪比为300的2s曝光来收集光谱数据，以确保样本均匀并且所收集的光谱代表整批材料。本文公开的用于不同组合物的代表性拉曼位移光谱数据可以在下文中找到。
实例5：由软骨衍生材料制备的组合物的表征
如本文公开的由软骨衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图2示出了溶液组合物的平均拉曼光谱和冷冻干燥组合物的平均拉曼光谱。
实例6：由骨衍生材料制备的组合物的表征
如本文公开的由骨衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图3示出了以下组合物的平均拉曼光谱：溶液材料的平均拉曼光谱(上)、冷冻干燥材料的平均拉曼光谱(中)和凝胶材料的平均拉曼光谱(下)。
实例7：由肌肉骨骼衍生材料制备的组合物的表征
如本文公开的由肌肉骨骼衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图4示出了以下组合物的平均拉曼光谱：溶液组合物(下)、冷冻干燥组合物(中)和凝胶组合物(下)。
实例8：由松质骨衍生材料制备的组合物的表征
如本文公开的由松质骨衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图5示出了凝胶组合物的平均拉曼光谱。
实例9：由肌衍生材料制备的组合物的表征
如本文公开的由肌衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图6示出了以下各项的平均拉曼光谱：溶液组合物(下)、冷冻干燥组合物(中)和凝胶组合物(下)。
实例10：由腱制备的组合物的表征
如本文公开的由腱衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图7示出了凝胶组合物的平均拉曼光谱。
实例11：由骨小梁衍生材料制备的组合物的表征
如本文公开的由骨小梁衍生材料制备的组合物通过拉曼光谱进行表征。图8示出了以下各项的平均拉曼光谱：凝胶组合物(上)、冷冻干燥组合物(中)和溶液组合物(下)。
实例12：流变实验条件
在图9中，使用配备有35mm直径板几何结构的HAAKE模块化高级流变系统和赛默科技的珀尔帖(Peltier)板温度控制系统来确定凝胶的流变特征。粘度测试包括1-10001/s的剪切速率阶梯测试，其中16个阶梯以对数形式分布。在图9中，将凝胶从4℃取出，并放置在室温(20℃)和水浴(37℃)中。四天后，执行流变测试。从4℃的冰箱中取出后，立即测试4℃样品。
在图10中，将凝胶从4℃取出，并放置在室温(20℃)和水浴(37℃)中。四天后，执行流变测试。从4℃的冰箱中取出后，立即测试4℃样品。
在图11中，将凝胶从4℃取出，并在室温(20℃)下放置一小时。在室温下加热后，在流变仪上测试两个样品。第一个样品的初始pH为6.5。使用1M NaOH将第二个样品调整到pH7.5。流变测试包括1-1000 1/s的剪切速率阶梯，其中16个阶梯以对数形式分布。
实例13：使用SEM(扫描电子显微镜)和英斯特朗(Instron)万能试验机(UTM)对组合物进行表征
通过扫描电子显微镜(SEM)检查支架的内部结构和微观结构，使用配备有电子背散射探测器的EVO 10LS环境扫描电子显微镜(纽约卡尔蔡司显微镜有限公司(Carl ZeissMicroscopy LLC))。使用负载能力为1kN的电子UTM(美国马萨诸塞州英斯特朗)以0.5mm/分钟的恒定十字头速度(crosshead velocity)对支架进行压缩测试，直到出现挤压破坏。在测试过程中，每隔0.1秒记录一次压缩载荷和位移。针对每种类型的支架测试了五个样品，以确定平均弹性模量。
实例14：冻干组合物、凝胶组合物和溶液组合物的制备
针对长骨(兔)、具有周围肌肉的长骨(兔和小鼠)以及肌肉(兔和小鼠)中的每一个制备冻干组合物、凝胶组合物和溶液组合物。每种制剂的材料和方法如下所述。
方法：
