CN1816347A

CN1816347A - 不含人血清白蛋白的稳定化干扰素液体制剂

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Publication number: CN1816347A
Application number: CNA2004800188759A
Authority: CN
Inventors: F·萨马利塔尼; A·德尔里奥
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2006-08-09
Anticipated expiration: 2024-04-29
Also published as: IL171709A; CN1816347B; EP1617861B1; RS52869B; UA80331C2; MEP60408A; EA200501699A1; US8309069B2; PL1617861T3; NZ542912A; US20070059285A1; MY151121A; SI1617861T1; AU2004233603A1; RS20050821A; EA009995B1; TWI272948B; KR101116058B1; NO335674B1; MXPA05011718A

Abstract

本发明揭示了一种稳定的不含人血清白蛋白的液体药物组合物，其包括一干扰素，其中所述制剂是一种溶液，它含有缓冲剂、表面活性剂、等渗剂和抗氧化剂。干扰素最好是人重组体干扰素－β。

Description

不含人血清白蛋白的稳定化干扰素液体制剂

技术领域

本发明一般涉及含有一种干扰素的药物组合物，更具体地说，涉及稳定的干扰素-β的制剂，其中不含作为药物赋形剂而加入的人血清白蛋白。

背景技术

干扰素是细胞因子，即在细胞间传递信号的可溶性蛋白质，在免疫系统中起重要作用，帮助破坏引起感染的微生物，同时修复损伤。干扰素为受感染的细胞自然分泌，于1957年首次被鉴别出来。它们的名字取自它们干扰病毒的复制和大量生产。

干扰素既表现了抗病毒活性，又表现了抗增殖活性。根据其生物化学和免疫学特性，天然形成的人干扰素分成3大类：干扰素-α(白细胞型)、干扰素-β(成纤维细胞型)和干扰素-γ(免疫型)。α-干扰素已经被美国以及其他国家承认并用于治疗多毛细胞白血病、性病湿疣、卡普氏肉瘤(一种恶性肿瘤，常见于获得性免疫缺陷综合症(AIDS)病人)和慢性非甲非乙型肝炎。

另外，干扰素是人体应对病毒感染反应所产生的糖蛋白。它们抑制保护细胞中病毒的增殖。由于由一种低分子量的蛋白质组成，故而干扰素在反应中表现出明显的非特异性，也就是说，由一种病毒诱导所产生的干扰素可以有效对抗大范围内的其他病毒的感染。然而，它们有种特异性，也就是说，由一种病毒产生的干扰素将只刺激同种或相似种的细胞产生抗病毒活性。干扰素是第一组被发现有潜在抗肿瘤和抗病毒活性的细胞因子。

三种主要干扰素指的是干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ。这些主要的干扰素最初根据它们的细胞来源分类(白细胞，成纤维细胞或T细胞)。然而，越来越清楚的是，几种干扰素可以由一种细胞产生。因此白细胞干扰素称为干扰素-α，成纤维细胞干扰素称为干扰素-β，T细胞干扰素称为干扰素-γ。也有第四种类型的干扰素即类淋巴母细胞型干扰素，产生于“纳马瓦”细胞系(来源于Burkitt氏淋巴瘤)，该细胞系似乎会产生白细胞干扰素和成纤维细胞干扰素的混合物。

据报道，作为测量干扰素的活性的单位或者是国际单位(U或IU，国际单位)定义为保护50％的细胞抗病毒所需要的数量。这种用来测量生物活性的测定方法是如前所述的测定抑制细胞病理(Rubinstein，等人.1981；Familletti，P.C.，等人，1981)。在这种干扰素抗病毒测定中，1单位/毫升干扰素是产生50％的细胞病理效应所需要的数量。此单位由国家卫生研究所(Pestka，S.1986)提供的人干扰素-β的国际参考标准来确定。

每种干扰素含有好几个截然不同的亚类。干扰素-β和干扰素-γ分别是单个基因的产物。

干扰素-α的蛋白质最为多样化，有15种亚类。在第九条染色体上有一簇干扰素-α的基因含有至少23个成员，其中15个是有活性的，并且进行转录。成熟的干扰素-α没有糖基化。

干扰素-α和干扰素-β具有相同的长度(165或166个氨基酸)以及相同的生物学活性。干扰素-γ有145个氨基酸，与α及β相似程度较低。只有干扰素-γ能够活化巨噬细胞，或诱导杀伤性T细胞的成熟。这些新型的治疗试剂有时被称为生物学反应调节剂(BRMs)，因为它们在生物对肿瘤的应答中发挥效应，通过免疫调节影响机体对肿瘤的识别。

人成纤维细胞型干扰素(干扰素-β)具有抗病毒活性，也可以刺激自然杀伤细胞对抗肿瘤细胞。它是一种分子量约20,000道尔顿的多肽，由病毒和双链RNA诱导产生。从成纤维细胞型干扰素基因的核苷酸系列，通过重组DNA技术克隆，(Derynk等人.1980)推算出该蛋白质的完整氨基酸系列。它是166个氨基酸长度的蛋白质。

Shepard等人(1981)描述了一个在第842个碱基(在141位点上半胱氨酸→酪氨酸)突变的突变体，该突变体的抗病毒活性被灭活，还描述了由核苷酸1119到1121的缺失所形成的不同的克隆。

Mark等人(1984)插入了一个人工的突变，在469位点上用碱基A来代替碱基T，使氨基酸在位点17上从半胱氨酸变成丝氨酸。这种干扰素-β和天然干扰素-β一样有活性，在-70℃的条件下可以长期稳定贮藏。

Rebif^(Serono-重组体人干扰素-β)是一种最新开发出的治疗多发性硬化的干扰素-β-1a，它从哺乳动物细胞系中制备。它的国际非专有名称(INN)是“干扰素-β-1a”。

和所有以蛋白质为基础的药物一样，在应用干扰素-β时有一个主要的障碍需要克服。作为一种治疗剂，药物制剂不稳定可以导致药物的效用丧失。

在药物制剂中，导致多肽失活和功效降低的物理性质不稳定性包括变性及可溶性和不可溶性物质聚合形成，而化学性质不稳定性则包括水解，酰亚胺形成，氧化，外消旋作用和脱酰胺基作用。这些变化中已知有一些会导致重要蛋白质药效的丧失或降低。另外，这些变化的准确的影响还不知道，但是由于有潜在的副作用，制药上不接受导致降解的产物。

药物组合物中多肽的稳定要在试配法起主要作用的区域内(Wang评论(1999)Int.J.Pharm.185：129-188；Wang and Hanson(1988)J.Parenteral Sci.Tech.42：S3-S26)。加入到多肽药物制剂以增强稳定性的赋形剂包括缓冲液、糖、表面活性剂、氨基酸、聚乙二醇和聚合体，但是这些化学添加剂的稳定效果与蛋白质极其相关。

现有的干扰素-β制剂使用人血清白蛋白作为干扰素-β的可溶性增强剂。然而，用人血清白蛋白有一些不足之处。人血清白蛋白是一种从人血中得到的产物，因此必须从人体收集。为了降低风险而必须采取措施，因为用人血液产品如人血清白蛋白有潜在感染HIV和HCV病毒的危险。

因此，需要找另外的干扰素-β药物组合物，其含有物理上兼容的稳定剂来提高这种蛋白质的可溶性以及稳定，蛋白质免于聚合形成，籍以增强药物功效。

发明详述

本发明的目的在于提供了一种含有干扰素(IFN)的稳定化的药物组合物及其制备方法。所制备的组合物不含人血清白蛋白(HSA)，因此不需要这种药物赋形剂。本文把这样一些组合物称之为不含人血清白蛋白的干扰素的药物组合物，组合物包括一种干扰素或其异构体、突变蛋白质、融合蛋白质、功能性衍化物、有活性的片段及其盐，其中，所述组合物是一种溶液，含有缓冲液、表面活性剂、等渗剂和抗氧化剂。

根据本发明的一实施例，该组合物还含有抑菌剂。

本文使用的干扰素或者“IFN”包括在文献中所定义为干扰素的任何一种分子，即包括诸如上述“发明背景”部分所述的每一种类型的干扰素。具体地说，在上述定义中所包括的是干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ。根据本发明，干扰素-β是优先选择的干扰素。根据本发明，适合的干扰素-β在市场上有供应，如Rebif^(Serono)，Avonex^(Biogen)或者Betaferon^(Schering)。根据本发明，优先选择使用来源于人体的干扰素。本发明所指的术语干扰素还包括其异构体、突变蛋白质、融合蛋白质、功能性衍化物、有活性的片段及其盐。

本发明所指的术语干扰素-β(IFN-beta或IFN-β)包括成纤维细胞型干扰素，尤其是指来源于人体，从生物液中分离得到或者从原合宿主细胞或真核宿主细胞中经DNA重组技术中得到的干扰素及其盐、功能性衍化物、变种、类似物和有活性的片段。干扰素-β最好是干扰素-β-1a。

本文所使用的术语“突变蛋白质”是指干扰素的类似物，其中天然干扰素的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸取代，或缺失，或干扰素天然序列中加入一个或多个氨基酸残基，与野生型IFN相比其所得产物活性改变不大。这些突变蛋白质可由众所周知的合成和/或基因突变技术，或者其他已知的合适的技术制备。首选的突变蛋白质包括由Shepard等人(1981)或Mark等人(1984)所描述的那些。

这种突变蛋白质的任何一种最好充分复制了干扰素的氨基酸序列，以便具有与一IFN大体上相似甚至更好的活性。干扰素的生物学特性为所属技术领域的技术人员所熟知。生物学标准也已经建立起来并且可以得到，如在国家生物学标准和控制研究所(http：//immunology.org/links/NIBSC)中得到。

测定IFN活性的生物检定已经有所描述。如Rubinstein等人.，1981所述，可作一种IFN测定。因此，可以通过常规实验确定任何一种给出的突变蛋白质是否有和干扰素大体上相似的或者更好的活性。

根据本发明，可以采用的干扰素的突变蛋白质及其编码的核酸包括一组有限的基本上对应的序列。按照本文所提供的教导及指引，本领域的一个普通的技术人员在实验法没有不适当的情况下，可经常规实验得到此序列的置换肽或多核苷酸。

根据本发明，突变蛋白质的较佳变化是“保守性”置换。本发明中的多肽或蛋白质的氨基酸保守性置换可包括在同一组的同义氨基酸，它们有充分相似的物理化学特性，同组成员之间的置换会保护分子的生物功能。很明显，在不改变其功能的情况下，氨基酸的插入和缺失也可以在上述定义的序列中发生，特别是如果插入或缺失仅仅涉及少数的氨基酸，如少于30个氨基酸，更适宜的是少于10个氨基酸，并且不要移动或置换对功能构造很重要的氨基酸，如半胱氨酸残基。由这种缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白质也包括在本发明的范围内。

表I所限定的是较佳的同义氨基酸组，表II所限定的是更佳的同义氨基酸组，表III所限定的是最佳的同义氨基酸组。

表I

较佳的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser，Thr，Gly，Asn

Arg Arg，Gln，Lys，Glu，His

Leu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu

Pro Gly，Ala，Thr，Pro

Thr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr

Ala Gly，Thr，Pro，Ala

Val Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val

Gly Ala，Thr，Pro，Ser，Gly

Ile Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile

Phe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe

Tyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr

Cys Ser，Thr，Cys

His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His

Gln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln

Asn Gln，Asp，Ser，Asn

Lys Glu，Gln，His，Arg，Lys

Asp Glu，Asn，Asp

Glu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu

Met Phe，Ile，Val，Leu，Met

Trp Trp

表II

更佳的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg His，Lys，Arg

Leu Leu，Ile，Phe，Met

Pro Ala，Pro

Thr Thr

Ala Pro，Ala

Val Val，Met，Ile

Gly Gly

Ile Ile，Met，Phe，Val，Leu

Phe Met，Tyr，Ile，Leu，Phe

Tyr Phe，Tyr

Cys Cys，Ser

His His，Gln，Arg

Gln Glu，Gln，His

Asn Asp，Asn

Lys Lys，Arg

Asp Asp，Asn

Glu Glu，Gln

Met Met，Phe，Ile，Val，Leu

Trp Trp

表III

最佳的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu，Ile，Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile，Met，Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys，Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met，Ile，Leu

