KR20060011976A

KR20060011976A - 인간혈청알부민이 없는 안정화된 인터페론 액상 제제

Info

Publication number: KR20060011976A
Application number: KR1020057020444A
Authority: KR
Inventors: 파브리지오 사마리타니; 알레산드라 델 리오
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.에이.
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2006-02-06
Also published as: AU2004233603A1; PT1617861E; ZA200508124B; TWI272948B; TW200503754A; EP1617861A2; ES2417061T3; AU2009201261A1; JP2011225599A; BRPI0410488B8; JP4870550B2; NZ542912A; WO2004096263A2; CN1816347B; MY151121A; JP5346065B2; CN1816347A; HK1088847A1; UA94032C2; ME00404B

Abstract

본 발명은 안정화된 HSA가 없는 액상 약제학적 조성물에 관한 것으로, 인터페론(IFN)을 포함하며, 상기 제제는 완충제, 계면활성제, 등장화제 및 항산화제를 포함하는 용액이다. 바람직하게는 상기 인터페론은 인간 재조합 IFN-베타이다.

Description

인간혈청알부민이 없는 안정화된 인터페론 액상 제제{Human serum albumin-free stabilized interferon liquid formulations}

본 발명은 일반적으로 인터페론을 함유한 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 첨가된 약제학적 부형제로 인간 혈청 알부민이 없는 인터페론-베타의 안정화된 제제에 관한 것이다.

인터페론은 시토카인(cytokine), 즉 세포들 사이에서 메시지를 전달하며, 감염을 유발하는 미세유기물을 파괴하는 것을 돕고 발생하는 손상을 치유함으로써 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 가용성 단백질(soluble protein)이다. 인터페론은 감염된 세포들에 의해 자연적으로 분비되며 1957년에 처음으로 확인되었다. 그 이름은 인터페론이 바이러스 복제와 생성을 "방해"한다는 사실로부터 유래된 것이다.

인터페론은 항바이러스 및 항증식 활성도를 모두 나타낸다. 생화학적 및 면역학적 특성들을 기초로 하여, 자연적으로 발생하는 인간 인터페론은 새 개의 주된 클래스로 그룹화된다: 인터페론-알파(백혈구), 인터페론-베타(섬유아세포) 및 인터페론-감마(면역). 알파-인터페론은 현재 미국 및 다른 나라들에서 털세포백혈병(hairy cell leukemia), 성병사마귀(venereal wart), 카포시육종(Kaposi's Sarcoma)(대개 후천면역결핍증후군(AIDS) 환자를 괴롭히는 암), 및 만성 비-A, 비- B 간염의 치료를 위해 승인되고 있다.

또한, 인터페론(IFNs)은 바이러스 감염에 반응하여 인체에서 생성되는 당단백질(glycoprotein)이다. 인터페론은 보호된 세포들에서 바이러스의 증식을 억제한다. 저분자량의 단백질로 구성되는, 인터페론은 그 작용에 있어서 현저하게 비특이적이다. 즉 하나의 바이러스에 의해 유도된 IFN은 광범위한 다른 바이러스들에 대해서도 효과적이다. 하지만 인터페론은 종특이적(species-specific)이다. 즉, 하나의 종에 의해 생성된 IFN은 단지 동일하거나 밀접하게 관련된 종의 세포들에서 항바이러스 활성을 자극할 것이다. IFNs은 그 잠재적인 항종양 및 항바이러스 활성도를 위해 이용되는 시토카인의 제1 그룹이었다.

세 개의 주된 IFNs은 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ로 나타낸다. 상기 IFNs의 주요한 종류들은 처음에는 그들이 유래한 세포들에 따라 분류되었다(백혈구, 섬유아세포 또는 T 세포). 하지만, 몇몇 유형들이 하나의 세포에 의해 생성될 수 있다는 것이 분명해졌다. 따라서 백혈구 IFN은 현재 IFN-α로, 섬유아세포 IFN은 IFN-β로 그리고 T 세포 IFN은 IFN-γ로 불리워진다. 또한, IFN의 4번째 유형, "Namalwa" 세포주(버킷 임프종에서 유래된) "Namalwa" 세포주에서 생성되며, 백혈구 및 섬유아세포 IFN 모두의 혼합물을 생성하는 것으로 보이는, 림프블라스토이드(lymphoblastoid) IFN이 있다.

인터페론 유닛 또는 인터페론의 국제 유닛(국제 유닛의 경우, U 또는 IU)은 바이러스 손상에 대하여 세포들을 50% 보호하는데 필요한 양으로 정의된 IFN의 활성도의 측정으로서 보고되어 왔다. 생리활성도를 측정하는데 사용될 수 있는 검정 법(assay)은 (Rubinstein, et al. 1981; Familletti, P. C., et al., 1981)에 기재된 세포병변효과 억제 검정법(cytopathic effect inhibition assay)이다. 인터페론에 대한 이러한 항바이러스 검정법에서, 약 1unit/ml의 인터페론이 50%의 세포병변효과를 나타내는데 필요한 양이다. 상기 유닛들은 미국국립보건원(National Institutes of Health)(Pestka, S. 1986)에 의해 제공된 Hu-IFN-베타에 대한 국제 참조 표준(international reference standard)에 대해 측정된다.

IFN의 모든 클래스는 몇몇 별개의 유형들을 포함한다. IFN-β 및 IFN-γ는 각각 단일 유전자 생성물이다.

IFNs-α로 분류되는 단백질들은 약 15개 유형들을 포함하는, 가장 다양한 그룹이다. 적어도 23개의 멤버들을 포함하는, 그 중 15개는 활성이고 전사되는, 염색체 9상의 IFN-α 유전자들의 클러스터(cluster)가 있다. 성숙 IFNs-α는 당화되지 않는다.

IFNs-α 및 IFN-β는 유사한 생물학적 활성도를 갖는 모두 동일한 길이(165 또는 166 아미노산)이다. IFNs-γ는 길이가 146 아미노산이며, 상기 α 및 β 클래스들과는 덜 닮았다. 단지 IFNs-γ는 대식세포(macrophage)들을 활성화시키거나 세포독성 T 세포(killer T cell)들을 유도할 수 있다. 이러한 새로운 유형의 치료제들이 종종 생물학적 반응 조절체(biologic response modifiers: BRMs)일 수 있는데, 이는 그들이 면역조절을 통한 인지(recognition)에 영향을 미치는, 종양에 대한 유기체의 반응에 효과적이기 때문이다.

인간 섬유아세포 인터페론(IFN-β)은 항바이러스 활성도를 가지며 또한 종양 세포들에 대한 자연세포독성세포(natural killer cell)들을 자극할 수 있다. 그것은 바이러스 및 이중 나선 RNA에 의해 유도된 약 20,000 Da의 폴리펩티드이다. 섬유아세포 인터페론에 대한 유전자의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)로부터, 재조합 DNA 기술(Derynk et al. 1980)에 의해 클론되며, 상기 단백질의 완전한 아미노산 서열이 유추된다. 그것은 166 아미노산 길이이다.

세퍼드(Shepard) 등(1981)은 그것의 항바이러스 활성도를 없앤 염기 842에서의 변이(141 위치에서 Cys→Tyr), 및 뉴클레오티드 1119-1121의 결손에 의한 변이 클론(variant clone)을 기재하였다.

마크(Mark) 등(1984)은 염기 469(T)를 위치 17에서 Cys → Ser로 아미노산 전환(amino acid switch)을 유발하는 (A)로 교체함으로써 인위적 돌연변이를 삽입하였다. 생성되는 IFN-β는 '선천(native)' IFN-β와 같은 활성을 가지며 장기 보관(-70℃) 동안에 안정한 것으로 보고되었다.

다발경화증(multiple sclerosis)(MS)에 대한 인터페론 치료에 있어서 가장 최근에 개발된, 레비프(Rebif)^®(Serono-재조합 인간 인터페론-β)는 포유류 세포주(cell line)로부터 생성되는, 인터페론(IFN)-베타-1a이다. 그것의 권장된 국제적으로 통용되는 일반명(International Non-proprietary Name: INN)은 "인터페론-베타-1a"이다.

모든 단백질계 약물들처럼, 치료제로서 IFN-베타의 이용에 있어서 극복되어야만 하는 하나의 주요한 장애는 약제학적 제제에서 그것의 불안정성으로부터 발생 할 수 있는 약제학적 효용의 손실이다.

약제학적 제제들에서 폴리펩티드 활성도 및 효능을 위협하는 물리적 불안정성은 가용성 및 비가용성 응집체(aggregate)의 변성 및 생성을 포함하며, 한편 화학적 불안정성은 가수분해(hydrolysis), 이미드 형성(imide formation), 산화, 라세미화반응(racemization), 및 탈아르니드화반응(dearnidation)을 포함한다. 이러한 변화들 일부는 중요한 단백질의 약제학적 활성도의 손실 또는 감소를 일으키는 것으로 알려져 있다. 다른 경우에, 이러한 변화들의 정확한 효과들은 알려져 있지 않지만, 발생하는 분해 생성물들은 여전히 원하지 않는 부작용에 대한 잠재성 때문에 약제학적으로 허용가능하지 않은 것으로 간주된다.

약제학적 조성물에서 폴리펩티드의 안정화는 여전히 시행착오가 중요한 역할을 하는 영역이다(Wang(1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Wang and Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26에서 검토됨). 폴리펩티드 약제학적 제제들의 안정성을 증가시키기 위해 이들에 첨가되는 부형제는 완충제, 설탕, 계면활성제, 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리머를 포함하지만 이러한 화학 첨가제의 안정화 효과는 단백질에 따라 달라진다.

현행 IFN-베타 제제들은 IFN-베타에 대한 용해성 증강제로서 HSA를 사용하고 있다. 하지만, HAS의 사용은 일부 단점이 있다. HSA는 인간 혈액의 생성물이며 따라서 인간 대상으로부터 수집되어야만 한다. 위험을 줄이는 단계들이 취해지더라도, HSA와 같은 인간 혈액 생성물의 이용은 HIV 및 HCV 같은 인간 바이러스의 잠재적인 도입을 가져온다.

따라서, 응집체 형성에 대하여 단백질을 안정화시키고, 단백질의 용해성을 향상시키는 생리학적으로 적합한 안정화제를 포함하는 추가적인 IFN-베타의 약제학적 조성물이 필요하다.

본 발명은 인터페론(IFN)을 포함하는 안정화된 약제학적 조성물들 및 그 제조방법에 관한 것이다. 이러한 조성물들은 인간혈청알부민(human serum albumin: HSA) 없이 제조되므로, 이러한 약제학적 부형제가 존재하지 않게 된다. 그러한 조성물들은 "HSA가 없는(HSA-free)" 인터페론 약제학적 조성물들로 나타내며, 그들은 인터페론(IFN) 또는 그것의 이성형태(isoform), 뮤테인(mutein), 융합 단백질(fused protein), 기능 유도체(functional derivative), 활성 분획물(active fraction) 또는 염을 포함하며, 상기 조성물은 완충제, 계면활성제, 등장화제(isotonicity agent) 및 항산화제를 포함하는 용액이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 조성물들은 또한 정균제(bacteriostatic agent)를 포함한다.

여기서 사용되는 바와 같이, "인터페론" 또는 "IFN"은 예를 들면 상기 배경기술 부분에서 언급된 IFNs의 임의의 유형을 포함하는, 문헌에서 정의된 임의의 분자를 포함하는 것이다. 특히, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ는 상기 정의에 포함된다. IFN-β가 본 발명에 따른 바람직한 IFN이다. 본 발명에 따른 적당한 IFN-β는 예를 들면 레비프(Rebif)^®(Serono), 아보넥스(Avonex)^®(Biogen) 또는 베타페론(Betaferon)^®(Schering)과 같이 상업적으로 입수가능하다. 인간 기원의 인터페론의 이용이 본 발명에 따라 또한 바람직하다. 여기서 사용되는, 상기 용어 인터페론은 그것의 이성형태, 뮤테인, 융합 단백질, 기능 유도체, 활성 분획물 또는 염을 포함하는 것이다.

상기 용어 "인터페론-베타(IFN-beta 또는 IFN-β)"는 여기서 사용되는 바와 같이, 생물학적 유체(biological fluid)로부터 분리되어 얻어지거나 원핵 또는 진핵 숙주 세포들로부터 DNA 재조합 기술들을 이용하여 얻어지는, 특히 인간 기원의 섬유아세포 인터페론뿐만 아니라, 그것의 염, 기능 유도체, 변형체, 유사체 및 활성 단편(active fragment)을 포함하는 것이다. 바람직하게는 IFN-베타는 인터페론 베타-1a를 의미하는 것이다.

여기서 사용되는 상기 용어 "뮤테인(mutein)"은 IFN의 유사체(analog)들을 나타내며, 상기 IFN의 유사체들에서 천연 IFN의 하나 이상의 아미노산 잔기들이 다른 아미노산 잔기들에 의해 대체되거나, 또는 삭제되거나, 또는 와일드형 IFN과 비교하여 발생하는 생성물들의 활성을 상당히 변화시키지 않으면서 하나 이상의 아미노산 잔기들이 IFN의 천연 서열에 추가되어 있다. 이러한 뮤테인은 공지된 합성법 및/또는 부위특이적 돌연변이유발 기술들(site-directed mutagenesis techniques), 또는 이를 위한 안정한 임의의 다른 공지 기술들에 의해 제조된다. 바람직한 뮤테인은 예를 들면 세퍼드 등(1981) 또는 마크 등(1984)에 의해 기재된 뮤테인을 포함한다.

임의의 그러한 뮤테인은 바람직하게는 IFN과 실질적으로 유사하거나 심지어 더 나은 활성도를 갖는, IFN의 그것과 충분히 중복되는 아미노산들의 서열을 갖는다. 인터페론의 생물학적 기능은 당해 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 생물학적 표준들이 확립되어 있으며, 예를 들면 영국의 국립생물제제표준화연구소(National Institute for Biological Standard and Control)(http://immunology.org/links/NIBSC)로부터 이용가능하다.

IFN 활성도의 측정을 위한 생물학적검정법들이 기재되어 있다. IFN 검정법은 예를 들면 루빈스타인(Rubinstein) 등, 1981에 의해 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 따라서, 관행적으로 행해지는 실험에 의해 임의의 소정 뮤테인이 실질적으로 IFN과 유사하거나, 또는 심지어 더 나은 활성도를 갖는지를 결정할 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는, IFN의 뮤테인들, 또는 그것에 대한 핵산 코딩(nucleic acid coding)은 여기서 제시된 교시들 및 안내에 근거하여, 부당한 실험 없이, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 얻어질 수 있는 치환 펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들과 실질적으로 동일한 서열의 유한 세트를 포함한다.

본 발명에 따른 뮤테인들에 대한 바람직한 변화들은 "보존적(conservative)" 치환들로 알려진 것이다. 본 발명의 폴리펩티들 또는 단백질들의 보존적 아미노산 치환들은 그룹 내에서 동의 아미노산(synonymous amino acid)들을 포함할 수 있으며, 상기 그룹의 멤버들 간의 치환이 분자의 생물학적 기능을 보존할 충분히 유사한 물리화학적 성질들을 갖는다. 아미노산들의 삽입 및 결손은 그들의 기능을 변화시키지 않으면서, 특히 삽입 또는 결손이 단지 소수의 아미노산들, 예컨대 30개 이하, 바람직하게는 10개 이하에서 일어나고 기능적 형태에 중요한 아미노산들, 예컨대 시스테인 잔기들을 제거하거나 대체하지 않는다면, 상기 정의된 서열들 안에서 또한 이루어질 수 있다. 상기 결손 및/또는 삽입에 의해 생성된 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위 내에 있다.