按照以下顺序清理组织：第1次洗涤、第1次冲洗、第2次洗涤、第2次冲洗。洗涤包括在含0.01％(w/v)庆大霉素的盐水中搅拌5分钟。冲洗包括在盐水中搅拌5分钟。清理后，通过破坏组织界面来处理组织，以产生包括活核心有效细胞实体和支持实体的聚集物的受刺激组合物，其中活核心有效细胞实体表达LGR4、LGR5和/或LGR6的序列。将处理过的组织放置在50mL的锥形管中，其中10x HBSS与组织的体积比为1:1。将组织和HBSS在4℃下摇晃36-48小时，然后以5000rpm离心15分钟。去除上清液，通过40μm网进行过滤，并放置在模具中冷冻干燥。模具在使用前用硅酮脱模剂喷涂。冷干机的设置包含：真空为500-600mTorr之间，升温速率为1.7℃/分钟，在-29℃下冷冻2小时，在-18℃下初步干燥40小时，在29℃下二次干燥1小时。
透析：
1.通过#40大小的网过滤组合物。
2.将组合物装入透析管(光谱/Por透析膜MWCO：100-500D，光谱实验室131057)
3.在振荡器上的冰箱中使用1:100的样品-缓冲液体积，将装满的透析管放置在具有期望渗透压的适当缓冲液中。例如：
a.5X HBSS放置2-3小时，随后1X HBSS放置4-5小时，然后1X HBSS放置一夜
4.从透析管中取出样品，并收集在锥形管中，并且在1200g和4℃下离心20分钟
6.将上清液从溶液中去除，得到与步骤2.b中相同的体积
冲洗：
根据以下方案执行冲洗：
1.通过#40大小的网(细胞分离筛，西格玛(Sigma)CD1-1KT)过滤组合物
2.将组合物装入期望的模具中
3.冷干样品(24小时曲线，Labconco冷干机)
4.从模具中取出样品
5.使用以下细节在盐水中冲洗样品：
a.每次冲洗包括每5mg样品1mL盐水
b.总共5次冲洗(每次冲洗用新的盐水代替)，每次冲洗10分钟
实例15：压缩模量
使用负载能力为1kN的电子UTM(万能试验机)(美国马萨诸塞州英斯特朗)以1mm/分钟的恒定十字头速度测试实例14中制备的冻干组合物的压缩(模量)强度，直到达到断裂点。每种类型测试N＝2个样品。在测试过程中，每隔0.1秒记录一次载荷和位移值。图20示出了兔肌肉和骨冻干组合物的压缩模量。
实例16：蛋白质分析
Figure BDA0002585266590000281
MAP小鼠血管生成/生长因子磁珠板用于测定实例14中制备的肌肉和骨组合物的蛋白质。具体地说，24-plex(用于血清/血浆的)试剂盒MAGPMAG-24K用于同时定量以下分析物：血管生成素-2、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、sFasL、sAlk-1、双调蛋白、瘦素、IL-1b、β细胞素、EGF、IL-6、内皮糖蛋白、内皮素-1、FGF-2、卵泡抑制素、HGF、PECAM-1、IL-17a、PLGF-2、KC、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、催乳素、MIP-1a、基质细胞衍生因子(SDF-1)、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-A和肿瘤坏死因子(TNF)。图21-25示出了蛋白质测定的结果。
实例17：生物标记物分析
Figure BDA0002585266590000282
MAP小鼠骨磁珠板-骨代谢多重测定用于表征实例14中制备的肌肉和骨组合物。
Figure BDA0002585266590000283
MAP小鼠骨磁珠板包含以任何组合方式测量以下各项的所有必要的组件：ACTH(促肾上腺皮质激素)、DKK-1(Dickkopf WNT信号通路抑制剂1)、IL-6、胰岛素、瘦素、TNFα、OPG(骨保护素)、SOST和FGF-23。图26-28示出了此测定的结果。图35和36还分别示出了肝衍生组合物和软骨衍生组合物的此测定的结果。
实例18：对比拉曼光谱分析
方法：
按照以下顺序清理组织：第1次洗涤、第1次冲洗、第2次洗涤、第2次冲洗。洗涤包括在含0.01％(w/v)庆大霉素的盐水中搅拌5分钟。冲洗包括在盐水中搅拌5分钟。清理后，通过破坏组织界面来处理组织，以产生包括活核心有效细胞实体和支持实体的聚集物的受刺激组合物，其中活核心有效细胞实体表达LGR4、LGR5和/或LGR6的序列。将处理过的组织放置在50mL的锥形管中，其中盐水与组织的体积比为1:1。将组织和盐水在4℃下摇晃36-48小时，然后以5000rpm离心15分钟。去除上清液，通过100μm网进行过滤，并储存在-20℃下用于分析。根据实例4执行拉曼光谱分析，从而将组合物与天然组织样品进行对比。