Trp Met

在本发明中所用到的，氨基酸在蛋白质中置换用作产生干扰素的突变蛋白质的生产实施例包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943，Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111；以及Lee等人的5,017,691；以及US 4,904,584(Shaw等人)中指出的赖氨酸置换蛋白。

术语“融合蛋白质”是指一多肽，其包括一干扰素或其突变蛋白质，和另一个蛋白质融合，这种融合蛋白在体液中停留的时间延长。干扰素因此可以融合到另一蛋白质、多肽及其类似物，如免疫球蛋白或其片段。

本文用到的“功能性衍生物”涵盖了干扰素的衍生物及其突变蛋白质和融合蛋白质的衍生物。借助于本领域的现有技术，它们可以由产生于残基的侧链上的功能基团或氨基末端及羧基末端基团来制备。只要它们在药学上可接受，即这些衍生物不破坏与干扰素活性基本相似的蛋白质的活性，也不导致含有该衍生物的组合物出现毒性，就包括在本发明中。这些衍生物可以包括诸如聚乙二醇侧链，可以掩盖抗原位点，在体液中延长干扰素的停留时间。其他衍生物还有羧基基团的脂族卤化物，羧基基团与氨或与一级或二级胺反应而产生的氨基化合物，氨基酸残基的自由氨基基团和酰基(如烷酰基或碳环化合物的芳基基团)的一部分形成的N-酰基衍生物，或自由羟基基团(如丝氨酰或苏氨酰残基的)和酰基的一部分形成的O-酰基衍生物。

作为干扰素或其突变蛋白质及融合蛋白质的“活性片段”，本发明涵盖了蛋白质分子多肽链的任何片段或前体，以及蛋白质结合其他分子及其相连的残基如糖，磷酸盐残基的多肽链的片段或前体，或蛋白质分子或糖残基自身聚合的聚合物，如果和相应的干扰素相比，所述片段没有大大降低其活性。

本文的术语“盐”指的是上述蛋白质及其类似物的羧基基团盐和氨基基团的酸加成的盐。羧基基团的盐可以根据已知技术形成，包括无机盐，如钠、钙、铵、铁或锌盐，和类似的盐，以及以有机碱盐，如与胺等形成的盐类，例如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、啶、普魯卡因和类似物。酸加成的盐包括，和矿物酸例如盐酸、硫酸结合的盐，以及和有机酸如醋酸、草酸结合的盐。当然，其中任何一种盐必须保持与本发明有关的蛋白质(干扰素)的生物学活性，也就是说，它们可以与相应的受体结合，启动受体信号。

根据本发明，特别适宜用重组体人干扰素-β及本发明中包括的化合物。

最近报道了一种特殊的干扰素变异体，这种称为“同感干扰素”是一种非天然形成的干扰素变异体(US 6,013,253)。根据本发明的一较佳实施例，本发明的化合物可以与一种同感干扰素组合使用。

所提到的人同感干扰素(IFN-con)是指一非天然形成的多肽，其主要包括那些与干扰素-α的一子集所共有的氨基酸残基，这个子集代表绝大部分天然形成的人白细胞型干扰素亚型的系列，并且，在一个或多个没有所有的亚型共有的氨基酸位点上，包括一氨基酸，其主要在某位点上形成，在任何情况下都不包括在至少已天然形成的亚型中的在此位点上不存在的任何氨基酸残基。同感干扰素包括但并不限于在美国专利4,695,623，4,897,471和5,541,293中揭示的IFN-con1，IFN-con2和IFN-con3的氨基酸系列。编码同感干扰素的DNA序列可以根据以上提到的专利中的叙述而生产，或者根据其他标准方法生成。

在一进一步的较佳实施例中，融合蛋白质含有一个免疫球蛋白融合物。此融合物可以直接或通过短肽连接，短肽的长度可以是1到3个氨基酸残基，也可以稍长，如13个氨基酸残基。所说的连接体可以是一个系列为E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，也可以是一个由Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met组成的十三个氨基酸的连接体。它们在干扰素和免疫球蛋白的系列之间传导。所得的融合蛋白质在特性上有所改良，如在体液中延长了停留时间(半衰期)，增强了特异性活性，增加了表达水平，或者使融合蛋白质的纯化变得更容易。

在一另外较佳实施例中，干扰素与免疫球蛋白分子的恒定区融合。最好它融合在重链区，如人IgG1的CH2和CH3的片段。其它免疫球蛋白分子的异构体也适用于产生本发明融合蛋白质，如异构体IgG2，IgG3或IgG4，或者其他免疫球蛋白的类型，如IgM或IgA。融合蛋白质可以是单体或多聚体，也可以是异种多聚体或同种多聚体。

在又一较佳实施例中，功能性的衍生物包括至少有一部分附在一个或多个功能基团上，这些功能基团以一个或多个侧链出现在氨基酸残基上。最好此部分是聚乙烯部分(PEG)。聚乙烯化可根据已知方法来合成，例如在WO99/55377中有描述。

个体的用药，无论是给予单剂量或多剂量，根据不同的因素而变化，这些因素包括药代动力学特性，给药途径，病人状况和特征(性别，年龄，体重，健康情况，高矮)，症状范围，当前进行的治疗，治疗的频率和所预期的效果。

人干扰素-β的标准剂量从每天80000单位/千克到200000单位/千克，或每人每天6MIU(百万国际单位)及12MIU(百万国际单位)，或每人每天22到44μg(微克)。根据本发明，干扰素的较佳剂量是每人每天大约1到50μg，更佳剂量则是每人每天大约10到30μg或者10到20μg。

根据本发明，活性成分的给药途径可以是静脉内，肌肉内，或皮下注射。干扰素首选的给药途径是皮下注射。

干扰素可以每日或隔日给药，甚至间隔更长时间，其较佳时间是每周用药1，2或3次。

首选的用药途径是皮下注射，每周三次。更首选的用药途径是可以每周一次的肌肉注射。

首选的用药是22到44μg或6MTU到12MIU的干扰素-β每周三次皮下注射。

干扰素-β可以以25到30μg或8到9.6MIU的剂量皮下注射，隔日一次。此外可以每周一次肌肉注射30μg或6MIU的干扰素-β。

本发明的术语“稳定”是指干扰素制成品的物理、化学和结构上的稳定(包括生物效能的维持)。一蛋白质制剂不稳定可能是因为化学降解或蛋白质分子聚合形成较高次序上的聚合体、去糖基化、糖基化修饰、氧化或其他结构上的修饰而引起。因此，降低了包含在本发明中的一种干扰素多肽的至少一种生物活性。

一种稳定的溶液或制剂，其中的蛋白质降解、修饰、聚合、生物学活性和类似性质的丧失程度必须在可控制的范围内，并且不随着时间而增加。在至少12到24个月里，制剂较佳保留了至少约60％，更佳保留了至少70％，最佳保留了至少80％的贴上标签的干扰素活性。本发明的稳定化的不含人血清白蛋白干扰素组合物在2到8℃的条件下，较佳的贮存期限至少约6个月，12个月，18个月，更佳的贮存期限是至少20个月或22个月，最佳的期限是至少24个月。

监控本发明中的不含人血清白蛋白干扰素的药物组合物稳定性的方法在本领域已经公开，其包括那些在本文的实施例中所述的方法。因此，在本发明的液体药物组合物贮存期间，可以根据测量在溶液中可溶的干扰素随着时间的变化来确定干扰素的聚合物形成。有很多适合探测干扰素的分析测定方法可以对在溶液中的可溶干扰素进行定量测定。这些测定方法包括如下面的实施例中所述的反相高效液相色谱法，紫外线吸收光谱法。

测定在液体制剂贮存中的可溶和不可溶的聚合物可以采用分析超离心方法，例如，如以下实施例中提到的，以鉴别以可溶性的聚合物出现的可溶性多肽的部分，和以非聚合物、生物学上活性的分子形式出现的部分。

“多剂量用法”表达是指包括干扰素制剂的单个小瓶、安瓿或药筒用于超过一次的注射，即2，3，4，5，6或更多次注射剂。注射剂最好持续一段时间，至少约12小时，24小时，48小时等等，直到约12天。注射剂最好按时间来存放，如，按6，12，24，48，72小时存放。

术语“缓冲液”或“生理学上可接受的缓冲液”指这些化合物溶剂在制剂中用于制药或兽医已知是安全的，而且具有制剂的pH值可维持或控制在所需范围的作用。PH可控制在适度酸性到适度碱性的可接受的缓冲液包括但并不限于这样一些化合物：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸。“TRIS”是指2-氨-2-羟甲基-1，3-丙二醇及其药理学上可接受的盐。首选缓冲液是加入生理盐水或一种认可的盐的醋酸缓冲液。

“等渗剂”是一种在生理学上能耐受的化合物，它给予制剂适合的渗透性来防止水分透过与制剂接触的细胞膜流出。一些化合物是常用的等渗剂，如已知浓度的甘油。其他适合的等渗剂包括但并不限于氨基酸或蛋白质(如甘氨酸或白蛋白)、盐(如氯化钠)以及糖(如葡萄糖、甘露醇、蔗糖和乳糖)。首选等渗剂是甘露醇。

术语“抗氧化剂”是指一种化合物，其可防止氧和氧的自由基与其他物质相互作用。抗氧化剂属于一些常用于制药系统以加强物理或化学稳定性的赋形剂。加入抗氧化剂可以减少或延迟氧化的过程，氧化过程经常发生在一些药物或赋形剂暴露在氧或氧自由基中。这些过程可被光、温度、一定浓度的氢、痕量金属或过氧化物所催化。亚硫酸盐、重亚硫酸盐、硫、蛋氨酸、乙二胺四乙酸盐(EDTA)、丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基羟基茴香醚(BHA)经常作为药物中的抗氧化剂。业已发现，EDTA钠可以鳌合催化氧化反应的金属离子，有增强抗氧化剂活性的作用。首选的抗氧化剂是蛋氨酸。

术语“抑菌剂”是指一种化合物或组合物，作为抗菌剂加入制剂中。本发明含有干扰素的防腐的制剂最好依照一种市售的多用途产品防腐效果法规指南。抑菌剂实例包括酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯化甲酚、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸酯(甲基、乙烷基、丙基、丁基等等)、氯下烷铵、氯化苄乙氧铵、保果鲜和硫柳汞。最适宜的抑菌剂是苯甲醇。

术语“表面活性剂”是指一种可溶的化合物，它可以降低液体表面张力，或降低在两种液体之间或一液体与一固体之间的界面的张力，表面张力是一种作用于液体表面的力，有减少表面面积的倾向。为了改良药物的吸收或传递到目的组织，表面活性剂有时用于药物制成品上，其包括低分子量药物和多肽的传送。公知的表面活性剂有聚山梨醇酯(聚氧乙烯衍生物，Tween)和聚醚。

根据本发明的一优选的实施例，已经发现，用选自Pluronic^F77，Pluronic F87，Pluronic F88和Pluronic^F68的表面活性剂，特别优选的是Pluronic^F68(BASF，也称为泊洛沙姆188)与干扰素配制成制剂，获得的稳定制剂使因吸附在小瓶和/或传送装置(注射器、泵、导尿管等)的表面而造成的活性丧失减至最少。还发现，用Pluronic^F68与干扰素配制成制剂，获得的稳定制剂更能抵抗氧化和蛋白质聚合形成。

