CN1993138A - 稳定蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种制备稳定的单体蛋白质本体溶液的方法，该方法包括提供配制在缓冲液中的单体蛋白质本体和在该本体中加入辅料，所述辅料选自抑菌剂、表面活性剂、等渗剂、氨基酸、抗氧化剂及其组合。该单体蛋白质优选是IFN－β。

Description

稳定蛋白质的方法
技术领域
本发明总地涉及一种通过提供配制在缓冲液中的单体蛋白质本体(bulk)和在该本体溶液(bulk solution)中加入特定辅料来制备稳定的单体蛋白质本体溶液的方法。
背景技术
干扰素是一类细胞因子，即能在细胞之间传递信号的可溶性蛋白质，通过帮助摧毁引起感染的微生物和修复所导致的损伤而在免疫系统中发挥着重要作用。干扰素在自然情况下由受感染细胞分泌，在1957年第一次得到鉴定。它们的名字源于它们能“干扰”病毒的复制和繁殖。
干扰素显示具有抗病毒和抗增殖活性。根据其生化及免疫学性能，将天然产生的人干扰素分为三个主要类型：干扰素α(白细胞)，干扰素β(成纤维细胞)和干扰素γ(免疫细胞)。干扰素α目前在美国和其他国家已批准用于治疗毛细胞白血病、性病疣、卡波济肉瘤(获得性免疫缺陷综合征(AIDS)病人常患的一种癌症)，以及非甲非乙型慢性肝炎。
另外，干扰素(IFNs)是机体对病毒感染应答反应过程中产生的糖蛋白。它们能抑制病毒在受保护细胞中的繁殖。由低分子量蛋白质组成的IFNs的作用非常显著地没有特异性，即一种病毒诱导产生的IFN对广泛范围的其他病毒也有效。然而它们是物种特异性的，即一种动物产生的IFN只能激发同种或密切相关种类动物的细胞产生抗病毒活性。IFNs是第一类发现的具有潜在抗肿瘤和抗病毒活性的细胞因子。
IFNs的三种主要类型称为干扰素α，干扰素β和干扰素γ。IFNs的这些主要类型最初是根据它们的细胞来源(白细胞，成纤维细胞或T细胞)进行分类的。然而现已清楚，一种细胞可产生几种类型的IFNs。因此，白细胞IFN现称为干扰素α，成纤维IFN称为干扰素β，T细胞IFN称为干扰素γ。还有第四类IFN，即淋巴母细胞样干扰素，由“Namalwa”细胞系(衍生自伯基特淋巴瘤)产生，该细胞系似乎产生的是白细胞IFN和成纤维细胞IFN的混合物。
干扰素单位或国际单位(U或IU，国际单位)，据报告是用作IFN活性的衡量单位，其定义为保护50％的细胞免遭病毒损害所必须的量。可用于检测其生物活性的试验是如(Rubinstein，等.1981；Familletti，P.C.，等.，1981)所述的细胞病变作用抑制试验。在此干扰素抗病毒试验中，约1U/ml的干扰素是产生50％细胞病变(抑制)作用所必需的量。其单位可用国立卫生研究院所提供的人IFN-β国际参考标准品来测定(Pestka，S，1986)。
每一类IFN都含有几种不同亚型。IFN-β和IFN-γ各为单一基因的产物。
分类为IFN-α的蛋白质是多样性最高的一类，包含约15个亚型。IFN-α基因簇位于第九号染色体上，包含至少23个成员，其中15个有活性能被转录。成熟的IFN-α是非糖基化的。
IFN-α和IFN-β长度几乎相同(165或166个氨基酸)，具有相似的生物学活性。IFN-γ长146个氨基酸，与IFN-α和IFN-β相似程度较低。只有IFN-γ能够激活巨噬细胞或诱导T杀伤细胞成熟。这些新型治疗剂有时称为生物反应调节剂(BRM)，因为它们在机体抗肿瘤反应中具有作用，可通过免疫调节而影响识别。
人成纤维细胞干扰素(IFN-β)具有抗病毒活性，也能激活自然杀伤细胞对抗癌细胞。它是病毒和双链RNA诱导产生的分子量约20,000Da的一种多肽。用重组DNA技术克隆了成纤维细胞干扰素基因的核苷酸序列(Derynk等.1980)，并推断出该蛋白的完整氨基酸序列。它的长度为166个氨基酸。
Shepard等.(1981)描述了第842位碱基的突变(第141位半胱氨酸被取代为酪氨酸)消除了干扰素的抗病毒活性，和缺失了第1119-1121位核苷酸的变体克隆。
Mark等(1984)通过在碱基469位用腺嘌呤(A)取代胸腺嘧啶(T)插入一个人造突变，导致该蛋白质的第17位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸。据报道所产生的IFN-β与“天然的”IFN-β具有相同的活性并且在长期储存(-70℃)中稳定。
在干扰素疗法中近年开发的用于治疗多发性硬化症的Rebif(Serono公司生产的重组人干扰素-β)是IFN-β-1a，由哺乳动物细胞系所产生。其推荐的国际非专利药名(International Non-proprietary Names for PharmaceuticalSubstance，INN)是“干扰素-β-1a”。
作为治疗剂，和所有的蛋白质为基础的药物一样，IFN-β-1a应用中必须克服的一个主要障碍是由于药物制剂中该蛋白质的不稳定性可能导致的药物利用度丧失。
药品制剂中危害多肽活性和药效的物理不稳定性包括：变性和可溶及不可溶凝聚体的形成。而化学不稳定性包括水解、亚胺生成、氧化、外消旋和脱酰胺。已知这些变化中的一些可能导致感兴趣蛋白质的药物活性丧失或降低。其他方面，这些变化的精确影响尚不可知，但所产生的降解产物由于具有潜在的不良副作用而认为在药学上是不可接受的。
药物组合物中多肽的稳定性仍然是一个主要的麻烦和易失误问题(Wang(1999)Int.J.Pharm.185：129-188的综述；Wang和Hanson(1988)J.Parenteral Sci.Tech.42：S3-S26)。可加入多肽药物制剂中提高其稳定性的辅料包括：缓冲剂、糖类、表面活性剂、氨基酸、聚乙二醇和多聚体，但是这些化学添加剂的稳定作用根据蛋白质而不同。
目前的蛋白质制剂在最终蛋白质制品中采用了辅料。然而这些制品仍然是部分不稳定的。此外，具有单体生物学活性的蛋白质，即单体蛋白，在应力(如温度应力)作用下有聚合和凝聚倾向。
因此，需要一种方法来改进蛋白质的可溶性和提高单体蛋白质的稳定性以对抗凝聚和寡聚，从而提高它们的药物利用度。
发明概述
一方面，本发明提供一种制备稳定的单体蛋白质本体溶液的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供配制在缓冲液中的单体蛋白质本体，和
b)在该本体中加入辅料，所述辅料选自：
i)抑菌剂，
ii)表面活性剂
iii)等渗剂
iv)氨基酸
v)抗氧化剂
vi)等渗剂和抗氧化剂
vii)等渗剂、抗氧化剂和氨基酸
viii)氨基酸和抗氧化剂
ix)氨基酸、抗氧化剂和表面活性剂
x)抑菌剂和抗氧化剂，和
xi)抑菌剂、抗氧化剂和表面活性剂
此外，在实施本发明第一方面所述方法之前或之后，可在特定温度下培育所述本体蛋白质。
第二方面，本发明提供根据本发明第一方面所述方法获得的预配制的本体蛋白质。
第三方面，本发明提供了一种提高和/或维持单体蛋白质稳定性的方法，包括本发明第一方面所述的预配制本体蛋白质的方法。
附图说明
图1-实验室小规模热解聚方法。
图1显示实施例1a实验室小规模热解聚方法，涉及培育温度和培育时间对本体干扰素稳定性的影响。图1与表4相对应。
4轮F/T循环后0.9ml本体样品的SE-高效液相色谱(SE-HPLC)结果。
图2：报告了在29℃经实施例1b所述4轮F/T循环后实验室规模热解聚的结果。Y轴代表面积百分比。X轴代表检测到的重组人IFN-β-1a的形式，即凝聚体，二聚体或单体。检测到的各形式的第一直方柱是对照，对应于室温2小时融化、然后-4℃贮藏的本体预制剂。检测到的各形式的第二直方柱对应于室温2小时融化、然后29℃培育3小时的本体预制剂。检测到的各形式的第三直方柱对应于室温2小时融化，然后29℃培育15小时的本体预制剂。检测到的最后或第四直方柱对应于用水浴融化，然后29℃培育15小时的预制剂。图2与表11相对应。
图3：2轮F/T循环后200ml本体样品的SE-高效液相色谱(SE-HPLC)结果。
图3报告了在29℃经实施例1b所述的2轮F/T循环后实验室规模的热解聚结果。Y轴代表面积百分比。X轴代表检测到的重组人IFN-β1a形式，即凝聚体，二聚体或单体。检测到的各形式的第一直方柱都是对照，对应于室温7小时融化，然后-4℃贮藏的本体预制剂。检测到的各形式的第二直方柱对应于室温7小时融化，然后29℃培育15小时的本体预制剂。图3与表12相对应。
图4：实验室规模F/TX1循环时的热解聚动力学。蛋白单体随时间变化的百分比。
图4显示在29℃培育1轮F/T循环后重组人IFN-β1a单体随时间变化的百分比。Y轴代表面积百分比。X轴代表时间(小时)。图4的结果见表14。
图5：实验室规模F/TX1循环时的热解聚动力学。二聚体随时间变化的百分比。
图5显示在29℃培育1轮F/T循环后重组人IFN-β1a二聚体随时间变化的百分比。Y轴代表面积百分比。X轴代表时间(小时)。图5的结果见表14。
图6：实验室规模F/TX1循环时的热解聚动力学。凝聚体随时间变化的百分比。
图6显示29℃培育1轮F/T循环后重组人IFN-β凝聚体随时间变化的百分比。Y轴代表面积百分比。X轴代表时间(小时)。图6结果见表14。
图7：实施例2的预配制研究方案。
图7代表实施例2的研究方案，该研究关注从SEC-EL分级至最终剂型(FDF)贮存之间的操作步骤中最大程度减少重组人IFN-β1a的寡聚化，以提供稳定的本体干扰素-β。该方案在实施例2的6.2节中还有描述。
图8：实施例3的预配制研究方案。
图8代表实施例3的研究方案，该研究的目的是最大程度减少重组人IFN-β1a的寡聚化。采用了两种不同的方法：速度超离心法和SE-高效液相色谱分析法(SE-HPLC)来测量稳定本体IFN-β之后重组人IFN-β1a单体的水平。该方案在实施例3的6.1和6.2节中还有描述。
发明详述
本发明涉及一种制备稳定的单体蛋白质本体溶液的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供配制在缓冲液中的单体蛋白质本体，和
b)在该本体中加入辅料，所述辅料选自：
i)抑菌剂，
ii)表面活性剂
iii)等渗剂
iv)氨基酸
v)抗氧化剂
vi)等渗剂和抗氧化剂
vii)等渗剂、抗氧化剂和氨基酸
viii)氨基酸和抗氧化剂
ix)氨基酸、抗氧化剂和表面活性剂
x)抑菌剂和抗氧化剂，和
xi)抑菌剂、抗氧化剂和表面活性剂
申请人发现，如果在本体蛋白质中加入本专利申请书中详细描述的一种或多种辅料来使其稳定，那么这种稳定从本体蛋白质中加入一种或者多种辅料时即开始直至最后处理含该蛋白质的制剂，如最终被病人服用。因此，稳定不仅发生在贮存阶段，而是贯穿蛋白质在其生命周期直至被处理所面临的各阶段，即贮存前、贮存中及贮存后。本发明的方法能抵消蛋白质或蛋白质制剂在其生命周期内可能遭受的各种应力的作用。因此，不仅在制造过程中，而且在运输、贮藏和输送过程中均能稳定。
本发明也包括通过本发明方法得到的稳定的本体，也称为“预配制的本体(pre-formulated bulk)”。
本文中的术语“预制剂(preformulation)”指含有本体单体蛋白的制剂。这些预制剂的稳定性不仅指凝聚和寡聚化较低，还包括氧化、脱酰胺等其他有害过程较轻微。例如，本发明也包括其他过程，只要这些过程影响到单体蛋白质的稳定性。
术语“贮藏过程”指制剂或组合物制备后没有立即给予个体，而是制备后进行包装以液体形式或适合于给予个体的其他形式贮藏。
术语“干燥形式”指通过冻干、喷雾干燥或空气干燥等方法干燥的制剂或组合物。药物制剂中单体蛋白或其他组分形成的凝聚体物或寡聚体可能会对单体蛋白质的生物学活性产生不良影响，导致该药物制剂疗效丧失。而且，当用输液系统给予含单体蛋白质的药物组合物时，形成的凝聚体或寡聚体可能导致其它一些问题，如堵塞管道、膜或泵。
术语“稳定性”指蛋白质的活性，如抗病毒活性和/或蛋白质结构等随时间变化而保持相对恒定，根据需要，有一个功能性定义。术语“稳定性”也指本发明干扰素预制剂的物理、化学和构象稳定性(包括生物学效能的维持)。蛋白质分子的化学降解或凝聚形成更高级聚合物、脱糖基、糖基化修饰、氧化或可能导致本发明单体蛋白质至少一种生物学活性降低的其它结构性修饰，都可能引起蛋白质预制剂的不稳定。
一种“稳定性的(stable)”预制剂是指本文所述蛋白质的降解、修饰、凝聚、生物活性丧失等程度被可接受地控制、不会随时间推移而不可接受地增加。
术语“稳定的(stabilized)”指，与缺少本文所述加入到本体单体蛋白质或含单体蛋白质的制剂中的辅料时制备的单体蛋白质或制剂相比，显示稳定性提高和/或保持的本发明的单体蛋白质或含单体蛋白质的制剂。
如本文所用，术语“稳定化”可与“降低或/和防止蛋白质凝聚”和/或“降低或/和防止蛋白质寡聚”和/或“降低或/和防止凝聚体形成”和/或“降低和/或防止聚合”和/或“降低或/和防止氧化”和/或“降低和/或防止微胶束形成”和/或“降低和/或防止脱酰胺”和/或“降低和/或防止对单体蛋白质或含单体蛋白质制剂的任何种类有害作用”互换使用。
术语“单体”或“单体的”指只含有一条肽链的分子。
术语“本体蛋白质(bulk protein)”或“蛋白质本体”或“本体单体蛋白质(bulk monomeric protein)”或“单体蛋白质本体”本文指已通过制备过程的纯化步骤，但还没有通过最终配制步骤的蛋白质或单体蛋白质状态，其允许制备“最终剂型(FDF)”或“药物组合物”以进行最后包装和发送销售。因此本文认为重组蛋白质本体是在纯化步骤结束时产生的产物，但该产物还未通过最后配制步骤。换句话说，可认为本发明方法包括预配制步骤，其允许获得预配制的本体，通过加入其它辅料产生最终剂型或药物组合物。通常先贮藏预配制的或未配制的本体然后制备最终制剂，但也不一定。如果冷冻贮藏，本体蛋白质常需解冻、过滤、然后进入最终配制步骤，但也不一定如此。
根据本发明的具体实施方案，当所述蛋白质是重组人干扰素-β1a(r-hIFN-β1a)时，在最终层析步骤的洗脱液中加入稳定化辅料，所述的层析步骤例如是在进行过滤步骤之前或者是刚好在过滤步骤之后进行分子大小排阻层析(SEC)，本文称为“SEC-EL”或“SEC-EL2”，(参见实施例)。此时，SEC代表纯化过程的最终步骤。在其他纯化过程中，最后步骤可采用其他层析技术或分离方法，或者也可采用其他不依赖于分离方法作为最后纯化步骤的纯化方法；这不意味着限制如术语“本体蛋白质”所定义的本发明范围。只要在纯化程序之后加入稳定性辅料，无论采用哪种纯化方法均包括在本发明范围内。另外，也可将本发明所述的稳定性辅料加入到最终制剂(FDF)中。因此，FDF中含有的辅料可对应于加入到本体预制剂中的那些辅料，但并不一定如此。
“寡聚蛋白“或”寡聚体“本文用于指具有两个或多个多肽链的多亚基蛋白质。有时“寡聚蛋白”指具有两个或多个相同的亚基多肽链的蛋白质。所述寡聚体至少可区分为3种：
·快速可逆性非共价小寡聚体(二聚体，三聚体，四聚体等)
·不可逆性非共价寡聚体
·共价寡聚体(如二硫化物)
“多亚基蛋白质”是含有多个亚基的蛋白质。“亚基”指组成多聚体蛋白质的相同的或不同的蛋白质分子之一。
“寡聚化”指由较大或较小分子产生寡聚体的化学过程。“寡聚化”也指单体或单体混合物转变成寡聚体的过程。术语“寡聚化”还指单个蛋白分子通过非共价或共价相互反应形成多聚体的过程。寡聚化可以是可逆的，也可以是不可逆的。
术语“聚合”描述单体经反复混合而形成长或大的分子聚合物的化学反应过程，或单体或单体混合物转变为聚合物的过程。
术语“凝聚”指主要由于较小物质的非共价粘合而形成较高分子量物质的过程。具体对蛋白质而言，凝聚是一种变性形式，其中二级结构非极性表面，例如通常形成分子内相互作用并且包埋在蛋白内部的α-螺旋和β-折叠的非极性表面，被允许进行分子间相互反应并形成有时不可溶的多聚分子形式。术语“不可溶的”相比较于“可溶的”有时候分别指“不可逆的”相比较于“可逆的”。凝聚体也可定义为大的寡聚蛋白结合体(如：10个以上的多聚体)。非共价“凝聚体”可能是可逆的。