바람직하게는, 상기 동의 아미노산 그룹들은 표 I에 정의되어 있는 그룹들이다. 더욱 바람직하게는, 상기 동의 아미노산 그룹들은 표 II에 정의되어 있는 그룹들이며; 가장 바람직하게는 상기 동의 아미노산 그룹들은 표 III에 정의되어 있는 그룹들이다.

표 I

동의 아미노산들의 바람직한 그룹들

아미노산 동의 그룹(synonymous group)

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

표 II

동의 아미노산들의 보다 바람직한 그룹들

아미노산 동의 그룹

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu Leu, Ile, Phe, Met

Pro Ala, Pro

Thr Thr

Ala Pro, Ala

Val Val, Met, Ile

Gly Gly

Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr Phe, Tyr

Cys Cys, Ser

His His, Gln, Arg

Gln Glu, Gln, His

Asn Asp, Asn

Lys Lys, Arg

Asp Asp, Asn

Glu Glu, Gln

Met Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp Trp

표 III

동의 아미노산들의 가장 바람직한 그룹들

아미노산 동의 그룹

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Phe

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile, Met, Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys, Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met, Ile, Leu

Trp Met

본 발명에 사용하기 위한, IFN의 뮤테인들을 얻기 위해 사용될 수 있는 단백질들에서 아미노산 치환 생성물의 실시예들은 마크 등에게 허여된 미국특허 제4,959,314호, 제4,588,585호 및 제 4,737,462호; 코스(Koths) 등에게 허여된 미국특허 제5,116,943호, 나멘(Namen) 등에게 허여된 미국특허 제4,965,195호; 총(Chong) 등에게 허여된 미국특허 제4,879,111호; 및 리(Lee) 등에게 허여된 미국특허 제5,017,691호에 제시된, 임의의 공지된 방법 단계들; 및 미국특허 제4,904,584호(셔(Shaw) 등)에 제시된 라이신(lysine) 치환된 단백질들을 포함한다. IFN-베타의 특이 뮤테인들이 예를 들면 마크 등, 1984에 의해 기재되어 있다.

상기 용어 "융합 단백질(fused protein)"은 IFN을 포함하는 폴리펩티드, 또는 다른 단백질에 융합된, 그것의 뮤테인을 나타내며, 예컨대 체액(body fluid)에서 연장된 체류 시간을 갖는다. 따라서 IFN은 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 그 유사물, 예컨대, 그것의 단편 또는 면역글로블린에 융합될 수 있다.

여기서 사용된 "기능적 유도체(functional derivative)들"은 IFN의 유도체들, 및 그 뮤테인들 및 융합 단백질들을 포함하며, 당해 기술분야에서 공지된 수단에 의해, N- 또는 C-말단기들 또는 잔기들 상의 측쇄(side chain)들로서 발생하는 작용기(functional group)들로부터 제조될 수 있으며, 그들이 약제학적으로 허용가능한 한, 즉, 그들이 IFN의 활성도와 실질적으로 유사한 단백질의 활성도를 파괴하지 않으며 그것을 함유한 조성물들 상에서 유해 특성들을 주지 않는 한, 본 발명에 포함된다. 이러한 유도체들은, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 측쇄들을 포함할 수 있으며, 항원 부위(antigenic site)들을 마스크하고 체액에서 IFN의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체들은 카르복실기들의 지방족 에스테르(aliphatic ester), 암모니아와의 반응 또는 1차 또는 2차 아민들과의 반응에 의한 카르복실기들의 아마이드, 아실 모이어티로 형성된 아미노산 잔기들의 유리 아미노기들의 N-아실 유도체들, 또는 아실 모이어티로 형성된 (예컨대 세릴 또는 트레오닐 잔기들의) 유리 하이드록실기들의 O-아실 유도체들을 포함한다.

IFN의 "활성 분획물(active fraction)들", 또는 뮤테인들 및 융합 단백질들과 같이, 본 발명은 상기 분획물이 상응하는 IFN과 비교하여 상당히 감소된 활성도를 갖지 않는 경우에, 단백질 분자 단독의 또는 그것에 결합된 잔기들 또는 관련 분자들, 예컨대 설탕 또는 인산염 잔기들, 또는 상기 단백질 분자의 응집체들 또는 그 자신에 의한 설탕 잔기들과 함께 그것의 폴리펩티드 사슬의 임의의 단편(fragment)들 또는 전구체(precursor)들을 포함한다.

상기 용어 "염(salt)"은 상술한 단백질들 또는 그것의 유사체들의 카르복실기의 염 및 아미노기들의 산부가염 모두를 나타낸다. 카르복실기의 염은 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의해 형성될 수 있으며, 무기염, 예를 들면 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염, 및 그 유사물, 및 예를 들면 트리에탄올아민과 같은 아민, 아르기닌(arginine) 또는 라이신, 피페리딘, 프로카인(procaine) 및 그 유사물로 형성되는, 유기 염기에 의한 염을 포함한다. 산부가염은 예를 들면 염산 또는 황산과 같은 무기산 염, 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산 염을 포함한다. 물론, 어떤 이런 염도 본 발명에 관련된 단백질(IFN)의 생물학적 활성도, 즉 대응하는 수용체에 결합하고 수용체 신호전달(receptor signaling)을 개시하는 능력을 유지하여야 한다.

본 발명에 따라서, 재조합 인간 IFN-베타 및 본 발명의 화합물들의 이용이 특히 바람직하다.

특별한 종류의 인터페론 변형체가 최근에 기재되고 있다. 소위 "일치 인터페론(consensus interferon)"은 IFN의 비자연 발생 변형체이다(US 6,013,253). 본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 본 발명의 화합물들은 일치 인터페론과 함께 사용된다.

여기서 사용되는 바와 같이, 인간 인터페론 일치(IFN-con)는 비자연 발생 폴리펩티드를 의미하는 것이며, 대다수의 자연 발생 인간 백혈구 인터페론 아형 서열들의 IFN-알파의 표본의 서브셋(subset)에 공통인 아미노산 잔기들을 주로 포함하며, 모든 아형(subtype)들에 공통인 아미노산이 없는 하나 이상의 위치들에서, 상기 위치에서 주로 발생하는 아미노산을 포함하며, 결코 적어도 하나의 자연 발생 아형의 상기 위치에서 존재하는 않는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. IFN-con은 미국특허 제4,695,623호, 제4,897,471호 및 제5,541,293호에 개시되어 있는 아미노산 서열들이 지정된 IFN-con1, IFN-con2 및 IFN-con3을 포함하지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. DNA 서열들 부호화 IFN-con은 상기 전술한 특허들에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 또는 다른 표준 방법들에 의해 제조될 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 Ig 융합을 포함한다. 상기 융합은 직접적으로, 또는 1 내지 3 아미노산 잔기들 만큼 짧은 길이로 이루어지거나 보다 긴 예를 들면 13 아미노산 잔기들 길이로 이루어질 수 있는 짧은 링커 펩티드(short linker peptide)를 통하여 이루어질 수 있다. 상기 링커는 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met)의 트리펩티드, 예컨대, 또는 IFN의 서열 및 면역글로블린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met를 포함하는 13 아미노산 링커 서열일 수 있다. 생성되는 융합 단백질은 체액에서 연장된 잔류 시간(반감기), 증가된 특이 활성도, 증가된 발현 레벨과 같은 개선된 특성들을 가질 수 있으며, 또는 상기 융합 단백질의 정제가 촉진된다.

다른 바람직한 구체예에서, IFN은 Ig 분자의 일정 부위에 융합된다. 바람직하게는, 예를 들면 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 영역들과 같은, 중쇄 부위(heavy chain region)들에 융합된다. Ig 분자들의 다른 이소형태들은 또한 이소형태들 IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄, 또는 예를 들면 IgM 또는 IgA 같은, 다른 Ig 클래스들처럼, 본 발명에 따른 융합 단백질들의 발생에 적합하다. 융합 단백질들은 모노메릭(monomeric) 또는 멀티메릭(multimeric), 헤테로- 또는 호모멀티메릭(homomultimeric)일 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 기능적 유도체는 하나 이상의 작용기들에 부착된 적어도 하나의 모이어티(moiety)를 포함하며, 상기 모이어티는 아미노산 잔기들 상에서 하나 이상의 측쇄들로 생성된다. 바람직하게는, 상기 모이어티는 폴리에틸렌(PEG) 모이어티이다. PEG를 이용한 접합(PEGylation)은 예를 들면 국제공개공보 제WO99/5377호에 기재된 방법들과 같은, 공지된 방법들에 의해 수행될 수 있다.

개인에게 싱글 도즈(single dose) 또는 멀티플 도즈(multiple dose)로, 투여된 투여량은 약동학적 성질들, 투여 경로, 환자의 상태 및 특성들(성, 나이, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 수반하는 치료, 치료의 빈도 및 원하는 효과를 포함하는 여러 인자들에 따라서 달라질 것이다.

인간 IFN-베타의 표준 투여량은 매일 80,000IU/kg 내지 200,000IU/kg 범위 내 또는 매일 인(person)당 6 MIU(million international units) 내지 12 MIU 범위 내 또는 인당 22 내지 44㎍(micorgram) 범위 내이다. 본 발명에 따르면, IFN은 바람직하게는 매일 인당 약 1 내지 50㎍, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 30㎍ 또는 약 10 내지 20㎍ 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 활성 성분들의 투여는 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의해 이루어질 수 있다. IFN의 바람직한 투여 경로는 피하 경로이다.

IFN은 또한 매일 또는 하루 걸러서, 보다 적은 빈도로 투여될 수 있다. 바람직하게는, IFN은 일주일에 한 번, 두 번 또는 세 번 투여된다.

바람직한 투여 경로는 예를 들면 일주일에 세 번 투여되는, 피하 투여이다. 더욱 바람직한 투여 경로는 예를 들면, 일주일에 한번 투여될 수 있는, 근육내 투여이다.

바람직하게는, 22 내지 44㎍ 또는 6 MIU 내지 12 MIU의 IFN-베타가 피하 주사로 일주일에 세 번 투여된다.

IFN-베타는 하루걸러, 25 내지 30㎍ 또는 8 MIU 내지 9.6 MIU의 투여량으로, 피하 투여될 수 있다. 30㎍ 또는 6 MIU IFN-베타가 일주일에 한번 근육내 투여될 수도 있다.

상기 용어 "안정성(stability)"은 (생물학적 효능의 유지를 포함하는) 본 발명의 인터페론의 제제들의 물리적, 화학적 및 입체형태적 안정성을 나타낸다. 단백질 제제의 불안정성은 고차 폴리머(higher order polymer)를 형성하는 단백질 분자들의 화학적 분해나 응집, 탈당화(deglycosylation), 당화의 변경, 산화 또는 본 발명에 포함되는 인터페론 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성도를 감소시키는 임의의 다른 구조적 변경에 의해 유발될 수 있다.

"안정한" 용액 또는 제제는 그 안에서 단백질들의 분해, 변경, 응집, 생물학적 활성도의 감소 및 그와 유사한 것의 정도가 허용가능하게 제어되고, 시간이 흐름에 따라 허용되지 않게 증가하지는 않는다. 바람직하게는 상기 제제는 12 내지 24개월의 기간에 걸쳐 표지 인터페론 활성도의 적어도 60%나 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%나 약 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%나 약 80%를 유지한다. 본 발명의 안정화된 HSA가 없는 IFN 조성물들은 2-8℃에서 보관되는 경우 바람직하게는 적어도 약 6개월, 12개월, 18개월, 더욱 바람직하게는 적어도 20개월, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 22개월, 가장 바람직하게는 약 24개월의 저장기간을 갖는다.

본 발명의 HAS가 없는 IFN 약제학적 조성물들의 안정성을 모티터링하기 위한 방법들이 당해 기술분야에서 이용가능하며 여기에 개시된 실시예들에 기재된 방법들을 포함된다. 따라서, 본 발명의 액상 약제학적 조성물의 저장 동안에 IFN 응집체 형성은 시간의 흐름에 따라 용액에서 가용성 IFN의 변화를 측정함으로써 쉽게 측정될 수 있다. 용액내 가용성 폴리펩티드의 양은 IFN의 검출에 적합한 많은 분석 검정법들에 의해 정량화될 수 있다. 그러한 검정법들은 예를 들면 이하의 실시예들에 기재된, 역상(reverse phase: RP)-HPLC 및 UV 흡수 분광법을 포함한다.

액상 제제로 저장되는 동안에 가용성 및 비가용성 응집체들 모두의 검출은 예를 들면, 가용성 응집체들로 존재하는 가용성 폴리펩티드의 부분 및 비응집체, 생물학적 활성 분자 형태로 존재하는 부분 간을 구별하기 위해 이하의 실시예들에 언급된 분석 초원심분리(analytical ultracentrifugation)를 이용하여, 이루어질 수 있다.

상기 표현 "멀티-도즈 이용(multi-dose use)"은 1회 이상의 주사, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 주사를 위한 인터페론 제제의 단일 바이알, 앰플 또는 카트리지의 이용을 포함하는 것이다. 상기 주사는 적어도 약 12시간 또는 약 12시간, 24시간, 48시간, 등의 시간에 걸쳐, 바람직하게는 12일 또는 약 12일까지 행하여 진다. 상기 주사는 시간 간격을 두고, 예컨대, 6, 12, 24, 48 또는 72시간 주기마다 수행될 수 있다.

상기 용어 "완충제(buffer)" 또는 "생리학적으로 허용가능한 완충제(physiologically-acceptable buffer)"는 제제에서 약제학적 또는 수의학적 사용에 대해 안정한 것으로 알려져 있으며 제제에 바람직한 pH 범위로 제제의 pH를 유지 또는 조절하는 효과를 갖는 조성물들의 용액을 나타낸다. 약산성 pH 내지 약염기 pH로 pH를 조절하기 위한 허용가능한 완충제는 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 아르기닌, 트리스(TRIS), 및 히스티딘과 같은 화합물들을 포함하지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. "트리스(TRIS)"는 2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올, 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 임의의 염을 나타낸다. 바람직한 완충제는 식염수 또는 허용가능한 염을 포함하는 아세트산염 완충제이다.

"등장화제(isotonicity agent)"는 생리학적 내성이 있으며 제제와 접촉하는 세포막들을 가로지르는 물의 알짜 흐름을 방해하기 위하여 제제에 적당한 긴장성(tonicity)을 부여하는 화합물이다. 글리세린과 같은 화합물들이 알려진 농도로 상기 목적을 위해 일반적으로 사용된다. 다른 적당한 등장화제는 아미노산 또는 단백질(예를 들면 글리세린 또는 알부민), 염(예컨대 염화나트륨), 및 설탕(예를 들면 포도당, 만니톨, 자당 및 유당)을 포함하지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 등장화제는 만니톨(mannitol)이다.

상기 용어 "항산화제(antioxidant)"는 산소 또는 산소 유래 자유 라디칼들이 다른 물질들과 상호작용하는 것을 방지하는 화합물이다. 항산화제는 물리적 및 화학적 안정성을 강화하기 위해서 약제학적 시스템에 일반적으로 첨가되는 다수의 부형제 중의 하나이다. 항산화제는 자유 라디칼들의 존재 하에 또는 산소에 노출되었을 때 일부 약물이나 부형제에서 발생하는 산화 과정을 줄이거나 방해하기 위해 첨가된다. 이러한 과정은 종종 빛, 온도, 수소 농도, 금속이나 과산화물의 존재에 의해 촉진될 수 있다. 아황산염(sulfite), 중아황산염(bisulfite), 티오요소(thiourea), 메티오닌(methionine), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 염, 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene: BHT), 및 부틸화 하이드록시 아니솔(butylated hydroxy anisole: BHA)이 약물의 항산화제로 종종 사용된다. 소듐 EDTA는 산화 반응을 촉진하였을 금속 이온들과 킬레이트 화합물을 형성함으로써 항산화제의 활성도를 증강시키는 것으로 알려져 있다. 가장 바람직한 항산화제는 메티오닌이다.