结果：
图29-33示出了对比拉曼光谱分析的结果，以及组合物的分子指纹与衍生所述组合物的相应天然组织样本之间的对应差异。图29示出了与天然兔肌肉(上)相比提供了改变的分子指纹的兔肌肉衍生组合物(下)的拉曼光谱。图30示出了与天然兔脂肪(上)相比提供了改变的分子指纹的兔脂肪衍生组合物(下)的拉曼光谱。图31示出了与天然兔软骨(上)相比提供了改变的分子指纹的兔软骨衍生组合物(下)的拉曼光谱。图32示出了与天然兔骨(上)相比提供了改变的分子指纹的兔骨衍生组合物(下)的拉曼光谱。图33示出了与天然人类皮肤(上)相比提供了改变的分子指纹的人类皮肤衍生组合物(下)的拉曼光谱。
实例19：肌肉衍生组合物的制备
使用锐器解剖法采集兔大腿肌肉。在去离子水中将组织冲洗3个循环，随后用等渗溶液(例如0.9％NaCl)冲洗。通过将10克组织放置在50cc锥形管(锥形A)中并与40mL胶原酶/胰蛋白酶溶液(0.2％胰蛋白酶，0.2％IV型胶原酶，50ml DMEM/F12中50μg/ml庆大霉素)结合，分接组织并破坏细胞和非细胞界面。在37℃下将混合物轻轻搅拌30分钟。与体积相等的终止剂结合。将溶液以1000RPM离心10分钟，并将上清液转移到50cc锥形管(锥形B)中。用40μL DNase(2U/μL)将锥形管中的内容物重新悬浮在10mL DMEM/F12中，并在室温下偶尔搅拌培育5分钟。以1000RPM离心5分钟，并将上清液转移到锥形管B。用10mL DMEM/F12冲洗锥形管A的内容物，并在室温下搅拌120分钟。以100RPM离心2分钟。将复合外皮组织和上清液转移到锥形管B。向锥形管A添加20mL 0.9％NaCl，并在4℃下培育，用于细胞间区室的进一步组合和/或进一步分解。在4℃下培育锥形管B，直到添加锥形管A的内容物。此后，在室温下将锥形管B培育120分钟，随后在振荡器上在4℃下培育一夜。所得组合物的pH应在4.8至8.5之间的范围内，并且渗透压为199和800mOsm/Kg。将半固体和上清液转移到涂有硅酮脱模剂的具有期望表面积和高度的敞口容器中，并填充到期望厚度。可以使用冷冻干燥保存或固化产物，所述冷冻干燥使用冷干机设置，包含500-600mTorr之间的真空，1.0℃/分钟的升温速率，在-35℃下冷冻3小时，以及在-20℃下初步干燥45小时。可以储存所得组合物，或根据需要与如0.9％NaCl、HBSS、DMEM/F12或RPMI的生物相容性化合物结合，以产生应用所需的物理特性和粘度。
实例20：肌肉/骨衍生组合物的制备
使用锐器解剖法收集具有相关骨组织片段的整块兔大腿肌肉，并转移到适当大小的容器中。将组织在去离子水中浸没5分钟。倾析溶液，并将这一过程重复总共3个循环。将组织在含0.01％(w/v)庆大霉素的等渗溶液中浸没5分钟。然后，将组织与浓度范围为1x到10x(即1x到10x NaCl)的生物相容性溶液以0.5:1到1:10(v/v)的比例结合，并机械分解，从而得到5mm3到1cm3的颗粒大小。添加浓度为10mM到0.5M的EDTA，并在振荡器上在4℃下培育一夜。将所得组合物以1000RPM离心15分钟，并将剩余组织从溶液中取出。剩余的被破坏的细胞界面以1:1的体积与10x HBSS结合，并在室温下在振荡器上培育2小时，然后在4℃下储存一夜。将溶液以100RPM离心5分钟。将复合外皮组织和上清液转移到具有期望大小和表面积的涂有硅酮脱模剂的敞口容器。将组合物在37℃下加热干燥48小时。干燥后，可以将样品在-20℃下冷冻储存，或与0.9％NaCl缓慢结合，并在4℃下培育2小时，然后以100RPM离心5分钟，最后丢弃上清液。
实例21：脂肪衍生组合物的制备