本发明不受限于以下定义：“凝聚”、“凝聚体”、“寡聚体”、“多聚物”、“寡聚”、“多聚”、“多聚的”、“寡聚的”、“聚合”，无论是那种定义。因此，本发明的范围不限于那些术语或者关于这些术语的任何理论。重要的是：“凝聚体”和“寡聚体”可通过检测方法(如SE-HPLC)而彼此区别，通常利用不同的可鉴别信号，如分离的各个峰；各峰对应于凝聚体或寡聚体。同样，蛋白质的单体形式对应于一个精确而唯一的明确的峰。
术语“缓冲液”或“生理学上可接受的缓冲液”指已知可安全地应用于药学或兽医学制剂中、具有维持或控制该制剂的pH在所需范围的化合物溶液。能控制pH在温和酸性pH至温和碱性pH范围的可接受的缓冲液包括但不限于：磷酸、乙酸、柠檬酸、精氨酸、TRIS和组氨酸这类化合物。“TRIS”指2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，和其药学上可接受的盐。优选的缓冲剂是乙酸缓冲盐水或可接受的盐。
“等渗剂”指生理学上可耐受的化合物，该化合物可以赋予药物适宜的渗透张力避免水份跨越接触该药物的细胞膜净流动。如甘油等化合物常以已知浓度用于此目的。其他合适的等渗剂包括但不限于：氨基酸或蛋白质(如甘氨酸或白蛋白)，盐类(如氯化钠)以及糖类(如葡萄糖、甘露醇、蔗糖和乳糖)。等渗剂优选甘露醇。
术语“抗氧化剂”指可防止氧或氧产生的自由基与其它物质相互反应的化合物。抗氧化剂是常加入到药物系统中以提高其物理和化学稳定性的多种辅料中的一种。加入抗氧化剂是为了最大程度减小或阻滞在一些药物或辅料接触氧或存在自由基时所发生的氧化过程。这些氧化过程常常受到光、温度、高浓度氢、存在的痕量金属或过氧化物所催化。亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硫脲、甲硫氨酸、乙二胺四乙酸盐(EDTA)、丁基羟基甲苯(BHT)和丁基羟基茴香醚(BHA)常用作药物中的抗氧化剂。已发现EDTA钠盐可通过与催化氧化反应的金属离子螯合而增强抗氧化剂的活性。最优选的抗氧化剂是甲硫氨酸。抗氧化剂本文也称为稳定剂。
甲硫氨酸可以其游离碱形式或盐形式存在。只要甲硫氨酸以其游离碱或其盐形式存在，在本发明的方法中或本发明的制剂中可采用甲硫氨酸的任何一种立体异构体(如L，D或DL异构体)。优选采用L型立体异构体。也可在本发明的制剂中采用甲硫氨酸的类似物。术语“甲硫氨酸类似物”指自然产生的甲硫氨酸的衍生物。甲硫氨酸类似物可以其游离碱形式或其盐形式用于本发明制剂中。
加入抗氧化剂(如甲硫氨酸)来提高或者维持稳定性是浓度依赖性的。即在本发明含干扰素-β的制剂中不存在抗氧化剂而正常情况下发生氧化、形成凝聚体/寡聚体时，提高抗氧化剂的浓度将导致提高和/或维持本发明含干扰素-β制剂的稳定性。可采用本领域技术人员通常知道的方法无须过多实验，不难确定本发明制剂中为了减少氧化或凝聚体/寡聚体形成所采用的氧化剂(如甲硫氨酸)的量。
术语“抑菌剂”指作为抗菌剂加入到制剂中的化合物或组合物。本发明含干扰素制剂的防腐制剂宜符合为商品化多用途活性产品防腐效果制定的法定或管理指南的要求。抑菌剂的例子包括苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷酯(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯及其类似物)、氯化苯甲烃铵，氯化苄乙氧胺，脱氢乙酸钠和硫柳汞。优选的抑菌剂是苯甲醇。苯甲醇本文也称为稳定剂。
术语“表面活性剂”指能降低液体表面张力或者降低两液体间或液体与固体间界面张力的化合物，表面张力是作用于液体表面，趋向于最大程度减小表面面积的力。有时在药物制剂中采用表面活性剂目的包括输送低分子量药物和多肽以改进该药物的吸收或将其输送给靶组织。优选的表面活性剂是Tween20或泊咯沙姆(poloxamer)。更优选的表面活性剂为泊咯沙姆188。甚至更优选的表面活性剂为TweenTM20。
术语“氨基酸”指氨基酸或氨基酸混合物，任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。当采用混合氨基酸时，所有的氨基酸可以其游离碱形式存在，或可以其盐形式存在，或一些以其游离碱形式存在而其他以其盐形式存在。本发明方法或制剂中所用的优选氨基酸是具有带电荷侧链的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更优选的氨基酸为赖氨酸和精氨酸。还要优选的氨基酸为赖氨酸。只要某特定氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在，本发明方法或制剂中可采用该特定氨基酸的任何立体异构体(如：L，D，或DL异构体)，或者这些立体异构体的组合物。优选采用L-立体异构体。本发明方法或制剂中也可采用这些优选氨基酸的类似物。术语“氨基酸类似物”指自然产生的氨基酸的衍生物。合适的精氨酸类似物包括，例如氨基胍和N-单乙基-L-精氨酸。和优选的氨基酸一样，这些氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形式用于本发明方法或制剂中。本文中氨基酸也称为稳定剂。
本发明的方法或制剂中所用的氨基酸能保护治疗性活性多肽，使其免遭各种应力的作用，因而提高了或/和维持了单体蛋白质或含单体蛋白质的制剂在该单体蛋白质生命周期(贮藏前、贮藏过程中、贮藏后)中的稳定性。这里，术语“应力”包括但不限于：热、冷冻、pH、光、搅拌、氧化、脱水、表面、剪切力、冷冻/解冻、压力、重金属、酚类化合物、变性剂等。术语“应力”包括任何能调节(即降低，维持或提高)(单体)蛋白质或含(单体)蛋白质的制剂稳定性的因素。加入氨基酸来提高和/或维持稳定性是浓度依赖性的。即当本发明的单体蛋白质或者含单体蛋白质的制剂中不存在氨基酸通常会形成凝聚体/寡聚体时，提高氨基酸的浓度将导致提高和/或维持本发明单体蛋白质或含单体蛋白质制剂的稳定性。可采用本领域技术人员通常知道的方法无须过多实验，不难确定本发明方法或制剂中为了减少寡聚体或凝聚体形成，从而提高在该单体蛋白质整个生命周期内单体蛋白质的稳定性，和提高所述制剂稳定性所采用的特定氨基酸的量。
“冷冻贮藏”指将预制备的单体蛋白质水溶液制剂在0℃以下，优选-20℃或以下，更加优选在-70℃冷冻与保存。
“冷冻/解冻循环”或“冷冻/解冻操作“指使用冻存的蛋白质样品时所用的已知技术，其中将蛋白质样品的温度提高到使其恢复液体状态水平足够时间以允许使用Rampie后，再将该样品冷冻到0℃以下回到冻存状态，优选在-20℃或以下，更优选-70℃。
本发明的目的是至少抵消单体蛋白质以及加入本发明本体蛋白质中的其他试剂、组分或化合物的凝聚和寡聚过程(本发明不仅限于这些过程)。因此，本发明能对加入到本发明本体中和将包含在所述蛋白质的最终剂型或药物组合物中的所有化合物、试剂(如抑菌剂、等渗剂)、蛋白质、表面活性剂、辅料赋予稳定性(如减少和/或抑制寡聚体和凝聚体的形成)。换句话说，不仅仅赋予(单体)蛋白质，而且赋予含(单体)蛋白质的“整个”制剂稳定性。凝聚不仅仅损害了生物学活性，而且可产生中和抗体(NAb)导致注射部位反应和免疫原性。
本文提供的实施例清楚地表明，在本体单体蛋白制剂中加入特定辅料后，可通过防止和/或抑制冻存或/和反复冻/融循环期间多肽凝聚体或寡聚体的形成，从而显著提高单体蛋白质制剂的稳定性和溶解性。另外，本发明证明热解聚能有效赋予(单体)蛋白质或含该(单体)蛋白质的制剂稳定性。
术语“热解聚”本文指多聚体形式的蛋白质在温度作用下转变为或者解聚成为还原的多聚形式或单体形式(如二聚体蛋白质置于特定温度下转变为单体)。制剂中的蛋白质是以复合多聚体形式(二聚体，三聚体等)存在。热解聚能有效地将所有的多聚体形式转变或解聚成为还原的多聚体或单体形式。本发明证明温度和多聚体解聚之间有相关性。当进行热解聚时，与未经热解聚的制剂相比，制剂所含的多聚体形式较少、单体形式增多。优选热解聚将所有的多聚体转变为单体形式。温度可立即设定为固定温度或呈梯度升高至特定温度。另外，本发明证明持续热解聚能有效稳定(单体)蛋白质或含(单体)蛋白质的制剂。本发明证明热解聚的持续时间与多聚体的解聚之间有相关性。实施例表明在热解聚过程中前几个小时热解聚最有效，直至达到某时间点而失效。热解聚是蛋白质特异性的。本领域技术人员采用常规技术，不难为某具体蛋白质设定合适的参数，如温度和持续时间，以获得最佳热解聚。
本领域的技术人员知道许多分析方法可用来测定降解产物，如凝聚、氧化、脱酰氨、剪切、表面吸附、表面变性、环状亚胺基形成、截短等。检测稳定性的方法包括但不限于：高效液相色谱(HPLC)、分子大小排阻HPLC(SEC)(样品或流动相中含有或者不含有变性剂，如SDS、盐酸胍、或有机溶剂)、反向(RP)HPLC、离子交换HPLC、电泳、疏水相互作用层析(HIC)、亲和层析、SDS-PAGE、用还原剂还原二硫键、天然凝胶电泳、毛细管电泳、分析型超离心、光散射、浊度试验和蛋白质浓度试验。结构稳定性研究可采用园二色性、荧光(内在的和疏水性探针结合的)、UV、FTIR、和/或差别性扫描量热计量法。因此，某特定辅料对单体蛋白质凝聚或寡聚的影响可通过，例如在溶液中可溶性单体蛋白随时间的变化来测定。
在分子大小排阻HPLC或SEC，也称为凝胶过滤层析或分子筛层析法中，设计的层析柱装有多孔基质，其可滞留小于孔径的分子，较大的分子被排斥而较早洗脱下来。大多数应用中都采用等度(isocratic)梯度。
下面从不同方面对本发明进行描述。
第一方面，本发明提供一种制备稳定的单体蛋白质本体溶液的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供配制在缓冲液中的单体蛋白质本体，和
b)在该本体中加入辅料，所述辅料选自：
i)抑菌剂
ii)表面活性剂
iii)等渗剂
iv)氨基酸
v)抗氧化剂
vi)等渗剂和抗氧化剂
vii)等渗剂、抗氧化剂和氨基酸
viii)氨基酸和抗氧化剂
ix)氨基酸、抗氧化剂和表面活性剂
x)抑菌剂和抗氧化剂，和
xi)抑菌剂、抗氧化剂和表面活性剂
还可将辅料或其组合物加入到最终制剂(FDF)中，而不是只加入到单体蛋白质本体中。换句话说，可在单体蛋白质本体的各个阶段和制备过程的最终配制步骤中加入辅料，但至少在单体蛋白质本体中加入一次。优选该单体蛋白质是干扰素。更优选该干扰素是IFN-β。还要优选该IFN-β是人重组IFN-β。
优选稳定该蛋白质避免凝聚和寡聚。
优选的抑菌剂是苯甲醇，表面活性剂是Tween20，等渗剂是甘露醇，氨基酸选自赖氨酸或精氨酸，抗氧化剂是甲硫氨酸。优选的辅料组合为：
1.等渗剂是甘露醇、抗氧化剂是甲硫氨酸；
2.等渗剂是甘露醇、抗氧化剂是甲硫氨酸、氨基酸是赖氨酸；
3.氨基酸是赖氨酸、抗氧化剂是甲硫氨酸；
4.氨基酸是赖氨酸、抗氧化剂是甲硫氨酸、表面活性剂是Tween20；
5.抑菌剂是苯甲醇、抗氧化剂是甲硫氨酸；或者
6.抑菌剂是苯甲醇、抗氧化剂是甲硫氨酸和表面活性剂是Tween20。
另外，可在特定温度下培育本体蛋白质以促进单体蛋白质的热解聚。优选该温度的范围是27℃-31℃。最优选该温度设定为29℃。或者，梯度升高温度直至达到上述的特定温度。优选培育过程至少3小时，或6-40个小时。更优选培育过程在15-30小时或10小时、16小时、18.5小时或24小时。甚至更优选培育24小时。可在本发明第一方面所述的预配制步骤之前或之后进行培育，但不限于此。可在制备过程的任何一个阶段，即也可以在最终配制步骤中，培育本发明第一方面所述已经稳定化的单体蛋白质。
第二方面，本发明提供了用本发明第一方面所述方法获得的预配制的本体蛋白质。
本发明第三方面提供了提高和/或维持单体蛋白质稳定性的方法，该方法包括本发明第一方面所述的蛋白质本体的预配制方法。
现通过优选实施方案来描述本发明的特定单体蛋白质干扰素、更优选IFN-β。
“干扰素”或“IFN”，如本文所用包括文献中如此定义的任何分子，这些分子包括，例如在上述“发明背景”中所提到的任何类型的IFN。具体说，在上述定义中包括IFN-α，IFN-β和IFN-γ。IFN-β是本发明的优选IFN。根据本发明，合适的IFN-β可从市场上购得，如Rebif(Serono)、Avonex(Biogen)或Betaferon(Schering)。根据本发明，也优选采用人源干扰素。术语干扰素，如本文所用，包括其盐、功能性衍生物、变体、类似物和活性片段。
术语“干扰素-β(IFN-β)”，如本文所用，包括成纤维细胞干扰素，特别是来源于人的，如从生物体液分离得到的、或用DNA重组技术从原核或真核宿主细胞得到的，及其盐、功能性衍生物、变体、类似物和活性片段。优选的IFN-β指干扰素β-1a。
术语“突变蛋白”本文用于指IFN的类似物，在该类似物中天然IFN有一个或多个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基，或缺失，或在IFN的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但所得产物的活性与野生型IFN相比无显著改变，得到的产物活性无显著改变。这些突变蛋白可用已知的合成技术和/或定点诱变技术，或其他已知的合适技术制备。优选的突变蛋白包括如Shepard等.(1981)或Mark等.(1984)所述的突变蛋白。
任何此类突变蛋白优选具有与IFN充分相同的氨基酸序列，因而具有与IFN基本上相似甚至更加优良的活性。干扰素的生物学功能是该领域技术人员所熟知的，而且其生物学标准品已建立可从例如国立生物学标准品和控制研究所购卖到(http：//immunology.org/links/NIBSC)。
IFN活性测定的生物学试验已有描述。例如可按Rubinstein等.，1981所述进行IFN试验。因此，可通过常规实验测定某给定的突变蛋白是否具有与IFN基本上相似，或者甚至更优越的活性。
可用于本发明的IFN突变蛋白，或其编码核酸，包括根据本文提供的说明和指南无须过多实验，本领域普通技术人员可用常规方法获得的有限的一组基本上相应的序列，如取代的多肽或多聚核苷酸。
本发明突变蛋白的优选变化是称为“保守”取代的变化。本发明多肽或蛋白质的保守性氨基酸取代，可包括某一组内的同义氨基酸取代，由于同义氨基酸具有基本相似的理化性能，同组内成员之间的取代将保存该分子的生物学功能。已清楚知道，也可在以上定义的序列中插入和缺失氨基酸而不改变其功能，特别是如果该插入或缺失只涉及少数的几个氨基酸，如30个以下，优选10个以下，而不去除或取代那些对功能构象起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。通过这种缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围。
优选的同义氨基酸分组是表I中所定义的那些。更优选的同义氨基酸分组是表II中所定义的那些；最优选的同义氨基酸分组是表III所定义的那些。
                          表I
                   优选的同义氨基酸分组
氨基酸                   同义组
Ser                      Ser，Thr，Gly，Asn
Arg                      Arg，Gln，Lys，Glu，His
Leu                      Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
Pro                      Gly，Ala，Thr，Pro
Thr                      Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
Ala                      Gly，Thr，Pro，Ala
Val                      Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
Gly                      Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