상기 용어 "정균제"는 항박테리아제로 작용하도록 제제에 첨가되는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 본 발명의 보존 인터페론-함유 제제는 바람직하게는 상업적으로 이용가능한 다용도 생성물이 되기 위하여 보존 효능에 대한 법정 또는 규정 지침을 만족한다. 정균제로는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 그 유사물), 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride), 염화벤제토늄(benzethonium chloride), 소듐 디하이드로아세테이트(sodium dehydroacetate) 및 티메로살(thimerosal)을 포함한다. 바람직하게는 정균제는 벤질 알코올이다.

상기 용어 "계면활성제"는 액체의 표면장력을 감소시키거나, 또는 두 액체들간이나 액체와 고체간 계면장력을 감소시키는 가용성 화합물을 나타내며, 상기 표면장력은 액체의 표면에 작용하는 힘으로, 표면적을 최소화시킨다. 계면활성제는 때때로 표적 조직에 대한 약물의 전달 또는 약물의 흡수를 변경하기 위해서, 저분자 물질 약물 및 폴리펩티드의 전달을 포함하는, 약제학적 제제에 사용되어 왔다. 잘 알려진 계면활성제는 플루로닉(Pluronic) 뿐만 아니라, 폴리소르베이트(polysorbate)(폴리옥시에틸렌 유도체; Tween)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 플루로닉(Pluronic)® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉® F68에서 선택된 계면활성제, 특히 바람직하게는 플루로닉 F68(BASF, 플루로닉 F68은 폴록사머(Poloxamer) 188로도 알려져 있다)과 함께 인터페론을 제제화함으로써, 바이알 및/또는 전달장치(예컨대 주사기, 펌프, 카테터 등)의 표면에서의 흡수에 의해 발생하는 흡수율의 손실을 최소화하는 안정한 제제를 얻는다는 것을 발견하였다. 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉® F68로부터 선택된 계면활성제, 특히 바람직하게는 플루로닉F68(BASF, 플루로닉 F68은 또한 폴록사머 188로도 알려져 있다)과 함께 인터페론을 제제화함으로써, 안정한 제제를 얻으며, 보다 큰 내산화성 및 단백질 응집체 형성에 대한 내성을 갖는다.

플루로닉 계면활성제는 에틸렌옥사이드(EO) 및 프로필렌옥사이드(PO)의 블록 공중합체(block copolymer)이다. 상기 프로필렌옥사이드 블록(PO)은 두 개의 에틸렌옥사이드(EO) 블록들 사이에 끼워져 있다.

플루로닉 계면활성제는 두 단계 공정으로 합성된다:

1. 원하는 분자량의 소수기(hydrophobe)는 프로필렌글리콜의 두 개의 수산화기들에 프로필렌옥사이드를 조절하여 첨가함으로써 형성된다;

2. 친수성기들 사이에 상기 소수기가 삽입되도록 에틸렌옥사이드가 첨가된다.

플루로닉® F77에서, 폴리옥시에틸렌(친수기)의 백분율은 70%이고, 소수기(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 대략 2,306 Da이다.

플루로닉 F87에서, 폴리옥시에틸렌(친수기)의 백분율은 70%이고, 소수기(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 대략 2,644 Da이다.

플루로닉 F88에서, 폴리옥시에틸렌(친수기)의 백분율은 80%이고, 소수기(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 대략 2,644 Da이다.

플루로닉 F68에서, 폴리옥시에틸렌(친수기)의 백분율은 80%이고, 소수기(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 대략 1,967 Da이다.

플루로닉 F77의 일반적인 특성은 다음과 같다:

평균 분자량: 6600;

녹는점/유동점: 48℃;

20℃에서 물리적 형태: 고체;

점도(브룩필드) cps: 480[25℃에서 액체, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];

표면장력, 25℃에서 dynes/cm;

0.1% Conc.: 47.0

0.01% Conc.: 49.3

0.001% Conc.: 52.8

계면장력, 누졸(Nujol)에 대한 25℃에서 dynes/cm

0.1% Conc.: 17.7

0.01% Conc.: 20.8

0.001% Conc.: 25.5

드레이브즈 습윤(Draves Wetting), 25℃에서 초(second)

1.0% Conc.: >360

0.1% Conc.: >360

폼 높이(Foam Height)

로스 마일스(Ross Miles), 0.1%, 50℃에서 mm: 100

로스 마일스, 0.1%, 26℃에서 mm: 47

동적, 0.1%, 400ml/min에서 mm: > 600

수용액에서 운점(cloud point), ℃

1% Conc.: >100

10% Conc.: >100

HLB(hydrophile-lipophile balance: 친수성 친유성비): 25

플루로닉 F87의 일반적인 특성은 하기와 같다:

평균분자량: 7700;

녹는점/유동점: 49℃;

20℃에서 물리적 형태: 고체;

점도(브룩필드) cps: 700[25℃에서 액체, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];

표면장력, 25℃에서 dynes/cm;

0.1% Conc.: 44.0

0.01% Conc.: 47.0

0.001% Conc.: 50.2

계면장력, 누졸(Nujol)에 대한 25℃에서 dynes/cm

0.1% Conc.: 17.4

0.01% Conc.: 20.3

0.001% Conc.: 23.3

드레이브즈 습윤(Draves Wetting), 25℃에서 초(second)

1.0% Conc.: >360

0.1% Conc.: >360

폼 높이(Foam Height)

로스 마일스(Ross Miles), 0.1%, 50℃에서 mm: 80

로스 마일스, 0.1%, 26℃에서 mm: 37

동적, 0.1%, 400ml/min에서 mm: > 600

수용액에서 운점(cloud point), ℃

1% Conc.: >100

10% Conc.: >100

HLB(hydrophile-lipophile balance: 친수성 친유성비): 24

플루로닉 F88의 일반적인 특성은 하기와 같다:

평균분자량: 11400;

녹는점/유동점: 54℃;

20℃에서 물리적 형태: 고체;

점도(브룩필드) cps: 2300[25℃에서 액체, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];

표면장력, 25℃에서 dynes/cm;

0.1% Conc.: 48.5

0.01% Conc.: 52.6

0.001% Conc.: 55.7

계면장력, 누졸(Nujol)에 대한 25℃에서 dynes/cm

0.1% Conc.: 20.5

0.01% Conc.: 23.3

0.001% Conc.: 27.0

드레이브즈 습윤(Draves Wetting), 25℃에서 초(second)

1.0% Conc.: >360

0.1% Conc.: >360

폼 높이(Foam Height)

로스 마일스(Ross Miles), 0.1%, 50℃에서 mm: 80

로스 마일스, 0.1%, 26℃에서 mm: 37

동적, 0.1%, 400ml/min에서 mm: > 600

수용액에서 운점(cloud point), ℃

1% Conc.: >100

10% Conc.: >100

HLB(hydrophile-lipophile balance: 친수성 친유성비): 28

플루로닉 F68의 일반적인 특성은 다음과 같다:

평균분자량: 8400;

녹는점/유동점: 52℃;

20℃에서 물리적 형태: 고체;

점도(브룩필드) cps: 1000[25℃에서 액체, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];

표면장력, 25℃에서 dynes/cm;

0.1% Conc.: 50.3

0.01% Conc.: 51.2

0.001% Conc.: 53.6

계면장력, 누졸(Nujol)에 대한 25℃에서 dynes/cm

0.1% Conc.: 19.8

0.01% Conc.: 24.0

0.001% Conc.: 26.0

드레이브즈 습윤(Draves Wetting), 25℃에서 초(second)

1.0% Conc.: >360

0.1% Conc.: >360

폼 높이(Foam Height)

로스 마일스(Ross Miles), 0.1%, 50℃에서 mm: 35

로스 마일스, 0.1%, 26℃에서 mm: 40

동적, 0.1%, 400ml/min에서 mm: > 600

수용액에서 운점(cloud point), ℃

1% Conc.: >100

10% Conc.: >100

HLB(hydrophile-lipophile balance: 친수성 친유성비): 29

상기 나열된 폴리머들과 유사한 특성을 갖는 다른 폴리머들이 또한 본 발명의 제제에 사용될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 플루로닉 F68, 및 유사한 특성을 갖는 계면활성제들이다.

플루로닉, 특히 바람직하게는 플루로닉 F68은 원하는 저장 기간(예를 들면 12 내지 24개월) 동안에 인터페론 안정성을 유지하기 충분한 농도, 및 또한 바이알, 앰플 또는 카테터 또는 주사기와 같은, 표면상에서 흡수로 인한 단백질 손실을 방지하기에 충분한 농도로 존재하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 액상 제제에서 플루로닉, 특히 플루로닉 F68의 농도는 0.01mg/ml 또는 약 0.01mg/ml 내지 10mg/ml 또는 약 10mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.05mg/ml 또는 약 0.05mg/ml 내지 5mg/ml 또는 약 5mg/ml, 더욱 특히 바람직하게는 0.1mg/ml 또는 약 0.1mg/ml 내지 2mg/ml 또는 약 2mg/ml, 가장 바람직하게는 1mg/ml 또는 약 1mg/ml이다.

바람직하게는 상기 제제에서 IFN-베타의 농도는 10㎍/ml 또는 약 10㎍/ml 내지 800㎍/ml 또는 약 800㎍/ml, 더욱 바람직하게는 20㎍/ml 또는 약 20㎍/ml 내지 500㎍/ml 또는 약 500㎍/ml, 더욱 특히 바람직하게는 30㎍/ml 또는 약 30㎍/ml 내지 300㎍/ml 또는 약 300㎍/ml, 가장 바람직하게는, 22, 44, 88 또는 264㎍/ml 또는 약 22, 44, 88 또는 264㎍/ml이다.

바람직하게는 본 발명의 제제들은 약 3.0 내지 5.0 또는 약 5.0, 더욱 바람직하게는 3.7 또는 약 3.7 또는 4.7의 pH를 갖는다. 바람직한 완충제는 아세트산염이며, 바람직한 짝이온은 나트륨 또는 칼륨 이온이다. 아세트산염 식염수 완충제는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 전체 용액에서 완충제 농도는 이하의 농도 또는 약 5mM, 9.5mM, 19mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 및 500mM 사이에서 변화할 수 있다. 바람직한 완충제 농도는 10mM 또는 약 10mM이다. 특히 바람직하게는 3.5±0.2 또는 4.5±0.2의 pH를 갖는 아세테이트 이온의 10mM 완충제이다.

본 발명의 조성물에서 바람직하게는 항산화제는, 예를 들면 메티오닌(methionine)이며, 0.01 또는 약 0.01 내지 5.0 또는 약 5.0mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.05 또는 약 0.05 내지 0.3 또는 약 0.3mg/ml, 가장 바람직하게는 0.1mg/ml 또는 약 0.1mg/ml의 농도로 존재한다.

바람직하게는 액상 제제에서 등장화제(예를 들면 만니톨)의 농도는 0.5mg/ml 또는 약 0.5mg/ml 내지 500mg/ml 또는 약 500mg/ml, 더욱 바람직하게는 1mg/ml 또는 약 1mg/ml 내지 250mg/ml 또는 약 250mg/ml, 더욱 특히 바람직하게는 10mg/ml 또는 약 10mg/ml 내지 100mg/ml 또는 약 100mg/ml, 가장 바람직하게는 55mg/ml 또는 약 55mg/ml이다.

본 발명은 액상 제제를 포함한다. 바람직한 용매는 주사용 물이다.

액상 제제는 모노-도즈(mono-dose) 또는 멀티-도즈(multi-dose)일 수 있다. 멀티-도즈로 사용되는 본 발명의 액상 인터페론 제제들은 바람직하게는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬 파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 이와 유사한 것), 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 소듐 디하이드로아세테이트(sodium dehydroacetate) 및 티메로살과 같은, 정균제를 포함한다. 페놀, 벤질 알코올 및 m-크레졸이 특히 바람직하며, 벤질 알코올이 더욱 바람직하다. 상기 정균제는 멀티-도즈 주사 기간 동안에 주사에 적합하게 제제를 본질적으로 박테리아가 없도록 유지시키기에 유효한 농도를 주는 양으로 사용되며, 상기 멀티-도즈 주사 기간은 약 12시간 또는 24시간 내지 약 12일, 바람직하게는 약 6일 내지 약 12일일 수 있다. 상기 정균제는 바람직하게는 0.1%(박테리아 질량/용매 질량) 혹은 약 0.1% 내지 2.0% 혹은 약 2.0%, 더욱 바람직하게는 0.2% 혹은 약 0.2% 내지 1.0% 혹은 약 1.0%이다. 벤질 알코올의 경우, 0.2 또는 0.3% 농도가 특히 바람직하다. 하지만, 보존제, 예컨대 벤질 알코올의 사용이 멀티-도즈 제제에 한정되는 것은 아니며, 또한 모노-도즈 제제에도 첨가될 수 있다.

본 발명의 제제에서 인터페론의 함량 범위는 비록 보다 낮은 농도 및 보다 높은 농도가 실시가능하고 의도하는 전달 비히클에 따라 달라지더라도, 예컨대 용액 제제는 경피 패취(transdermal patch), 폐, 경점막(trnasmucosal), 또는 삼투 혹은 마이크로 펌프 방법들과는 차이가 있을지라도, 재구성(reconstitution) 시에 산출되는 양, 약 1.0㎍/ml 내지 약 50mg/ml의 농도를 포함한다. 상기 인터페론 농도는 바람직하게는 약 5.0㎍/ml 또는 약 5.0㎍/ml 내지 2mg/ml 또는 약 2mg/ml, 더욱 바람직하게는 10㎍/ml 또는 약 10㎍/ml 내지 1mg/ml 또는 약 1mg/ml, 가장 바람직하게는 30㎍/ml 또는 약 30㎍/ml 내지 100㎍/ml 또는 약 100㎍/ml이다.

바람직하게는 본 발명의 제제는 24개월의 기간에 걸쳐 포장 시에 인터페론 활성의 적어도 60% 또는 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 또는 약 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80% 또는 약 80%를 유지한다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 전술한 액상 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 전술한 활성 성분 및 부형제를 포함하는 용액을 배치하는 것을 포함하는 포장된 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 약제학용 제품을 제공하며, 상기 제품은 전술한 약제학적 조성물을 포함하는 바이알(vial), 및 최초 사용 후 24시간 또는 약 24시간 또는 더 긴 시간 동안에 상기 용액이 유지될 수 있다고 기재한 서면 자료(written material)를 포함한다. 바람직하게는 상기 서면 자료에는 상기 용액이 12일 또는 약 12일까지 유지될 수 있다고 기재된다.

멀티-도즈 제제의 최초 사용 후, 적어도 약 24시간 또는 약 24시간, 바람직하게는 적어도 4, 5 또는 6일 또는 약 4, 5 또는 6일, 더욱 바람직하게는 최대 12일까지 유지되고 사용될 수 있다. 최초 사용 후 상기 제제는 바람직하게는 실온 이하(즉 25℃ 또는 약 25℃ 이하), 더욱 바람직하게는 10℃ 또는 약 10℃ 이하, 더욱 바람직하게는 2-8℃ 또는 약 2-8℃, 가장 바람직하게는 4-6℃ 또는 약 4-6℃에서 저장된다.