收集皮下组织、内脏组织和/或棕兔脂肪组织，并放置在50cc锥形管中，并在4℃下在含0.01％(w/v)庆大霉素的等渗溶液中浸没10分钟。然后，将组织转移到50cc的锥形管中，并与等渗溶液(例如1x HBSS、0.9％NaCl或1x DMEM)结合，并在4℃下有力摇动5分钟。将组合物以500RPM离心2分钟，丢弃上清液，并重复另外2次循环。将组合物以1:1(v/v)的比例与10x DMEM结合，并在室温下在振荡器上培育2小时。将组合物转移到50cc锥形管中，并通过100μM的过滤器三次，并且在900g下离心15分钟。去除油分离物，并将剩余分解界面和上清液转移到50cc的锥形管，并在4℃下培育一夜。去除另外的钝态油分离物。通过与包含氯化钙或戊二醛的另外的处理方法交联，可以进一步增强组合物的一致性。
实例22：脂肪衍生组合物的制备
收集皮下组织、内脏组织和/或棕兔脂肪组织，并放置在50cc锥形管中，并在4℃下在含0.01％(w/v)庆大霉素的等渗溶液中浸没10分钟。然后，将组织转移到50cc的锥形管中，并与等渗溶液(例如1x HBSS、0.9％NaCl或1x DMEM)结合，并在4℃下有力摇动5分钟。将组合物以500RPM离心2分钟，丢弃上清液，并重复另外2次循环。将组合物与DMEM和0.1％胶原酶在37℃下结合1小时，随后在37℃下分散5U/μL的酶两小时。将组合物与体积相等的终止剂结合。将组织以2000RPM离心10分钟。去除油/脂肪层，并将剩余细胞界面和分解的材料与0.5:1(v/v)10x HBSS在室温下在振荡器上结合2小时。将组织以600VPM涡旋，并与1:1(v/v)5x HBSS结合，并在4℃下摇晃2小时。将组织以600VPM涡旋，并与1:1(v/v)1x HBSS结合，并在4℃下摇晃一夜。将复合外皮组织和上清液转移到具有期望大小和表面积的涂有硅酮脱模剂的敞口容器。将组合物在25℃下加热干燥4小时，随后在37℃下固化40小时。干燥后，可以将样品在-20℃下冷冻储存，或与0.9％NaCl缓慢结合，并在4℃下培育2小时，然后以100RPM离心5分钟，最后丢弃上清液。
实例23：细胞活力实验
使用阿尔玛蓝测定(Alamar blue assay)评估单独的人骨肉瘤细胞(MG-63)(对照)或与各种骨组织衍生组合物或商购可得的人衍生脱钙骨基质(DBM)共培养的人骨肉瘤细胞的活力/增殖。与对照细胞相比，与组织衍生组合物共培养的细胞展示出增加的活力，这表明本文公开的组合物的细胞增殖和活力增加，如图34所示。因此，图34展示了本文公开的组合物包括受刺激生物材料并增加天然组织的产生或愈合。
方法：
细胞制备：
1.将MG-63细胞(传代P+5)在完整的DMEM(10％FBS，50μg/ml庆大霉素)培养基中解冻，并在75cm2烧瓶中平铺，直至融合(约1周)。使细胞胰蛋白酶消化并移到4个新的75cm2烧瓶中，并生长至融合，然后再次进行胰蛋白酶消化并移到20新个烧瓶中。将融合的烧瓶进行胰蛋白酶消化，重新悬浮在18ml的冷冻培养基(90％胎牛血清，10％DMSO)中，并在-80℃下冷冻在Nalgene Cryo1 C释放容器中(目录#5100-001)。细胞瓶标签上写着：
MG-63细胞系(人骨肉瘤)
西格玛，目录#86051601；批次#14K002
传代8
2.将残余细胞放置在3个烧瓶中，并生长到～90％融合，用于活力实验。
3.将支架堵头放置在48孔板中，并在500μl完整的DMEM中再水化1小时(注意：第6列仅填充500μl培养基，并用作无支架对照)。
4.使MG-63细胞胰蛋白酶消化并重新悬浮在培养基中。将每孔总共0.5x 105个细胞(125μl体积)添加到D-F排的每个孔。将另外125μl的完整的DMEM添加到C排中的孔，作为无细胞对照。将细胞在37℃、5％CO2下培育一夜。
通过分光光度法使用阿尔玛蓝测量细胞毒性或增殖：
1.采集处于生长对数期的细胞，并确定细胞计数。将细胞计数调整到1x 104个细胞/ml。
2.将细胞平铺并与待测试剂结合。
3.随后通过摇动进行混合，并且然后在无菌条件下以等于孔中体积的10％的量添加阿尔玛蓝。
4.用阿尔玛蓝将培养物培育4-8小时。注意
5.使用荧光分光光度法测量细胞毒性或增殖。
6.培育后，在570nm和600nm的波长下测量吸光度。仅使用了空白培养基。