聚醚表面活性剂是氧化乙烯(EO)和环氧丙烷(PO)的块状聚合体。环氧丙烷(PO)夹在两块氧化乙烯(EO)之间。

EO

PO

EO

聚醚表面活性剂由两步合成：

1，在可控的条件下将环氧丙烷加入丙二醇的两个羟基基团，即可形成所需分子量的疏水物；

2，加入氧化乙烯，将疏水物夹在亲水基团中。

在Pluronic^F77中，聚甲醛(亲水)占70％，疏水物的分子量(聚氧化丙烯)大约是2306道尔顿。

Pluronic F87，聚甲醛(亲水)占70％，疏水物的分子量(聚氧化丙烯)大约是2644道尔顿。

Pluronic F88，聚甲醛(亲水)占80％，疏水物的分子量(聚氧化丙烯)大约是2644道尔顿。

Pluronic^F68，聚甲醛(亲水)占80％，疏水物的分子量(聚氧化丙烯)大约是1967道尔顿。

Pluronic^F77的典型特征列如下：

平均分子量：6600；

熔点/流点：48℃；

在20℃下的物理形态：固体；

粘性(布氏粘度計)周/秒：480[液体，25℃；糊状，60℃；固体，77℃]；

表面张力，dynes/cm，在25℃；

0.1％浓度：47.0

0.01％浓度：49.3

0.001％浓度：52.8

界面张力，dynes/cm，25℃时与医药用润滑油对比；

0.1％浓度：17.7

0.01％浓度：20.8

0.01％浓度：25.5

Draves Wetting，秒，25℃

1.0％浓度：＞360

0.1％浓度：＞360

泡沫高度

Ross Miles，0.1％，mm@50℃：100

Ross Miles，0.1％，mm@26℃：47

动力学的，0.1％，mm@400ml/min：＞600

水溶液中的浊点，℃

1％浓度：＞100

10％浓度：＞100

HLB(亲水-亲脂平衡)：25

Pluronic F87的典型特征列如下：

平均分子量：7700；

熔点/流点：49℃；

20℃时的物理形态：固体；

粘性(布氏粘度計)周/秒：700[液体，25℃；糊状，60℃；固体，77℃]；

表面张力，dynes/cm，在25℃；

0.1％浓度：44.0

0.01％浓度：47.0

0.001％浓度：50.2

界面张力，dynes/cm，25℃时与医药用润滑油对比；

0.1％浓度：17.4

0.01％浓度：20.3

0.01％浓度：23.3

Draves Wetting，秒，25℃

1.0％浓度：＞360

0.1％浓度：＞360

泡沫高度

Ross Miles，0.1％，mm@50℃：80

Ross Miles，0.1％，mm@26℃：37

Dynamic，0.1％，mm@400ml/min：＞600

水溶液中的浊点，℃

1％浓度：＞100

10％浓度：＞100

HLB(亲水-亲脂平衡)：24

Pluronic F88的典型特征列如下：

平均分子量：11400；

熔点/流点：54℃；

20℃时的物理形态：固体；

粘性(布氏粘度計)周/秒：2300[液体，25℃；糊状，60℃；固体，77℃]；

表面张力，dynes/cm，在25℃；

0.1％浓度：48.5

0.01％浓度：52.6

0.001％浓度：55.7

界面张力，dynes/cm，25℃时与医药用润滑油对比；

0.1％浓度：20.5

0.01％浓度：23.3

0.01％浓度：27.0

Draves Wetting，秒，25℃

1.0％浓度：＞360

0.1％浓度：＞360

泡沫高度

Ross Miles，0.1％，mm@50℃：80

Ross Miles，0.1％，mm@26℃：37

Dynamic，0.1％，mm@400ml/min：＞600

水溶液中的浊点，℃

1％浓度：＞100

10％浓度：＞100

HLB(亲水-亲脂平衡)：28

Pluronic F68的典型特征列如下：

平均分子量：8400；

熔点/流点：52℃；

20℃时的物理形态：固体；

粘性(布氏粘度計)周/秒：1000[液体，25℃；糊状，60℃；固体，77℃]；

表面张力，dynes/cm，25℃；

0.1％浓度：50.3

0.01％浓度：51.2

0.001％浓度：53.6

界面张力，dynes/cm，25℃时与医药用润滑油对比；

0.1％浓度：19.8

0.01％浓度：24.0

0.01％浓度：26.0

Draves Wetting，秒，25℃

1.0％浓度：＞360

0.1％浓度：＞360

泡沫高度

Ross Miles，0.1％，mm@50℃：35

Ross Miles，0.1％，mm@26℃：40

Dynamic，0.1％，mm@400ml/min：＞600

水溶液中的浊点，℃

1％浓度：＞100

10％浓度：＞100

HLB(亲水-亲脂平衡)：29

其他与上述所列特性有相似的聚合物也适用于本发明的制剂。首选表面活性剂是Pluronic F68，以及与之有相似特性的表面活性剂。

聚醚，尤其是Pluronic F68，最好配成一种适宜浓度，此浓度可以在预期的贮存时间(如12到24个月)内有效维持干扰素的稳定，也有效防止蛋白质因吸附于小瓶、安瓿、药筒或注射器而损失。

聚醚，尤其是Pluronic F68在液体制剂中的较佳浓度，大约为0.01mg/ml到10mg/ml，更佳的浓度大约为0.05mg/ml到5mg/ml，特别佳的浓度大约为0.1mg/ml到2mg/ml，最佳的浓度大约为1mg/ml。

制剂中的干扰素-β的较佳浓度是大约10μg/ml到800μg/ml，更佳的浓度大约是20μg/ml到500μg/ml，特别佳的浓度大约是30μg/ml到300μg/ml，最佳的浓度大约是22、44、88μg/ml或264μg/ml。

本发明的制剂较佳的pH值在大约3.0到5.0之间，更佳的大约是3.7到4.7之间。首选缓冲剂是醋酸钠盐或醋酸钾盐。醋酸生理盐水缓冲液在所属技术领域广为人知。在总溶液中缓冲液浓度的范围变化于5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、200mM、250mM和500mM之间，较佳的浓度大约是10mM。特别佳的缓冲液是10mM的缓冲液中醋酸盐离子的pH值为3.5±0.2或4.5±0.2。

本发明的组合物的抗氧化剂，如蛋氨酸，其较佳浓度大约是0.01到5.0mg/ml，更佳的浓度大约是0.05到0.3mg/ml，最佳浓度大约是0.1mg/ml。

等渗剂(如甘露醇)在液体制剂中的较佳浓度大约是0.5mg/ml到500mg/ml，更佳的浓度大约是1mg/ml到250mg/ml，特别佳的浓度大约是10mg/ml到10000mg/ml，最佳浓度大约是55mg/ml。

本发明包括液体制剂，其首选溶剂是注射用水。

液体制剂可以是单剂量的，也可以是多剂量的。发明中的液体干扰素制剂是指多剂量用法，并含有抑菌剂如酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯化甲酚、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸酯(甲基、乙烷基、丙基、丁基及其类似物)、氯下烷铵、氯化苄乙氧铵、保果鲜和硫柳汞。特别适宜的抑菌剂是酚、苯甲醇和m-甲酚。更佳的是苯甲醇。抑菌剂的数量必须维持在其浓度足以维持制剂在多剂量注射期间基本无菌(适合注射)。此注射时间可以是大约12或24小时到大约12天，较佳的时间是大约6到12天，抑菌剂的较佳浓度是大约0.1％(抑菌剂质量/溶剂质量)到2％，更佳的浓度是0.2％到1％。苯甲醇的较佳浓度是0.2％或0.3％。然而，防腐剂如苯甲醇的用法并不受限于多剂量制剂，也可以用于单剂量制剂中。

本发明中干扰素在制剂中的范围包括从贮存中恢复后所产生的数量，其浓度为大约1.0μg/ml到50μg/ml，根据预期的传递媒介，如不同的溶液制剂，经皮斑片、肺部的、经粘膜的、渗透性的或微型泵方法，可以达到更低或更高的浓度。较佳的干扰素浓度大约是5.0μg/ml到2mg/ml，更佳的浓度大约是10μg/ml到1mg/ml，最佳的浓度是30μg/ml到100μg/ml。

本发明的优选制剂在包装的24个月内保留至少大约60％的干扰素活性，更优选的是保留至少大约70％的活性，最优选的是保留至少80％的活性。

在一较佳实施例中，本发明提供了一种制造如前所述的液体药物组合物的方法。

在另一个较佳实施例中，本发明也提供了一种生产包装的药物组合物的方法，此组合物包括含有如前所述的活性成分和赋形剂的溶液。

在又一个较佳实施例中，本发明也提供了一种用于人类药物生产的方法，包括包含前述的药物组合物的小瓶和所写材料，此材料指明这种溶液可以在第一次使用后保留大约24小时或更长时间。更佳的是所写材料指明这种溶液可以保留至大约12天。

一种多剂量的制剂在第一次使用后可以保留至少大约24小时，较佳的是保留至少大约4，5或6天，更佳的是保留至12天。在第一次使用后制剂适宜在低于室温贮存(即低于25℃)，在低于10℃贮存更好，特别适于在2到8℃贮存，最好在大约4到6℃贮存。

本发明的制剂可经以下步骤所制备：先将计算所需的数量的赋形剂加入到缓冲溶液中，再加入干扰素。

所得的溶液再放入小瓶、安瓿或药筒中。所属技术领域的普通技术人员会认识到这种过程中的变量。例如，成分加入的顺序，是否用额外的添加剂，制剂的温度和pH值，都是使其浓度和给药方法最适化因素。

在多剂量用法的制剂中，抑菌剂可以加入到含有活性成分(干扰素)的溶液中，或者保留在另外的小瓶或药筒中，在使用时再加入到含有活性成分的溶液中混合。

本发明的制剂可以用已知的装置来给药。这些装置含有包括给输送溶液的如Rebijec^的自动注射器或笔式注射器装置的小瓶系统。

权利要求中的产品包括包装材料。此包装材料提供了管理机构所要求的信息以外的使用产品的条件。本发明的包装材料给病人提供了用法说明，在必要时怎样从2种小瓶，湿/干的产品准备最终溶液以及在24小时或更长时间内使用最终溶液。单个小瓶的溶液产品，标签指明了此溶液可在24小时或更长时间内使用。权利要求中的产品对用于人类的药物产品有用。

提供给病人的稳定贮存的制剂是一种清澈的溶液。溶液可以是单次用的，也可以是多次重复使用的，它可以满足无论是单疗程的病人还是多疗程的病人，因此提供了一种比现存方案更方便的治疗方案。

根据本发明，在稳定或防腐的制剂中的或在此描述的溶液中的干扰素，可以通过各种给药途径给药，包括皮下注射和肌肉注射；经皮的、肺部的、经粘膜的、植入的、渗透性泵的、药筒、微型泵、口服或其它为所属技术领域所知的被熟练的技术人员所接受的方法。

术语“小瓶”是泛指一种适合的贮器，其在一种封闭的消毒状态下保存干扰素为液体或固体形态。这里所用的小瓶包括安瓿、药筒、硬度泡沫塑料衬垫包装或其它适合干扰素通过注射器、泵(包括渗透性的)、导尿管、经皮斑片、肺部或经粘膜喷雾给病人给药的容器。对包装非肠道、肺部、经粘膜或经皮给药的产品，其适合的小瓶为所属技术领域所熟知。

术语“治疗”在本发明的上下文中指在疾病的进展中任何有益的效果，包括疾病发作后的病理发展减弱、减少、降低或消失。

本发明的药物组合物，含有干扰素或其异构体、突变蛋白质、融合蛋白质、功能性衍生物、活性片段或盐，有利于对这种多肽治疗有反应的临床指征的诊断、预防和治疗(局部或系统)。其临床指征包括，中枢神经系统(CNS)、脑和/或脊髓的紊乱或疾病，包括多发性硬化；自身免疫性疾病，包括风湿性关节炎、牛皮癬、克隆病；以及癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、胆囊癌、肾癌和结肠癌。

本文所引用的所有参考资料包括杂志文章或摘要、公开的或未公开的美国或外国的专利申请、已颁发的美国或外国专利或其它文献，都完全引入作为参考，包括所引用的参考文献中的所有数据，表格，图例和文字。另外，本文所引用的参考文献的完整内容也全部纳入本文作为参考。

参考已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法无论如何并不是认为，本发明的任何方面、描述或实施例在相关技术领域内被揭示、教导或建议。

以下所述的具体实施例将如此全面地阐述本发明的基本特性，以至于其余的人在实验方法适当、没有偏离本发明的基本概念的情况下，可以运用所属技术领域(包括本文中引用的参考文献的内容)的技术知识很容易为不同的应用对这样一些具体实施例作出变更和/或修改。因此，这样的一些修改应当确定为基于本文中所提出的指导的揭示的实施例的等同范围之内。可以理解为本文中的措辞或术语是为了方便叙述而并不是限定，本说明书的术语和措辞将可以由熟练技术人员按照本文中所提出的指导并结合所属技术领域的知识来解释。

附图简述

图1：所示为贮存于40℃后，在含有不同浓度的苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂中的氧化物形成百分比。

图2：所示为贮存于25℃后，在含有不同浓度的苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂中的氧化物形成百分比。

图3：所示为贮存于2-8℃后，在含有不同浓度的苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂中的氧化物形成百分比。

图4，所示为贮存于40℃后，在含有不同浓度的苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂中形成的总聚合物百分比。