본 발명의 제제는 계산된 양의 부형제를 완충된 용액에 첨가한 후 인터페론을 첨가하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

그리고 나서 상기 생성된 용액은 바이알, 앰플 또는 카트리지(cartridge)에 놓여진다. 이러한 공정의 변형은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 인정된다. 예를 들면, 첨가되는 성분들의 순서, 추가 첨가제를 사용할지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용된 투여 농도 및 수단을 위해 최적화될 수 있는 모든 인자들이다.

멀티-도즈용 제제의 경우, 정균제가 활성 성분(인터페론)을 함유한 용액에 첨가될 수 있으며 또는 선택적으로 정균제가 별도의 바이알 또는 카트리지에 보관되고 그 후에 사용 시에 활성 성분을 함유한 용액에 혼합될 수 있다.

본 발명의 제제는 인지된 장치들을 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 단일 바이알 시스템들을 포함하는 예로는 레비젝트(Rebiject)^® 같은 용액을 전달하기 위한 오토-인젝터(auto-injector) 또는 펜-인젝터(pen-injector) 장치들을 포함한다.

현재 클레임된 생산품은 포장 물질을 포함한다. 포장 물질은 규제기관(regulatory agency)들에 의해 요구되는 정보 외에, 생산품이 사용될 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장 물질은 필요하다면, 두 개의 바이알, 습식/건식, 제품에 대하여 24시간 혹은 더 긴 시간에 동안에 최종 용액을 조제하고 그러한 최종 용액을 사용하기 위해, 환자에게 지시를 제공한다. 단일 바이알, 용액 제품의 경우, 레벨에 상기 용액이 24시간 또는 그 보다 긴 시간에 걸쳐 사용될 수 있다는 지시가 나타난다. 현재 클레임된 제품은 인간 약제학적 제품용으로 유용하다.

안정한 보존 제제가 투명 용액으로 환자에게 제공될 수 있다. 상기 용액은 일회 사용될 수 있으며 또는 여러 번 재사용될 수 있으며, 환자 치료의 단일 또는 복수 주기에 충분할 수 있으며 따라서 현재 이용가능한 것 보다 편리한 치료를 제공한다.

여기서 기술된 안정하거나 보존된 제제 또는 용액 내 인터페론이 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 이식, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 경구, 또는 당해 기술 분야에서 잘 알려진, 당업자에 의해 인지된 다른 수단을 포함하는 여러 전달 방법들을 통하여 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.

상기 용어 "바이알(vial)"은 함유된 멸균 상태에서 고체 또는 액체 형태로 인터페론을 유지하기에 적합한 저장기(reservoir)이다. 여기서 사용되는 바이알의 예로는 앰플, 카트리지, 블리스터 패키지(blister package), 또는 주사기, 펌프(삼투압 포함), 카테터, 경피 패취, 폐 또는 경점막 스프레이를 통하여 환자에게 인터페론을 전달하기에 적합한 다른 저장기를 포함한다. 비경구, 폐, 경점막 또는 경피 투여용 제품을 포장하기에 적합한 바이알이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

본 발명의 문맥 내 상기 용어 "치료(treatment)"는 질병의 발명 후 병리 발달의 약화, 축소, 감소 또는 점감을 포함하는, 질병의 진행상의 유익한 효과를 나타낸다.

IFN 또는 이소형태, 뮤테인, 융합 단백질, 기능 유도체, 활성 분획물 또는 염을을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 이러한 폴리펩티드에 의한 치료에 반응하는 임상 징후들의 (국부적 또는 전신), 진단, 예방, 및 치료에 유용하다. 그러한 임상 징후들은 예를 들면, 다발경화증을 포함하는, 중추신경계(CNS), 뇌 , 및/또는 척수(spinal cord)의 질환 또는 질병; 류마티스 관절염, 건선, 크론씨병을 포함하는, 자가면역병; 및 유방, 전립선, 방광, 신장 및 결장 암들을 포함하는, 암을 포함한다.

저널 기사 또는 초록, 공개되거나 비공개된 미국, 또는 외국 특허출원, 등록된 미국, 또는 외국 특허들 또는 임의의 다른 참조 문헌들을 포함하는, 여기서 인용된 모든 참조문헌들은, 인용 문헌들에 제시된 모든 데이터, 표, 도면 및 텍스트를 포함하여, 여기서 참조로 완전하게 포함된다. 추가로, 여기서 인용된 참조문헌들 내에서 언급된 참조문헌들의 전체 내용도 또한 참조로 완전하게 포함된다.

공지된 방법 단계들, 종래의 방법 단계들, 공지된 방법 또는 종래 방법에 대한 언급은 결코 본 발명의 양태, 기재 또는 구체예가 관련 기술에 개시, 시사 또는 제시되고 있다는 것을 인정하는 것은 아니다.

특정 구체예들의 전술한 기재는 본 발명의 일반적인 특징을 완전하게 나타냄으로써, (여기서 언급된 참조문헌들의 내용을 포함한) 당해 기술 분야 내 지식을 적용함으로써, 다른 사람들이 본 발명의 일반 사상을 벗어나지 않으면서 부당한 실험 없이, 여러 적용을 위해 상기 특정 구체예들을 용이하게 변경 및/또는 응용할 수 있다. 따라서, 그러한 응용 및/또는 변경은 여기서 제시된 교시 및 안내에 근거하여, 개시된 실시예들에 상당하는 범위 내에 있는 것이다. 여기서 사용된 표현 또는 용어는 기재를 위한 것이며 여기에 한정되지 않으며, 본 명세서의 용어 또는 표현은 당해 기술분야의 당업자의 지식과 결합하여, 여기서 제시된 교시 및 안내에 비추어 당업자에 의해 해석될 수 있다.

도 1은 40℃에서 저장 후 다른 농도의 벤질 알코올을 포함하는 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 산화된 형태(oxidised form)의 백분율을 나타낸다.

도 2는 25℃에서 저장 후 다른 농도의 벤질 알코올을 포함하는 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 산화된 형태의 백분율을 나타낸다.

도 3은 2-8℃에서 저장 후 다른 농도의 벤질 알코올을 포함하는 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 산화된 형태의 백분율을 나타낸다.

도 4는 40℃에서 저장 후 다른 농도의 벤질 알코올을 포함하는 인터페론 베 타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 전체 응집체(total aggregate)의 백분율을 나타낸다.

도 5는 25℃에서 저장 후 다른 농도의 벤질 알코올을 포함하는 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 전체 응집체의 백분율을 나타낸다.

도 6은 2-8℃에서 저장 후 다른 농도의 벤질 알코올을 포함하는 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 전체 응집체의 백분율을 나타낸다.

도 7은 25℃에서 저장 후 다른 택일적인 정균제를 함유한 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 산화된 형태의 백분율을 나타낸다.

도 8은 2-8℃에서 저장 후 다른 택일적인 정균제를 함유한 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 산화된 형태의 백분율을 나타낸다.

도 9는 다른 택일적인 정균제를 함유한 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 전체 응집체의 백분율을 나타낸다.

도 10은 25℃에서 저장 후 EDTA를 함유한 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 산화된 형태의 백분율을 나타낸다.

도 11은 25℃에서 저장 후 EDTA를 함유한 인터페론 베타-1a 멀티-도즈 제제들에 존재하는, 전체 응집체의 백분율을 나타낸다.

도 12는 (2-8℃에서) 산화제로서 0.012% L-메티오닌의 효능을 나타낸다.

도 13은 (25±2℃에서) 산화제로서 0.012% L-메티오닌의 효능을 나타낸다.

실시예 1- 미리- 충진된 주사기들에서 액상 모노- 도즈 HSA 가 없는 인터페론 베타-1a 제제

1.1 예비 적합성 연구(Preliminary Compatibility Studies)

현 생산품에서 인간 혈청 알부민(HSA)의 제거가 산화, 응집체의 형성 및 표면에 대한 흡착에 있어서 상기 생산품에 영향을 줄 수 있기 때문에, 항산화제 및 계면활성제와 같은 일부 부형제에 의해 나타난 보호 효과를 입증하기 위해 예비 실험을 실시하였다.

0.4% HSA, 0.012% L-메티오닌, 트윈(Tween) 20(0.005%, 0.007%, 0.01%), 폴록사머(Poloxamer) 188(0.05%, 0.1%, 0.5%)와 같은 몇몇 부형제와 함께 54.6mg/ml 만니톨을 함유한 아세트산나트륨 완충제에서 인터페론 베타-1a를 44mcg/ml 및 88mcg/ml의 농도로 제제화하였다. 다른 조합물들을 스트레싱 조건(stressing condition)(40℃에서 저장 또는 볼텍싱(vortexing))에 노출시키고, (RP-HPLC에 의한) 산화 테스트 및 (SE-HPLC에 의한) 응집 테스트를 실시하였다.

표 DEP-1 및 -2는 40℃에서 2주 저장 후 산화 및 응집 레벨을 나타낸 것이다. 테스트된 두 부형제들(트윈 20 및 폴록사머 188)과 인터페론 베타-1a의 조합은 산화 레벨이 증가되었으며, 각 유형의 계면활성제의 경우, 농도에 따라 달라지며(표 DEP-1, 조합 #4-6 및 #7-9); (플루로닉 F-68 또는 F-68로 또한 언급된) 0.5% 폴록사머 188의 레벨에서, 약물질이 완전히 분해된다(표 DEP-1, #9). 예상한 대로, 트윈 20에 대해서 보다 큰 분해 속도가 관찰되는데, 이는 합성에서 잔류물로 존재할 수 있는 산화 종(예컨대 과산화물) 때문이다.

테스트된 다른 농도에서 두 계면활성제들은 40℃ 저장 시에 응집 레벨에 영 향을 주지 않는다(표 DEP-2).

표 DEP-1 40℃ 저장 후 RP- HPLC 에 의한 산화 형태(%)

		T=0	2w
#1	IFN 44	3.0	6.5
#2	IFN 44 mcg + 0.4% HSA(현재)	2.4	5.5
#3	IFN 44 mcg + 0.012% L-	3.9	6.2
#4	IFN 44 mcg	3.5	6.0
#5	IFN 44 mcg	3.4	7.0
#6	IFN 44 mcg	3.5	8.7
#7	IFN 44 mcg	3.5	6.9
#8	IFN 44 mcg	3.3	8.0
#9	IFN 44 mcg	3.6	n.m.
#10	IFN 44 mcg + 0.012% L-Met + 0.007%	3.5	6.9
#11	IFN 44 mcg + 0.012% L-	3.5	7.6

n.m. = 완전히 분해되기 때문에 측정 불가

표 DEP-2 40℃ 저장 후 SE- HPLC 에 의한 전체 응집체(%)

		T=0	2w
#1	IFN 44	2.6	2.8
#4	IFN 44 mcg	2.4	2.1
#5	IFN 44 mcg	2.8	2.0
#6	IFN 44 mcg	2.6	2.0
#7	IFN 44 mcg	2.5	2.9
#8	IFN 44 mcg	2.5	2.5
#9	IFN 44 mcg	2.6	2.9

표 DEP-3은 양 계면활성제들, 임계미셀농도(CMC)로 사용된, 트윈 20 및 폴록사머 188(F-68)이 5분 볼텍싱에 의해 유도된 응집체를 방지하는데 도움을 준다는 것을 나타낸다.

표 DEP-3 5분 볼텍싱 후 SE- HPLC 에 의한 전체 응집체(%)

		T=0	5분 볼텍스
#1	IFN 44 mcg	1.6	2.5
#3	IFN 44 mcg+0.012% L-Met	1.4	2.4
#10	IFN 44 mcg+0.012% L-Met+0.007% 트윈 20	1.4	1.3
#11	IFN 44 mcg+0.012% L-Met+0.1% F-68	1.3	1.3

1.1.1 물리화학적 특성

제조된 약물의 질에 중요한 것으로 알려진 물리화학적 특성은 산화량 및 이량체/응집체의 양이다. 이러한 특성은 앞서 기술한, 적합성 연구에서 고려되었다.

1.2 부형제

1.2.1 10 mM 아세트산나트륨 완충제 , pH 3.5

등장화제로 54.6 mg/ml 만니톨을 함유한 pH 3.5의 10 mM 아세트산나트륨 완충제는 현재 판매되는 제품(Rebif^®)에 대한 이전 개발 동안에 나타난 바와 같이 그리고 EP 759,775에 기재된 바와 같이, 제품을 안정화시킨다.

1.2.2 폴록사머 188

폴록사머 188(또는 플루로닉 F-68)은 제조 공정 중에 용기의 표면에 약물질의 흡착을 방지하기 위해서 0.1%(임계미셀농도)의 레벨로 제제에 포함된다; 보다 높은 농도는 제품의 안정도에 부정적인 영향을 줄 수 있다(보다 높은 산화); 보다 낮은 농도는 흡착을 제한하는데 덜 효과적일 수 있다.

제조 공정 중에 약물질의 흡착을 방지하는 폴록사머 188의 효능은 다음과 같은 연구에 의해 증명되었다: 44 mcg/ml 인터페론 베타-1a를 함유한 물질을 3가지 다른 농도의 계면활성제(트윈 20 또는 폴록사머 188) 또는 HSA와 혼합하고, 제조 공정을 모방하였다; 다른 단계들(컴파운딩, 무균 여과, 충진)에서 샘플들을 채취하여 정량 RP-HPLC 방법에 의해 테스트하였다.

샘플들이 이하의 단계에서 채취되었다:

여과 전(BF)

1차 여과 후(AF1)

2차 여과 후(AF2)

충진 후(T=0에서 완료된 제품)

표 DEP-4에 결과를 나타내고 최초 값(즉 여과 전 배합된 용액)에 대한 회수율(%)로 표시하였다: 폴록사머 188은 트윈 20보다 효과적이지만, 제조 공정 중에 약물질의 흡착을 방지하는데 있어 HSA 만큼 효과적이다.

표 DEP-4 제조 중에 인터페론 베타-1 a 회수율%

	무 HSA/무 계면활성제	HSA	0.003% 트윈 20	0.007% 트윈 20	0.02% 트윈 20	0.05% F-68	0.1% F-68	0.2% F-68
AF1	97.8	97.5	98.2	97.7	99.1	98.3	98.6	98.9
AF2	94.5	96.3	96.3	96.6	97.6	97.0	98.4	98.3
T=0	93.8	96.9	95.8	95.7	96.3	96.5	97.0	98.0

다른 공급자로부터 입수된 다른 등급의 폴록사머 188에 대해 사용되는 질을 정의하기 위해서 촉진 조건(40℃에서 2주)에서 산화 생성물을 연구하였다: 바스프사(BASF)로부터 입수된 폴록사머 188이 보다 낮은 산화 레벨을 나타내며 약제학적 등급으로 공급되기 때문에 이것을 선택하였다. 결과를 표 DEP-5에 나타내었다.

표 DEP-5 폴록사머 188(다른 질 및 공급자)을 함유한 제제에서 검출된 산화된 형태%

공급자	질	T=0	40℃에서 1주	40℃에서 2주
바스프(BASF)	약제학적 등급	2.6	-	3.2
플루카(Fluka)	GC용	-	3.8	4.7
시그마(Sigma)	생화학용	-	3.2	4.4

1.2.3 L-메티오닌

L-메티오닌(L-Met)은 산화를 제한하기 위해서 0.012%의 레벨로 제제에 포함된다. 이러한 농도의 효능을 L-메티오닌을 함유하지 않은 제제와 비교하여 나타내었다; L-메티오닌의 보다 높은 농도(0.05%, 0.1%)는 안정성에 동등한 효과를 나타낸다. 40℃ 저장 시에 검출된 산화 생성물을 표 DEP-6에 나타내었다.