7.在细胞毒性和增殖测定中，经处理的细胞与对照细胞之间的减少的差异百分比通过下式计算：
经处理的细胞与对照细胞之间的百分比差异＝[(O2 x A1)–(O1 x A2)/(O2 xP1)-(O1 x P2)]x 100
根据前述详细说明，将显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对本文公开的方法和组合物作出修改和变化。所述的实施例在所有方面被认为仅仅是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附技术方案而不是由前述说明来指示。技术方案的等效含义和范围内的所有变化都将涵盖在其范围内。

Claims (38)

1.一种组合物，其包括衍生自界面区室的受刺激生物材料，其中当将所述组合物施用于有需要的受试者时，所述组合物能够增加天然组织的产生或愈合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中衍生自所述界面区室的所述受刺激生物材料是非细胞的。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述受刺激生物材料包括衍生自哺乳动物组织界面细胞的异质群体的生物材料。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中衍生自所述界面区室的所述受刺激生物材料包括与所述哺乳动物组织界面细胞的所述异质群体相关的多个相互作用组。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述受刺激生物材料包括活核心有效细胞实体和支持实体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述活核心有效细胞实体表达选自由LGR4、LGR5、LGR6及其任何组合组成的群组的一或多种含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体的RNA转录物和/或多肽。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述活核心有效细胞实体表达Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、角蛋白15、角蛋白5、分化簇34(CD34)、Sox9、c-Kit+、Sca-1+或其任何组合中的一或多种的RNA转录物和/或多肽。
8.根据权利要求5到7中任一权利要求所述的组合物，其中所述支持实体包括间质衍生细胞群。
9.根据权利要求5到8中任一权利要求所述的组合物，其中所述支持实体包括细胞群、细胞外基质成分或其任何组合。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述细胞外基质成分包括透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、细胞外囊泡、酶和糖蛋白中的一或多种。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的组合物，其中所述受刺激生物材料衍生自骨组织界面、皮肤组织界面、肌肉骨骼组织界面、脂肪组织界面或软骨组织界面。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述骨组织界面是皮层周围组织界面、板层周围组织界面、小梁周围组织界面、皮质-松质骨组织界面或其任何组合。
13.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的组合物，其中所述受刺激生物材料衍生自三胚层组织界面。
14.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物进一步包括选自由药物、酶、分子及其任何组合组成的群组的试剂。
15.一种试剂盒，其包括根据权利要求1到14中任一权利要求所述的组合物和使用说明书。