图5，所示为贮存于25℃后，在含有不同浓度的苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂中形成的总聚合物百分比。

图6，所示为贮存于2-8℃后，在含有不同浓度的苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂中形成的总聚合物百分比。

图7：所示为氧化物形成百分比示意图，此氧化物形成为含有选择性抑菌剂的干扰素-β-1a多剂量制剂贮存于25℃后形成。

图8：所示为氧化物形成百分比示意图，此氧化物形成为含有选择性抑菌剂的干扰素-β-1a多剂量制剂贮存于2-8℃后形成。

图9：所示为总聚合物百分比示意图，此总聚合物形成于含有选择性抑菌剂的干扰素-β-1a多剂量制剂中。

图10，所示为氧化物形成百分比示意图，此氧化物形成为含有EDTA的干扰素-β-1a多剂量制剂贮存于25℃后形成。

图11：所示为总聚合物百分比示意图，此总聚合物为含有EDTA的干扰素-β-1a多剂量制剂贮存于25℃后形成。

图12：所示为0.012％的L-蛋氨酸作为抗氧化剂在2-8℃时的效力示意图。

图13：所示为0.012％的L-蛋氨酸作为抗氧化剂在25±2℃时的效力示意图。

具体实施例

实施例1---在预先填充的注射器里的液体单剂量不含人血清白蛋白的干扰素-β-1a制剂

1.1初步相容性研究

既然从现有产品中去除人血清白蛋白(HSA)可能会影响产品的氧化、聚合形成和吸附在界面上，那么初步实验来证实一些赋形剂如抗氧化剂和表面活性剂的保护效应。

干扰素-β-1a被制成浓度为44和88mcg/ml的醋酸钠溶液，此溶液含有54.6mg/ml的甘露醇，并结合了几种赋形剂如0.4％的HSA、0.012％的L-蛋氨酸、Tween 20(0.005％、0.007％、0.01％)、泊洛沙姆188(0.05％、0.1％、0.5％)。不同的组合物暴露在压力条件下(贮存在40℃或剧烈摇晃)，然后测定其氧化(反相HPLC方法)和聚合(SE-HPLC方法)。

表格DEP-1和-2总结了贮存在40℃两周后的氧化和聚合水平。干扰素-β-1a和测试的两个表面活性剂(Tween 20和泊洛沙姆188)的组合物氧化水平随每种表面活性剂浓度而升高(表格DEP-1，组合物#4-6和#7-9)；在0.5％的泊洛沙姆188(也称为聚醚F-68或F-68)中，药物物质完全降解(表格DEP-1，#9)。如预期一样，观察到Tween有较高的降解率，因为其氧化种类(如过氧化物)可以作为合成中的残基。

在所测定的不同的浓度下，两种表面活性剂贮存在40℃不影响聚合水平(表格DEP-2)。

表格DEP-1贮存在40℃后氧化物形成(％)，分析方法是反相HPLC

		T＝0	2W
		T＝0	2W	#1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#11	IFN 44IFN 44mcg+0.4％HSA(现溶液)IFN 44mcg+0.012％L-MetIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcg+0.012％L-Met+0.007％Tween 20IFN 44mcg+0.012％L-Met+0.1％F-68	3.02.43.93.53.43.53.53.33.63.53.5	6.55.56.26.07.08.76.98.0n.m6.97.6

n.m＝无法测量，因为完全降解

表格DEP-2：贮存在40℃后总聚合物(％)，分析方法是SE-HPLC

		T＝0	2w
		T＝0	2w	#1#4#5#6#7#8#9	IFN 44IFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcgIFN 44mcg	2.62.42.82.62.52.52.6	2.82.12.02.02.92.52.9

表格DEP-3显示了两种年表面活性剂在它们的临界胶束浓度(CMC)时，有助于防止因5分钟剧烈摇动而形成的聚合。

表格DEP-35min剧烈摇晃后总聚合物(％)，分析方法是SE-HPLC

		T＝0	5’剧烈摇晃
		T＝0	5’剧烈摇晃	#1	IFNβ-1a 44mcg	1.6	2.5
#3	IFNβ-1a 44mcg+0.012％L-Met	1.4	2.4	#1	IFNβ-1a 44mcg	1.6	2.5
#3	IFNβ-1a 44mcg+0.012％L-Met	1.4	2.4	#10	IFNβ-1a 44mcg+0.05％L-Met+0.007％Tween 20	1.4	1.3
#11	IFNβ-1a 44mcg+0.05％L-Met+0.1％F-68	1.3	1.3	#10	IFNβ-1a 44mcg+0.05％L-Met+0.007％Tween 20	1.4	1.3

1.1.1物理化学特性

已知对药物产品质量非常重要的物理化学性质是氧化物和二聚体/聚合体的数量。这些性质如上所总结，在相容性研究中有所考虑。

1.2赋形剂

1.2.1 10mM醋酸钠缓冲液，pH值3.5

如目前市场上的产品(Rebif^)之前的发展中显示，以及如EP759，775中描述，含有54.6mg/ml的甘露醇的10mM pH值是3.5的醋酸钠缓冲液作为等渗剂来稳定产品。

1.2.2泊洛沙姆188

制剂中含有0.1％(临界胶团浓度)的泊洛沙姆188(或聚醚F-68)，是为了防止在生产过程中药物被吸附在容器的表面；浓度太高会影响药物的稳定性(较多的氧化物)；浓度太低则会减少防止吸附的效果。

泊洛沙姆188防止药物在生产过程中吸附的效力可经如下的研究证明：含有44mcg/ml干扰素-β-1a的溶液和某一表面活性剂(Tween20或泊洛沙姆188)的3种不同浓度或人血清白蛋白组合来模仿生产过程；在不同的步骤中取样(合成、防腐剂筛选、装样)，并用定量的反相-HPLC方法来测定。

取样于以下步骤进行

-筛选之前(BF)

-第一次筛选之后(AF1)

-第二次筛选之后(AF2)

-装样之后(在T＝0时完成的产品)

其结果显示在表格DEP-4中。其表达为恢复率(％)对应初始值(即在筛选之前的组合溶液)：在生产过程中，泊洛沙姆188对防止药物的吸附比Tween20更有效果，但和人血清白蛋白效果一样。

表格DEP-4干扰素-β-1a在生产过程中的恢复百分比(％)

	无HSA/无表面活性剂	HSA	0.003％Tween 20	0.007％Tween 20	0.02％Tween20	0.05％F-68	0.1％F-68	0.2％F-68
	无HSA/无表面活性剂	HSA	0.003％Tween 20	0.007％Tween 20	0.02％Tween20	0.05％F-68	0.1％F-68	0.2％F-68	AF1AF2T＝0	97.894.593.8	97.597.396.9	98.296.395.8	97.796.695.7	99.197.696.3	98.397.096.5	98.698.497.0	98.998.398.0

从不同供应商得到的不同级别的泊洛沙姆188，在速成条件下(在40℃中2周)测定并根据其氧化产物来定义所用到的质量：这里选择BASF提供的泊洛沙姆188，因为此公司提供了药理等级的产品，有较低的氧化水平。其结果总结在表格DEP-5中：

表格DEP-5在含有0.1％的泊洛沙姆188制剂中检测到的氧化物形成(不同的质量和供应商)

供应商	质量	T＝0	1周，40℃	2周，40℃
供应商	质量	T＝0	1周，40℃	2周，40℃	BASF	药理等级	2.6	-	3.2
Fluka	For GC	-	3.8	4.7	BASF	药理等级	2.6	-	3.2
Fluka	For GC	-	3.8	4.7	Sigma	生物化学所用	-	3.2	4.4

1.2.3L-蛋氨酸

制剂中含有0.012％的L-蛋氨酸(L-Met)来降低氧化。同不含蛋氨酸的制剂相比显示出这个浓度的效力；较高浓度(0.05％，0.1％)的蛋氨酸在稳定性上表现出相应的效果。在40℃下测到的氧化产物显示在表格DEP-6中。

表格DEP-6含有不同浓度L-蛋氨酸(L-Met)的干扰素-β-1a制剂的氧化物形成百分比(％)

	T＝0	1周，40℃	4周，40℃
	T＝0	1周，40℃	4周，40℃	IFNβ-1a 44mcgIFNβ-1a 44mcg+0.012％L-MetIFNβ-1a 44mcg+0.05％L-MetIFNβ-1a 44mcg+0.1％L-Met	2.8---	3.82.93.02.6	7.65.35.15.0

在制剂发展的过程中，蛋氨酸作为抗氧化剂的效力可以根据在2-8℃和25±2℃中，含有L-蛋氨酸结合表面活性剂的制剂3个月产生的稳定性数据来证实：L-蛋氨酸在0.012％的水平作为抗氧化剂有效，对比目前所观察到的产品可以保证稳定性(参图12和13)。

1.3药物产品

1.3.1制剂的发展

新的不含人血清白蛋白的干扰素-β-1a制剂的发展着重于去证实在最终容器中的初步实验结果(L-蛋氨酸作为抗氧化剂的效力，包括泊洛沙姆188在生产过程中防止活性丧失的效力)。

制备含有54.6mg/ml的甘露醇的干扰素-β-1a溶液，其在10mM醋酸钠缓冲液中的浓度是44和88mcg/ml，pH值3.5，并加入如下的赋形剂：

·Tween 20(0.003％、0.007％、0.02％)

·泊洛沙姆188(0.05％、0.1％、0.2％)

·L-蛋氨酸(0％、0.012％)

·HSA(0.4％，现有制剂，称为“参考”)

所检测到的制剂的组合物显示在表格DEP-7。

表格DEP-7含有干扰素-β-1a的制剂组合物

制剂	IFN-β-1a(mcg)	甘露醇(mg)	Tween20(mg)	泊洛沙姆188(mg)	HSA(mg)	L-蛋氨酸(mg)	10mM醋酸缓冲液pH3.5
制剂	IFN-β-1a(mcg)	甘露醇(mg)	Tween20(mg)	泊洛沙姆188(mg)	HSA(mg)	L-蛋氨酸(mg)	10mM醋酸缓冲液pH3.5	IFN-1	44	54.6	0.03	-	-	-	适量加到1ml
IFN-2	44	54.6	0.07	-	-	-	适量加到1ml	IFN-1	44	54.6	0.03	-	-	-	适量加到1ml
IFN-2	44	54.6	0.07	-	-	-	适量加到1ml	IFN-3	44	54.6	0.2	-	-	-	适量加到1ml
IFN-4	44	54.6	-	0.5	-	-	适量加到1ml	IFN-3	44	54.6	0.2	-	-	-	适量加到1ml
IFN-4	44	54.6	-	0.5	-	-	适量加到1ml	IFN-5	44	54.6	-	1	-	-	适量加到1ml
IFN-6	44	54.6	-	2	-	-	适量加到1ml	IFN-5	44	54.6	-	1	-	-	适量加到1ml
IFN-6	44	54.6	-	2	-	-	适量加到1ml	IFN-7(参考)	44	54.6	-	-	4	-	适量加到1ml
IFN-8	44	54.6	-	-	-	-	适量加到1ml	IFN-7(参考)	44	54.6	-	-	4	-	适量加到1ml
IFN-8	44	54.6	-	-	-	-	适量加到1ml	IFN-9	44	54.6	0.2	-	-	0.12	适量加到1ml
IFN-10	44	54.6	-	2	-	0.12	适量加到1ml	IFN-9	44	54.6	0.2	-	-	0.12	适量加到1ml
IFN-10	44	54.6	-	2	-	0.12	适量加到1ml	IFN-11	88	54.6	-	1	-	0.12	适量加到1ml

制剂根据以下所描述的程序来生产：

在无菌条件下生产每种制剂90毫升，所需数量的赋形剂溶解于含有药物成分(干扰素-β-1a)的WFI中；制剂经0.22微米的过滤膜过滤(经2张过滤膜过滤2次)，然后每种溶液的0.5毫升注入1毫升的Hypak玻璃注射器中。每一批大约180个注射器。

制剂贮存在2-8℃，25±2℃及40±2℃直到12周，进行稳定性的测量(对贮存在40±2℃的样品，直到6周)。

在过程中，用以下分析形测定和方法(实例2有更多测定上的细节)。

-生物活性(CPE生物测定)

-测定(RP-HPLC方法)

-氧化产物(RP-HPLC方法)