표 DEP-6 다른 레벨의 L-메티오닌(L-Met)을 함유하는 인터페론 베타 1a-제제에서 산화된 형태%

	T=0	40℃에서 1주	40℃에서 4주
IFNβ-1a 44mcg	2.8	3.8	7.6
IFNβ-1a 44mcg + 0.012% L-Met	-	2.9	5.3
IFNβ-1a 44mcg + 0.05% L-Met	-	3.0	5.1
IFNβ-1a 44mcg + 0.1% L-Met	-	2.6	5.0

제제 개발 동안에, 항산화제로서의 L-메티오닌의 효능은 계면활성제와 조합된 L-메티오닌을 함유한 제제에서 발생되는, 2-8℃ 및 25±2℃에서 3개월 안정성 데이터에 의해 확인되었다: L-메티오닌은 0.012%에서 항산화제로서 효과적이며 현 제품에서 관찰된 것에 대등한 안정성을 보장할 수 있다(도 12 및 13 참조).

1.3 의약품

1.3.1 제제 개발

새로운 HSA가 없는 인터페론 베타 1a의 제제에 대한 개발은 최종 용기에서 예비 연구 결과(제조 중에 손실을 방지하기 위해 폴록사머 188을 포함한, L-메티오닌의 항산화제로서의 효능)의 확인에 초점을 맞추었다.

pH 3.5의 10 mM 아세트산나트륨 완충제에서 54.6mg/ml 만니톨을 함유한 44 mcg/ml 및 88 mcg/ml의 인터페론 베타-1a의 용액들을 제조하였으며, 다음과 같은 부형제들이 포함되었다:

● 트윈 20(0.003%, 0.007%, 0.02%)

● 폴록사머 188(0.05%, 0.1%, 0.2%)

● L-메티오닌(0%, 0.012%)

● HSA(0.4%, 현제제, "ref"로 표시됨)

연구된 제제들의 조성을 표 DEP-7에 나타내었다.

표 DEP-7: 인터페론 베타-1a를 함유한 제제들의 조성

제제	IFN-β-1a	만니톨(mg)	트윈 20(mg)	폴록사머 188(mg)	HSA(mg)	L-메티오닌(mg)	10mM 아스트산염 완충제 pH 3.5
IFN-1	44	54.6	0.03	-	-	-	q.s. to 1ml
IFN-2	44	54.6	0.07	-	-	-	q.s. to 1ml
IFN-3	44	54.6	0.2	-	-	-	q.s. to 1ml
IFN-4	44	54.6	-	0.5	-	-	q.s. to 1ml
IFN-5	44	54.6	-	1	-	-	q.s. to 1ml
IFN-6	44	54.6	-	2	-	-	q.s. to 1ml
IFN-7(ref)	44	54.6	-	-	4	-	q.s. to 1ml
IFN-8	44	54.6	-	-	-	-	q.s. to 1ml
IFN-9	44	54.6	0.2	-	-	0.12	q.s. to 1ml
IFN-10	44	54.6	-	2	-	0.12	q.s. to 1ml
IFN-11	88	54.6	-	1	-	0.12	q.s. to 1ml

이하에 기재된 절차에 따라 제제들을 제조하였다.

약물질(인터페론 베타-1a)와 함께 WFI에 용해시킨 필요량의 부형제들을 컴파운딩하여, 각각의 제제 90ml를 멸균 조건하에서 제조하였다; 그리고 나서 상기 제제들을 0.22㎛ 막을 통과시켜 여과시키고(두 개의 막 필터를 통과시켜 2번 여과시킴) 여과된 각 용액 0.5ml를 1ml Hypak 유리 주사기에 채웠다. 배치(batch) 크기는 약 180 주사기였다.

그런 다음 상기 제제들을 2-8℃, 25±2℃ 및 40±2℃에 저장하고, 12주(40±2℃에서 저장한 샘플들에 대해서는 최대 6주)까지 안정성을 테스트하였다.

개발 동안에 다음과 같은 분석 테스트들 및 방법들을 사용하였다(이러한 검정법에 대한 보다 자세한 사항은 실시예 2 참조):

- 생리활성도(bioactivity)(CPE 생물검정법)

- 검정법(RP-HPLC 방법)

- 산화 생성물(RP-HPLC 방법)

- 이량체/응집체(SE-HPLC 방법 및 SDS-PAGE)

- pH(전위차법)

- 오스몰농도(osmolality)(빙점 측정)

결과 및 그 평가를 표 DEP-8 내지 DEP-17에 나타내었다.

표 DEP-8 바이오아이덴터티(Bioidentity)(MIU/ml)

2-8℃
	O 시간	4주	8주	12주
IFN-1	11.7	12.4	11.6	11.0
IFN-2	11.5	12.1	11.9	11.1
IFN-3	11.3	10.0	9.9	9.7
IFN-4	11.8	11.8	12.4	11.1
IFN-5	12.1	12.3	12.6	11.6
IFN-6	12.1	12.2	11.4	10.7
IFN-7	12.1	12.4	12.6	11.1
IFN-8	11.2	11.4	11.5	10.8
IFN-9	11.2	12.4	12.7	11.9
IFN-10	12.0	13.0	12.4	11.6

25℃
	0시간	2주	4주	8주	12주
IFN-1	11.7	11.2	11.5	11.0	10.7
IFN-2	11.5	11.8	11.3	11.1	10.7
IFN-3	11.3	10.7	10.6	10.4	8.9
IFN-4	11.8	10.8	11.8	12.2	11.6
IFN-5	12.1	12.3	12.5	12.0	10.9
IFN-6	12.1	12.9	12.0	11.5	10.5
IFN-7	12.1	11.2	12.7	12.8	11.3
IFN-8	11.2	11.1	11.5	11.6	10.9
IFN-9	11.2	11.0	12.1	11.5	10.9
IFN-10	12.0	11.7	11.8	12.5	11.6

40℃
	0시간	2주	4주	6주
IFN-1	11.7	9.4	9.4	9.6
IFN-2	11.5	10.0	9.4	9.6
IFN-3	11.3	7.8	7.2	6.0
IFN-4	11.8	10.9	11.4	13.0
IFN-5	12.1	12.1	13.1	12.1
IFN-6	12.1	11.6	12.7	11.4
IFN-7	12.1	11.0	12.2	12.0
IFN-8	11.2	11.0	11.6	12.0
IFN-9	11.2	10.1	9.1	7.1
IFN-10	12.0	12.3	12.0	11.0

표 DEP-9에 기재되고 선형 회귀 분석(linear regression analysis)에 의해 계산된 기울기들은 트윈 20(#1, 2, 3, 9)을 함유하고 40℃에서 저장된 모든 제제들에서 생물학적 활성도가 감소하는 것을 나타낸다; 생리활성도의 감소는 25℃ 및 2- 8℃에서 저장 후 제제들 #3 및 6(계면활성제의 가장 높은 농도)에 대해서도 또한 관찰된다.

표 DEP-9 바이오아이덴터티를 위한 선형 회귀 분석( MIU /ml x week로 표시된 기울기들)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10
2-8℃	-0.07	-0.04	-0.12	-0.04	-0.03	-0.13	-0.06	-0.03	0.06	-0.06
25℃	-0.08	-0.08	-0.17	0.03	-0.10	-0.17	-0.02	-0.01	-0.02	0.00
40℃	-0.32	-0.29	-0.83	0.20	0.05	-0.05	0.06	0.16	-0.67	-0.17

표 DEP-10 RP- HPLC 에 의한 검정( mcg /주사기)

2-8℃
	0시간	4주	8주	12주
IFN-1	23.4	21.5	22.8	21.2
IFN-2	22.9	21.4	22.2	21.1
IFN-3	22.4	20.8	20.8	20.2
IFN-4	22.9	22.4	23.1	21.2
IFN-5	23.6	23.3	21.7	22.2
IFN-6	23.1	21.4	22.9	21.2
IFN-7	23.0	22.8	23.4	22.0
IFN-8	21.2	20.0	23.5	20.0
IFN-9	23.0	21.7	21.6	22.1
IFN-10	22.8	22.6	22.7	23.2
IFN-11	45.6	43.9	44.3	44.7

25℃
	0시간	2주	4주	8주	12주
IFN-1	23.4	20.5	20.7	20.7	20.1
IFN-2	22.9	21.2	19.8	20.8	19.7
IFN-3	22.4	19.9	19.1	17.6	16.6
IFN-4	22.9	21.5	22.2	22.5	21.1
IFN-5	23.6	23.4	23.0	23.6	21.4
IFN-6	23.1	22.6	20.7	22.0	20.5
IFN-7	23.0	23.1	22.9	23.2	22.6
IFN-8	21.2	20.8	19.8	20.8	19.7
IFN-9	23.0	20.5	20.2	18.2	18.6
IFN-10	22.8	22.2	22.6	22.0	22.3
IFN-11	45.6	45.2	44.6	43.4	44.8

40℃
	0시간	2주	4주	6주
IFN-1	23.4	18.8	17.8	16.6
IFN-2	22.9	18.5	16.2	15.4
IFN-3	22.4	15.1	11.2	10.4
IFN-4	22.9	20.1	19.8	18.7
IFN-5	23.6	21.8	21.0	19.6
IFN-6	23.1	20.7	18.8	18.7
IFN-7	23.0	20.6	18.8	16.7
IFN-8	21.2	19.6	18.3	18.1
IFN-9	23.0	16.8	12.7	13.1
IFN-10	22.8	20.5	19.8	19.9
IFN-11	45.6	43.4	41.5	40.1

표 DEP-11에 기재되고 선형 회귀 분석에 의해 계산된 기울기들은 40℃에서 저당된 트윈 20(#1, 2, 3, 9)을 함유한 제제들에 대한 단백질 함량의 보다 큰 손실을 나타낸다; 동일한 경향이 제제들 #5 및 6에 대해서뿐만 아니라 25℃에서도 관찰된다. 단백질 함량의 유의성 있는 감소가 제제들 #1, 2, 3(트윈 20 함유), 4, 5(폴록사머 188 함유) 및 9(트윈 20 및 L-메티오닌 함유)에 대해 2-8℃에서 발생한다.

표 DEP-11 검정을 위한 선형 회귀 분석( mcg /syringe x week로 표시된 기울기들)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11
2-8℃	-0.13	-0.11	-0.16	-0.11	-0.14	-0.11	-0.06	0.00	-0.07	0.03	-0.06
25℃	-0.19	-0.20	-0.44	-0.09	-0.15	-0.18	-0.03	-0.09	-0.34	-0.04	-0.10
40℃	-1.10	-1.20	-2.00	-0.64	-0.64	-0.76	-1.00	-0.53	-1.70	-0.47	-0.92

표 DEP-12 RP- HPLC 에 의한 산화된 형태%

2-8℃
	0시간	4주	8주	12주
IFN-1	2.8	2.8	3.3	3.4
IFN-2	2.5	2.9	3.4	3.4
IFN-3	2.7	3.0	4.2	4.5
IFN-4	2.6	2.6	3.6	3.2
IFN-5	2.8	2.8	3.6	3.2
IFN-6	2.5	3.1	4.5	4.4
IFN-7	1.5	1.5	1.7	1.3
IFN-8	2.8	2.9	3.2	3.1
IFN-9	3.3	3.4	3.4	3.6
IFN-10	3.0	3.2	3.0	3.0
IFN-11	2.6	2.9	2.9	2.9

25℃
	0시간	2주	4주	8주	12주
IFN-1	2.8	3.0	3.1	4.2	4.3
IFN-2	2.5	3.0	3.1	3.4	4.6
IFN-3	2.7	3.5	3.9	6.7	6.8
IFN-4	2.6	3.0	3.1	4.7	4.8
IFN-5	2.8	3.0	3.1	4.4	4.5
IFN-6	2.5	3.0	3.2	5.3	5.7
IFN-7	1.5	1.7	1.9	2.0	2.3
IFN-8	2.8	3.1	2.9	4.1	4.3
IFN-9	3.3	3.4	3.5	3.9	4.4
IFN-10	3.0	3.0	3.2	3.3	3.5
IFN-11	2.6	2.8	3.1	3.2	3.4

40℃
	0시간	2주	4주	6주
IFN-1	2.8	6.0	8.3	12.4
IFN-2	2.5	3.7	8.7	10.7
IFN-3	2.7	8.8	12.3	16.9
IFN-4	2.6	4.1	6.7	10.3
IFN-5	2.8	3.7	7.2	9.6
IFN-6	2.5	4.9	7.6	13.3
IFN-7	1.5	2.8	3.9	11.8
IFN-8	2.8	3.8	7.6	10.7
IFN-9	3.3	5.7	8.6	12.8
IFN-10	3.0	3.6	9.3	9.7
IFN-11	2.6	3.2	5.3	6.8

표 DEP-13에 기재되고 선형 회귀 분석에 의해 계산된 기울기들은 트윈 20을 함유한 제제들이 폴록사머 188을 함유한 제제들과 비교하여 산화 속도가 더 빠르며 산화 레벨이 트윈 20의 농도에 의존적이라는 것을 나타낸다.

테스트된 다른 온도에서 산화를 제한하는 L-메티오닌의 효능은 #3(트윈 20)를 함유한 제제 #9(트윈 20+L-메티오닌) 및 #6(폴록사머 188)을 함유한 제제 #10(폴록사머 188+L-메티오닌)의 비교에 의해서도 나타난다.

표 DEP-13 산화된 형태에 대한 선형 회귀 분석(%산화된 형태/주(week)로 표시된 기울기들)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-7	IFN-8	IFN-9	IFN-10	1FN-11
2-8℃	0.06	0.08	0.17	0.07	0.05	0.17	-0.01	0.03	0.02	0.00	0.02
25℃	0.14	0.16	0.38	0.21	0.16	0.29	0.06	0.14	0.09	0.04	0.06
40℃	1.60	1.50	2.30	1.30	1.20	1.80	1.60	1.40	1.60	1.30	0.74

표 DEP-14 SE- HPLC 또는 SDS-PAGE에 의한 전체 응집체(%)

2-8℃
	0시간	4주	8주	12주
IFN-1	0.8	0.5	0.7	0.5
IFN-2	0.8	0.4	0.7	0.3
IFN-3	1.1	0.6	0.9	1.2
IFN-4	1.2	0.9	1.4	1.7
IFN-5	1.0	1.4	0.9	1.6
IFN-6	1.1	1.8	0.9	1.5
IFN-7*	≤3%	<3%	<3%	<4.5%
IFN-8	1.2	1.6	1.2	2.0
IFN-9	1.7	1.4	1.7	1.2
IFN-10	1.4	1.3	1.3	1.3
FIN-11	1.4	0.9	0.4	1.7

25℃
	0시간	2주	4주	8주	12주
IFN-1	0.8	0.4	0.2	0.2	0.3
IFN-2	0.8	0.4	0.1	0.3	0.0
IFN-3	1.1	0.6	0.3	0.3	0.5
IFN-4	1.2	1.2	0.6	0.9	0.9
IFN-5	1.0	0.6	0.8	0.4	0.9
IFN-6	1.1	0.7	0.9	0.6	0.8
IFN-7*	<3%	<3%	<3%	<3%	<4.5%
IFN-8	1.2	0.8	0.9	0.4	0.9
IFN-9	1.7	0.6	0.9	0.6	0.5
IFN-10	1.4	0.5	0.7	0.5	0.5
IFN-11	1.4	1.1	0.9	0.5	1.4

40℃
	0시간	2주	4주	6주
IFN-1	0.8	0.5	0.4	0.9
IFN-2	0.8	0.6	0.6	0.8
IFN-3	1.1	0.7	0.5	0.6
IFN-4	1.2	1.4	0.6	1.1
IFN-5	1.0	0.9	1.1	1.4
IFN-6	1.1	1.1	1.2	1.4
IFN-7*	≤3%	<3%	≤3%	<4.5%
IFN-8	1.2	0.8	0.7	0.6
IFN-9	1.7	0.8	1.0	0.6
IFN-10	1.4	0.8	1.4	1.0
IFN-11	1.4	1.3	1.2	1.8

* SDS-PAGE에 의한

표 DEP-15에 기재되고 선형 회귀 분석에 의해 계산된 기울기들은 다른 온도에서 저장 시에 전체 응집체 함량에 있어 유의성 있는 증가가 발생하지 않는다는 것을 나타낸다.