16.一种用于增加有需要的受试者的组织再生的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求11到12或14中任一权利要求所述的组合物。
17.一种用于增加有需要的受试者的天然组织的愈合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到14中任一权利要求所述的组合物。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者患有退行性骨病。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述退行性骨病是骨关节炎或骨质疏松症。
20.根据权利要求16到19中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者患有骨折或骨裂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述骨折是稳定性骨折、开放性复合骨折、横向骨折、倾斜骨折或粉碎性骨折。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述天然组织是皮肤，并且施用所述组合物防止或减少受试者的疤痕。
23.一种用于制备根据权利要求1到13中任一权利要求所述的组合物的方法，所述方法包括：
刺激组织样本的哺乳动物界面区室的至少一部分以产生受刺激生物材料，其中所述哺乳动物界面区室包括哺乳动物组织界面细胞的异质群体；以及
分离所述受刺激生物材料的一部分。
24.根据权利要求23所述的方法，其中使用机械刺激、化学刺激、酶刺激、能量刺激、电刺激、生物刺激或其任何组合来刺激所述哺乳动物界面区室的所述部分。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述刺激在存在生物相容性材料的情况下发生。
26.根据权利要求23到25中任一权利要求所述的方法，其中所述生物相容性材料选自由药剂、酶、分子及其组合组成的群组。
27.根据权利要求23到26中任一权利要求所述的方法，其进一步包括向所述受刺激生物材料添加生物相容性转移剂。
28.根据权利要求23到27中任一权利要求所述的方法，其中所述受刺激生物材料的所述部分是非细胞部分。
29.根据权利要求23到28中任一权利要求所述的方法，其中从多个供体获得所述组织样本。
30.根据权利要求25到29中任一权利要求所述的方法，其中所述组织样本和所述生物相容性材料的体积比为约1:1到约3:1。
31.根据权利要求23到30中任一权利要求所述的方法，其进一步包括保存所述受刺激生物材料的所述分离部分。
32.根据权利要求31所述的方法，其中通过干燥或冷冻干燥保存所述受刺激生物材料的所述分离部分。
33.根据权利要求23到32中任一权利要求所述的方法，其进一步包括向所述受刺激生物材料的所述分离部分添加稳定剂。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物相容性转移剂选自由藻酸盐、明胶、石油、胶原蛋白、矿物油、透明质酸、类晶体、硫酸软骨素、弹性蛋白、藻酸钠、硅酮、PCL/乙醇、卵磷脂、泊洛沙姆及其任何组合组成的群组。
35.根据权利要求23到34中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在分离所述受刺激生物材料之前，将所述哺乳动物界面区室的所述受刺激部分培育约12到72小时。
36.根据权利要求23到35中任一权利要求所述的方法，其中通过离心、过滤或其组合来分离所述受刺激生物材料的所述部分。
37.根据权利要求23到36中任一权利要求所述的方法，其中刺激导致哺乳动物组织界面细胞的所述异质群体的相互作用组发生一或多种改变。
38.根据权利要求23到37中任一权利要求所述的方法，其中所述受刺激生物材料的所述分离部分包括选自细胞内相互作用组、细胞间相互作用组、细胞外相互作用组、跨细胞相互作用组、细胞周围相互作用组及其组合的多个相互作用组。
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