-二聚体/聚合体(SE-HPLC方法及SDS-PAGE)

-pH值(电位方法)

-重量克分子渗透压浓度(crioscopic测量)

结果及其评估总结于表格DEP-8到DEP-17中。

表格DEP-8生物鉴别(MIU/ml)

2-8℃
2-8℃							0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10	11.711.511.311.812.112.112.111.211.212.0	12.412.110.011.812.312.212.411.412.413.0	11.611.99.912.412.611.412.611.512.712.4	11.011.19.711.111.610.711.110.811.911.6			0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10	11.711.511.311.812.112.112.111.211.212.0	12.412.110.011.812.312.212.411.412.413.0	11.611.99.912.412.611.412.611.512.712.4	11.011.19.711.111.610.711.110.811.911.6		25℃
	0	2周	4周	8周	12周	25℃
	0	2周	4周	8周	12周	IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10	11.711.511.311.812.112.112.111.211.212.0	11.211.810.710.812.312.911.211.111.011.7	11.511.310.611.812.512.012.711.512.111.8	11.011.110.412.212.011.512.811.611.512.5	10.710.78.911.610.910.511.310.910.911.6
40℃						IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10	11.711.511.311.812.112.112.111.211.212.0	11.211.810.710.812.312.911.211.111.011.7	11.511.310.611.812.512.012.711.512.111.8	11.011.110.412.212.011.512.811.611.512.5	10.710.78.911.610.910.511.310.910.911.6
40℃							0	2周	4周	6周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10	11.711.511.311.812.112.112.111.211.212.0	9.410.07.810.912.111.611.011.010.112.3	9.49.77.211.413.112.712.211.69.112.0	9.69.66.013.012.111.412.012.07.111.0			0	2周	4周	6周

线性回归分析所计算出的斜率以及表格DEP-9的总结显示，贮存在40℃含有Tween 20(#1，2，3，9)的制剂生物学活性均有降低；贮存在25℃和2-8℃的制剂#3和6(含有最高浓度的表面活性剂)的生物学活性也有降低。

表格DEP-9线性回归分析生物鉴定(斜率表达为MIU/ml X周)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10
	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	2-8℃25℃40℃	-0.07-0.08-0.32	-0.04-0.08-0.29	-0.12-0.17-0.83	-0.040.030.20	-0.03-0.100.05	-0.13-0.17-0.05	-0.06-0.020.06	-0.03-0.010.16	0.06-0.02-0.67	-0.060.00-0.17

表格DEP-10反相HPLC测定

2-8℃
2-8℃							0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	23.422.922.422.923.623.123.021.223.022.845.6	21.521.420.822.423.321.422.820.021.722.643.9	22.822.220.823.121.722.923.423.521.622.744.3	21.221.120.221.222.221.222.020.022.123.244.7			0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	23.422.922.422.923.623.123.021.223.022.845.6	21.521.420.822.423.321.422.820.021.722.643.9	22.822.220.823.121.722.923.423.521.622.744.3	21.221.120.221.222.221.222.020.022.123.244.7		25℃
	0	2周	4周	8周	12周	25℃
	0	2周	4周	8周	12周	IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	23.422.922.422.923.623.123.021.223.022.845.6	20.521.219.921.523.422.623.120.820.522.245.2	20.719.819.122.223.020.722.919.820.222.644.6	20.720.817.622.523.622.023.220.818.222.043.4	20.119.716.621.121.420.522.619.718.622.344.8
40℃						IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	23.422.922.422.923.623.123.021.223.022.845.6	20.521.219.921.523.422.623.120.820.522.245.2	20.719.819.122.223.020.722.919.820.222.644.6	20.720.817.622.523.622.023.220.818.222.043.4	20.119.716.621.121.420.522.619.718.622.344.8
40℃							0	2周	4周	6周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	23.422.922.422.923.623.123.021.223.022.845.6	18.818.515.120.121.820.720.619.616.820.543.4	17.816.211.219.821.018.818.818.312.719.841.5	16.615.410.418.719.618.716.718.113.119.940.1			0	2周	4周	6周

线性回归分析所计算出的斜率以及表格DEP-11的总结显示，贮存在40℃含有Tween 20的制剂(#1，2，3，9)蛋白质含量损失较多；贮存在25℃的制剂#5和6有同样的倾向。贮存在2-8℃的制剂#1，2，3(含Tween 20)，4，5(含泊洛沙姆188)以及9(含Tween 20和L-蛋氨酸)，其蛋白质含量有明显降低。

表格DEP-11线性回归分析测定(斜率表达为MIU/注射器X周)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11
	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11	2-8℃25℃40℃	-0.13-0.19-1.10	-0.11-0.20-1.20	-0.16-0.44-2.00	-0.11-0.09-0.64	-0.14-0.15-0.64	-0.11-0.18-0.76	-0.06-0.03-1.00	-0.00-0.09-0.53	-0.07-0.34-1.70	0.03-0.04-0.47	-0.06-0.10-0.92

表格DEP-12反相HPLC测定氧化物形成百分比(％)

2-8℃
2-8℃							0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	2.82.52.72.62.82.51.52.83.33.02.6	2.82.93.02.62.83.11.52.93.43.22.9	3.33.44.23.63.64.51.73.23.43.02.9	3.43.44.53.23.24.41.33.13.63.02.9			0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	2.82.52.72.62.82.51.52.83.33.02.6	2.82.93.02.62.83.11.52.93.43.22.9	3.33.44.23.63.64.51.73.23.43.02.9	3.43.44.53.23.24.41.33.13.63.02.9		25℃
	0	2周	4周	8周	12周	25℃
	0	2周	4周	8周	12周	IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	2.82.52.72.62.82.51.52.83.33.02.6	3.03.03.53.03.03.01.73.13.43.02.8	3.13.13.93.13.13.21.92.93.53.23.1	4.23.46.74.74.45.32.04.13.93.33.2	4.34.66.84.84.55.72.34.34.43.53.4
40℃						IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	2.82.52.72.62.82.51.52.83.33.02.6	3.03.03.53.03.03.01.73.13.43.02.8	3.13.13.93.13.13.21.92.93.53.23.1	4.23.46.74.74.45.32.04.13.93.33.2	4.34.66.84.84.55.72.34.34.43.53.4
40℃							0	2周	4周	6周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	2.82.52.72.62.82.51.52.83.33.02.6	6.03.78.84.13.74.92.83.85.73.63.2	8.38.712.36.77.27.63.97.68.69.35.3	12.410.716.910.39.613.311.810.712.89.76.8			0	2周	4周	6周

线性回归分析所计算出的斜率以及表格DEP-13的总结显示，和含有泊洛沙姆188的制剂相比，含有Tween 20的制剂氧化率更快，并且其氧化水平随Tween 20浓度变化。

制剂#9(含Tween 20+L-蛋氨酸)和#3(Tween 20)相比以及#10(泊洛沙姆188+L-蛋氨酸)和#6(泊洛沙姆188)相比的结果，也显示了L-蛋氨酸在不同的检测温度下防止氧化的效力。

表格DEP-13线性回归分析氧化物形成(斜率表达为％氧化物形态/周)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11
	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11	2-8℃25℃40℃	0.060.141.60	0.080.161.50	0.170.382.30	0.070.211.30	0.050.161.20	0.170.291.80	-0.010.061.60	0.030.141.40	0.020.091.60	0.000.041.30	0.020.060.74

表格DEP-14总聚合物(％)，SE-HPLC或SDS-PAGE

2-8℃
2-8℃							0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7^*IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	0.80.81.11.21.01.1≤3％1.21.71.41.4	0.50.40.60.91.41.8＜3％1.61.41.30.9	0.70.70.91.40.90.9＜3％1.21.71.30.4	0.50.31.21.71.61.5＜4.5％2.01.21.31.7			0	4周	8周	12周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7^*IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	0.80.81.11.21.01.1≤3％1.21.71.41.4	0.50.40.60.91.41.8＜3％1.61.41.30.9	0.70.70.91.40.90.9＜3％1.21.71.30.4	0.50.31.21.71.61.5＜4.5％2.01.21.31.7		25℃
	0	2周	4周	8周	12周	25℃
	0	2周	4周	8周	12周	IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7^*IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	0.80.81.11.21.01.1≤3％1.21.71.41.4	0.40.40.61.20.60.7＜3％0.80.60.51.1	0.20.10.30.60.80.9＜3％0.90.90.70.9	0.20.30.30.90.40.6＜3％0.40.60.50.5	0.30.00.50.90.90.8＜4.5％0.90.50.51.4
40℃						IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7^*IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	0.80.81.11.21.01.1≤3％1.21.71.41.4	0.40.40.61.20.60.7＜3％0.80.60.51.1	0.20.10.30.60.80.9＜3％0.90.90.70.9	0.20.30.30.90.40.6＜3％0.40.60.50.5	0.30.00.50.90.90.8＜4.5％0.90.50.51.4
40℃							0	2周	4周	6周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7^*IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	0.80.81.11.21.01.1≤3％1.21.71.41.4	0.50.60.71.40.91.1＜3％0.80.80.81.3	0.40.60.50.61.11.2＜3％0.71.01.41.2	0.90.80.61.11.41.4＜4.5％0.60.61.01.8			0	2周	4周	6周

^*SDS-PAGE方法

线性回归分析所计算出的斜率以及表格DEP-15的总结显示，贮存在不同温度下总聚合物含量没有显著增加。

表格DEP-15：线性回归分析总聚合物(斜率表达为％总聚合物/周)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11
	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11	2-8℃25℃40℃	-0.01-0.040.01	-0.03-0.050.01	0.01-0.04-0.09	0.04-0.03-0.07	0.04-0.010.07	0.01-0.030.05	0.05-0.03-0.10	-0.03-0.07-0.15	-0.01-0.05-0.03	0.01-0.010.07

表格DEP-16pH值，2-8℃

2-8℃
2-8℃								0	4周	8周	12周	24周	104周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	3.73.73.73.73.73.63.63.63.63.63.5	3.73.73.73.83.73.73.53.63.73.73.6	3.73.73.63.73.73.73.63.73.63.73.6	3.73.73.63.63.73.73.63.73.73.73.6	----------3.6	-----3.73.63.7-3.7-		0	4周	8周	12周	24周	104周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	3.73.73.73.73.73.63.63.63.63.63.5	3.73.73.73.83.73.73.53.63.73.73.6	3.73.73.63.73.73.73.63.73.63.73.6	3.73.73.63.63.73.73.63.73.73.73.6	----------3.6	-----3.73.63.7-3.7-	25℃
	0	2周	4周	8周	12周	24周	25℃
	0	2周	4周	8周	12周	24周	IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	3.73.73.73.73.73.63.63.63.63.63.5	3.63.63.63.63.73.73.63.73.73.73.6	3.83.83.83.83.63.73.53.63.73.73.6	3.63.63.73.73.73.63.63.73.63.73.6	3.73.73.73.73.73.73.63.73.63.63.6	----------3.6
40℃							IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	3.73.73.73.73.73.63.63.63.63.63.5	3.63.63.63.63.73.73.63.73.73.73.6	3.83.83.83.83.63.73.53.63.73.73.6	3.63.63.73.73.73.63.63.73.63.73.6	3.73.73.73.73.73.73.63.73.63.63.6	----------3.6
40℃								0	2周	4周	6周
IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11	3.73.73.73.73.73.63.63.63.63.63.5	3.63.63.63.63.73.73.63.63.63.73.6	3.73.73.73.73.63.63.63.73.73.73.5	3.73.83.83.83.74.03.63.73.73.63.6				0	2周	4周	6周

在贮存中没有观察到pH值变动。

表格DEP-17重量克分子渗透压浓度(OSM/kg)

IFN-1IFN-2IFN-3IFN-4IFN-5IFN-6IFN-7IFN-8IFN-9IFN-10IFN-11

0.3480.3450.3450.3460.3540.3580.3990.3540.3690.3660.361

所测量的重量克分子渗透压浓度合适。

根据制剂的进展结果，选择如下不含人血清白蛋白的制剂：

·44或88mcg/ml的干扰素beta-1a在pH3.5的醋酸钠缓冲液中，含有：

·54.6mg/ml甘露醇，

·1mg/ml泊洛沙姆188，

·0.12mg/ml L-蛋氨酸。

1.3.2过剩

不实行过剩生产。

1.3.3物理化学性质和生物学性质

如上所述，在制剂的发展中，已经考虑到其物理化学特性和生物学特性。

1.4生产过程进展

1.4.1生产过程的进展

目前的生产过程经实验室等级的几批新制剂的制备调节而成：药物经其成分直接混合而成；然后为了模仿工业等级过程进行二次过滤，预知为一次无菌过滤，继而在注入注射器之前进行一次在管线中的过滤。最后人工灌注消过毒的最终溶液到注射器中。