Ile                      Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
Phe                      Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
Tyr                      Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
Cys                      Ser，Thr，Cys
His                      Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
Gln                      Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
Asn                      Gln，Asp，Ser，Asn
Lys                      Glu，Gln，His，Arg，Lys
Asp                      Glu，Asn，Asp
Glu                      Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
Met                      Phe，Ile，Val，Leu，Met
Trp                      Trp
                  表II
          更优选的同义氨基酸分组
氨基酸                   同义组
Ser                      Ser
Arg                      His，Lys，Arg
Leu                      Leu，Ile，Phe，Met
Pro                      Ala，Pro
Thr                      Thr
Ala                      Pro，Ala
Val                      Val，Met，Ile
Gly                      Gly
Ile                      Ile，Met，Phe，Val，Leu
Phe                      Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
Tyr                      Phe，Tyr
Cys                      Cys，Ser
His                      His，Gln，Arg
Gln                      Glu，Gln，His
Asn                      Asp，Asn
Lys                      Lys，Arg
Asp                      Asp，Asn
Glu                      Glu，Gln
Met                      Met，Phe，Ile，Val，Leu
Trp                      Trp
                   表III
         最优选的同义氨基酸分组
氨基酸                   同义组
Ser                      Ser
Arg                      Arg
Leu                      Leu，Ile，Met
Pro                      Pro
Thr                      Thr
Ala                      Ala
Val                      Val
Gly                      Gly
Ile                      Ile，Met，Leu
Phe                      Phe
Tyr                      Tyr
Cys                      Cys，Ser
His                      His
Gln                      Gln
Asn                      Asn
Lys                      Lys
Asp                      Asp
Glu                      Glu
Met                      Met，Ile，Leu
Trp                      Met
在蛋白质中产生氨基酸取代(可用于本发明中获得IFN突变蛋白)的例子包括任何已知方法步骤，如以下专利中所述的方法步骤：授予Mark等的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的专利5,116,943，授予Namen等的专利4,965,195；授予Chong等的专利4,879,111；和授予Lee等的专利5,017,691；以及美国专利4,904,584(Shaw等)所述的赖氨酸取代的蛋白质。已描述了具体的IFN-β突变蛋白，如Mark等，1984。
术语“融合蛋白”指包含融合于另一蛋白质的IFN或IFN突变蛋白的多肽，例如，该融合蛋白在体液中具有延长的停留时间。因此IFN可融合于另一蛋白质、多肽等，例如免疫球蛋白或其片段。
本文所用“功能性衍生物”包括IFN衍生物以及它们的突变蛋白和融合蛋白，可用本领域已知的方法从作为残基侧链的官能团、或N-或C-末端基团来制备这些功能性衍生物，并且只要它们保持是药学上可接受的，即它们不破坏与活性IFN基本相同的蛋白质的活性并且不给含有该功能性衍生物的组合物带来毒性，则这些功能性衍生物都包括在本发明中。这些衍生物可(例如)包括聚乙二醇侧链；其可掩蔽抗原基并延长IFN在体液中的停留。其它衍生物包括羧基的脂族酯类、羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物或游离羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
本发明中的IFN“活性片段”或突变蛋白以及融合蛋白包括该蛋白分子多肽链的任何片段或前体，其为单独的或者和与其相连的分子或残基(例如糖或磷酸残基)一起，或该蛋白分子的凝聚物以及糖残基本身，只要与相应的IFN相比，所述片段的活性没有显著降低。
术语“盐”在本文指上述蛋白质或其类似物的羧基成的盐以及氨基的酸加成盐。可用本领域已知的方法形成羧基的盐，包括无机盐，例如，钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及与有机碱形成的盐，例如与胺(如三乙醇胺)、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等形成的盐。酸加成盐包括例如，与无机酸(例如盐酸或硫酸)形成的盐，以及与有机酸(例如乙酸或草酸)形成的盐。当然，这些盐必须保持与本发明相关的蛋白质(IFN)的生物活性，即结合相应受体并启动受体信号转导的能力。
根据本发明，尤其优选采用重组人INF-β以及本发明的化合物。
最近描述了一种特殊种类的干扰素变体。这种所谓的“共有序列干扰素”是非天然存在的IFN变体(美国专利6,013,253)。根据本发明的一个优选实施方式，将本发明的化合物与共有序列干扰素联用。
如本文所用，人干扰素共有序列(IFN-con)指一种非天然存在的多肽，其主要包括在大多数天然存在的人白细胞干扰素亚型序列的IFN-α代表性亚组中共有的氨基酸残基，在不存在所有亚型共有的氨基酸的那些位置中的一个或多个位置上，该多肽包含在该位置主要存在的氨基酸，并且决不包含任何在至少一种天然存在的亚型中都不存在于该位置的氨基酸。IFN-con包括但不限于美国专利4,695,623、4,897,471和5,541,293中称为IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列。可如上述专利所述或用其它标准方法制备编码IFN-con的DNA序列。
在另一个优选实施方式中，融合蛋白包括与Ig的融合。融合可以是直接连接，或通过短的接头肽，接头肽的长度可短至1-3个氨基酸残基或更长，例如长度为13个氨基酸残基。所述接头可以是例如序列为E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或包含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13个氨基酸的接头序列，该接头序列介于IFN序列和免疫球蛋白序列之间。产生的融合蛋白可具有改进的性质，如在体液中的停留时间(半衰期)延长、特异活性增加、表达水平提高或有利于融合蛋白的纯化。
在另一个优选的实施方式中，IFN融合于Ig分子的恒定区。优选地，其融合于例如人IgG1的重链区如CH2和CH3结构域。根据本发明，Ig分子的其它同工型也适于产生融合蛋白，所述其它同工型为例如同工型IgG2、IgG3或IgG4，或其它Ig类别，如IgM或IgA。融合蛋白可为单体或多聚体、异多聚体或均多聚体。
在另一个优选实施方式中，功能性衍生物包括连接于一个或多个官能团的至少一个部分，所述官能团是氨基酸残基的一个或多个侧链。优选该部分是聚乙烯(PEG)部分。可用已知方法进行PEG化，如WO99/55377中所述的方法。
本发明一般可应用于所有种类的干扰素，应用于上述的干扰素，并且还包括天然干扰素、用重组DNA技术产生的干扰素和化学合成或修饰产生的干扰素。术语干扰素还包括来自人或任何其它合适物种的成纤维细胞、白细胞、淋巴细胞或任何其它含有干扰素或产生干扰素的组织的粗制干扰素、半纯化干扰素和纯化的干扰素。更优选地，本发明可用于人成纤维细胞干扰素(干扰素-β)。
预制剂中优选IFN-β的浓度为或约为10μg/ml-2000μg/ml，更优选为或约为100μg/ml-1000μg/ml，最优选为或约为500-810μg/ml。
优选地，缓冲液的量足以维持所述组合物的pH值在特定pH值的上下0.5单位范围内，其中所述特定pH值约为3.5-5.5。更优选，pH为3.8、4.2或4.7。更优选，pH为4.7。优选地，缓冲液的浓度为或约为5mM-500mM。整个溶液中的缓冲液浓度可在为或约为5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM至500mM之间变动。优选缓冲液浓度为或约为10mM或50mM。尤其优选缓冲液为或约为50mM的醋酸盐离子，pH4.7。优选缓冲液为醋酸盐缓冲液，优选的抗衡离子为钠离子或钾离子。醋酸盐缓冲液是本领域熟知的。
优选等渗剂(例如甘露醇)浓度为或约为0.5mg/m1-500mg/ml。更优选等渗剂浓度为或约为55mg/ml。更优选等渗剂浓度为或约为150mM，或为或约为300mM或者为或约为600mM。
优选表面活性剂(即Tween 20)浓度为或约为0.01mg/ml-10mg/ml，更优选，表面活性剂浓度为或约为0.05mg/ml。
优选抗氧化剂(例如甲硫氨酸)浓度为或约为0.01-5.0mg/ml。更优选抗氧化剂浓度为或约为0.12mg/ml-0.24mg/ml。
优选氨基酸为赖氨酸或精氨酸。更优选氨基酸为赖氨酸。优选氨基酸浓度(例如赖氨酸或精氨酸)为或约为20-200mg/ml。优选赖氨酸浓度为或约为27mg/ml、为或约为55mg/ml、为或约为82mg/ml、为或约为164mg/ml。优选精氨酸浓度为或约为32mg/ml、或为或约为63mg/ml。
优选抑菌剂(例如苯甲醇)浓度为或约为0.01mg/ml-200mg/ml。更优选抑菌剂浓度为或约为5mg/ml、或为或约为10mg/ml。
本文引入的所有文献，包括刊物文章或摘要、公开或未公开的美国或国外专利申请、已授权的美国或国外专利或任何其它参考文献，均全文纳入本文作为参考，包括所引用文献中的所有数据、表格、图表和文本。因此，本文参考文献中引入的文献的全部内容也整体纳入本文作为参考。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的引用并非承认本发明的任何方面、描述或实施方式在相关领域中被揭示、教导或暗示。
以上对具体实施方式的描述将完全揭示本发明的总体特性，通过应用本领域一般常识(包括本文所引用的文献的内容)，其他人可容易地改动这些具体实施方式和/或调整这些具体实施方式的用途，这些改动和调整无需过多试验，也没有偏离本发明的总体概念。因此，根据本发明的教导和指引，这些调整和改动包括在所公开的实施方式的等同范围内。应理解，本文所用措词和术语是用于描述而并非限制，因此，本领域一般技术人员可根据本发明的教导和指引并结合本领域一般技术人员的知识来解释本发明的术语或措词。
实施例
以下实施例中使用的分析方法在实施例6中进行描述。
实施例1：培育温度和培育时间对本体干扰素稳定性的影响(热解聚)。
进行以下实验以评估解冻温度、培育温度和培育时间(持续时间)对本体干扰素-β稳定性的影响。目的是有效和恒定地降低制备过程中干扰素寡聚体和/或干扰素凝聚体的形成。以下实验主要应用于冻藏的本体干扰素制品(0℃以下，如-20℃或-70℃下贮藏的制品)，将该制品先融化，然后最终在给定的温度、给定的时间内培育或贮藏以进行进一步的制备处理。这些实验中的考虑也可应用于0℃以上(例如2-8℃)贮藏因此不经过解冻过程(或温度变化)但可能经受其它应力作用的制品。术语“静置的”指冻存制品的融化(如在培育箱，水浴或其他地方)，然后在给定温度下，在给定的时间内贮藏(如在培育箱，水浴或其他地方)；术语“静置温度”指解冻温度和培育温度；如果将冷冻制剂直接置于培育箱中，术语“培育温度”或“静置温度”可互换使用。“静置时间”指在特定温度下贮存的时间(如培育的时间)和解冻时间之和；如果将冷冻制剂直接置于培育箱中，术语“培育时间”或“静置时间”可互换使用。
1.a各种温度实验室小规模热解聚实验
在第一次实验中，测定了解冻温度为室温(RT)、或25℃、27℃或29℃，然后在25℃、27℃或29℃培育的效果，共16小时或24小时。该实验是在不干扰温度设置的情况下进行的，因此在整个过程中保持稳定。表4与图1总结了此过程。干扰素寡聚体和干扰素凝聚体用新型SEC-HPLC方法，本文称为NEW SEC来测定。该NEW SEC方法能定量和定性检测非共价和共价寡聚体。目的是优化本体干扰素的热解聚(TD)，在制备药物产品(损伤修复)之前，用下面的参数或变量将寡聚和/或凝聚降到最低。
1)培育温度(25℃、27℃和29℃)对热解聚效率的影响；
2)培育持续时间对热解聚效率的影响；
3)通过在培育箱中解冻来缩短解冻持续时间。
                                  表4
  实验          设置1         设置2   对照
  解冻温度/℃   RT   RT   RT   25   27   29   RT
 *培育温度/℃   25   27   29   25   27   29   RT
*解冻和培育时间共16小时或24小时。
室温对照进行一次，实验设置1进行了2次，实验设置2进行了3次。各条件都使用了装有小规模模式(里面装有1.8ml“新鲜”的本体干扰素的2ml NUNC试管，“插入的试管模式”)的250ml试管。培育箱用水保温夹套或用气体循环保温。
词汇表/缩写
Agg                 凝聚体
COA                 分析验证.