표 DEP-15 전체 응집체에 대한 선형 회귀 분석(% 전체 응집체/주(week)로 표시된 기울기들)

	IFN-1	IFN-2	IFN-3	IFN-4	IFN-5	IFN-6	IFN-8	IFN-9	IFN-10	IFN-11
2-8℃	-0.01	-0.03	0.01	0.04	0.04	0.01	0.05	-0.03	-0.01	0.01
25℃	-0.04	-0.05	-0.04	-0.03	-0.01	-0.03	-0.03	-0.07	-0.05	-0.01
40℃	0.01	0.01	-0.09	-0.07	0.07	0.05	-0.10	-0.15	-0.03	0.07

표 DEP-16 2-8℃에서 pH 값

2-8℃
	0시간	4주	8주	12주	24주	104주
IFN-1	3.7	3.7	3.7	3.7	-	-
IFN-2	3.7	3.7	3.7	3.7	-	-
IFN-3	3.7	3.7	3.6	3.6	-	-
IFN-4	3.7	3.8	3.7	3.6	-	-
IFN-5	3.7	3.7	3.7	3.7	-	-
IFN-6	3.6	3.7	3.7	3.7	-	3.7
IFN-7	3.6	3.5	3.6	3.6	-	3.6
IFN-8	3.6	3.6	3.7	3.7	-	3.7
IFN-9	3.6	3.7	3.6	3.7	-	-
IFN-10	3.6	3.7	3.7	3.7	-	3.7
IFN-11	3.5	3.6	3.6	3.6	3.6	-

25℃
	0시간	2주	4주	8주	12주	24주
IFN-1	3.7	3.6	3.8	3.6	3.7	-
IFN-2	3.7	3.6	3.8	3.6	3.7	-
IFN-3	3.7	3.6	3.8	3.7	3.7	-
IFN-4	3.7	3.6	3.8	3.7	3.7	-
IFN-5	3.7	3.7	3.6	3.7	3.7	-
IFN-6	3.6	3.7	3.7	3.6	3.7	-
IFN-7	3.6	3.6	3.5	3.6	3.6	-
IFN-8	3.6	3.7	3.6	3.7	3.7	-
IFN-9	3.6	3.7	3.7	3.6	3.6	-
IFN-10	3.6	3.7	3.7	3.7	3.6	-
IFN-11	3.5	3.6	3.6	3.6	3.6	3.6

40℃
	0시간	2주	4주	6주
IFN-1	3.7	3.6	3.7	3.7
IFN-2	3.7	3.6	3.7	3.8
IFN-3	3.7	3.6	3.7	3.8
IFN-4	3.7	3.6	3.7	3.8
IFN-5	3.7	3.7	3.6	3.7
IFN-6	3.6	3.7	3.6	4.0
IFN-7	3.6	3.6	3.6	3.6
IFN-8	3.6	3.6	3.7	3.7
IFN-9	3.6	3.6	3.7	3.7
IFN-10	3.6	3.7	3.7	3.6
IFN-11	3.5	3.6	3.5	3.6

저장 시에 pH 변화가 관찰되지 않았다.

표 DEP-17 오스몰농도 ( OSM /kg)

IFN-1	0.348
IFN-2	0.345
IFN-3	0.345
IFN-4	0.346
IFN-5	0.354
IFN-6	0.358
IFN-7	0.399
IFN-8	0.354
IFN-9	0.369
IFN-10	0.366
IFN-11	0.361

테스트된 제제들의 오스몰농도는 적당하다.

제제 개발의 결과를 토대로, 다음과 같은 HSA가 없는 제제가 선택되었다:

54.6 mg/ml 만니톨,

1 mg/ml 폴록사머 188

0.12 mg/ml L-메티오닌을 함유한

pH 3.5의 아세트산나트륨 완충제 내 44 또는 88 mcg/ml 인터페론 베타-1a

1.3.2 과잉공급(overage)

과잉공급은 적용되지 않았다.

1.3.3 물리화학적 및 생물학적 특성

이러한 특징은 전술한 제제 개발 연구들에서 고려되었다.

1.4 제조 공정 개발

1.4.1 제조 공정의 개발

현 제조 공정이 새로운 제제의 랩 스케일 배치들의 제조에 적응되었다: 약물질을 성분들과 함께 직접 컴파운드하였다; 그리고 나서 주사기 충진 전에 인-라인(in-line) 여과가 뒤따르는 멸균 여과가 예상되는 산업 규모 공정을 모방하기 위해서 이중 여과를 수행하였다. 그런 다음 주사기들에 최종 멸균 용액을 손으로 채웠다.

양 여과 단계들 및 주사기 충진은 층류 하에서 수행하였다.

상기 공정의 각 단계에 대한 설명이 이하에 기재된다.

1.4.2 예비 계산

44 mcg/ml 용액을 얻는데 필요한 인터페론 베타-1a 약물질의 양 D(mg):

D(mg) = 44 mcg/ml x 90 ml = 3960 mcg = 3.96 mg

상기 양 D(mg)에 상응하는 인터페론 베타-1a 약물질의 체적 B(ml):

B(ml) = 3.96 mg: 벌크 역가(bulk titre) (mg/ml)

44 mcg/ml 용액 90ml를 얻는데 필요한 부형제 용액의 체적 V(ml)

V(ml) = 90ml-B(ml)*

*(d≡ 1 g/ml)

1.4.3 수산화나트륨 1M 용액의 제조

1M 수산화나트륨 용액을 WFI에서 제조하였다.

1.4.4 pH 3.5의 0.01M 아세트산나트륨 완충제의 제조

적량의 빙초산을 WFI에 첨가하고, 1M NaOH 또는 50% 희석된 아세트산을 이용 하여 pH를 3.5±0.2로 조정하였다. 상기 용액을 WFI를 이용하여 최종 체적으로 맞추었다.

1.4.5 부형제 용액의 제조

계산된 양의 부형제(만니톨, 트윈 20 또는 폴록사머 188, L-메티오닌)의 무게를 달아 0.01M 아세트산나트륨 완충제 pH 3.5의 필요량에 용해시켰다; 그리고 나서 pH를 체크하고, 필요한 경우 1M NaOH 또는 50% 희석된 아세트산으로 pH를 3.5±0.2로 조정하였다; 그런 다음 0.01M 아세트산나트륨 완충제를 이용하여 상기 용액을 최종 무게로 맞추었다.

1.4.6 약물질 용액의 컴파운딩

인터페론 베타-1a약물질의 필요량 B(g)을 부형제 용액의 필요량 V(g)에 첨가하고 균질해지도록 서서히 교반하였다.

1.4.7 상기 약물질 용액의 1차 여과

상기 컴파운드된 용액을 질소 압력(1 bar max) 하에서, 스테인레스 스틸 홀더가 장착된, 0.2㎛ 나일론 막을 통과시켜 여과하고 유리 비이커에 수집하였다.

1.4.8 상기 약물질 용액의 2차 여과

앞서 여과된 용액을 동일한 조건 하에서 새로운 0.2㎛ 나일론 막을 통과시켜 다시 여과하였다.

1.4.9 주사기의 충진

1ml 유리 주사기에 최종 용액 0.5ml를 무균 충진하였다.

1.4.10 공정 중 온도

냉각된 W.F.I.을 사용하고 상기 부형제 용액 및 상기 컴파운드된 용액을 2-8℃에 저장함으로써 전체 공정 동안에 온도를 가능한 한 냉장 조건에 가깝게 유지하였다.

실시예 2 - 오토 - 인젝터에 적합한 카트리지 내 액상 멀티- 도즈 HSA 가 없는 인터페론 베타-1a 제제

카트리지의 멀티 도즈 제품 개발에 대한 필요가 현재 시판되고 있는 주사기 제품으로부터 HSA를 제거하는 것을 목표로 삼은 새로운 HSA가 없는 제제의 개발 동안에 일어났다. 상기 멀티-도즈 제제는 오토-인젝터에 의한 자가-투여를 가능하게 함으로써 환자의 편의성을 증진시킨다.

처음에는 가장 일반적으로 사용된 정균제(0.3% m-크레졸, 0.5% 페놀 및 0.9% 벤질 알코올)가 활성 물질과 조합하여 연구되었으며 모노-도즈 개발(pH 3.5의 10mM 아세트산나트륨 완충제에서 44 또는 88 mcg/ml 인터페론 베타-1a, 54.6 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml 폴록사머 188, 0.12 mg/ml L-메티오닌)의 틀 안에서 선택된 주사기 내 모노-도즈 제제와 비교되었으며; 다음 사항이 관찰되었다.

- 미생물 오염을 방지하기 위해 일반적으로 사용되는 농도로, 각각의 정균제들을 포함시키고, 산화된 형태의 증가 측정 및 응집체의 극적인 증가 촉진.

- 응집체의 극적 증가가 측정된 0.1% 폴록사머 188과 함께 0.5% 페놀의 조합 및 0.3% m-크레졸

프리포뮬레이션(preformulation) 중에 얻어진 정보를 바탕으로, 제제 개발은 처음에 추가 정균제(클로로부탄올, 페닐에탄올)뿐만 아니라 벤질 알코올 및 페놀( 폴록사머 188 제외)에 초점을 맞추었다; EDTA도 또한 벤질 알코올과 함께 연구되었다; 활성 약물의 산화 및 응집은 관찰된 주된 분해 경로들이었다; 제제에서 벤질 알코올 양의 환원은 제품의 저장기간을 증가시키는 것으로 나타났다.

이 단계 동안에 연구된 모든 다른 보존제들은 제품의 안정성에 있어 유의성 있는 향상을 나타내지 않았다.

제제 개발의 마지막에 다음과 같은 후보 멀티-도즈 제제들을 확인하였다:

- 제제 B - pH 3.5의 10 mM 아세트산 나트륨 완충제 3 ml 중의 264 mcg 인터페론 베타-1a, 163.8 mg 만니톨, 3 mg 폴록사머 188, 0.36 mg L-메티오닌, 6 mg 벤질 알코올

- 제제 A - pH 3.5의 11 mM 아세트산나트륨 완충제 2.7 ml 중의 264 mcg 인터페론 베타-1a, 163.8 mg 만니톨, 3 mg 폴록사머 188, 0.36 mg L-메티오닌을 WFI 내 3% 벤질 알코올 0.3 ml와 혼합하여 최종 멀티-도즈 제제를 얻는다.

세 가지 랩-스케일 배치들이 각각의 후보 제제에 대해 제조되었으며 6개월까지 안정성 지시 방법들로 테스트되었다: 2-8℃ 저장 시에는 유의성 있는 분해가 두 후보 제제들에 대해서 발생하지 않았다; 촉진 조건(25℃) 시에 발생한 주된 분해는 산화이다.

연구의 마지막에, 두 개의 후보 멀티-도즈 제제들에서 상당한 안정성 프로파일이 확인되었다:

- 제제 B는 0.2% 벤질 알코올을 함유한 즉석에서 사용할 수 있는 멀티-도즈 제제이다;

- 제제 A는 2개의 카트리지들(하나는 활성 성분 및 부형제를 함유하며, 다른 하나는 최종 프리젠테이션에 도달하도록 벤질 알코올의 필요량을 함유함)의 내용물을 혼합한 후 얻어지는 0.3% 벤질 알코올을 함유한 멀티-도즈 제제이다.

2.1 연구의 목표

이러한 연구의 목표는 오토-인젝터에 의한 투여를 가능하게 하는 3 ml 카트리지 내 264 mcg의 인터페론 베타-1a의 HSA가 없는 멀티-도즈 제제를 개발하는 것이었다.

2.2 실험 파트

2.2.1 물질

인터페론-베타-1a (Serono S.A.)

만니톨 DAB, Ph Eur, BP USP, FCC, E421 (Merck)

빙초산 100% GR (Merck)

수산화나트륨 펠릿 GR (Merck)

폴록사머 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, BASF)

생화학용 L-메티오닌 (Merck)

합성용 m-크레졸 (Merck)

합성용 페놀 (Merck)

벤질 알코올 Ph Eur, BP, NF (Merck)

클로로부탄올 (Aldrich)

페닐에탄올 (Sigma)

소듐 메틸파라벤 BP, USP/NF (Formenti)

소듐 프로필파라벤 BP, USP/NF (Formenti)

EDTA 디소듐염 (Fluka)

1,2-프로판디올 엑스트라퓨어 DAB, Ph Eur, BP, USP (Merck)

아세토니트릴 (Merck)

트리플루오로아세트산 (Baker)

헵타플루오로부티르산 (Pierce)

2.2.2 장치

HPLC 시스템 (Waters)

밀레니엄 32 소프트웨어 (Waters)

삼투압측정기 (Osmomat 030-D, Gonotec)

pH 측정기 (mod. 654, Metrohm)

교정 피펫(Gilson)

울티포(Ultipor) N66 0.2㎛ 나일론 막, FTKNF, φ 4.7cm (Pall)

울티포 N66 0.2㎛ 나일론 막, NR14225, φ 14.2cm (Pall)

스테인레스 스틸 홀더, φ 4.7cm 및 φ 10cm (Sartorius)

스테인레스 스틸 탱크 (Sartorius)

C4 칼럼 5㎛ (0.46x25cm) (Baker)

C4 칼럼, 수펠코실(Supelcosil) LC-304 5㎛ (0.46x25cm) (Supelco)

TSK 칼럼, G2000SWXL (0.46x25cm) (TosoHaas)

2.3 프리 - 포뮬레이션 연구

가장 일반적으로 사용된 정균제들(0.3% m-크레졸, 0.5% 페놀 및 0.9% 벤질 알코올)이 처음에 최종 용기(3 ml 카트리지)에서 활성 물질 및 다른 부형제 혼합물들과 조합하여 연구되었다: 아세트산염 완충제, 아세트산염 완충제/만니톨, 아세트산염 완충제/만니톨/L-Met/폴록사머 188. 다른 환경에서 활성 물질의 적합성(compatibility)이 40℃ 저장 시에 (RP-HPLC에 의한) 산화 및 (SE-HPLC에 의한) 응집 측면에서 연구되었다. 이러한 예비 단계의 다른 단계들 동안에 연구된 제제들을 하기 표 1에 나타내었다.

각각의 정균제의 포함 효과를 주사기 내 모노-도즈 개발의 틀 내에서 선택된 모노-도즈 포뮬러와 비교하였다(pH 3.5의 10mM 아스트산나트륨 완충제 중의 44 또는 88 mcg/ml 인터페론 베타-1a, 54.6 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml 폴록사머 188, 0.12 mg/ml L-메티오닌).