过滤和注射器灌注都需要在层流下进行。

过程中的每一个步骤如下描述。

1.4.2初步计算

得到44mcg/ml的溶液所需干扰素β-1a的药物物质D(mg)的数量：

D(mg)＝44mcg/ml×90ml＝3960mcg＝3.96mg

干扰素β-1a的药物物质B(ml)容积相应于D(mg)的数量：

B(ml)＝3.96mg∶整体滴定度(mg/ml)

赋形剂溶液V的容积(ml)，所需90ml的44mcg/ml溶液：

V(ml)＝90ml-B(ml)^*

{(d &cong; 1 g / ml)}_{*}

1.4.3 1M氢氧化钠溶液的制备

1M氢氧化钠溶液制备于WFI中。

1.4.4.0.01M pH值为3.5的醋酸钠缓冲液的制备

适量的冰醋酸加入WFI中，用1M NaOH或50％的稀释的醋酸将pH值调节到3.5±0.2。溶液用WFI加到最终容积。

1.4.5赋形剂溶液的制备

称出计算所得的赋形剂数量(甘露醇，Tween 20或泊洛沙姆188，L-蛋氨酸)，溶于所需数量的0.01M pH值为3.5的醋酸钠缓冲液；如有需要，检查并用1M NaOH或50％的稀释的醋酸调节pH值至3.5±0.2；溶液用0.01M的醋酸钠缓冲液加到最终重量。

1.4.6药物物质溶液的混合

所需干扰素β-1a的药物物质的数量B(g)加入所需量的赋形剂溶液V(g)，然后轻轻搅拌均匀。

1.4.7第一次药物物质溶液的过滤

混合得到的溶液经0.2微米的尼龙膜(Ultipor N₆₆ 0.2μm，2.5cm，Pall)在氮压力下(最大为1巴)过滤，尼龙膜装入一不锈钢支架，溶液收集到玻璃烧杯中。

1.4.8第二次药物物质溶液的过滤

第一次过滤后的溶液再次在同样的条件下经一新的0.2μm的尼龙膜过滤。

1.4.9注射器灌注

1ml的玻璃注射器中注入0.5ml的最终溶液。

1.4.10加工中的温度

整个过程中温度维持在尽可能接近冷冻条件，用冷冻的WFI，赋形剂溶液和混合物溶液贮存在2-8℃。

实施例2-在药筒中适合自动注射的液体多剂量不含人血清白蛋白干扰素β-1a制剂

在新的多剂量不含人血清白蛋白干扰素β-1a制剂的发展过程中，越来越需要发展一种在药筒中的多剂量产品，它旨在消除目前在市场上通用的注射器产品中的人血清白蛋白。多剂量产品可以用自动注射器让病人自己给药，增加了病人的方便。

最常用的抑菌剂(0.3％m-甲酚、0.5％酚and 0.9％苯甲醇)最初结合在活性物质中研究。对比在注射器中的单剂量的配方，此配方选自单剂量研制框架中(在10mM pH3.5的醋酸钠缓冲液中含44或88mcg/ml干扰素beta-1a、54.6mg/ml甘露醇、1mg/ml泊洛沙姆188、0.12mg/ml L-蛋氨酸)，观察如下：

·在常用浓度下预防微生物污染的每一种抑菌剂的内含物，都增加了氧化物形成，也大幅度增加了聚合程度；

·0.3％的m-甲酚以及0.5％的酚和0.1％的泊洛沙姆188混合物，其聚合有显著增加。

根据在预制备过程中所得到的信息，制剂研制最初集中在苯甲醇和酚(无泊洛沙姆188)以及其它的抑菌剂上(丙酮氯仿，苯基乙醇)；也研究EDTA和苯甲醇的混合物：活性药物的氧化和聚合是观察到的主要的降解路径；制剂中苯甲酚的数量减少可以使产品的贮存期限延长。

在此期间所研究的其它防腐剂没有明显提高产品的稳定性。

制剂研制中的最后，对以下多剂量的制剂进行鉴别：

·制剂B-264mcg干扰素β-1a，163.8mg甘露醇，3mg泊洛沙姆188，0.36mg L-蛋氨酸，6mg苯甲醇，加入到3ml的10mMpH值为3.5的醋酸钠缓冲液中。

·制剂A-264mcg干扰素β-1a，163.8mg甘露醇，3mg泊洛沙姆188，0.36mg L-蛋氨酸，加入到2.7ml 11mM pH值为3.5的醋酸钠缓冲液中，和0.3ml 3％的溶于WFI的苯甲醇混合所得的最终多剂量溶液。

用指示稳定性的方法检测三批实验室等级的每一个候选制剂，一直到6个月：两种制剂在贮存于2-8℃时没有显著降解；贮存于速成条件下(25℃)的主要降解是氧化。

研究最后，两种多剂量制剂用一种可比较的稳定性剖视图来鉴别：

·制剂B是一种现成的含有0.2％苯甲醇的多剂量制剂，

·制剂A是一种含有0.3％苯甲醇的多剂量制剂，它需要混和2种药筒的内容(一种含有活性要素和赋形剂，另一种含有所需达到最终浓度的苯甲醇数量)而得到。

2.1研究目的

本研究的目的是发展一种可以自动注射的多剂量的不含人血清白蛋白的干扰素β-1a，其浓度是3ml药筒中含有264mcg药物。

2.2实验部分

2.2.1材料

干扰素β-1a(Serono S.A.)

甘露醇DAB，Ph Eur，BP，USP，FCC，E421(Merck)

冰醋酸100％GR(Merck)

氢氧化钠小球GR(Merck)

泊洛沙姆188(Lutrol F 68 DAC，USP/NF，BASF)

L-蛋氨酸生物化学用(Merck)

m-甲酚合成用(Merck)

酚合成用(Merck)

苯甲醇Ph Eur，BP，NF(Merck)

丙酮氯仿(Aldrich)

苯基乙醇(Sigma)

对羟基苯甲酸甲酯钠BP，USP/NF(Formenti)

对羟基苯甲酸丙酯钠BP，USP/NF(Formenti)

EDTA去钠盐(Fluka)

1，2-丙二醇极纯DAB，Ph Eur，BP，USP(Merck)

氰化甲烷(Merck)

三氟乙酸(Baker)

Heptafluorobutirric acid(Pierce)

2.2.2仪器

HPLC系统(Waters)

Millenium 32软件(Waters)

渗透压计(Osmomat 030-D，Gonotec)

pH计(mod.654，Metrohm)

经校正的吸液管(Gilson)

Ultipor N66 0.2μm尼龙膜，FTKNF，4.7cm(Pall)

Ultipor N66 0.2μm尼龙膜，NR14225，14.2cm(Pall)

不锈钢支架，4.7cm and 10cm(Sartorius)

不锈钢槽(Sartorius)

C4柱5μm(0.46×25cm)(Baker)

C4柱，SupelCosil LC-3045Bm(0.46×25cm)(Supelco)

TSK柱，G2000SWXL(0.46×25cm)(TosoHaas)

2.3预制剂研究

最常用的抑菌剂(0.3％的m-甲酚、0.5％的酚和0.9％的苯甲酚)最初结合在最终容器(3ml药筒)中的混合物来进行研究，其混合物由活性物质和不同的赋形剂组成：醋酸缓冲液、醋酸缓冲液/甘露醇、醋酸缓冲液/甘露醇/L-蛋氨酸/泊洛沙姆188。贮存在40C时，根据活性物质在不同环境中的氧化(反相HPLC)和聚合(SE-HPLC)来研究其兼容性。所研究的制剂在初期的不同步骤总结于表I。

每种抑菌剂的内含物效果和单剂量配方对比(参考)，此配方选自在注射器的单剂量制剂的研制框架(10M pH 3.5的醋酸钠缓冲液中有44或88mcg/ml干扰素-β-1、54.6mg/ml甘露醇、1mg/ml泊洛沙姆188、0.12mg/ml L-蛋氨酸)。

表I多剂量的干扰素-β-1a的成分(预制剂)

制剂	成分
制剂	成分	参考	Ace/Man/Plu/Met1
EFGH	Ace/CRAce/PHAce/BAAce	参考	Ace/Man/Plu/Met1
EFGH	Ace/CRAce/PHAce/BAAce	JKL	Ace/Man/CRAce/Man/PHAce/Man/BAAce/Man
MNOPQR	Ace/Man/PHAce/Man/Met1/PHAce/Man/Met2/PHAce/Man/Plu/PHAce/Man/Plu/Met1/PHAce/Man/Plu/Met2/PH	JKL	Ace/Man/CRAce/Man/PHAce/Man/BAAce/Man
MNOPQR		STUVWX	Ace/Man/BAAce/Man/Met1/BAAce/Man/Met2/BAAce/Man/Plu/BAAce/Man/Plu/Met1/BAAce/Man/Plu/Met2/BA

Ace＝10mM醋酸钠缓冲液pH3.5；Man＝54.6mg/ml；Plu＝1mg/ml泊洛沙姆188；Met1＝0.12mg/ml L-蛋氨酸；Met2＝0.24mg/ml L-蛋氨酸；CR＝3mg/mlm-甲酚；PH＝5mg/ml酚；BA＝9mg/ml苯甲酚

2.4制剂研制

基于从预制剂中得到的信息，制剂研制最初集中在苯甲酚和酚上，另外也研究了组合在苯甲醇上的其它防腐剂(丙酮氯仿，苯基乙醇)和EDTA。一种用于比较的制剂(MS-3)，对应于新的单剂量不含人血清白蛋白的干扰素-β-1a制剂，也在药筒中制备并作为参考使用。

在此期间所生产的制剂的组合物(mg/ml)显示在表II到V中：

表II含有苯甲醇的干扰素-β-1a多剂量制剂(成分表达为mg/ml)

#	IFN	甘露醇	泊洛萨姆188	L-蛋氨酸	苯甲醇	醋酸缓冲液
#	IFN	甘露醇	泊洛萨姆188	L-蛋氨酸	苯甲醇	醋酸缓冲液	MS-3(参考)	0.088	54.6	1	0.12	-	适量加至1ml
MS-13	0.088	54.6	1	0.12	1.5	适量加至1ml	MS-3(参考)	0.088	54.6	1	0.12	-	适量加至1ml
MS-13	0.088	54.6	1	0.12	1.5	适量加至1ml	MS-14	0.088	54.6	-	0.12	1.5	适量加至1ml
MS-15	0.088	54.6	1	0.12	3	适量加至1ml	MS-14	0.088	54.6	-	0.12	1.5	适量加至1ml
MS-15	0.088	54.6	1	0.12	3	适量加至1ml	MS-16	0.088	54.6	-	0.12	3	适量加至1ml
MS-17	0.088	54.6	1	0.12	4.5	适量加至1ml	MS-16	0.088	54.6	-	0.12	3	适量加至1ml
MS-17	0.088	54.6	1	0.12	4.5	适量加至1ml	MS-18	0.088	54.6	-	0.12	4.5	适量加至1ml
MS-1	0.088	54.6	1	0.12	9	适量加至1ml	MS-18	0.088	54.6	-	0.12	4.5	适量加至1ml
MS-1	0.088	54.6	1	0.12	9	适量加至1ml	MS-2	0.088	54.6	-	0.12	9	适量加至1ml

表III干扰素-β-1a含有酚的多剂量制剂(表达为mg/ml)

#	IFN	甘露醇	丙二醇	酚	醋酸缓冲液
#	IFN	甘露醇	丙二醇	酚	醋酸缓冲液	MS-4	0.088	54.6	-	5	适量加至1ml
MS-5	0.088	54.6	100	5	适量加至1ml	MS-4	0.088	54.6	-	5	适量加至1ml

表IV含有丙酮氯仿和苯基乙醇的干扰素-β-1a多剂量制剂(成分表达为mg/ml)