Dim                 二聚体
Deg                 降解物
FDF                 最终剂型
F/T                 冷冻和解冻
r-h IFN-β1a        CHO细胞产生的重组人干扰素-β1a(r-h IFN-β1a)
r-h IFN-βFDF       重组人IFN-β1a的最终剂型(r-h IFN-βFDF)
SE-HPLC             分子大小排阻高效液相色谱
SAB                 50mM醋酸钠，pH-3.8
Temp.               温度
1.新型SEC-HPLC方法的设备和材料：
HPLC系统：Waters Alliances
UV检测器：波长214nm的Waters 996 PDA
自动取样温度设定：4℃
层析柱：TosoHaas TSK G2000 SWXL
层析柱温度：室温
流动相：pH3.8、含50mM NaCl的50mM醋酸钠
制备：将5.84g NaCl溶解于2升pH3.8的50mM醋酸钠缓冲液中。在灭菌溶液单元中将醋酸加入到WFI中并用10M的NaOH溶液滴定至pH-3.8来制备醋酸缓冲液。
流速：0.5mL/min
注射体积：0.34-0.36mg/mL重组人IFN-β1a本体200μL
试剂：
醋酸，Merck编号K31358056
NaOH，Merck B197582
10M NaOH溶液
WFI
NaCl，JT BAKER产品编号3627-07
2.步骤—步骤如图1所述
1)将1.8ml新鲜重组人IFN-β1a本体插入(加入)到2ml NUNC试管中，-70℃在含有200ml水的250ml试管中冷冻。
2)3个试管在室温下解冻，分别在25℃、27℃和29℃确证的(validated)培育箱(固定温度随时间变化保持恒定)中培育，共16小时。解冻后和16个小时(解冻+培育)后，从试管中取样用NEW SEC测定。
3)3个试管在室温下解冻，分别在25℃、27℃和29℃确证的培育箱中培育，共24小时。解冻后和24小时(解冻+培育)后，从试管中取样用NEW SEC测定。
4)3个试管分别在25℃、27℃和29℃确证的培育箱中解冻和培育，共16小时。解冻后和16个小时(解冻+培育)后，从试管中取样用NEWSEC测定。
5)3个试管分别在25℃、27℃和29℃确证的培育箱中解冻和培育，共16小时。16个小时(解冻+培育)后从试管中取样用NEW SEC测定，-此培育箱中解冻后没有取样。
6)3个试管分别在25℃、27℃和29℃确证的培育箱中解冻和培育，共24小时。24个小时(解冻+培育)后从试管中取样用NEW SEC测定-此培育箱中解冻后没有取样。
7)1个试管在室温下解冻16个小时，在2-8℃下贮藏至多72小时，-此试管取样作NEW-SEC测定，作为此实验的对照。
8)为了评价对分子的影响，本试验在选定的条件下进行重复。用NEW SEC，IEF，QUANT-HPLC，ES-MS，BIOASSAY，DEG/OX HPLC，CZE检测培育的样品。试验结果与室温解冻16小时并在2-8℃贮藏的对照样品作比较。
3.结果：％Mon或％单体＝％重组人干扰素-β1a单体
％Agg＝％重组人干扰素-β1a凝聚体
·室温解冻和培育共16小时
将3×250ml含有插入物的试管-70℃冷冻和室温解冻，将这些试管温和地颠倒20次，取样并立即转移到3个培育箱(25℃、27℃以及29℃)中，解冻和培育时间共16个小时。样品2-8℃贮藏直至用NEW SEC-HPLC分析。结果如表5所示。
                   表5**培育持续时间-10个小时
  条件**   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体   解冻持续时间
  25℃   88.05   0.64   11.3 6小时21-22.3℃
  27℃   92.58   0.70   6.7
  29℃   95.7   0.56   3.7
·室温解冻和培育共24小时
将3×250ml含有插入物的试管-70℃冷冻和室温解冻，将这些试管温和地颠倒20次，取样并立即转移到3个培育箱(25℃、27℃和29℃)中，解冻和培育共24个小时。样品2-8℃贮藏直至用NEW SEC-HPLC分析。结果如表6所示。
                  表6 **培育持续时间-18.5个小时
  条件**   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体   解冻持续时间
  25℃   92.25   0.58   7.1 5小时30分钟21.6-22.2℃
  27℃   96.4   0.5   3.1
  29℃   97.31   0.44   2.2
·培育箱中解冻和培育共16小时
将3×250ml含有插入物的试管-70℃冷冻后，分别在3个培育箱(25℃、27℃和29℃)中解冻，解冻和培育共16小时后，将这些试管温和地颠倒20次。样品在2-8℃贮藏直至用NEW SEC-HPLC分析。结果如表7所示。
                  表7 **培育持续时间-16个小时
  条件**   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体   解冻持续时间
  25℃空气循环   90.22   0.52   9.2   3小时9分钟
  27℃水保温   93.53   0.56   5.9   5小时
  29℃水保温   95.95   0.47   3.6   3小时32分钟
·培育箱中解冻和培育共24小时
将3×250ml含有插入物的试管-70℃冷冻后，分别在3个培育箱(25℃、27℃和29℃)中解冻，将这些试管温和地颠倒20次，取样用NEWSEC-HPLC分析，培育共24小时(解冻+培育)。样品2-8℃贮藏直至用NEW SEC-HPLC分析。本试验在另一天重复进行，-这些试管解冻之后没有取样。结果如表8a和8b所示。
               表8a **培育持续时间24个小时
  条件**   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体   解冻持续时间
  25℃解冻后立即培育 77.48 1.63 20.89 3小时21分钟
  27℃解冻后立即培育 77.2 1.73 21.07 5个小时
  29℃解冻后立即培育 78.56 1.64 19.8 3小时30分钟
  室温解冻后立即培育 77.42 1.65 20.92 6个小时
                                表8b
  条件**   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体   解冻持续时间
  25℃-A   93.42   0.42   6.1 3小时8分钟
  25℃-B   93.15   0.51   6.3
  27℃-A   96.32   0.54   3.1 5小时
  27℃-B   96.22   0.57   3.2
  29℃-A   97.85   0.53   1.6 3小时30分
  29℃-B   97.58   0.51   1.9
4.结论：
从以上的实验可以得出以下几点：
·提高培育温度和持续时间可以提高热解聚效率。
·与室温解冻相比，当样品在培育箱中解冻时，解冻持续时间减少，因此可提高单体的水平。
·根据常规SEC HPLC、Deg/Ox HPLC、Quant-HPLC、ES-MS，生物学试验和CZE的结果，25℃、27℃和29℃解冻和培育多至24小时对重组人干扰素-β1a分子没有负面影响。
上述实验证明：通过调节前述冻存的本体干扰素的静置温度和静置时间而降低寡聚获得了显著的结果。
与制剂如何解冻(如室温解冻或在培育箱中解冻)无关，提高静置温度至一特定温度对干扰素单体水平具有有益效果。因此，静置温度和蛋白质单体水平之间有相关性；将静置温度从25℃提高到29℃导致蛋白质单体水平提高。当本体溶液温度设定在29℃时获得最好结果。优选将本体溶液置于培育箱中29℃培育。比较培育温度，观察到从25℃到29℃单体水平增加～5-6％。优选将冷冻制剂直接置于培育箱中，在培育之前不在室温下解冻(而在培育箱中解冻)。结果也显示培育解冻的本体干扰素10小时已产生了超过95％的单体百分比。如果在室温下解冻，测定的培育持续时间为10小时或18.5小时。如果在培育箱中解冻，测定的培育持续时间为16小时或24小时。
同样的，静置时间也是一个影响寡聚的因素。与静置条件(如室温下解冻后培育或者直接培育)无关，在静置时间和单体水平之间有相关性；较长的静置时间提高了蛋白质单体水平。静置时间24小时可得到最好的结果。比较静置时间，静置时间从16小时到24小时可得到～3％的单体增加。优选冷冻制剂的静置时间为24小时。更优选将冷冻制剂直接置于培育箱(在培育箱中解冻)中培育时间(静置时间)为24小时。
组合两个变量(静置时间和静置温度)，可达到～9％的单体增加。当比较培育的制剂与那些没有培育的制剂时，结果甚至更加显著。如果在解冻后直接分析制剂(没有进行培育)，得到77.48％的单体，而当冷冻制剂在29℃培育温度下直接培育24小时得到97.9％的单体。因此，通过优化这两个变量得到20％的单体水平差异。优选将本体干扰素静置温度设定为29℃，静置时间24小时。更优选将本体干扰素直接在29℃培育(在培育箱中解冻)，培育时间24小时(最好的结果是产生97.9％的单体)。
结论是：静置时间和静置温度，和优选培育温度和培育时间是对维持和/或提高本体干扰素预制剂或制剂稳定性具有重要影响的重要因素。
1.b经不同轮次F/T循环29℃实验室规模热解聚实验
此报告评价了29℃培育对重组人干扰素-β1a药物中二聚体和凝聚体水平的影响。
1.步骤：
a采用NEW-SEC法分析如表9中所示经不同轮次F/T循环解冻后29℃培育15小时或3小时的重组人干扰素-β1a本体样品。将重组人干扰素-β1a本体转移到7个15ml corning试管中(每管0.9ml)。将试管-70℃冷冻。还将干扰素-β-1a本体(事先冷冻并解冻的)转移到2个250ml corning试管中(每管200ml)，将试管-70℃冷冻。
              表9实验室规模热解聚实验的样品处理
样品   F/T循环轮次 解冻   SEC-HPLC分析前贮藏
  1   1   室温-2小时   4℃贮藏
2 1 室温-2小时   29℃干燥培育箱15小时
3 1 29℃循环水浴-4分钟   29℃干燥培育箱15小时
  4   4   室温-2小时   4℃贮藏
5 4 室温-2小时   29℃干燥培育箱15小时
6 4 室温-2小时   29℃干燥培育箱3小时
7 4 29℃循环水浴-4分钟   29℃干燥培育箱15小时
  8(250ml试管) 2 室温-7小时   29℃干燥培育箱15小时
  9(250ml试管)   2   室温-7小时   4℃贮藏
b为了评价培育干扰素-β-1a本体对该分子的影响，采用：Deg/Ox-HPLC，IEF，ES-MS，Quant-HPLC，CZE检测了培育的本体(在1轮F/T循环后)。
c另外，还进行了实验室规模的1轮F/T循环热解聚的动力学实验。一轮F/T循环后，从250ml试管中取出等份重组人干扰素-β1a本体放入15ml试管中在29℃培育箱中培育。
2结果：
1)室温解冻后，培育重组人干扰素-β1a本体(1F/T)，使单体水平从82.8％上升到97.57％，凝聚体水平从0.7％降到0.2％(见表10)。29℃培育(培育箱中)15小时使二聚体有效解聚；
2)水浴解冻后培育重组人干扰素-β1a本体，使单体水平从82.8％上升到96.7％，但凝聚体水平从0.7％升高至1.97％(见表10)。
         表10 一轮F/T循环后，0.9ml本体样品的SEC-HPLC检测结果
  凝聚体   二聚体   单体
  样品名称   ％面积   ％面积   ％面积
  1轮F/T，室温解冻2小时-4℃贮藏-对照   0.72   17.01   82.27
  0.69   15.88   83.43
  平均值   0.70   16.4   82.85
  1轮F/T，室温解冻2小时29℃培育-15小时   0.23   2.3   97.47
  0.19   2.14   97.67
  平均值   0.21   2.22   97.57
  1轮F/T，水浴解冻(29℃4分钟)29℃培育-15小时   1.97   1.43   96.6
  1.97   1.18   96.85
  平均值   1.97   1.30   96.72
3)室温解冻后，培育重组人干扰素-β1a本体(4F/T)3小时，由于二聚体水平降低，单体水平从82.3％上升到89.5％(见表11和图2)。
4)室温解冻后，培育重组人干扰素-β1a本体(4F/T)15小时，由于二聚体水平降低，单体水平从82.3％进一步上升到93.7％(与培育3小时相比较)(见表11和图2)。
5)水浴解冻后，培育重组人干扰素-β1a本体，由于二聚体水平降低，单体水平从82.3％上升到94.7％(见表11和图2)。
        表11 4轮F/T循环后，0.9ml本体样品的SEC-HPLC检测结果
  凝聚体   二聚体   单体
  样品名称   ％面积   ％面积   ％面积
  4轮F/T，室温解冻2小时-4℃贮藏-对照   2.89   14.16   82.95
  3.03   15.26   81.71
  平均值   2.96   14.71   82.33
  4轮F/T，室温解冻2小时29℃培育-3小时   2.98   7.66   89.36
  2.92   7.42   89.66
  平均值   2.95   7.54   89.51
  4轮F/T，室温解冻2小时29℃培育-15小时   2.97   3.45   93.58
  2.91   3.27   93.82
  平均值   2.94   3.36   93.7
  4轮F/T，水浴中解冻29℃下培育-15小时   2.89   2.38   94.73
  2.83   2.31   94.86
  平均值   2.86   2.34   94.79
6)室温解冻后，培育200ml重组人干扰素-β1a本体样品使单体水平从73％上升到91.2％，凝聚体水平从3.9％下降到2.9％(见表12和图3)。
         表12 2轮F/T循环后，200ml本体样品的SEC-HPLC检测结果
样品名称   聚集体   二聚体   单体
  ％面积   ％面积   ％面积
  200ml室温解冻7小时4℃贮藏-对照   4.06   23.3   72.64
  3.85   22.71   73.44
  平均值   3.9   23.0   73.04
  200ml室温解冻7小时29℃培育15小时   2.98   5.65   91.37
  2.95   6.05   91
  平均值   2.9   5.8   91.18
7)用以下试验分析培育的重组人干扰素-β1a本体样品(0.9ml，1F/T)以及室温解冻4℃保存的对照样品(见表13)：
Deg/Ox-HPLC-与对照样品(4℃贮藏)相比，培育的样品中未见氧化水平提高
ES-MS-与对照样品相比，培育样品中未见糖类水平有差异
Quant-HPLC-未见浓度有显著差异
CZE-得到了相同的电泳图谱
IEF-在循环水浴中解冻的重组人干扰素-β1a F本体样品显示在p1-7附近有一条额外条带。对照样品和室温解冻培育15小时的样品符合规定要求。
                                              表13热解聚对干扰素的影响
样品   Deg/Ox   ES-MS   IEF   Q HPLC   CZE
  ％   NON   单体   二聚体   三聚体   8.9-9   8.5   7.9-8.0   μg/ml
  1轮F/T室温解冻，4℃ 99.3 1 15 72 12 19 58 23 334 conf.
  1轮F/T室温解冻，29℃，15小时 99.4 1 15 71 12 20 55 24 338 conf.
  1轮F/T29℃解冻，29℃，5小时 99.4 2 16 70 12 15 56 28 363 conf.