표 1: 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제의 조성( 프리 - 모퓰레이션 )

제제(Formulation)	조성(Composition)
대조(Reference)	Ace/Man/Plu/Met1
E	Ace/DR
F	Ace/PH
G	Ace/BA
H	Ace
I	Ace/Man/CR
J	Ace/Man/PH
K	Ace/Man/BA
L	Ace/Man
M	Ace/Man/PH
N	Ace/Man/Met1/PH
O	Ace/Man/Met2/PH
P	Ace/Man/Plu/PH
Q	Ace/Man/Plu/Met1/PH
R	Ace/Man/Plu/Met2/PH
S	Ace/Man/BA
T	Ace/Man/Met1/BA
U	Ace/Man/Met2/BA
V	Ace/Man/Plu/BA
W	Ace/Man/Plu/Met1/BA
X	Ace/Man/Plu/Met2/BA

Ace = 10 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 3.5; Man = 54.6 mg/ml; Plu = 1 mg/ml 폴록사머 188; Met1 = 0.12 mg/ml L-메티오닌; Met2 = 0.24 mg/ml L-메티오닌; CR = 3 mg/ml m-크레졸; PH = 5 mg/ml 페놀; BA = 9 mg/ml 벤질 알코올

2.4 제제 개발

프리-포뮬레이션 개발 동안에 얻어진 정보를 바탕으로, 제제 개발은 처음에 벤질 알코올 및 페놀에 초점을 맞추었다; 벤질 알코올에 혼합된 추가 보존제들(클로로부탄올, 페닐에탄올) 및 EDTA도 또한 연구되었다. 인터페론 베타-1a 모노-도즈의 새로운 HSA가 없는 제제에 상응하는, 비교 제제(MS-3)가 또한 카트리지 내에서 제조되어 대조로 사용되었다.

이러한 단계 동안에 제조된 제제들의 조성(mg/ml)을 표 2 내지 5에 나타내었 다.

표 2. 벤질 알코올을 함유한 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제들(mg/ml의 조성)

#	IFN	만니톨	폴록사머 188	L-Met	벤질 알코올	아세트산염 완충제
MS-3(ref.)	0.088	54.6	1	0.12	-	q.s. to 1ml
MS-13	0.088	54.6	1	0.12	1.5	q.s. to 1ml
MS-14	0.088	54.6	-	0.12	1.5	q.s. to 1ml
MS-15	0.088	54.6	1	0.12	3	q.s. to 1ml
MS-16	0.088	54.6	-	0.12	3	q.s. to 1ml
MS-17	0.088	54.6	1	0.12	4.5	q.s. to 1ml
MS-18	0.088	54.6	-	0.12	4.5	q.s. to 1ml
MS-1	0.088	54.6	1	0.12	9	q.s. to 1ml
MS-2	0.088	54.6	-	0.12	9	q.s. to 1ml

표 3. 페놀을 함유한 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제들(mg/ml)

#	IFN	만니톨	프로필렌 글리콜	페놀	아세트산염 완충제
MS-4	0.088	54.6	-	5	q.s. to 1 ml
MS-5	0.088	54.6	100	5	q.s. to 1 ml

표 4. 클로로부탄올 및 페닐에탄올을 함유한 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제들(mg/ml)

#	IFN	만니톨	폴록사머 188	L-Met	클로로부탄올	페닐에탄올	아세트산염 완충제
MS-35	0.088	54.6	1	0.12	1	-	q.s. to 1 ml
MS-34	0.088	54.6	1	0.12	-	1	q.s. to 1 ml
MS-34b	0.08	54.6	1	0.12	-	1	q.s. to 1 ml

표 5. EATA 를 함유한 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제들(mg/ml)

#	IFN	만니톨	L-Met	폴록사머 188	EDTA	벤질 알코올	아세트산염 완충제
MS-32	0.088	54.6	0.12	1	1	2	q.s. to 1ml
MS-33	0.088	54.6	-	1	1	2	q.s. to 1ml
MS-36	0.088	54.6	0.12	1	0.5	1	q.s. to 1ml

제제 개발의 마지막에 다음과 같은 후보 멀티-도즈 제제들이 확인되었다:

- 제제 B - 54.6 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml 폴록사머 188, 0.12 mg/ml L-메티오닌 및 2 mg/ml 벤질 알코올(0.2% 벤질 알코올)을 함유한 pH 3.5 아세트산염 완충제 3ml 내 264 mcg 인터페론 베타-1a

- 제제 A - 54.6 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml 폴록사머 188, 0.12 mg/ml L-메티오닌을 함유한 pH 3.5 아세트산염 완충제 2.7ml 중의 264 mcg 인터페론 베타-1a가 WFI 내 3% 벤질 알코올과 혼합되어 최종 멀티-도즈 제제(0.3% 벤질 알코올)이 얻어짐.

2.5 보존 효능 테스트(Preservative efficacy test)

다른 농도의 벤질 알코올(0.2% 내지 0.9%)을 함유한 멀티-도즈 제제들이 EP 및 USP 약전에 따른 보존 효능 테스트를 위해 선발되었다.

인디케이터(indicator)로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 검은곰팡이(Aspergillus niger) 및 칸디다 알비칸(Candida albicans)을 선택하여 예비 테스트를 실시하였다: 제제의 산성 pH는 그 자체로 박테리아(황색포도상구균)에 대한 정균 효과를 갖는다는 증거 및 칸디다 알비칸의 일부 세포주들이 낮은 pH 값(약 pH 2)에서도 심지어 생존한다는 보도 사실로 인해 테스테용 핵심 인디케이터로 칸디다 알비칸이 선택된다. 두 EP 및 USP 약전들에 기재된 보존 효능 테스트를 위한 허용기준들이 적용되었다.

2.6 후보 제제들

2.6.1 제제 A

약 140 카트리지/배치의 3개의 랩-스케일 배치들을 제조하였다; 상기 포뮬러를 표 6에 나타내었다:

표 6: 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제 A의 조성

IFNβ-1a	만니톨	폴록사머 188	L-메티오닌	11mM 아세트산나트륨 pH 3.5
97.8 mcg	60.7 mg	1.11 mg	0.13 mg	q.s. to 1.0 ml

활성 성분을 부형제 용액과 컴파운드한 후 0.22 ㎛ 나일론 막을 통과시켜 여과하였다; 카트리지에 2.7ml의 최종 용액을 채웠다. 상기 공정 동안에 활성 성분의 손실을 모니터하기 위해서 여과 전, 여과 후 및 충진 후에 샘플들을 채취하였다.

샘플들을 2-8℃(6개월), 25±2℃(3개월) 및 40±2℃(1개월)에서 저장하여 안정성을 테스트하였다.

WFI 내 3% 벤질 알코올의 6개 랩-스케일 배치들을 제조하여 활성 성분을 함유한 카트리지와 혼합하였다; 상기 배치들의 조성을 표 7에 나타내었다:

표 7: WFI 내 3% 벤질 알코올의 조성

벤질 알코올	WFI
30mg	q.s. to 1.0ml

벤질 알코올의 필요량을 WFI에 첨가한 후 0.22㎛ 두라포어(Durapore) 막을 통과시켜 여과하였다; 그리고 나서 카트리지에 0.5ml를 채우고 마지막으로 고압증 기멸균으로 소독하였다.

샘플들을 25±2℃에 저장하고 1개월까지 벤질 알코올 함량 및 pH를 테스트하였다.

2.6.2 제제 B

약 500 카트리지/배치의 3개의 랩-스케일 배치들을 제조하였다; 표 8에 그 조성을 나타내었다.

표 8: 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제 B의 조성

IFNβ-1^o	만니톨	폴록사머 188	L-메티오닌	벤질 알코올	10mM 아세트산나트륨 pH 3.5
88 mcg	54.6 mg	1 mg	0.12 mg	2 mg	q.s. to 1.0 ml

활성 성분을 부형제 용액과 컴파운드한 후에 0.22㎛ 나일론 막을 통과시켜 여과하였다; 카트리지에 3ml 최종 용액을 채웠다. 상기 과정 동안에 활성 성분의 손실을 모니터하기 위해서 여과 전, 여과 후 및 충진 후에 샘플들을 채취하였다.

샘플들을 2-8℃(6개월), 25±2℃(6개월) 및 40±2℃(3주)에서 저장하여 안정성을 테스트하였다.

2.6.3 보존 효능 테스트

두 후보 제제들에 대해서 EP 및 USP 약전에 따른 보존 효능 테스트를 실시하였다.

2.7 분석 테스트 및 방법

이하에 기재된 분석 테스트 및 방법이 랩-스케일 제제들의 안정성을 모티터 하기 위해 사용되었다:

pH (전위차 측정법)

단백질 정량 분석(RP- HPLC )

단백질의 정량이 C4, 와이드-포어 부틸 5㎛ 칼럼(Baker) 상에서 수행된다; 파장은 214nm에 설정되고 용리는 다음과 같은 이동상 및 기울기를 이용하여 1 mL/분으로 수행된다:

A = 물/ 트리플루오로아세트산 0.1%- B = 아세토니트릴 / 트리플루오로아세트산 0.1%- C = 아세토니트릴

기울기:

0분 70% A 30% B 0% C

5.0분 70% A 30% B 0% C

6.0분 58% A 42% B 0% C

15.0분 57% A 43% B 0% C

30.0분 46% A 54% B 0% C

35.0분 45% A 55% B 0% C

40.0분 40% A 60% B 0% C

40.1분 20% A 80% B 0% C

45.0분 20% A 80% B 0% C

45.1분 0% A 0% B 100% C

50.0분 0% A 0% B 100% C

50.1분 70% A 30% B 0% C

65.0분 70% A 30% B 0% C

런타임 = 65분

있는 그대로의 샘플(44 mcg/mL 샘플들) 100㎕ 또는 88 mcg/mL로 샘플들에 대해 동량의 플라시보(placebo)로 희석(1:1)하여 주입하여 샘플들을 분석하였다.

샘플들의 정량을 대조 기준 물질에 의해 준비된 0.0125 mg/mL-0.2 mg/mL 범위 내에서 표준 곡선과 대비하여 수행하였다.

산화된 형태(RP- HPLC )

산화된 형태의 정량이 40℃로 온도조절된 C4, 수펠코실(Supelcosil) LC-304 칼럼(Supelco)에서 수행된다; 파장은 208nm로 설정되고 용리는 다음과 같은 이동상 및 기울기를 이용하여 1 mL/분으로 수행된다:

A = 물 60%/아세토니트릴 40%/헵타플루오로부티르산 0.14%- B = 물 20%/아세토니트릴 80%/헵타플루오로부티르산 0.14% - C = 물 20%/아세토니트릴 80%/트리플루오로아세트산 0.1%

기울기:

0' 70% A 30% B 0% C

5' 70% A 30% B 0% C

58' 62% A 38% B 0% C 곡선 6

63' 0% A 100% B 0% C 곡선 1

68' 0% A 0% B 100% C 곡선 1

69' 70% A 30% B 0% C 곡선 6

런타임: 96분(70분+26분 평형)

있는 그대로의 샘플들을 200㎕(88 mcg/mL 샘플들) 또는 400㎕(44 mcg/mL 샘픔들)을 주입하여 분석하였다.

전체 응집체(SE- HPLC )

전체 응집체 함량의 검출은 TSK G2000SWXL 칼럼(TosoHaas) 상에서 수행된다; 용리는 아세토니트릴:물(30:70)+0.2% 트리플루오로아세트산을 이용하여 0.5 mL/분으로 일정용매 조성법(isocratic mode)으로 수행된다; 파장은 214nm로 설정된다. 런타임은 20분이다.

있는 그대로의 샘플들을 100㎕(88 mcg/mL 샘플들) 또는 200㎕(44 mcg/mL 샘플들)을 주입하여 분석하였다.

생물학적 활성도( 시험관내 생체검정)

생물학적 활성도는 바이러스의 세포병변효과에 대한 세포들(WISH 세포들-인간 양막 조직)의 IFN-β 유도 보호에 근거한 항바이러스 검정에 의해 측정된다.

오스몰농도 (빙점 측정)

오소몰농도 측정은 테스트된 용액에 대해 관찰된 어느점 강하에 기초한 빙점 측정에 의해 수행된다.

벤질 알코올 검정( GC )

벤질 알코올을 검출하는 GC 방법은 머크사에 의해 공급되는 벤질 알코올을 참조로 이용하여, 단일 지점 교정 접근(single point calibration approach)을 이 용한다. 또한 내부 표준(페닐에틸 알코올)이 양 테스트 샘플들, 대조군 샘플 용액 및 표준 용액의 피크 면적을 표준화하는데 사용된다. 상기 방법은 수펠코포트(supelcoport) 80/100 메쉬 상에서 10% 카보왁스(Carbowax) 20M을 구비한 6 feet x 2mm ID 스틸 칼럼 상에서 수행된다. 검출기는 FID(flame ionization detector: 불꽃이온화 검출기)이다.

결과는 ml 당 벤질 알코올의 mg으로 표시된다.

2.7.1 결과

2.7.1.1 프리 - 포뮬레이션

스트레스 조건(40℃)에서 검출된 산화된 형태 및 전체 응집체의 레벨을 표 9 및 10에 나타내었다:

표 9: 40℃에서 저장 시 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제들의 산화된 형태 %(RP-HPLC로 측정)

제제	조성	T=0	40℃에서 3일	40℃에서 6일
대조	Ace/Man/Plu/Met1	3.0	-	4.2
E	Ace/CR	2.8	2.7
F	Ace/PH	2.6	3.5	-
G	Ace/BA	2.6	6.3	-
H	Ace	3.6	2.7	-
I	Ace/Man/CR	2.3	3.0	-
J	Ace/Man/PH	3.6	2.5	-
K	Ace/Man/BA	4.0	4.7	-
L	Ace/Man	2.9	2.3	-
M	Ace/Man/PH	2.9	-	6.3
N	Ace/Man/Met1/PH	2.7	-	5.3
O	Ace/Man/Met2/PH	2.5	-	4.9
P	Ace/Man/Plu/PH	2.3	-	6.8
Q	Ace/Man/Plu/Met1/PH	2.2	-	7.2
R	Ace/Man/Plu/Met2/PH	2.1	-	4.2
S	Ace/Man/BA	2.6	-	5.0
T	Ace/Man/Met1/BA	2.7	-	5.0
U	Ace/Man/Met2/BA	2.5	-	4.8
V	Ace/Man/Plu/BA	2.5	-	5.0
W	Ace/Man/Plu/Met1/BA	2.6	-	5.0
X	Ace/Man/Plu/Met2/BA	3.0	-	6.2

표 10: 40℃에서 저장 시 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 제제들의 전체 응집체%(RP-HPLC로 측정)

제제	조성	T=0	40℃에서 3일	40℃에서 6일
대조	Ace/Man/Plu/Met1	3.2	-	3.2
E	Ace/CR	1.8	9.4	8.5
F	Ace/PH	2.2	39.8	9.4
G	Ace/BA	2.0	4.7	7.2
H	Ace	2.8	2.5	1.7
I	Ace/Man/CR	2.4	15.6	20.1
J	Ace/Man/PH	2.0	2.3	2.1
K	Ace/Man/BA	2.3	3.6	4.5
L	Ace/Man	3.0	3.2	2.3
M	Ace/Man/PH	2.2	-	4.4
N	Ace/Man/Met1/PH	2.2	-	5.8
O	Ace/Man/Met2/PH	2.3	-	8.8
P	Ace/Man/Plu/PH	2.2	-	40.3
Q	Ace/Man/Plu/Met1/PH	2.3	-	46.3
R	Ace/Man/Plu/Met2/PH	2.3	-	35.9
S	Ace/Man/BA	2.5	-	3.4
T	Ace/Man/Met1/BA	2.6	-	5.4
U	Ace/Man/Met1/BA	1.4	-	3.0
V	Ace/Man/Plu/BA	2.9	-	4.8
W	Ace/Man/Plu/Met1/BA	2.9	-	5.8
X	Ace/Man/Plu/Met2/BA	1.6	-	5.8

미생물 오염을 방지하는데 일반적으로 사용된 농도로, 각각의 정균제를 포함시키는 경우 산화된 형태의 증가가 측정되며 모노-도즈 제제(대조)와 비교하여 응 집체의 극적인 증가를 촉진한다.