#	IFN	甘露醇	泊洛沙姆188	L-蛋氨酸	丙酮氯仿	苯基乙醇	醋酸缓冲液
#	IFN	甘露醇	泊洛沙姆188	L-蛋氨酸	丙酮氯仿	苯基乙醇	醋酸缓冲液	MS-35	0.088	54.6	1	0.12	1	-	适量加至1ml
MS-34	0.088	54.6	1	0.12	-	1	适量加至1ml	MS-35	0.088	54.6	1	0.12	1	-	适量加至1ml
MS-34	0.088	54.6	1	0.12	-	1	适量加至1ml	MS-34b	0.088	54.6	1	0.12	-	1	适量加至1ml

表V含有EDTA的干扰素-β-1a多剂量制剂(成分表达为mg/ml)

#	IFN	甘露醇	L-蛋氨酸	泊洛沙姆188	EDTA	苯甲醇	醋酸缓冲液
#	IFN	甘露醇	L-蛋氨酸	泊洛沙姆188	EDTA	苯甲醇	醋酸缓冲液	MS-32	0.088	54.6	0.12	1	1	2	适量加至1ml
MS-33	0.088	54.6	-	1	1	2	适量加至1ml	MS-32	0.088	54.6	0.12	1	1	2	适量加至1ml
MS-33	0.088	54.6	-	1	1	2	适量加至1ml	MS-36	0.088	54.6	0.12	1	0.5	1	适量加至1ml

制剂研制的最后，对以下候选的多剂量制剂进行鉴别：

·制剂B-264mcg干扰素β-1a加到3ml醋酸缓冲液中(pH值为3.5)，其含有54.6mg/ml甘露醇、1mg/ml泊洛沙姆188、0.12mg/ml L-蛋氨酸、2mg/ml苯甲醇(0.2％苯甲醇)。

·制剂A-264mcg干扰素β-1a，加到2.7ml醋酸缓冲液中(pH值为3.5)，其含有54.6mg/ml甘露醇、1mg/ml泊洛沙姆188、0.12mg/ml L-蛋氨酸、和0.3ml的3％溶于WFI的苯甲醇混合所得的最终多剂量溶液(0.3％的苯甲醇)。

2.5防腐剂效果测试

根据EP或USP药典，含有不同浓度的苯甲醇(0.2％到0.9％)的多剂量制剂进行防腐剂效果测试筛选。

初步测试选择金黄色葡萄球菌，黑曲霉菌和白色念珠菌作为指示剂：制成品本身的酸性pH值对细菌(金黄色葡萄球菌)有抑菌作用的迹象以及白色念珠菌的一些菌株在低pH值(约为2)下可以存活的事实可以确定选择白色念珠菌作为测试的临界指示剂。关于防腐剂效果测试认可的标准在EP或USP药典有所描述。

2.6候选制剂

2.6.1制剂A

生产三批实验室标度的药筒，约140个/批：配方列于表VI：

表VI干扰素-β-1a多剂量制剂A组合物

IFNβ-1a	甘露醇	泊洛沙姆188	L-蛋氨酸	11mM醋酸钠pH3.5
IFNβ-1a	甘露醇	泊洛沙姆188	L-蛋氨酸	11mM醋酸钠pH3.5	97.8mcg	60.7mg	1.11mg	0.13mg	适量加至1.0ml

活性成分和赋形剂组合，然后经0.22微米的尼龙膜过滤；药筒内装入2.7ml的最终溶液。在过滤之前、之后以及装样之后选取样品来监控加工过程中的活性要素的丧失。

将样品贮存在2-8℃(6个月)，25±2℃(3个月)和40±2℃(1个月)中，测试其稳定性。

生产六批实验室标度的3％的溶于WFI的苯甲醇，与含有活性成分的药筒混合；其组合物列于表VII：

表VII3％溶于WFI的苯甲醇组合物

苯甲醇	WFI
苯甲醇	WFI	30mg	适量加至1.0ml

将所需苯甲醇的量加入WFI中，经0.22微米的Durapore膜过滤，药筒中填注入0.5ml的溶液，最后进行高压灭菌消毒。

将样品贮存在25±2℃中至一个月，测试其苯甲醇内含物和pH值。

2.6.2制剂B

生产3批实验室标度的药筒，约500个/批；其组合物列于表VIII：

表VIII干扰素-β-1a多剂量制剂B组合物

IFNβ-1a	甘露醇	泊洛沙姆188	L-蛋氨酸	苯甲醇	10mM醋酸钠缓冲液pH3.5
IFNβ-1a	甘露醇	泊洛沙姆188	L-蛋氨酸	苯甲醇	10mM醋酸钠缓冲液pH3.5	88mcg	54.6mg	1mg	0.12mg	2mg	适量加至1.0ml

活性成分和赋形剂溶液组合，然后经0.22微米的尼龙膜过滤；药筒内装入3ml的最终溶液。在过滤之前，之后以及装样之后选取样品来监控加工过程中的活性要素的丢失。

将样品贮存在2-8℃(6个月)，25±2℃(6个月)和40±2℃(3周)中，测试其稳定性。

2.6.3防腐剂效果测试

根据EP或USP药典，两种候选制剂均进行防腐剂效果测试。

2.7分析性检测和方法

以下所描述的分析性检测和方法用于监控实验室标度的制剂的稳定性：

pH(电位测量法)

蛋白质定量测定(反相-HPLC)

蛋白质定量在一C4，宽孔Butyl 5μm柱(Baker)中进行；波长设定在214nm，以1mL/min的速度洗脱，其流动相和梯度如下：

A＝水/三氟乙酸0.1％-B＝氰化甲烷/三氟乙酸0.1％-C＝氰化甲烷

梯度：

0min5.0min6.0min15.0min30.0min35.0min40.0min40.1min45.0min45.1min50.0min50.1min65.0min

70％ A70％ A58％ A57％ A46％ A45％ A40％ A20％ A20％ A0％ A0％ A70％ A70％ A

30％ B30％ B42％ B43％ B54％ B55％ B60％ B80％ B80％ B0％ B0％ B30％ B30％ B

0％ C0％ C0％ C0％ C0％ C0％ C0％ C0％ C0％ C100％ C100％ C0％ C0％ C

实验时间＝65min

注射每种样品的100微升进行样品分析，44mcg/mL的样品用原溶液，88mcg/mL的样品用对照剂稀释至1∶1。

对照标准曲线来进行样品定量，此标准曲线由一供参考的标准材料所制备，其范围是0.0125mcg/mL到0.2mcg/mL。

氧化物形成(反相HPLC)

氧化物形成的定量在一个C4，Supelcosil LC-304柱(Supelco)中进行，其温度是40℃；波长设定在208nm，以1mL/min的速度洗脱，其流动相和梯度如下：

A＝水60％/氰化甲烷40％/Heptafluorobutifric acid 0.14％-B＝水20％/氰化甲烷80％/Heptafluorobutirric acid 0.14％-C＝水20％/氰化甲烷80％/Trifluroacetic acid 0.1％

梯度：

0’5’58’63’68’69’

70％A70％A62％A0％A0％A70％A

30％B30％B38％B100％B0％B30％B

0％C0％C0％C0％C100％C0％C

Curve 6Curve 1Curve 1Curve 6

实验时间：96min(70min+26min平衡)

注射200μL样品原液(88mcg/mL的样品)或400μL样品原液(44mcg/mL的样品)来进行样品分析。

总聚合物(SE-HPLC)

总聚合物内含物的检测在TSK G2000SWXL柱(TosoHaas)中进行；洗脱用氰化甲烷∶水(30∶70)+0.2％的三氟乙酸在0.5mL/min的速度下进行；波长设定在214nm。时间是20分钟。

注射100μL样品原液(88mcg/mL的样品)或200μL样品原液(44mcg/mL的样品)来进行样品分析。

生物学活性(体外生物测定)

根据抗病毒测定来进行生物学活性测定，此测定根据干扰素-β-1a诱导细胞(WISH细胞-人羊膜细胞)保护来对抗一种病毒(疱疹性口炎病毒)引起的细胞变性的效果。

重量克分子渗透压浓度(冰点测定法)

根据测试溶液中所观察到的冰点降低，用冰点测定法测定重量克分子渗透压浓度。

苯甲醇测定(GC)

检测苯甲醇的GC方法是用Merck提供的苯甲醇作为参考的单点校正法。另外用内部标准(苯乙醇)对两种测试样品的峰区进行标准化，这两种样品即对照样品溶液和标准溶液。此方法在一个6英尺×2 mm ID的钢柱中进行，并在其中的supelcoport 80/100mesh上加入10％的Carbowax 20M。探头是一个FID(火焰离子化探头)。

其结果表达为mg苯甲醇/mL。

2.7.1结果

2.7.1.1预制剂

在压力条件下(40℃)所探测到的氧化物形成和总聚合物显示于表IX和X：

表IX：贮存在40℃时的干扰素-β-1a多剂量制剂的氧化物形成％(反相HPLC)

参考	组合物	T＝0	40℃ 3天	40℃ 6天
参考	组合物	T＝0	40℃ 3天	40℃ 6天	制成品	Ace/Man/Plu/Met1	3.0	-	4.2
EFGH	Ace/CRAce/PHAce/BAAce	2.82.62.63.6	2.73.56.32.7	----	制成品	Ace/Man/Plu/Met1	3.0	-	4.2
EFGH	Ace/CRAce/PHAce/BAAce	2.82.62.63.6	2.73.56.32.7	----	IJKL	Ace/Man/CRAce/Man/PHAce/Man/BAAce/Man	2.33.64.02.9	3.02.54.72.3	----
MNOPQR	Ace/Man/PHAce/Man/Met1/PHAce/Man/Met2/PHAce/Man/Plu/PHAce/Man/Plu/Met1/PHAce/Man/Plu/Met2/PH	2.92.72.52.32.22.1	------	6.35.34.96.87.24.2	IJKL	Ace/Man/CRAce/Man/PHAce/Man/BAAce/Man	2.33.64.02.9	3.02.54.72.3	----
MNOPQR		2.92.72.52.32.22.1	------	6.35.34.96.87.24.2	STUVWX	Ace/Man/BAAce/Man/Met1/BAAce/Man/Met2/BAAce/Man/Plu/BAAce/Man/Plu/Met1/BAAce/Man/Plu/Met2/BA	2.62.72.52.52.63.0	------	5.05.04.85.05.06.2

Ace＝10mM醋酸钠缓冲液pH3.5；Man＝54.6mg/ml甘露醇；Plu＝1mg/ml泊络沙姆188；Met1＝0.12mg/ml L-蛋氨酸；Met2＝0.24mg/ml L-蛋氨酸；CR＝3mg/ml m-甲酚；PH＝5mg/ml酚；BA＝9mg/ml苯甲醇

表X：贮存在40℃时的干扰素-β-1a多剂量制剂的总聚合物％(反相HPLC)

参考	组合物	T＝0	40℃ 3天	40℃ 6天
参考	组合物	T＝0	40℃ 3天	40℃ 6天	制成品	Ace/Man/Plu/Met1	3.2	-	3.2
EFGH	Ace/CRAce/PHAce/BAAce	1.82.22.02.8	9.439.84.72.5	8.59.47.21.7	制成品	Ace/Man/Plu/Met1	3.2	-	3.2
EFGH	Ace/CRAce/PHAce/BAAce	1.82.22.02.8	9.439.84.72.5	8.59.47.21.7	IJKL	Ace/Man/CRAce/Man/PHAce/Man/BAAce/Man	2.42.02.33.0	15.62.33.63.2	20.12.14.52.3
MNOPQR	Ace/Man/PHAce/Man/Met1/PHAce/Man/Met2/PHAce/Man/Plu/PHAce/Man/Plu/Met1/PHAce/Man/Plu/Met2/PH	2.22.22.32.22.32.3	------	4.45.88.840.346.335.9	IJKL	Ace/Man/CRAce/Man/PHAce/Man/BAAce/Man	2.42.02.33.0	15.62.33.63.2	20.12.14.52.3
MNOPQR		2.22.22.32.22.32.3	------	4.45.88.840.346.335.9	STUVWX	Ace/Man/BAAce/Man/Met1/BAAce/Man/Met2/BAAce/Man/Plu/BAAce/Man/Plu/Met1/BAAce/Man/Plu/Met2/BA	2.52.61.42.92.91.6	------	3.45.43.04.85.85.8