如Deg/ox HPLC、ES-MS、Quant-HPLC CZE和IEF所测定的那样，室温解冻后培育15小时，不影响IFN-β1a分子的参数。
8)1轮F/T热解聚动力学实验结果见表14和图4-6中所示。
        表14实验室规模的F/T X1热解聚动力学实验
  时间/小时   单体   二聚体   凝聚体
  0   73.4   24.7   1.94
  3   90.04   8.54   1.42
  6   94.13   4.7   1.19
  9   95.09   3.79   1.12
  12   95.92   3.09   0.99
  15   96.56   2.54   0.91
  24   97.2   1.94   0.87
3.结论：
1)室温解冻后，29℃培育重组人干扰素-β1a样品15小时显著降低了寡聚化水平(主要为二聚体)
2)29℃水浴解冻后，29℃培育重组人干扰素-β1a样品15小时显著降低了寡聚化水平。
3)根据所用的分析方法，如Deg/ox HPLC、ES-MS、Quant-HPLCCZE和IEF所测定的那样，室温解冻后，29℃培育重组人干扰素-β1a样品15小时对IFN-β-1a分子参数没有负面影响。解聚非共价寡聚体有效，但并非所有的非共价寡聚体都解聚(在250ml试管中有4％的非共价寡聚体没有解聚)。250ml试管中单体百分比达到94％(29℃培育9小时)而小试管中达到97.57％(29℃培育15个小时)。在热解聚后寡聚体立即达到平衡(见表和图)。15ml试管中29℃15小时后热解聚完成。总之，本实验(1.a和1.b)证明，热解聚(体现为具体温度和持续时间(即静置温度和静置时间或培育时间和培育温度))对维持和/或提高(单体)蛋白质或含(单体)蛋白质的制剂的稳定性非常重要。干扰素-β的热解聚动力学结果还显示，经1轮F/T循环的样品热解聚仅在3个小时后就产生了90％的单体，6个小时后几乎完成，然后在15小时达到“平台”。优选进行热解聚至少3小时。更优选将干扰素-β的热解聚持续时间(静置时间或培育时间)设定在6-40小时。甚至还要优选将干扰素-β的热解聚持续时间设定在15-30小时，或10小时、16小时、18.5小时或24小时。甚至更优选干扰素-β的热解聚持续时间为24小时。培育或静置温度优选设定为27℃-31℃。更优选该温度为29℃。虽然热解聚动力学实验结果是在1轮F/T循环后得到的，但本领域技术人员不难用常规技术测定经多轮F/T循环后(如：2F/T，4F/T或11F/T；或在其他种类的应力后)热解聚的动力学，或者甚至测定任何干扰素-β(如重组人干扰素-β1a)或任何单体蛋白质整个制备过程或一部分制备过程中的热解聚动力学。因此本发明不限于某具体的培育时间或持续时间(或静置时间)。同样，本领域技术人员不难用常规技术测定在一轮或多轮F/T循环后(或在其他种类的应力后)最适宜的培育温度(或静置温度)，或者甚至测定任何干扰素-β(如重组人干扰素-β1a)或任何单体蛋白质整个制备过程或一部分制备过程中的最适宜培育温度。因此本发明不限于某具体的培育温度(或静置温度)。
实施例2：在本体干扰素中加入辅料来稳定干扰素-β
进行这些实验以验证一些辅料如氨基酸、抑菌剂、表面活性剂和等渗剂对保护本体重组人干扰素-β1a减少寡聚和凝聚的效果。进行以下研究时在本体重组人干扰素-β1a预制剂中没有加入人血清白蛋白(HSA)。
1.0词汇表/缩写
Agg                    凝聚体
COA                    分析验证
Dim                    二聚体
Deg                    降解物
FDF                    最终剂型
F/T                    冷冻和解冻
r-h IFN-β1a           CHO细胞产生的重组人干扰素-β1a(r-h IFN-β1a)
r-h IFN-βFDF          重组人IFN-β1a的最终剂型(r-h IFN-βFDF)
SE-HPLC                分子大小排阻高效液相色谱
SAB                    50mM醋酸钠，pH-3.8
Temp                   温度
2.0介绍
此研究关注从SEC-EL分级到FDF贮藏的制备步骤中最大程度降低r-hIFN-β1a的寡聚化，以提供稳定的本体干扰素-β。
通过以下步骤最大程度降低应力(如F/T)产生的寡聚：
1.用辅料和/或其他稳定剂但不存在HSA的情况下预配制本体。
2.评价贮藏温度(-20℃、-70℃和2-8℃)对预配制的本体寡聚化的影响。
用SE-HPLC分析预配制的本体样品。
3.0目的/范围
最大程度降低本体处理过程中r-h IFN-β1a的寡聚化。
4.0设备和材料
4.1设备
0.2μ过滤装置P/N MPGL025 Millipore
Millex 0.2μ针头式微孔过滤器-P/N SLGV025LS Millipore
250ml锥形离心管-Corning
1.8ml冷冻管-Nunc
4.2材料
a.SEC el2组分
b.D-甘露醇DAB，欧洲药典(Ph Eur)，英国药典(BP)，美国药典(USP)，美国《食品化学药典》(FCC)，美国标准E421(编号1.05980，Merck)
c.100％冰醋酸(编号1.00063，Merck)
d.10M氢氧化钠
e.泊咯沙姆188(Poloxamer 188，Lutrol F 68 DAC，美国药典USP/美国国家处方集NF，Basf)，5163315
f.L-甲硫氨酸(1.05707，Merck)
g.苯甲醇Ph Eur，BP，NF(编号1.00987，Merck)
h.L-精氨酸单盐酸盐(编号1.01544，Merck)
i.TweenTM 20欧洲药典(Ph.Eur)，美国国家处方集(NF)，(编号：8.17072，Merck)
j.赖氨酸(编号1.05701，Merck)
k.0.48-0.5mg/ml或0.088mg/ml的重组人干扰素-β1a
l.pH3.8、50mM或10mM醋酸盐缓冲液。
稳定剂
氨基酸：
1. 31.6mg/ml精氨酸
2. 27.4mg/ml赖氨酸
3. 0.12mg/ml甲硫氨酸(抗氧化剂)
表面活性剂：
1. 0.05mg/ml Tween20
2. 0.5mg/ml泊咯沙姆188(Pluronic acid)
抑菌剂：
1.5mg/ml苯甲醇
等渗剂：
1. 54.6mg/ml甘露醇
5.0步骤
进行SEC-EL 2组分研究。
研究的总体方案见图7所示。
不同的预配制条件见15和16所示。
                                    表15实验方案
  4℃   -20℃   -20℃   -70℃   -70℃
稳定剂   表面活性剂 抗氧化剂   2ml试管   250ml试管   2ml试管   250ml试管   2ml试管
  +   -   -   +   +   +   +   +
+ -   L-甲硫氨酸 + - + - +
+   Tween20   L-甲硫氨酸 + - + - +
+   泊洛沙姆188   L-甲硫氨酸 + - + - +
  -   -   -   +   +   +   +   +
稳定剂：苯甲醇/L-精氨酸/甘露醇/赖氨酸
                                     表16测试的预配制条件
条件   醋酸盐缓冲液pH   苯甲醇mg/ml   L-精氨酸HClmg/ml   甘露醇mg/ml   赖氨酸mg/ml   泊咯沙姆188mg/ml   Tween20mg/ml   L-甲硫氨酸mg/ml   试管数量
1   50mMpH-3.8 5 - - - - - -   4×250ml6×2ml
  2   5   -   -   -   -   -   0.12   6×2ml
  3   5   -   -   -   -   0.05   0.12   6×2ml
  4   5   -   -   -   0.5   -   0.12   6×2ml
5 - 31.6 - - - - -   4×250ml6×2ml
  6   -   31.6   -   -   -   -   0.12   6×2ml
  7   -   31.6   -   -   -   0.05   0.12   6×2ml
  8   -   31.6   -   -   0.5   -   0.12   6×2ml
9   -   - 54.6 - - - -   4×250ml6×2ml
  10   -   -   54.6   -   -   -   0.12   6×2ml
  11   -   -   54.6   -   -   0.05   0.12   6×2ml
  12   -   -   54.6   -   0.5   -   0.12   6×2ml
13对照 - - - - - - -   2×250ml6×2ml
  14对照   10mMpH-3.8 - - - - - - - 6×2ml
15 50mMpH-3.8 - - - 27.4 - - -   4×250ml6×2ml
  16   -     -   -   27.4   -   -   0.12   6×2ml
  17   -     -   -   27.4   -   0.05   0.12   6×2ml
  18   -     -   -   27.4   0.5   -   0.12   6×2ml
6.1溶液制备
6.1.1 1升50mM、pH-3.8醋酸钠溶液(SAB)的制备
将3.003g冰醋酸加入到1000mlWFI中混合5分钟。
加入约0.56ml 10M氢氧化钠调pH至3.8，混合溶液5分钟，取样测电导率，用0.2μ滤器过滤。在预制剂中泊咯沙姆188(或Pluronic F-68)的水平为0.1％(重要的微胶束浓度(Critical Micellar Concentration))，以防制备过程中容器表面吸附药物；较高的浓度可能对产物稳定性有负面影响(氧化较高)；较低的浓度可能抑制吸附的效果较差。
6.1.2制备1升的以下溶液：
1. 50mM醋酸盐、pH-3.8，10mg/ml苯甲醇
如6.1.1加入10g苯甲醇后加入氢氧化钠
2. 50mM醋酸盐、pH-3.8，5mg/ml苯甲醇
如6.1.1加入5g苯甲醇后加入氢氧化钠
3. 50mM醋酸盐、pH-3.8，63.2mg/ml精氨酸
如6.1.1加入63.2g精氨酸后加入氢氧化钠
4. 50mM醋酸盐、pH-3.8，31.6mg/ml精氨酸
如6.1.1加入31.6g精氨酸后加入氢氧化钠
5. 50mM醋酸盐、pH-3.8，54.8mg/ml赖氨酸
如6.1.1加入54.8g赖氨酸后加入氢氧化钠
6. 50mM醋酸盐、pH-3.8，27.4mg/ml赖氨酸
如6.1.1加入31.6g精氨酸后加入氢氧化钠
7. 50mM醋酸盐、pH-3.8，600mM甘露醇
将3.003g冰醋酸加入到0.926kgWFI中混合溶液5分钟。在该溶液中加入100.3g甘露醇混合5分钟。加入约0.56ml 10M氢氧化钠调pH至3.8，混合溶液5分钟，取样测电导率，用0.2μ膜过滤。
8. 50mM醋酸盐、pH-3.8，600mM甘露醇
将3.003g冰醋酸加入到0.966kgWFI中混合溶液5分钟。在该溶液中加入55.1g甘露醇混合5分钟。加入约0.56ml 10M的氢氧化钠调pH至3.8，混合溶液5分钟，取样测电导率，用0.2μ膜过滤。
6.1.3制备1升以下溶液：
1. 50mM醋酸盐、pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸。
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。
2. 50mM醋酸盐pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml泊咯沙姆188
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和50g泊咯沙姆188。
3. 50mM醋酸盐、pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween 20
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gr Tween 20
4. 50mM醋酸盐、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸
5. 50mM醋酸盐、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml泊咯沙姆188
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和50g泊咯沙姆188。
6. 50mM醋酸盐、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml Tween 20
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g Tween。
7. 50mM醋酸盐、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。
8. 50mM醋酸盐、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml泊咯沙姆188(Poloxamer 188)
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g泊咯沙姆188。
9. 50mM醋酸盐、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml Tween 20
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g Tween。
10. 50mM醋酸盐、pH-3.8、27.4mg/ml赖氨酸、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。
11. 50mM醋酸盐、pH-3.8、27.4mg/ml赖氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml泊咯沙姆188
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g泊咯沙姆188
12. 50mM醋酸盐、pH-3.8、27.4mg/ml赖氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml Tween 20
如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g Tween。
6.2本体预制剂
本体制备和组成的总体方案见图7和表15所示。
第一阶段
6.2.1将197g的SEC-EL用SAB、10mg/ml苯甲醇以1∶1w/w稀释
6.2.2将197g的SEC-EL用SAB、63.2mg/ml精氨酸以1∶1w/w稀释
6.2.3将197g的SEC-EL用SAB、600mM甘露醇以1∶1w/w稀释
6.2.4将197g的SEC-EL用SAB、54.8mg/ml赖氨酸以1∶1w/w稀释
6.2.5 92g SEC-EL用208g SAB稀释以制备含0.5mg/ml重组人干扰素-β1a的溶液。过滤后，将溶液分入两个250ml试管(含有130g本体)和6个2ml的试管(含有0.5ml本体)中。
一个250ml试管和两个2ml试管-70℃冻存。
一个250ml试管和两个2ml试管-70℃冷冻，然后转移到第二个冷冻罐中-20℃贮存。
两个2ml试管2-8℃贮存。
用水稀释SEC-EL以制备6ml含有0.088mg/ml重组人干扰素-β1a的10mM醋酸盐溶液，pH-3.8。
第二阶段
制备重组人干扰素-β1a浓度为0.5mg/ml的以下溶液。
6.2.6将6.2.1中制备的溶液用SAB，5mg/ml苯甲醇稀释
6.2.7将6.2.2中制备的溶液用SAB，31.6mg/ml精氨酸稀释
6.2.8将6.2.3中制备的溶液用SAB，300mM甘露醇稀释
6.2.9将6.2.4中制备的溶液用SAB，27.4mg/ml赖氨酸稀释
6.2.10过滤后，将这4种溶液(6.2.6到6.2.9)分入4个250ml试管(含有130g本体)和6个2ml试管(含有2ml本体)中。总共14个250ml试管和18个2ml试管。
将这3种溶液的剩余部分进一步加工(第三阶段)
6.2.11每种溶液2个250ml试管和2个2ml试管-70℃冻存。
每种溶液2个250ml试管和2个2ml试管-70℃冷冻，然后转移到第二个冷冻罐中-20℃贮存。
每种溶液2个2ml试管2-8℃贮存。
第三阶段(1∶100稀释)
6.2.12将6.2.6中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB，5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸稀释。
6.2.13将6.2.6中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物(Pluronic)稀释。
6.2.14将6.2.6中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween 20稀释。
6.2.15将6.2.7中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸稀释。
6.2.16将6.2.7中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀释。
6.2.17将6.2.7中制备29.7ml的溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween 20稀释。
6.2.18将6.2.8中制备的29.7m溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸稀释。
6.2.19将6.2.8中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀释。
6.2.20将6.2.8中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml Tween 20稀释。
6.2.21将6.2.9中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml赖氨酸、12mg/ml甲硫氨酸稀释。
6.2.22将6.2.9中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml赖氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀释。
6.2.23将6.2.9中制备的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml赖氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml Tween 20稀释。
6.2.24所有的溶液(6.2.12到6.2.23)分别用Millex 0.2μ针头式过滤器过滤。
6.2.25将溶液分入2ml试管中(每种溶液至少6个试管)
6.2.26每种溶液2个2ml试管-70℃冻存。
每种溶液2个2ml试管-70℃冷冻，然后转移到第二个冷冻罐中-20℃贮存。
每种溶液2个2ml试管2-8℃贮存。
6.3本体分析
室温解冻2小时后，用SE-HPLC分析在2-8℃、-70℃和-20℃贮存的每种预配制条件的一个2ml试管。将-20℃贮存的样品在解冻前移回-70℃贮存4小时。结果见表17所示。
室温解冻6小时后，用SE-HPLC分析在条件1、5、9、13和15(见表1)预配制的-70℃贮存的一个250ml试管。结果见表18所示。
另外，取1轮F/T循环后29℃培育8小时的15ml试管中的样品进行热解聚研究(F/T x1后从250ml试管中取出1ml样品)并用SE-HPLC分析(结果见表19)。
7.0结果