0.5% 페놀 및 0.1% 폴록사머 188의 조합은 제품의 안정성에 부정적인 영향을 미치는데, 이는 약 40% 응집체가 발생하기 때문이다(제제들 P-Q-R). 0.3% m-크레졸은 다른 개발을 위해 제외되었는데, 이는 응집체 증가로 인해 제품의 안정성에 부정적인 영향을 미치기 때문이다(제제 I)

2.7.1.2 제제 개발

모든 안정성 데이터(원자료)가 섹션 테이블들에 수집된다; 상기 데이터를 평가하는데 선형 회귀 분석이 사용된다.

2.7.1.2.1 벤질 알코올을 함유한 제제들

도 1 내지 6에 나타나 있듯이, 고농도의 벤질 알코올(0.9%)은 산화된 형태 및 응집체 함량의 두 측면에서 제품의 안정성에 부정적인 영향을 미쳤다.

● 스트레스 조건(40℃) 하에서, 도 1에 나타나 있듯이, 0.9% 벤질 알코올을 함유한 제제들(MS-1 및 MS-2)에 대해서 산화 증가가 보다 높게 나타났다;

● 촉진 조건(2-8℃) 하에서, 도 2에 나타나 있듯이, 벤질 알코올이 없는 제제(MS-3, 대조)에 비하여 벤질 알코올을 함유한 모든 제제들에 대해서 산화 증가가 보다 높게 나타났다;

● 장기 저장(2-8℃) 시에, 0.9% 벤질 알코올을 함유한 제제들(MS-1 및 Ms-2)에 대해서 보다 높은 산화율이 관찰되었다; 0.45% 이하의 벤질 알코올을 함유한 제제들에 대해서도 필적할만한 분해율이 검출되었다(도 3).

응집체의 레벨에 대해서는 다음과 같은 관찰 결과가 얻어졌다:

● 스트레스 조건(40℃) 하에서, 도 4에 나타나 있듯이, 0.9% 벤질 알코올을 함유한 제제들(MS-1 및 MS-2)에 대해서 응집체의 증가가 관찰되었다;

촉진 및 장기 조건들(25℃ 및 2-8℃) 하에서, 도 5 및 6에 나타나 있듯이, 모든 제제들에 대해서 응집체의 증가가 관찰되지 않았다;

● 40℃에서 0.9% 벤질 알코올을 함유한 제제들(MS-1 및 MS-2)에 대해서 생리활성도의 감소가 관찰되었다; 25℃ 및 2-8℃에서 저당된 동일 샘플들에 대해서는 이러한 생리활성도의 감소가 관찰되지 않았다.

● 모든 온도에서 저장 시에 역가(titre)의 감소가 관찰되지 않았다.

● 모든 온도에서 저장 시에 pH 변화가 발생하지 않았다.

2.7.1.2.2 다른 정균제들(페놀, 클로로부탄올 , 페닐에탄올 )을 함유한 제제들

도 7 및 9에 나타나 있듯이, 페놀(MS-4 및 MS-5)은 산화된 형태 측면에서 제품의 안정성에 부정적인 영향을 미치는 반면에 클로로부탄올(MS-35) 및 페닐에탄올(MS-34 및 MS-34b)은 대조 용액(MS-3, 정균제가 없음)에 비하여 안정성을 나타내었다.

전체 응집체의 레벨의 경우, 도 9에 나타나 있듯이 페놀을 함유한 제제들(MS-4 및 MS-5)에 대해서 스트레스 조건(40℃) 시에 응집체의 극적인 증가가 관찰되었다; 보다 낮은 온도들(25℃ 및 2-8℃)에서는 응집체의 증가가 발생하지 않았다.

2.7.1.2.3 EDTA 를 함유한 제제들

0.1%-0.2% 벤질 알코올을 함유한 제제에 EDTA의 첨가(MS-32, MS-33, MS-36) 는 산화 레벨을 저하시키지 않았다(도 10); 0.1% EDTA 및 0.2% 벤질 알코올을 함유한 제제들(MS-32, MS-33)에 대해서 촉진 조건 시에 응집체 레벨의 증가가 관찰되었다(도 11); 2-8℃에서 필적할만한 분해가 관찰되었다:

2.7.1.2.4 보존 효능 결과

스크리닝 연구의 결과는 USP 및 EP 약전 기준이 적어도 0.3%와 동일하거나 높은 벤질 알코올의 농도에 대해서 만족된다는 것을 나타내었다(칸디다 알비칸의 경우).

2.8 후보 제제들

모든 데이터의 평가를 다음과 같은 방식으로 수행하였다: 각각의 배치에 대해 선형 회귀 분석을 수행한 다음, 배치-대-배치 변이성을 평가하기 위해서 공분산 분석(covariance analysis)(P-값 > 0.25)을 수행하였다; 저장 시에 변이성이 관찰되지 않았을 때에는 형식 통계 분석을 수행하지 않았다.

표 11: 후보 A의 제조 동안에 인터페론 베타-1 a 회수율 %

	RT-01	RT-02	RT-03
1차 여과 후	98.6	99.7	98.0
2차 여과 후	98.3	98.5	103.8
카트리지 내 최종 제품	98.4	97.5	100.7

2.8.1.2 활성 약물의 안정성

다른 온도에서 저장된 세 개의 배치들에서 산화된 형태의 레벨에 대해 공통 기울기 및 절편(intercept)을 계산하였다; 통계 분석 결과를 표 12에 나타내었다:

표 12: 인터페론 베타-1a 멀티- 도즈 후보 A(산화된 형태)에 대한 통계 분석 결과

2-8℃		25℃		40℃
합동 기울기(pooled slope)(%/주	합동 절편(%)	합동 기울기(%/주)	합동 절편(%)	합동 기울기(%/주)	합동 절편(%)
0.063	2.73	0.322	2.67	2.206	2.51

전체 응집체 레벨 및 검정에 대해서 유의성 있는 변이성이 관찰되지 않았다; 따라서 형식 통계 분석을 수행하지 않았다. 세 개의 배치들에 대한 응집체의 다른 레벨은 제조를 위해 사용된 벌크(bulk)들에서 다른 레벨에 기인한 것이다.

2.8.2 후보 B

2.8.2.1 제조 중 회수율

후보 B의 제조 동안에 수집된 공정 내 샘플들(여과 전 및 후, 최종 제품)에서 인터페론 베타-1a의 회수율을 표 15에 나타내었다: 활성 성분의 유의성 있는 손실이 기록되지 않았다.

표 15: 후보 B의 제조 동안에 인터페론 베타-1a 회수율 %

	MS-01	MS-02	MS-03
1차 여과 후	100.7	116.5	97.38
2차 여과 후	101.2	114.9	98.82
카트리지 내 최종 제품	100.6	112.0	95.76

2.8.2.2 활성 약물의 안정성

산화된 형태에 대해 수행된 통계 분석은 다음과 같다:

● 40℃의 3 배치들에 대해서 공통 기울기 및 절편을 계산하였다: 합동 기울기는 1.42%/주이며 합동 절편은 2.72%이다;

● 25℃의 3 배치들에 대해서는 공통 기울기를 계산할 수 없었다(P-값 = 0.095); 따라서, 가장 나쁜 케이스 접근(배치 MS-03)을 사용하였다: 1개월 저장 후에 산화된 형태의 1.17% 증가가 관찰되었다(0.27%/주);

● 2-8℃의 3 배치들에 대해서는 공통 기울기를 계산할 수 없었다(P-값 = 0.016); 따라서, 가장 나쁜 케이스 접근(배치 MS-03)을 사용하였다: 1개월 저장 후에 산화된 형태의 0.2% 증가가 관찰되었다(0.047%/주);

전체 응집체 레벨 및 검정에 대한 안정성 데이터에서 유의성 있는 변이성이 관찰되지 않았다; 따라서, 형식 통계 분석을 수행하지 않았다.

심지어 스트레스 조건(40℃) 하에서, 저장 시에 생리활성의 감소가 관찰되지 않았다.

2.9 결론

연구의 마지막에, 두 개의 후보 멀티-도즈 제제들에 대한 상당한 안정성 프로파일을 확인하였다:

● 후보 제제 B는 0.2% 벤질 알코올을 함유한 즉시 사용할 수 있는 멀티-도즈 제제이다;

● 후보 제제 A는 2개의 카트리지들(하나는 활성 성분 및 부형제를 함유하고 다른 하나는 최종 프리젠테이션에 도달하기 위해서 필요량의 벤질 알코올을 함유함)을 혼합한 후에 얻어지는 0.3% 벤질 알코올을 함유한 멀티-도즈 제제이다.

● 보다 높은 pH(4.5±0.2)에서 이러한 후보 용액들을 테스트하였으며, 안정성 프로파일에서 유의성 있는 변화가 나타나지 않았다. 출원인은 IFN 제제들의 이 러한 다소 높은 pH가 피하 주사의 국부적 내약성(tolerability)을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 따라서 pH 4.5 또는 4.7의 상기 2개의 후보 용액들은 환자의 적응(patient compliance) 측면에서 다른 이점을 제공할 수 있다.

실시예 3: 멀티- 도즈 -후보 제제 A의 제조방법

먼저 W.F.I.의 500g에 수산화나트륨 펠릿 20g을 용해시켜 수산화나트륨 1N 용액을 제조하였다.

그리고 나서 약 1800g의 W.F.I.에 빙초산 1.32g을 첨가하여 pH 3.5±0.2의 0.011M 아세트산나트륨 완충제를 제조하였다. 1N NaOH로 상기 용액의 pH를 pH 3.5±0.2로 조정하였다. 그런 다음 상기 용액을 2000g의 최종 무게로 취한다. 1N NaOH 또는 50% 희석된 아세트산으로 pH를 다시 3.5±0.2로 조정한다. 상기 용액을 2000g의 최종 무게로 취한다.

최종 용액은 다음과 같이 제조되었다.

계산된 양의 부형제의 무게를 달아 pH 3.5±0.2의 11mM 아세트산나트륨 완충제의 필요량에 용해시키고 용액의 pH를 체크하여 (필요하다면) pH를 조정한다; 그리고 나서 (CHO 세포들로부터 재조합 생산된) r-h 인터페론-베타-1a의 필요량을 첨가한다. pH 3.5±0.2의 11mM 아세트산나트륨을 첨가하여 최종 무게를 맞춘다.

이러한 최종 용액 1ml를 샘플로 취해 정량 RP HPLC로 테스트 하였다(샘플 BF = 1차 여과 전).

최종 용액을 스테인레스 스틸 홀더 안에 장착된 0.2㎛ 막을 통과시켜 여과하고 유리 비이커에 용액을 수집하였다.

이러한 최종 용액 1ml를 샘플로 취하여 정량 RP HPLC로 테스트하였다.

앞서 여과된 최종 용액을 스테인레스 스틸 홀더 안에 장착된 제2 0.2㎛ 막을 통과시켜 여과하였다.

2차 여과된 용액 1ml를 샘플로 취하여 정량 RP HPLC로 테스트하였다.

3ml 유리 카트리지에 최종 용액 2.7ml를 채우고 마개로 막았다.

이러한 용액은 WFI 내 3% 벤질 알코올 용액을 함유한 카트리지와 혼합될 준비가 되어 있다.

실시예 4 멀티- 도즈 -후보 제제 B의 제조방법

최종 용액은 다음과 같이 제조되었다.

계산된 양의 부형제의 무게를 달아 pH 3.5±0.2의 10mM 아세트산나트륨 완충제의 필요량에 용해시키고 용액의 pH를 체크하여 (필요하다면) pH를 조정한다; 그리고 나서 (CHO 세포들로부터 재조합 생산된) r-h 인터페론-베타-1a의 필요량을 첨가한다. pH 3.5±0.2의 10mM 아세트산나트륨을 첨가하여 최종 무게를 맞춘다.

이러한 최종 용액 1ml를 샘플로 취해 정량 RP HPLC로 테스트 하였다

3ml 유리 카트리지에 최종 용액 3ml를 채우고 마개로 막았다.

참조문헌

1. Study Group. The Lancet 1998; 352, 1498-1504.

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4. Familletti, P. C., Rubinstein, S., and Pestka, S. 1981 "A convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon, " in Methods in Enzymology, Vol. 78(S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 387-394;

5. Hultgren C, Milich DR, Weiland O, Sallberg M. (1988). The antiviral compound ribavirin modulates the T helper(Th) 1/Th2 subset balance in hepatitis B and C virus-specific immune responses. J Gen Virol 1998; 79: 2381-2391.

6. McCormick JB, King IJ, Webb PA, Scribner CL, Craven RB, Johnson KM, Elliott LH, Belmont-Williams R. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N Engl J Med. 1986 Jan 2; 314(1): 20-6.

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8. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology(S. Pestka, ed.), Academic Press, New York 119, 14-23.

9. Rubinstein S., Familletti, P.C., and Pestka, S. Convenient Assay for Interferons. J. Virol 1981; 37, 755-758.

10. Shepard H. M. et al., Nature 1981; 294, 563-565.

Claims

인터페론(IFN)을 포함하는 안정화된 HSA가 없는 액상 약제학적 조성물에 있어서, 상기 제제는 완충제, 계면활성제, 등장화제 및 항산화제를 포함하는 용액인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인터페론은 IFN-베타인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IFN-베타는 인간 재조합 IFN-베타인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 특정 pH의 플러스 또는 마이너스 0.5 단위 내에서 상기 조성물의 pH를 유지할 수 있는 양으로 존재하며, 상기 특정 pH는 3.5±0.2인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 3.5±0.2인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 4.5±0.2인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 약 5mM 내지 500mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 약 10 mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 아세트산염 완충제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 등장화제는 만니톨인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 등장화제는 약 0.5mg/ml 내지 약 500mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 등장화제는 약 55mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 플루로닉 F68인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 약 0.01mg/ml 내지 약 10mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 약 1mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제는 메티오닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제는 약 0.01 내지 약 5.0mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제는 약 0.1mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론은 약 10㎍/ml 내지 약 800㎍/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인터페론은 약 22, 44, 88 또는 264㎍/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 수용액인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 정균제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정균제는 벤질 알코올인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정균제는 약 0.1% 내지 약 2.0%의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정균제는 약 0.2 또는 0.3% 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 HSA가 없는 액상 약제학적 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 방법은 계산된 양의 계면활성제, 항산화제 및 등장화제를 완충제 용액에 첨가한 후 인터페론(IFN)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 액상 약제학적 제제를 포함하며, 사용 전 저장을 위해 멸균 조건 하에서 기밀 밀봉된 용기.
제27항에 있어서, 상기 용기는 모노-도즈 투여를 위해 미리-충진된 주사기인 것을 특징으로 하는 용기.
제27항에 있어서, 상기 용기는 바이알인 것을 특징으로 하는 용기.
제27항에 있어서, 상기 용기는 오토-인젝터용 카트리지인 것을 특징으로 하는 용기.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 용기는 모노-도즈 또는 멀티-도즈 투여를 위한 것임을 특징으로 하는 용기.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 멀티-도즈 투여용 키트에 있어서, 상기 키트는 제1항 내지 제21항 중 어느 항에 따른 약제학적 조성물이 충진된 제1 용기 및 정균제 용액이 충진된 제2 카트리지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.