对比单剂量制剂(参考)，在常用浓度下用来预防微生物污染的每种抑菌剂，其内含物测出有氧化物形成增高和聚合物明显增多。

0.5％的酚和0.1％的泊络沙姆188组合物中大约有40％的聚合产生，降低产品的稳定性(制剂P-Q-R)。在作进一步的研制中排除了0.3％的m-甲酚，因为它增加产品的聚合，降低产品的稳定性(制剂I)。

2.7.1.2制剂研制

所有的稳定性数据(未加工的数据)收集在这个部分的表格中；用线性回归分析来评估数据。

2.7.1.2.1含有苯甲醇的制剂

高浓度的苯甲醇(0.9％)无论在氧化物形成还是在聚合物含量方面都有增多，降低产品的稳定性，其结果显示在图1到6：

·在压力条件下(40℃)，含有0.9％的苯甲醇制剂(MS-1和MS-2)，其氧化增加更高，如图1所示；

·在速成条件下(25℃)，含有苯甲醇的制剂对比不含苯甲醇的制剂(MS-3，参考)，其氧化增加更高，如图2所示；

·长期贮存条件下(2-8℃)，在含有0.9％的苯甲醇(MS-1和MS-2)中观察到更高的氧化率；也观察到含有少于0.45％的苯甲醇制成品有相当高的降解率(图3)。

对于聚合水平观察到以下几点：

·在压力条件下(40℃)，含有0.9％的苯甲醇制剂(MS-1和MS-2)，所观察到的聚合增多，如图4所示；在速成和长期条件下(25℃和2-8℃)，所有制剂中没有观察到聚合增加，如图5和6所示；

·在40℃下，含有0.9％的苯甲醇的制剂(MS-1和MS-2)中观察到生物活性降低；这一点在贮存于25℃和2-8℃的相同样品中没有发现。

·贮存在3种温度下的制剂的滴度没有减少。

·贮存在3种温度下的制剂pH值没有变化。

2.7.1.2.2含有可选择的抑菌剂的制剂(酚，丙酮氯仿，苯基乙醇)酚(MS-4和MS-5)在氧化物形成上降低产品的稳定性，然而丙酮氯仿(MS-35)和苯基乙醇(MS-34和MS-34b)与参照溶液(MS-3，无抑菌剂)相比却显示了稳定性，如图7和8所示：

对于总聚合物水平，观察到在压力条件下(40℃)含有酚的制剂(MS-4和MS-5)聚合显著增加，如图9所示；在较低的温度下(25℃和2-8℃)，聚合没有增加。

2.7.2.1.3含有EDTA的制剂

在含有0.1％至0.2％的苯甲醇中加入EDTA(MS-32，MS-33，MS-34)并不降低氧化水平(图10)；在速成条件下，含有0.1％的EDTA和0.2％的苯甲醇的制剂(MS-32，MS-33)观察到聚合水平增加(图11)；在2-8℃时观察到降解发生较多。

2.7.1.2.4防腐剂功效结果

筛选研究结果显示，苯甲醇浓度至少等于或高于0.3％(对白色念珠菌)满足EP或USP药典标准。

2.8候选制剂

用以下方法来评估所有数据：对每一批数据进行线性回归分析，再用协方差分析(P值＞0.25)评估批与批之间的差异；如在贮存中观察到没有差异则不用进行正式的统计分析。

2.8.1候选制剂A

2.8.1.1在生产过程中的恢复

生产候选制剂A的过程中收集的样品，在加工过程中(过滤之前或之后，最终产品)中所含的干扰素β-1a的恢复，总结于表XI：活性物质没有显著丢失。

表XI生产候选制剂A的过程中，干扰素β-1a的恢复百分比(％)

	RT-01	RT-02	RT-03
	RT-01	RT-02	RT-03	第一次过滤后第二次过滤后药筒中的最终产品	98.698.398.4	99.798.597.5	98.0103.8100.7

2.8.1.2活性药物的稳定性

在不同温度下贮存的三批制剂中的氧化物形成水平用通用斜率和截距计算；统计分析结果如表XII所示：

表XII：干扰素β-1a多剂量候选制剂A(氧化物形成)的统计分析结果

2-8℃		25℃		40℃
2-8℃		25℃		40℃		总斜率(％/周)	总截距(％)	总斜率(％/周)	总截距(％)	总斜率(％/周)	总截距(％)
0.063	2.73	0.322	2.67	2.206	2.51	总斜率(％/周)	总截距(％)	总斜率(％/周)	总截距(％)	总斜率(％/周)	总截距(％)

对总聚合物水平及其测定，没有观察到显著差异；因此不需要进行正式的统计分析。三批制成品的聚合物水平不同是因为在生产中所用的容积水平不同。

2.8.2候选制剂B

2.8.2.1在生产过程中的恢复

生产候选制剂B的过程中收集的样品，在加工过程中(过滤之前或之后，最终产品)中所含的干扰素β-1a的恢复，总结于表XV：活性物质没有显著丢失。

表XV生产候选制剂B的过程中，干扰素β-1a的恢复百分比(％)

	MS-01	MS-02	MS-03
	MS-01	MS-02	MS-03	第一次过滤后第二次过滤后药筒中的最终产品	100.7101.2100.6	116.5114.9112.0	97.3898.8295.76

2.8.2.2活性药物的稳定性

在氧化物形成水平上的统计分析结果如下所示：

·在40℃下贮存的三批制剂中的氧化物形成水平用常用的斜率和截距计算：总斜率等于1.42％/周，总截距等于2.72％；

·无法计算出三批制剂在25℃时通用斜率(P值＝0.095)；因此，即使最坏情况下(第MS-03批)：在一个月的贮存后，观察到有1.17％的氧化物形成增加(0.27％/周)；

·无法计算出三批制剂在2-8℃时通用斜率(P-值＝0.016)；因此，即使最坏情况下(第MS-03批)：在一个月的贮存后，观察到有0.2％的氧化物形成增加(0.047％/周)；

对总聚合物及其测定，从其稳定性数据中没有观察到显著差异，因此，不进行正式的统计学分析。

在贮存期间，即使在压力条件下(40℃)，生物活性也没有降低。

2.9总结

在研究的最后，两种候选多剂量制剂根据可比较的稳定性剖面图鉴别如下：

·候选制剂B是一种现成的含有0.2％的苯甲醇的多剂量制剂；

·候选制剂A是一种含有0.3％的苯甲醇的多剂量制剂，其混合两种药筒内含物(一种含有活性要素和赋形剂，另一种含有所需数量的苯甲醇，以达到最终浓度)。

·这些候选的溶液也在较高的pH值(4.5±0.2)的条件下检测，在已经显示的稳定性剖面图中没有显著变化。申请人现在发现这种pH值稍微高一些的IFN制剂增加了局部皮下注射的耐受性。因此以上两种候选溶液，其pH值为4.5或4.7，在病人的顺应性上有更多优点。

实施例3：多剂量-候选制剂A的生产方法

首先，将20g的氢氧化钠小球溶于500g的W.F.I中形成1N的氢氧化钠溶液。

然后将1.32g冰醋酸加到1,800g W.F.I中，得到0.011M pH值为3.5±0.2的醋酸钠溶液。用1N NaOH调节溶液的pH值至3.5±0.2。此溶液是最终重量2000g中的一部分。再用1N NaOH或50％稀释的醋酸来调节溶液的pH值至3.5±0.2。此溶液是最终重量2000g中的一部分。

最终溶液按以下方法制备：

称出计算所得的赋形剂的数量，溶于所需量的pH值为3.5±0.2的11mM醋酸钠缓冲液，检查并调节溶液的pH值(如果需要)；加入所需量的r-h Interferon-beta-1a(从CHO细胞重组生成)；最后加入11mMpH值为3.5±0.2的醋酸钠缓冲液达到最终重量。

在1mL的这种最终溶液中取样用定量的反相HPLC来检测(样品BF＝第一次过滤之前)。

然后用0.2μm的膜过滤最终溶液，此膜装在一不锈钢支架上，将溶液收集在一玻璃烧杯中。

在1mL的这种最终溶液中取样用定量的反相HPLC来检测。

用以上所述的方法经装在一不锈钢支架上第二张0.2μm的膜过滤最终溶液。

在1mL的这种最终溶液中取样用定量的反相HPLC来检测。

3mL玻璃药筒中装入2.7mL的最终溶液并用塞子塞住。

此溶液可以与在WFI中含有3％苯甲醇的药筒混合直接使用。

实施例4：多剂量-候选制剂B的生产方法

首先，将20g的氢氧化钠小球溶于500g的W.F.I中制备成1N的氢氧化钠溶液。

然后将1.32g冰醋酸加到1,800g W.F.I中，得到0.011M pH3.5±0.2的醋酸钠溶液。用1N NaOH调节溶液的pH值至3.5±0.2。此溶液是最终重量2000g中的一部分。再用1N NaOH或50％稀释的醋酸来调节溶液的pH值至3.5±0.2。此溶液是最终重量2000g中的一部分。

最终溶液按以下方法制备：

称出计算得到的赋形剂的数量，溶于所需量的10mM pH值为3.5±0.2的醋酸钠缓冲液，检查并调节溶液的pH值(如果需要)；加入所需量的r-h Interferon-beta-1a(从CHO细胞重组生成)；最后加入10mM pH值为3.5±0.2的醋酸钠缓冲液达到最终重量。

在1mL的这种最终溶液中取样用以定量的反相HPLC来检测。

用以上所述的方法经装在一不锈钢支架上的第二张0.2μm的膜过滤最终溶液。

在1mL的这种最终溶液中取样用以定量的反相HPLC来检测。

3mL玻璃药筒中装入3ml的最终溶液并用塞子塞住。

参考文献

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10.Shepard H.M.et al.，Nature 1981；294，563-565.

Claims

1.一种稳定化的不含人血清白蛋白的液体药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括一种干扰素(IFN)，其中所述的制剂是一种含有缓冲液、表面活性剂、等渗剂和抗氧化剂的溶液。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述干扰素是IFN-β。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述IFN-β是人重组体IFN-β。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲液的量足以维持所述的组合物的pH值在一特定的pH值的±0.5个单位内，其特定的pH值大约为3.0到5.0。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的pH是3.5±0.2。

6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的pH是4.5±0.2。

7.如权利要求4-6中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲液浓度大约为5mM到500mM。

8.如权利要求7中所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲液浓度大约是10mM。

9.如权利要求4-8中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲液是醋酸缓冲液。

10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的等渗剂是甘露醇。

11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的等渗剂浓度大约为0.5mg/ml到500mg/ml。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述的等渗剂浓度大约为55mg/ml。

13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂选自Pluronic^F77、Pluronic F87、Pluronic F88和Pluronic F68。

14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂是Pluronic F68。

15.如权利要求13或14所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂浓度大约为0.01mg/ml到10mg/ml。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂浓度是大约1mg/ml。

17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的抗氧化剂是蛋氨酸。

18.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的抗氧化剂浓度大约为0.01到5.0mg/ml。

19.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的抗氧化剂浓度是大约0.1mg/ml。

20.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的干扰素浓度是大约为10μg/ml到800μg/ml。

21.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的干扰素浓度大约为22，44，88或264μg/ml。

22.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的干扰素是一种水溶液。

23.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的组合物进一步包括一种抑菌剂。

24.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的抑菌剂是苯甲醇。

25.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的抑菌剂浓度大约为0.1％到2.0％。

26.如上述任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述的抑菌剂浓度是大约0.2％或0.3％。

27.一种如权利要求1-25所述的一种稳定化的不含人血清白蛋白的液体药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：将计算出的数量的表面活性剂、抗氧化剂和等渗剂加入到缓冲液溶液中，然后加入干扰素(IFN)。

28.一种如权利要求1-25中任何一项所述的在使用之前，无菌和适当的贮存条件下密封的容器，其特征在于，所述的容器包括液体药物制剂。

29..如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述的容器是一种预先注入的单剂量给药的注射器。

30.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述的容器是一种小瓶。

31.如权利要求27所述的容器，其特征在于，所述的容器是一种可以自动注射的药筒。

32.如权利要求29或30所述的容器，其特征在于，所述的容器可以单剂量给药或多剂量给药。

33.一种如权利要求22到25中任何一项所述的的药物组合物多剂量给药盒，其特征在于，所述的盒包括一根据权利要求1到21中任何一项所述的药物组合物的第一容器以及一个装有抑菌剂溶液的药筒。