                     表17 贮存在-70℃、-20℃和2-8℃的Nunc试管(0.5ml)
                                       的预配制结果
  条件                                贮存条件
        2-8℃*        -20℃**          -70℃
  ％单体   ％凝聚体   ％单体   ％凝聚体   ％单体   ％凝聚体
  1BA   98.8   1.1   97.3   0.83   97.8   0.89
  2BA，MET   99   0.94   97.7   0.84   98.1   0.78
  3BA，MET，TW   98.7   0.14   98.9   0.85   99.1   0.84
  4BA，MET，POL   98.9   1.0   97.3   0.93   98.1   0.71
  5ARG   99.1   0.53   83.4   7.1   98.9   0.58
  6ARG，MET   98.9   0.52   84.6   5.1   98.8   0.66
  7ARG，MET，TW   98.6   0.8   97.5   2.5   99   0.49
  8ARG，MET，POL   98.9   0.7   76.6   12.1   98.9   0.43
  9MAN   99.9   0.05   81.2   1.3   97.8   0
  10MAN，MET   100   0   83.5   0.97   98.2   0
  11MAN，MET，TW   100   0   98.1   0.26   99.9   0
  12MAN，MET，POL   100   0   83.3   1.1   87.5   0.68
  1350mM醋酸盐对照   100   0   80.9   2.7   84   0.75
  1410mM醋酸盐   100   0   89   0   92.4   0.82
  15LYS   99.6   0   97.4   0   99.6   0.08
  16LYS，MET   99.4   0   99.4   0   99.4   0.03
  17LYS，MET，TW   99.1   0.18   99.4   0.23   99.6   0.13
  18LYS，MET，POL   99.5   0.24   86.7   2.3   96.7   0.59
 只有TWEEN20 - - - -   99.8   0.13
*2-8℃贮存3周。**-70℃冷冻，-20℃贮存16天，移回-70℃贮存4小时。结果为一式二份的平均值。本体缓冲液含50mM醋酸钠pH-3.8+辅料(BA-苯甲醇、MET-甲硫氨酸、MAN-甘露醇、TW-Tween 20、POL-泊咯沙姆)的不同组合。
                             表18在-70℃贮存、29℃培育8个小时(+INC)或不经29℃培育的250ml试管的预配制结果
条件 苯甲醇 -精氨酸HCl 甘露醇 赖氨酸   泊咯沙姆188   Tween20   L-Met   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体
  1-nunc   √   -   -   -   -   -   -   96.2   1.1   2.7
  1-(250ml管)   √   -   -   -   -   -   -   95.2   1.2   3.5
  1-(250ml管)+INC   √   -   -   -   -   -   -   97.6   1.08   1.3
  5-nunc   -   √   -   -   -   -   -   98.2   0.81   1.0
  5-(250ml管)   -   √   -   -   -   -   -   98.5   0.41   1.1
  5-(250ml管)+INC   -   √   -   -   -   -   -   99.46   0.58   0
  9-nunc   -   -   √   -   -   -   -   97.4   0   2.6
  9-(250ml试管)   -   -   √   -   -   -   -   78.1   0.52   21.4
  9-(250ml管)+INC   -   -   √   -   -   -   -   95.1   0   4.9
  13-nunc对照   -   -   -   -   -   -   -   82.1   1.2   16.6
  13对照(250ml管)   -   -   -   -   -   -   -   73.2   2.2   24.5
  13对照(250ml管)+INC   -   -   -   -   -   -   -   95.1   1.12   3.8
  15-nunc   -   -   -   √   -   -   -   99.6   0.02   0.42
  15-(250ml管)   -   -   -   √   -   -   -   99.4   0.03   0.61
  15-(250ml管)+INC   -   -   -   √   -   -   -   99.9   0.11   0
  Tween 20Nunc   -   -   -   -   -   √   -   98.1   0   1.84
  Tween 20Nunc+INC   -   -   -   -   -   √   -   99.8   0.04   0.13
结果为一式二份的平均值。
                表19经1轮F/T循环后15ml试管的热解聚
  添加剂苯甲醇   条件   单体   二聚体   凝聚体
  培育前   94.76   4.08   1.17
  29℃8小时后   97.58   1.34   1.08
  精氨酸   培育前   98.02   1.42   0.56
  29℃8小时后   99.43   0   0.58
  甘露醇   培育前   78.29   21.72   0
  29℃8小时后   95.08   4.93   0
  赖氨酸   培育前   99.3   0.62   0.09
  29℃8小时后   99.89   0   0.11
  Tween 20   培育前   98.15   1.84   0
  29℃8小时后   99.82   0.13   0.04
  对照   培育前   73.4   24.67   1.93
  29℃8小时后   95.09   3.79   1.12
8.0观察
在本体重组人干扰素-β1a中加入辅料一致地降低了二聚体和凝聚体的百分比(因而一致地提高了单体的百分比)。比较热解聚和所选辅料对重组人干扰素-β的作用，加入辅料可使单体水平轻度升高(降低二聚体和凝聚体水平)。另外，加入辅料而稳定的预制剂再经热解聚(如29℃培育)后甚至显示出更高的单体水平。
1.2ml试管
·4℃下
不同条件下单体％差异较小(最大的Δ为1.3％)，而含甘露醇的样品单体水平最高(100％)。
·-70℃下
甘露醇+Tween 20+甲硫氨酸的组合比赖氨酸略好。
不同组合中的所有稳定剂都能产生≥99％的单体％。
·-70℃下并在-20℃贮存
赖氨酸+Tween 20+甲硫氨酸组合获得了最高的单体百分比。
2.250ml试管
·-70℃
与其他测试的辅料相比，赖氨酸降低寡聚化水平具有明显的优势。
实施例3：用速度超离心、SEC和Deg/Ox HPLC分析在本体干扰素中
添加辅料后干扰素-β的稳定性
1.0词汇表/缩写
Agg                 凝聚体
Dim                 二聚体
Deg                 降解物
FDF                 最终剂型
F/T                 冷冻和解冻
r-h IFN-β1a        CHO细胞产生的重组人干扰素-β1a(r-h IFN-β1a)
r-h IFN-βFDF       重组人IFN-β1a的最终剂型(r-h IFN-βFDF)
SE-HPLC             分子大小排阻高效液相色谱
SAB                 50mM醋酸钠，pH-3.8
Temp                温度
1.0介绍
此研究关注从SEC-EL分级到FDF贮存的制备步骤中最大程度降低r-hIFN-β1a寡聚化以提供稳定的本体干扰素。
通过以下步骤将寡聚化降到最低：
1)在-70℃冷冻前，用辅料和/或其他稳定剂预配制本体
2)用辅料和/或其他稳定剂预配制本体，不冷冻，2-8℃运送
3)在2-8℃运送未经冷冻的r-h IFN-β1a本体，不进行预配制。
用SE-HPLC、Deg/Ox HPLC和速度超离心方法分析预配制的本体样品。SE-HPLC可能只检测共价寡聚体，而速度超离心还能够定性和定量检测非共价寡聚体。
3.0目的/范围
最大程度降低在本体处理过程中r-h IFN-β1a的寡聚化。
4.0设备和材料
4.1设备
0.2μ过滤装置P/N MPGL025 Millipore
-70℃Revco冰箱
蠕动泵
250ml锥形离心试管-Corning
1.8ml冷冻管-Nunc
4.2材料
SEC el2组分
D-甘露醇DAB，欧洲药典(Ph Eur)，英国药典(BP)，美国药典(USP)，FCC，E421(编号1.05980，Merck)
100％冰醋酸(编号1.00063，Merck)
10M氢氧化钠
L-甲硫氨酸(1.05707，Merck)
L-精氨酸单盐酸盐(编号1.01544，Merck)
赖氨酸(编号1.05701，Merck)
5.0步骤
进行SEC-EL2组分研究。
研究总体方案见图8所示。
不同的预配制条件见表20所示。
                                           表20预配制条件
  条件   L-精氨酸mg/ml   甘露醇mM   赖氨酸mg/ml   L-甲硫氨酸mg/ml   试管数量   贮存   最终pH值   mg/ml*
  1对照   -   -   -   -   1×250ml充满1×2ml充满1×2ml半满   2-8℃   3.9   495
  1×250ml2×2ml   -70℃
  2   31.6   -   -   -   1×250ml4×2ml   -70℃   3.83   420
  3   -   300   -   0.12   2×250ml充满4×2ml   2-8℃   3.92   507
  4   -   -   82.2   -   2×250ml4×2ml   -70℃   3.95   437
*用quant-HPLC测得。
6.4溶液制备
按实施例2制备溶液。
1.50mM，pH-3.8醋酸钠溶液(SAB)制备
见实施例2。
2.0.5升50mM、pH-3.8醋酸盐溶液、63.2mg/ml精氨酸制备
a.称重0.483kg WFI
b.加入31.6g精氨酸
c.混合溶液5分钟使精氨酸溶解
d.加入1.5g醋酸
e.混合溶液5分钟
f.测pH值时，加入约0.28ml 10M NaOH使pH达到3.8
g.溶液取样作电导率和pH测定
h.通过0.2微米过滤器过滤溶液
3.1升50mM、pH-3.8醋酸盐溶液、31.6mg/ml精氨酸制备
a.称重0.986kg WFI
b.加入31.6g精氨酸
c.混合溶液5分钟使精氨酸溶解
d.加入3.002g醋酸
e.混合溶液5分钟
f.测pH值时，加入约0.56ml 10M NaOH溶液使pH达到3.8
g.溶液取样作电导率和pH测定
h.通过0.2微米过滤器过滤溶液
4.1升50mM、pH-4.1醋酸盐溶液、164.4mg/ml赖氨酸制备
a.称重0.835kg WFI
b.加入164.4g赖氨酸
c.混合溶液5分钟使精氨酸溶解
d.加入3.002g醋酸
e.混合溶液5分钟
f.加入0.56ml 10M NaOH溶液使pH达到约4.1
g.溶液取样作电导率和pH测定
h.通过0.2微米过滤器过滤溶液
5.1升50mM、pH-4.0的醋酸盐溶液、82.2mg/ml赖氨酸制备
a.称重0.92kg WFI
b.加入82.2g赖氨酸
c.混合溶液5分钟使赖氨酸溶解
d.加入3.002g醋酸
e.混合溶液5分钟
f.加入0.56ml 10M NaOH溶液使pH达到约4.0
g.溶液取样作电导率和pH测定
h.通过0.2微米过滤器过滤溶液
6.1升50mM、pH-3.8醋酸盐溶液、600mM甘露醇、0.24mg/ml甲硫氨酸制备
a.称重0.92kg WFI
b.加入110.28g甘露醇
c.混合溶液5分钟使甘露醇溶解
d.加入3.002g醋酸
e.混合溶液5分钟
f.加入0.24g甲硫氨酸
g.混合溶液5分钟
h.测pH值时，加入约0.56ml 10M NaOH溶液使pH达到3.8
i.溶液取样作电导率和pH测定
j.通过0.2微米过滤器过滤溶液
7.2升50mM、pH-3.8醋酸盐溶液、300mM甘露醇、0.12mg/ml甲硫氨酸制备
a.称重1.93kg WFI
b.加入110.28r甘露醇
c.混合溶液5分钟使甘露醇溶解
d.加入6.006g醋酸
e.混合溶液5分钟
f.加入0.24g甲硫氨酸
g.混合溶液5分钟
h.测pH值时，加入约1.12ml 10M NaOH溶液使pH达到3.8
i.溶液取样作电导率和pH测定
j.通过0.2微米过滤器过滤溶液
6.1本体预配制
本体预配制和组成的总体方案见图8和表20所示。以下详述该预配制过程。
SEC-EL经OD280定量测定浓度为1.31mg/ml。
第一阶段(用不同缓冲液以1∶1w/w稀释SEC-EL2)
6.2.1用155g SAB、164.4mg/ml赖氨酸以1∶1(w/w)稀释155gSEC-EL
6.2.2用78g SAB、63.2mg/ml精氨酸以1∶1(w/w)稀释78g SEC-EL
6.2.3用220g SAB、600mM甘露醇、0.24mg/ml甲硫氨酸以1∶1(w/w)稀释220g SEC-EL
6.2.4用306g SAB稀释189g SEC-EL以制备含有0.50-mg/ml r-h IFN-β1a的溶液。过滤后将该溶液分入250ml试管和2ml nunc试管中，-70℃或2-8℃贮存，用于2-8℃运送的250ml试管装满至盖。
第二阶段(最终的本体稀释至0.50-0.58mg/ml r-h IFN-β1a)
制备以下溶液(目的浓度为0.5mg/ml r-h IFN-β1a)
6.2.5用90g SAB、82.4mg/ml赖氨酸稀释310g 6.2.1中制备的溶液。
6.2.6用48g SAB、31.6mg/ml精氨酸稀释156g 6.2.2中制备的溶液。
6.2.7用132g SAB、300mM甘露醇，0.12mg/ml甲硫氨酸稀释440g6.2.3中制备的溶液。
6.2.8过滤后，将这3种溶液(6.2.5-6.2.7)分入250ml试管和2ml试管(含有2ml本体)。
6.2.9将含有赖氨酸和精氨酸溶液的250ml试管和2ml试管-70℃冻存，含甘露醇和甲硫氨酸的溶液2-8℃贮存(250ml试管装满至盖)
6.3预配制的本体的处理
用速度超速离心、Deg/Ox HPLC和SE-HPLC测定-70℃和2-8℃贮存的样品。
7.0结果
                                                               表21
  条件   L-精氨酸mg/ml   赖氨酸mg/m1   甘露醇mM   甲硫氨酸mg/ml   贮存   pH   ％单体   ％凝聚体   ％二聚体   DEG/OXHPLC
  1对照SEC-HPLC - - - - -70℃ 3.9 77.6 1.6 20.8 1.1
  1对照AUC - - - -   80.4 2.2 17.4
  1对照SEC-HPLC - - - - 2-8℃   99.9 1.1
  1对照AUC - - - - 2-8℃   95
  2SEC-HPLC   31.6   -   -   -   -70℃ 3.83   99   0   1 1
  2AUC 31.6 - - - -70℃ 96.6 0.7 2.7
  3SEC-HPLC   -   -   300   0.12   2-8C 3.92   99.8   0.2   0 1.1
  3AUC   -   -   300   0.12   2-8C   95   0.6   4.4
  4SEC-HPLC   -   82.2   300   0.12   -70℃   3.95   99.6   0.4   0 1.1
  4AUC   -   82.2   300   0.12   -70℃   3.95   93.8   0.6   5.6
8.0观察
本研究中用速度超离心和SEC方法证实了实施例2获得的结果(单体水平％的差异可能是由于SEC只能检测到共价寡聚体而致)。另外，DEG/OXHPLC显示在本体r-h IFN-β1a中加入辅料后，氧化形式的水平保持稳定。
实施例4：在过滤步骤前后在本体干扰素中加入辅料稳定干扰素-β
1.0词汇表/缩写
Agg                凝聚体
COA                分析验证.
Dim                二聚体
Deg                降解物
Deg/Ox-HPLC        测定降解物和氧化形式的反相高效液相色谱
F/T                冷冻和解冻
Quant-HPLC         定量测定r-h IFN-β1a本体中r-IFNβ量的反相高效
                   液相色谱
r-h IFN-β1a       CHO细胞产生的重组人干扰素-β1a(r-h IFN-β1a)
r-h IFN-βFDF      重组人IFN-β1a的最终剂型(r-h IFN-βFDF)
SE-HPLC            分子大小排阻高效液相色谱
Temp               温度
2.0小结
采用SE-HPLC和速度超离心方法显示：在本体过滤之前或之后加入300mM甘露醇(冷冻前)预配制IFN-β-1a本体，经1轮F/T和4轮F/T循环，共价和非共价寡聚体和凝聚体减到最少。
过滤前加入300mM甘露醇更显著地降低了寡聚化水平，尤其是在250ml试管(盛放r-h IFN-β1a本体的常规容器)中的非共价寡聚体和凝聚体。
采用SE-HPLC和速度超离心方法显示：2-8℃贮存的未冷冻的r-h IFN-β1a本体中不形成寡聚体，但在r-h IFN-β1a本体冷冻和解冻过程中形成寡聚体。
3.0介绍
最大程度程度减少冷冻解冻循环中r-h IFN-β1a的寡聚和凝聚是所需的目标，因为认为蛋白质凝聚可引起免疫反应导致产生中和抗体。
目前用于测定本体中单体水平的分析方法是SE-HPLC。采用速度超离心得到的初步结果似乎表明，SE-HPLC只能检测到共价寡聚体而速度超速离心还可定性和定量检测非共价寡聚体(见实施例2)。此项研究采用SE-HPLC和速度超离心作为分析方法，来测定以生产规模用甘露醇预配制本体对r-hIFN-β1a寡聚和凝聚的影响。
4.1目的/范围
4.1.1测定SEC组分中(过滤前和冷冻前)是否有非共价凝聚体。
4.1.2测定在本体过滤前或后、冷冻前加入300mM甘露醇，经1轮或4轮F/T循环后是否能将共价和非共价寡聚体和凝聚体减至最少。
4.1.3测定在本体过滤前、冷冻前加入150mM甘露醇，经1轮或4轮F/T循环后是否能将共价和非共价寡聚体和凝聚体减至最少。
4.1.4测定在F/T循环后，1.8ml测试试管中的非共价凝聚体水平是否与250ml试管的水平相似。
5.0设备和材料
5.1设备
0.2μl50-500ml过滤装置Nalgene
5.2材料
SEC el2组分-800ml
甘露醇-Merck P/N 1.05980.9050
50mM、pH3.8醋酸盐缓冲液-IPL编号S88RD600
50mM、pH3.8、含300mM甘露醇的醋酸盐缓冲液(54.6g甘露醇/升)
50mM、pH3.8、含600mM甘露醇的醋酸盐缓冲液(109.3g甘露醇/升)
50mM、pH3.8、含150mM甘露醇的醋酸盐缓冲液(27.3g甘露醇/升)
250ml锥形离心管-Corning P/N 430776
1.8ml冷冻管-Nunc试管P/N 375418
6.0步骤
进行SEC el2组分的研究。
(浓度为1.81mg/ml，根据OD280)
6.1本体制备
如下制备本体：
(1)SEC el2组分
将装满的1.8ml试管速度超离心，在2-8℃运送。
(2)对照
将180ml SEC el2组分通过0.2μm过滤装置过滤，然后用720ml 50mM、pH-3.8的醋酸盐溶液洗涤滤器。-70℃冷冻前，将该本体分入4个250ml试管(每个200ml)和10个1.8ml冷冻管中。其中两个1.8ml试管不冷冻。将这两个装满的试管的其中一个在速度超离心分析前保存在2-8℃。
本体浓度为350μg/ml(根据quant-HPLC)。
(3)过滤后加入300mM的甘露醇
将180ml SEC el2组分通过0.2μm滤器过滤，然后用180ml的50mM醋酸盐、600mM甘露醇pH-3.8和540ml的50mM醋酸盐、300mM甘露醇、pH-3.8洗涤滤器。-70℃冷冻前，将该本体分入4个250ml试管(每个200ml)和10个1.8ml冷冻管中。其中两个1.8ml试管不冷冻。将这两个装满的试管的其中一个在速度超离心分析前保存在2-8℃。甘露醇最终浓度为300mM。该本体的浓度为344μg/ml(根据quant-HPLC)。
(4)过滤前加入150mM的甘露醇
将200ml SEC el2与200ml 50mM醋酸盐、300mM甘露醇溶液混合。将380ml此混合液通过0.2μm过滤器过滤，然后用570ml 50mM醋酸盐、150mM甘露醇、pH-3.8洗涤滤器。-70℃冷冻前，将该本体分入4个250ml试管(每个200ml)和10个1.8ml冷冻管中。其中两个1.8ml试管不冷冻。将这两个装满的试管的其中一个在速度超离心分析前保存在2-8℃。甘露醇最终浓度为150mM。该本体的浓度为342μg/ml(根据quant-HPLC)。
(5)过滤前加入300mM甘露醇
将200ml SEC el2与200ml 50mM醋酸盐、600mM甘露醇溶液混合。将380ml此混合液通过0.2μm过滤器过滤，然后用400ml 50mM醋酸盐、300mM甘露醇洗涤滤器。-70℃冷冻前，将该本体分入4个250ml试管(每个200ml)和10个1.8ml冷冻管中。其中两个1.8ml试管不冷冻。将这两个装满的试管的其中一个在速度超离心分析前保存在2-8℃。甘露醇最终浓度为300mM。该本体的浓度为342μg/ml(根据quant-HPLC)。
注意：通过有4个电控制的阀门的系统，将SEC柱洗脱液平行收集在4个1升玻璃瓶中，该电控制阀门每隔5分钟交替打开(由LCC500控制器控制)。在SEC-EL2组分过滤前加入甘露醇时，从SEC柱上洗脱时，在在线玻璃瓶中(glass bottle online)轻轻混合SEC组分和甘露醇溶液(4)或(5)。在SEC过滤后加入甘露醇时(3)，加入甘露醇并通过同一过滤装置过滤，但在SEC EL-2组分之后。
6.2冷冻和解冻
将250ml试管冷冻至少8个小时、室温解冻7小时，进行4轮F/T循环，。然后每轮解冻循环后25次颠倒混合试管内容物。将1.8ml试管冷冻至少8小时和解冻2个小时，进行4轮F/T循环。在下轮冷冻循环前20次颠倒混合试管内容物。对每种本体条件(2-5)，保存经1轮F/T循环和4轮F/T循环的2个冷冻250ml试管和2个1.8ml试管作速度超离心分析。每种本体条件的其他两个250ml试管和1.8ml试管解冻，用SEC-HPLC测试。
对解冻24±2小时的样品进行SE-HPLC试验和速度超离心。先使甘露醇溶解。
            表22各批SEC/本体批次测试样品列表
  样品描述   试管中的样品体积   试验
SEC 2-8℃(1)   1.8ml，1.8ml试管   速度超离心
本体2-8℃(1)   1.8ml，1.8ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心SE-HPLC
本体1F/T(2)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLC
  0.5ml，1.8ml试管   SE-HPLC
本体4F/T(2)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLC
  本体300mM甘露醇.(SEC过滤后加入)2-8℃(3)   1.8ml，1.8ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心SE-HPLC
本体300mM甘露醇.(SEC过滤后加入)1F/T(3)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLC
本体300mM甘露醇.(SEC过滤后加入)4F/T(3)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLC
  本体150mM甘露醇(SEC过滤前加入)2-8℃(4)   1.8ml，1.8ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心SE-HPLC
本体150mM甘醇.(SEC过滤前加入)1F/T(4)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLCQUANT HPLC
本体150mM甘醇.(SEC过滤前加入)4F/T(4)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLC
  本体300mM甘醇.(SEC过滤前加入)   1.8ml，1.8ml0.5ml，1.8ml   速度超离心SE-HPLC
  2-8℃(5)
本体300mM甘醇.(SEC过滤前加入)1F/T(5)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLC
本体300mM甘醇.(SEC过滤前加入)4F/T(5)   200ml，250ml试管1.8ml，1.8ml试管200ml，250ml试管0.5ml，1.8ml试管   速度超离心速度超离心SE-HPLCSE-HPLC
本体缓冲液(50mM醋酸盐缓冲液)   250ml，250ml试管(5个试管)250ml，250ml试管(5个试管) Chemscan平板法(Platemethod)
注：括号中的数字指总体方案。
7.0结果
7.1采用SE-HPLC方法，经1轮F/T循环后，在所有3种条件(3、4和5)下用甘露醇预配制对降低1.8ml试管和250ml试管中的寡聚化水平有轻度影响。(与对照样品相比纯度高～0.4％)。
采用超离心方法，经1轮F/T循环后，在所有3种条件(3、4和5)下甘露醇对1.8ml试管和250ml试管中的寡聚化水平都有显著作用。
在250ml试管中(表25)，与过滤后加入300mM甘露醇(条件3)相比，过滤前加入300mM甘露醇(条件5)对降低寡聚化有更积极(positive)的作用。
7.2采用SE-HPLC方法，经4轮F/T循环后(表26)，在所有3种条件下(3、4和5)甘露醇对1.8ml试管中的寡聚化水平都有显著作用(与对照样品相比，当用300mM甘露醇预配制时纯度提高～2.6％)
采用超离心，经4轮F/T循环后，在所有3种条件下(3、4和5)甘露醇对1.8ml试管和250ml试管中的寡聚化水平具有显著作用。然而，在1.8ml试管中这种积极作用更显著。
7.3用SE-HPLC和超离心二方法(表23)测定，2-8℃贮存样品(未冷冻)中未测到寡聚化。
7.4根据SE-HPLC和超离心结果，250ml试管的寡聚化水平显著高于1.8ml试管。
注意：表23-27的括号中结果是指凝聚体％。
        表23 2-8℃贮藏的1.8ml试管中本体纯度％
  试验                          条件
  2   4  3   5
  无甘露醇对照   150mM甘露醇过滤前加入  300mM甘露醇过滤后加入   300mM甘露醇过滤前加入
  SE-HPLC   100   100  100   100
  超离心   NA   NA  NA   NA
                 表24 1轮F/T循环后1.8ml试管中本体纯度％
  试验                                条件
  2   4   3   5
  不含甘露醇对照   150mM甘露醇过滤前加入   300mM甘露醇过滤后加入   300mM甘露醇过滤前加入
  SE-HPLC   99.4(0.5)   99.7(0.1)   99.7(0)   99.8(0.1)
  超离心   84.6(1.1)   88.1(0.5)   96.6(0.1)   94(0.9)
                   表25 1轮F/T循环后250ml试管中的本体纯度％
  试验                                  条件
  2   4   3   5
  不含甘露醇对照   150mM甘露醇过滤前加入   300mM甘露醇过滤后加入   300mM甘露醇过滤前加入
  SE-HPLC   1*   98.5(0.1)   98.6(0.1)   99(0.1)   98.8(0.2)
  2*   98.5(0.1)   98.6(0.1)   98.9(0.1)   99(0.1)
  平均值   98.5(0.1)   98.6(0.1)   98.95(0.1)   98.9(0.15)
  超离心   75.8(2.35)   78(2.22)   80.7(1.05)   86(0.35)
样品取自同一250ml试管
                     表26 4轮F/T循环后1.8ml试管中的本体纯度％
  试验                            条件
  2   4   3   5
  无甘露醇对照   150mM甘露醇过滤前加入   300mM甘露醇过滤后加入   300mM甘露醇过滤前加入
  SE-HPLC   1*   96.3(1.4)   98.3(0.4)   99(0.3)   99(0.3)
  2*   96.5(1.5)   98.3(0.4)   99.1(0.2)   98.8(0.3)
  平均值   96.4(1.45)   98.3(0.4)   99.05(0.25)   98.9(0.3)
  超离心   77(6.8)   92.7(0.9)   84.6(1.5)   86.1(0.7)
*样品取自不同的1.8ml试管。
                          表27 4轮F/T循环后250ml试管中的本体纯度％
  试验                                  条件
  2   4   3   5
  无甘露醇对照   150mM甘露醇过滤前加入   300mM甘露醇过滤后加入   300mM甘露醇过滤前加入
  SE-HPLC   1*   94(2.1)   93.8(0.9)   94.3(1.5)   93.8(1.4)
  2*   94(2.1)   93.8(1.0)   94.3(1.5)   93.8(1.5
  平均值   94(2.1)   93.8(0.95)   94.3(1.5)   93.8(1.45)
  超离心   72(6.29)   74(4.48)   76.4(3.63)   76.6(4.01)
*样品取自一个试管。
8.0结论
8.1采用SE-HPLC和速度超离心两种方法，当在本体过滤之前或之后加入300mM甘露醇(冷冻前)预配制r-h IFN-β1a本体时，经1轮F/T和4轮F/T循环后，共价和非共价寡聚体和凝聚体减至最少。然而，过滤前加入300mM甘露醇更显著地降低了寡聚化水平，特别是250ml试管(IFN-β-1a本体的常规容器)中的非共价寡聚体和凝聚体。
用甘露醇预配制本体，经F/T循环后，对r-h IFN-β1a寡聚和凝聚的影响在1.8ml试管中与250ml试管中相似(与对照样品相比，用SE-HPLC测定纯度提高约0.4％，而用速度超离心测定提高约13％)。
8.2在本体过滤前，冷冻前加入150mM浓度的甘露醇，经1轮F/T循环和4轮F/T循环后，减少了共价和非共价寡聚体和凝聚体，但是这种作用不如300mM那样显著。
8.3SE-HPLC和速度超离心二种方法显示，在2-8℃贮藏的、未冷冻的r-h IFN-β1a本体和SEC-EL无寡聚体形成，但在r-h IFN-β1a本体冷冻和解冻过程中形成寡聚体。
8.4速度超离心得到的初步结果似乎表明，SE-HPLC(与NEW SEC相反)只能检测出共价寡聚体而速度超离心还可定性和定量检测非共价寡聚体。未经F/T循环的4℃(或2-8℃)贮藏的样品非常稳定(根据％单体含量)。不希望受理论的束缚，据信应力，如冷冻/解冻循环对于分子的作用，均会增加干扰素-β寡聚体的形成。4℃贮存的样品中，最好的结果是联用甘露醇和甲硫氨酸和最后补加苯甲醇或Tween20时获得的，显示样品2-8℃贮存没有寡聚化。优选本发明方法联用甘露醇和甲硫氨酸作为稳定剂，还可加入苯甲醇或Tween20。单单赖氨酸或其任何组合也是可采用的优选辅料。一些辅料显示具有稳定活性可对抗F/T循环所产生的应力，即Tween20、苯甲醇或赖氨酸(即，已证明这些辅料能抵消冷冻/解冻应力)。如果制备过程包括冷冻/解冻循环，宜将优选的辅料，如Tween20、苯甲醇或赖氨酸加入到本体溶液中。
因此，当制备过程包括F/T循环时，也鉴定了优选的辅料及其组合。本发明-20℃贮存的样品经多轮F/T循环(试管先-70℃冷冻然后再转移到第二个冷冻罐中-20℃贮存16天。然后样品在解冻前移回-70℃贮存4小时。)。根据以上所述，当经历应力如F/T循环时，优选采用Tween20、苯甲醇和赖氨酸作稳定剂。因此，在任何贮存温度(-70℃，-20℃或4℃)和存在F/T循环应力时，Tween20、赖氨酸和苯甲醇单独或联用是本体干扰素溶液中的优选辅料。以下组合尤其优选：
1.赖氨酸和苯甲醇
2.赖氨酸和Tween20
3.赖氨酸和苯甲醇和Tween20，和
4.苯甲醇和Tween20
以下实施方案是在任何贮存温度(-70℃、-20℃或4℃)下和在F/T循环应力存在时最优选的实施方案。就单体％和凝聚体％而言，在-20℃以及4℃和-70℃时赖氨酸产生了很好的结果。赖氨酸是经测试的唯一能够抵抗冷冻/解冻应力而稳定干扰素-β的氨基酸。因此，赖氨酸是最优选的抗F/T循环应力的辅料，避免了对抗菌剂(如苯甲醇)或表面活性剂(如Tween20)的需要，它们是显示了抗F/T应力的稳定活性的另外两种辅料。因此，可考虑预制剂中只包含赖氨酸或赖氨酸与抗氧化剂(如甲硫氨酸)的组合。-20℃时的最好结果事实上是由赖氨酸和甲硫氨酸组合而获得的。更优选本发明采用赖氨酸和甲硫氨酸的组合。甘露醇、甲硫氨酸和Tween20的组合获得了高水平的单体百分比(98.12％单体)。苯甲醇和甲硫氨酸的组合产生了很高的单体百分比(～98％单体)。因此，苯甲醇和甲硫氨酸的组合是优选的。也可将Tween20加入到这种组合中，产生更高的单体百分比(～99％)。因此，更优选苯甲醇、甲硫氨酸和Tween20的组合。
在整个制备过程中的两个特定步骤中进行了实验。在过滤前或后加入某种辅料(如甘露醇)能降低和/或减少寡聚体和凝聚体的形成。采用SE-HPLC和速度超离心法，在本体过滤前或后加入300mM甘露醇(冷冻前)预配制r-hIFN-β1a本体，经1轮F/T循环或4轮F/T循环后，共价和非共价寡聚体和凝聚体降至最低。本发明因此不应只限于本体蛋白质制备过程中某一特定步骤，而可包括预配制的本体蛋白质的制备和/或贮存所需要的所有步骤(即，可在本体处理的多个不同步骤中加入稳定性辅料)。结果显示就寡聚和凝聚而言没有很大的不同，但在过滤前加入甘露醇会产生更好的结果，特别是对于250ml试管中的非共价寡聚体和凝聚体。因此优选在过滤步骤前加入甘露醇。
最后，上述实验显示：与分别使用时获得的水平相比，某些辅料与热解聚相组合可产生更高水平的单体百分比。通过此方法，二聚体和凝聚体的水平显著减少。因此，本发明优选将通过加入辅料而稳定的本体溶液与热解聚相结合。热解聚步骤可在生产过程的任何阶段实施，不应限于本体处理过程的某一特定步骤。
实施例5：pH4.7的预制剂研究
为评价pH对寡聚体和凝聚体形成的影响，在pH4.7进行了预配制研究。
(1)步骤：
1.通过1∶1混合(1体积的SEC E12组分与1体积的50mM、pH7.2(用NaOH滴定)的醋酸盐溶液混合)，预配制pH为4.7的约0.5mg/ml的第一种本体。
2.通过1∶1混合(1体积的SEC E12组分与1体积的50mM、pH7.2(用NaOH滴定)、含164.4mg/ml赖氨酸的醋酸盐溶液混合)，预配制pH为4.7的含82.2mg/ml赖氨酸的第二种本体。
3.将这些制剂与用50mM、pH3.8醋酸盐配的0.5mg/ml对照和用50mM、pH3.9、含82.2mg/ml赖氨酸的醋酸盐预配制的对照作比较。
4.在1.8ml试管中经一轮冷冻解冻循环后，用新型SEC-HPLC方法检测样品。
结果：
                              表28
  条件   ％单体   ％二聚体   ％凝聚体
  pH 3.8   81.41   17.92   0.67
  pH 4.7   99.1   0.9   0
  pH 4.7   99.4   0.6   0
  pH 4.7+82.2mg/ml赖氨酸   99.6   0.24   0.12
  pH 3.9+82.2mg/ml赖氨酸   99.7   0.03   0.27
(2)结论：
·与pH3.8时相比，pH4.7的预制剂降低了寡聚体和凝聚体的形成(分别为～99％单体比～81％单体，0％凝聚体比0.67％凝聚体)。因此，本发明的方法宜在pH4.7实施。
·含赖氨酸的pH 3.9或pH 4.7的预制剂寡聚化减少。在pH4.7时，加入赖氨酸产生了99.6％的单体，而不加入赖氨酸产生99.1％的单体。在pH3.8时，加入赖氨酸对减少寡聚有显著作用，产生99.7％的单体，与之相比不加赖氨酸的单体为81.41％。因此，在本发明中方法中赖氨酸是优选加入的氨基酸。
·采用pH4.7预配制和赖氨酸相组合产生了最好的结果。因此，本发明的方法最优选采用pH4.7和加入赖氨酸作为辅料。因此在最优选的实施方案中，本发明的方法可在pH4.7的本体干扰素中加入优选辅料，并结合热解聚。
实施例6-分析方法
本实施例描述采用的不同分析方法。
采用分子大小排阻(SE)-HPLC、新SE-HPLC本文也称为“新型SE-HPLC”或“NEW SEC”，和速度超离心(AUC)检测重组人干扰素-β1a(r-hIFN-β1a或r-hβIFN-1a)中的凝聚体和寡聚体水平。所述NEW SE-HPLC和AUC方法能定性和定量检测共价和非共价寡聚体和凝聚体。
a.SE-HPLC-纯度测试
用SE-HPLC测定IFN-β-1a本体中凝聚体的数量。
步骤
分析100μl待测IFN-β-1a本体样品和对照样品(PRB)。
制备以下溶液：30％ACN(乙腈)/0.2％TFA(三氟乙酸)/H2O。
层析柱(Progel-TSK G2000或等同物)用洗脱液平衡，流速为0.5ml/min，至少1小时。一旦获得稳定的基线，注入100μl样品液，以0.5ml/min流速用等梯度液洗脱。用214nmUV检测记录柱洗脱图。本体样品中IFN-β-1a单体的百分比由蛋白质峰整合面积来测定。
说明
IFN-β-1a本体样品的主峰面积(对应完整分子)占总峰面积的比例不少于95％，含有不多于1％的凝聚体。
冷冻/解冻循环(F/T)对照样品的SE-HPLC测试步骤
1.从-70℃的冰箱中取出需要量的重组人干扰素-β1a本体/批(batch)。
2.大试管(～200ml)室温解冻6-9小时，小试管/安瓿(1-15ml)2-4小时。(第一轮冷冻/解冻循环)
3.按以上本体所需量分成1ml等份(大试管)。
4.-70℃冷冻各等份至少2个小时。
5.再重复步骤2和步骤4三次。
6.在第四轮解冻循环后，将少量对照样品用稀释缓冲液稀释到0.25mg/ml作检查。
7.各等份应-70℃贮存。
8.在进行SE-HPLC试验之前，将对照F/T各等份试管室温解冻2小时。
b.NEW SE-HPLC
在TSK G2000SWXL柱(TosoHaas)或BioSuite柱(Waters)中检测凝聚体的总含量；用50mM醋酸盐缓冲液、50mM、pH3.8NaCl，以0.5mL/min流速进行等梯度模式洗脱；波长设定在215nm。运行时间30分钟。将重组人干扰素-β1a本体(0.35mg/ml)注入到处于饱和相的柱子中(每次注入0.2ml)。
·New SE-HPLC方法的仪器和材料：
HPLC系统：Waters Alliance
UV检测仪：Waters 996PDA波长214nm
自动取样器温度设定：4℃
·TosoHaas TSK G2000SWXL色谱柱
柱温：室温
流动相：含50mM NaCl的50mM、pH3.8醋酸盐溶液
制备方法：取5.84g NaCl溶于2升50mM、pH3.8醋酸盐缓冲液中。在无菌溶液操作单元中将醋酸加入到WFI中，用10MNaOH滴定至pH-3.8制备该醋酸盐缓冲液。
流速：0.5ml/min
洗脱液：50mM CH3COONa-50mM NaCl、pH 3.8
激活液：50mM HCl-50mM NaCl
·试剂：
醋酸盐，Merck编号K31358056
NaOH，Merck B197582
10M NaOH溶液
WFI
NaCl，JT BAKER编号3627-07
C.沉降速度分析-AUC
1.方法描述
将样品液加载到含2通道-木炭环氧树脂中间体(2-channel charcoal-eponcentrepieces)带有12mm光通路的加样小室中。用洗涤剂清洗该中间体和兰宝石窗口，然后在水中浸泡以尽可能得到最清洁的表面。将对应的安慰剂加载到参比通道中(该仪器的功能类似于双光束分光光度计)。然后将那些已加样的小室放入AN-50Ti分析型转头中，装入Beckman Optima XL-I分析离心机中，20℃。转头加速到3000rpm时，扫描样品(280nm吸收峰)，以证实加样小室载量合适。然后将转头加速至最终转速50000rpm。记录各样品在此转速时的50次扫描结果。
用Peter Schuck在N.I.H(国立卫生研究院)开发的和在他的分析程序SEDFIT中实施的c(s)方法(8.7版；Schuck，P.(2000).用沉降速度超离心和Lamm方程模型进行大分子的大小分布分析(Size-distribution analysis ofmacromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equationmodelling).Biophys.J.78，1606-1619)分析数据。
在此方法中，直接拟合许多原始数据产生沉降系数分布曲线，同时模拟扩散对数据的影响以增强解析。基于所有的物质具有相同的总体流体动力学形状(overall hydrodynamic shape)(由相对于球体摩擦系数的摩擦系数比值f/f0定义所述形状)的假设，该方法通过为各沉降系数值赋予一个扩散系数来发挥作用。然后改变f/f0值以发现各样品数据的最佳总体拟合值。用0.51最大熵校平法(maximum-entropy smoothing)计算分布。
2.分析参数
—转头类型                                    8孔转子
—转速                                        50k rpm
—中间体                                      木炭环氧树脂
—通道长度                                    12mm
—AUC运行温度                                 20℃
—检测波长                                    280nm
—样品体积                                    432mcl
—参比体积                                    442mcl
3.设备和软件
分析型超速离心机XL-I型(Beckman Coulter)
SEDFIT ver 8.70b软件(Peter Schuck-国立卫生研究院)
Origin ver 6.03软件(Beckman Coulter)
Proteome Lab XL-A/XL-I ver 5.0软件(Beckman Coulter)
d.用RP-HPLC-QUANT-HPLC定量测定IFN-β-1a
下述反相色谱法可用来定量测定本体样品中的IFN-β-1a。
在C4，5μm大孔丁基柱(Wide-Pore Butyl)(Baker)中进行蛋白质定量测定；波长设定为214nm，用以下流动相和梯度液以1mL/min流速进行洗脱。
步骤
用50mM、pH3.8醋酸钠缓冲液稀释待测的IFN-β-1a样品至浓度50-150μg/ml之间。
制备以下溶液：
洗脱液A：0.1％TFA水溶液(水/三氟乙酸0.1％)
洗脱液B：0.1％TFA乙腈溶液(乙腈/三氟乙酸0.1％)
洗脱液C：ACN(乙腈)
先用洗脱液C以1.0ml/min流速洗涤C4RP-HPLC柱30分钟，然后用50％水和50％ACN洗涤15分钟。用70％洗脱液A和30％的洗脱液B以约1.0ml/min流速平衡此柱15分钟。
一旦得到稳定的基线，将IFN-β-1a本体样品、对照样品和校准曲线样品(PRB，1.24-19.8μg)依次注入。每种注入100μl，除了1.24μg校准曲线样品注入20μl外。流速保持在1.0ml/min。
采用以下梯度液：
                     表29
  时间(分钟)  ％洗脱液A  ％洗脱液B  ％洗脱液C
  0   70   30   0
  5.0   70   30   0
  6.0   58   42   0
  15.0   57   43   0
  30.0   46   54   0
  35.0   45   55   0
  40.0   40   60   0
  40.1   20   80   0
  45.0   20   80   0
  45.1   0   0   100
  50.0   0   0   100
  50.1   70   30   0
  65.0   70   30   0
运行时间＝65分钟
由校准曲线面积的对数回归曲线计算得到所测样品中IFN-β-1a的量。
说明
IFN-β-1a本体含有0.280-0.500mg/ml的IFN-β-1a。
e.用反相(RP)-HPLC-DEG/OX测定纯度
下述反相方法能检测IFN-β-1a的氧化形式，所述氧化形式在洗脱时与完整分子不同。
该氧化形式的定量测定在40℃恒温C4，Supelcosil LC-304柱(Supelco)中进行；波长被设定为208nm，用以下流动相和梯度液洗脱，流速1mL/min：
制备以下溶液：
洗脱液A：60％水/40％ACN/0.14％HFBA(水60％/乙腈40％/七氟丁酸酐(Heptafluorobutirric acid)0.14％)
洗脱液B：20％水/80％ACN/0.14％HFBA(水20％/乙腈80％/七氟丁酸酐0.14％)
洗脱液C：20％水/80％ACN/0.1％TFA(水20％/乙腈80％/三氟乙酸0.1％)
用70％洗脱液A和30％洗脱液B以1ml/min流速平衡C4RP-HPLC柱至少15分钟(直至获得稳定基线)。注入120μl样品。用50mM、pH3.8醋酸钠溶液稀释待测样品至浓度0.250-0.280mg/ml。
采用以下梯度液：
                   表30
  时间(分钟)  ％洗脱液A  ％洗脱液B  ％洗脱液C
  0   70   30   0
  8   70   30   0
  61   62   38   0
  66   0   100   0
  71   0   0   100
  72   70   30   0
利用蛋白质峰整合面积计算IFN-β-1a本体样品的纯度百分比。
说明
IFN-β-1a的主峰面积(对应于完整分子)不低于总峰面积的95％。
f.细胞病变效应抑制生物学试验-CPE
生物效能(抗病毒活性)
用细胞病变效应(CPE)抑制生物学试验来测定IFN-β-1a本体的抗病毒活性。
用基于IFN-β诱导的保护细胞(WISH细胞-人羊膜组织)对抗病毒(水疱性口炎病毒)的细胞病变作用的抗病毒试验来检测生物学活性。
干扰素的生物学试验的原理在于，一些病毒如水疱性口炎病毒(VSV)引起的细胞死亡可用活细胞染色方法观测。
继而，细胞病变效应可用于定量测定干扰素的细胞保护效果。
该试验通过用活细胞摄取染料四唑盐MTT(硫代二甲基四唑)的量进行评估来间接测定细胞的死亡。该方法采用自动化分光光度仪测定受保护细胞的百分比和三点平行线试验对滴度作统计评价。
步骤
在微量滴定板中进行该试验。
a.将50μl细胞培养液(MEM/5％FBS)加入到各孔中。
b.将100μl IFN-β-1a样品或标准溶液(60-100IU hIFN-β/ml)加入到各孔中，在板中逐行进行3次1∶1.5分步稀释。
c.将50μl WISH细胞悬浮液(0.78-0.82×106细胞/ml)加入各孔中，在5％CO2湿度培育箱中37℃培育微孔板18-20小时。
d.将VSV悬液加入各孔中，除细胞对照孔加入MEM/2.5％FBS外。
e.在5％CO2湿度培育箱中37℃培育微孔板24个小时。
f.用倒置显微镜验证以下情况：
(1)VSV对照行中至少80％细胞损伤，和
(2)在IFN-β标准品存在时，未稀释的标准品保护百分比平均值为84％；1∶1.5稀释时为45％，而1∶3稀释时为27％。
然后用特异性染料MTT染色培养的细胞。
g.用自动化分光光度仪测定染色强度，读取592nm值。
h.用计算机程序(Colombo软件)分析OD读取值，定量测定IFN-β-1a的活性。
说明
IFN-β-1a本体含量不少于50×106IU/ml。
g.用电喷雾电离质谱(ES-MS)法绘制糖图谱(Carbohydrate mapping)
用四极质谱仪对IFN-β-1a的糖部分(N-连接于Asn-80残基)作完整分子的ES-MS分析。
步骤
该试验方法包括以下步骤：
(1)IFN-β-1a本体样品脱盐，
(2)用四极质谱仪作IFN-β-1a完整糖型类别的ES-MS半定量分析。
按照它们的预期分子量(21-24kDa，蛋白链分子量20kDa)，用ES-MS谱鉴定完整的糖型。然后，根据其唾液酸化水平(非唾液酸化、单唾液酸化、双唾液酸化、三唾液酸化)将糖型分组，并根据它们的相对峰高度确定它们的相对丰度％。
样品脱盐
用乙腈/水/醋酸(40/60/1，v/v)室温透析((Microcon 10装置，Amicon，或等同装置)给约35μg IFN-β-1a样品(对照IFN-β-1a样品和本体测试样品)脱盐(最终浓度为每毫升约150μg IFN-β-1a)
ES-MS分析
在Micromass Platform LCZ单一四极质谱仪(或等同仪器)中进行阳离子ES-MS分析，用一套灌注泵使脱盐的样品直接流入电喷射源，流速约6-10μl/min。
用m/z 600-2400Da范围的肌红蛋白校准该质谱仪，用以下设定运行质谱仪：
毛细管电压：2.5-4.0KV
锥电压：36V
电喷源温度：70-100℃
以约10秒/扫描的典型扫描速度，扫描600Da-2400Da(肌红蛋白)和1100-2400Da(IFN-β-1a)获得质谱结果。多电荷离子的质谱处理和去卷积用Mass Lynx软件(或等同软件)完成。
ES-MS结果的解释
代表性去卷积的ES-MS谱显示：MS峰(A-F)代表不同糖型，可根据其唾液酸化程度将这些糖型分为4个主要的糖型组，见下表34所示。
             表31在IFNβ1a的ES-MS谱中观察到的糖型
  MS峰   糖型*   预期的分子量(Da)   唾液酸化水平
  F   2A0S1F   21793   非唾液酸化
  B   2A1S1F   22084   单唾液酸化
  A   2A2S1F   22375   双唾液酸化
C   3A2S1F和/或2A2S1F+1 HexNacHex重复 22739 双唾液酸化
  D   3A3S1F   23031   三唾液酸化
E   4A3S1F和/或3A3S1F+1 HexNacHex重复 23400 三唾液酸化
*2A＝双触(Biantennary)复合型低聚糖；3A＝三触(Triantennary)复合型低聚糖；4A＝四触(Tetrantennary)复合型低聚糖；0S＝非唾液酸化；2S＝双唾液酸化，3S＝三唾液酸化，1F＝岩藻糖基化的(Fucosylated)。
如下进行4种主要糖型每种的半定量评估：
·非唾液酸化糖型百分比：F峰高度/总峰高度×100
·单唾液酸化糖型百分比：B峰高度/总峰高度×100
·双唾液酸化糖型百分比：(A+C)峰高度/总峰高度×100
·三唾液酸化糖型百分比：(D+E)峰度/总峰高度×100
总峰高度为A-F所有峰高之和。
请注意：对应于缺失末端甲硫氨酸的N-末端截短的(2-166aa)2A2S1FIFN-β-1a的约22244Da处未标记的MS峰(图SPA-1)，在IFN-β-1a双唾液酸化糖型百分比计算中没有考虑，通过独立的本体纯度释放试验(N-末端截短，N-1：NMT 6％)来控制这种杂质的水平。
说明：
质谱与预期的IFN-β-1a分布图(峰高百分比)相一致：
非唾液酸化糖型：不多于5％
单唾液酸化糖型：6-30％
双唾液酸化糖型：56-81％
三唾液酸化糖型：8-16％
h.等电聚焦-IEF
用等电聚焦分离IFN-β-1a的同工型，考马斯亮蓝染色观察。然后将同工型的pl值与PRB的pl值作比较。用密度法(densitometry)测定糖型的面积和pl值。
步骤
样品制备
将IFN-β-1a样品用微量离心装置浓缩至0.7-1.0mg/ml。
凝胶制备和等电聚焦
制备5％IEF丙烯酰胺凝胶，浇铸后洗涤除去所有未聚合的丙烯酰胺。然后用两性电解质(最终2％，pH 3-10)、10mM谷氨酸、10mM赖氨酸和3％甘油重建，置入水平电泳装置中冷却至15℃。
在存在CO2捕获剂(0.1MNaOH)的氮气流下，以1W功率将凝胶预先聚焦60分钟。
将约3.5μg本体IFN-β-1a、6μg细胞色素C和合适的pI标准液逐滴(5μl)滴加到凝胶表面。
10℃，8000V-小时聚焦IEF凝胶。
用20％(w/v)TCA固定凝胶30-35分钟，然后用Neuhoff等人所述的胶凝程序以考马斯亮蓝染色(Neuhoff，V.，Arold，N.，Taube，D.，Ehrhardt，W.，采用考马斯亮蓝G-250和R-250改进聚丙烯酰凝胶蛋白质的染色，包括等电聚焦产生具有清晰背景的凝胶，纳克级灵敏度(Improved staining of proteinsin polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear backgroundat nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250)，Electrophoresis，1988：9：255-262)。
用自动化密度计(Computing Densitometer，Molecular Dynamics，USA，配备ImageQuant 3.3程序和其它整合/计算结果所需要的专门化软件；或等同装备)定量测定IFN-β-1a同工型和pl值。
说明
测试样品获得的电泳图与参比标准品(reference house standard)获得的类似：
1.所得到的电泳图由3组主要条带组成，共含有5-10条电泳带(不包括进样点处的条带)，与用参比标准品得到的带型一致。
2.用密度法测定的5条主要条带，应属于表32所示的组中。
表32-等电聚焦，同工型的说明
  分组的序号   等电点   总面积％
  1   8.8-9.2   8-27
  2   8.4-8.7   47-72
  3   7.7-8.1   11-34
                          参考文献
1.Derynk R.等，Nature 1980；285，542-547。
2.Familletti，P.C.，Rubinstein，S.，和Pestka，S.1981“一种干扰素的方便快速细胞病变作用抑制试验”，Methods in Enzymology，Vol.78(S.Pestka，编写.)，Academic Press，New York，387-394；
3.Mark D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(18)5662-5666(1984)。
4.Pestka，S.(1986)“干扰素的标准品和通用缩写”，Methods inEnzymology(S.Pestka，编写.)，Academic Press，New York 119，14-23。
5.Rubinstein，S.，Familletti，P.C.，和Pestka，S.方便的干扰素试验，J.Virol 1981；37，755-758。
6.Shepard H.M.等，Nature 1981；294，563-565。

Claims (44)

1.一种制备稳定的单体蛋白质本体溶液的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供配制在缓冲溶液中的单体蛋白质本体，和
b)在所述本体中加入辅料，所述辅料选自：
i)抑菌剂
ii)表面活性剂
iii)等渗剂
iv)氨基酸
v)抗氧化剂
vi)等渗剂和抗氧化剂
vii)等渗剂、抗氧化剂和氨基酸
viii)氨基酸和抗氧化剂
ix)氨基酸、抗氧化剂和表面活性剂
x)抑菌剂和抗氧化剂，和
xi)抑菌剂、抗氧化剂和表面活性剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单体蛋白质为干扰素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述干扰素为IFN-β。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述IFN-β是重组人IFN-β。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质相对于凝聚具有稳定性。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质定相对于寡聚化具有稳定性。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌剂为苯甲醇。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂是Tween20。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等渗剂为甘露醇。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸或精氨酸。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂为甲硫氨酸。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等渗剂为甘露醇、抗氧化剂为甲硫氨酸。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等渗剂为甘露醇、抗氧化剂为甲硫氨酸、氨基酸为赖氨酸。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸、抗氧化剂为甲硫氨酸。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸、抗氧化剂为甲硫氨酸、表面活性剂为Tween20。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌剂为苯甲醇、抗氧化剂为甲硫氨酸。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌剂为苯甲醇、抗氧化剂为甲硫氨酸、表面活性剂为Tween20。
18.如权利要求1所述的方法，该方法还包括在27℃-31℃温度范围内培育所述本体蛋白质的步骤。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述温度为29℃。
20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，在权利要求1预配制步骤之前或之后进行所述培育。
21.如权利要求18、19或20任何一项所述的方法，其特征在于，所述培育过程至少进行3个小时。
22.如权利要求18、19或20任何一项所述的方法，其特征在于，所述培育过程进行6-40个小时。
23.如权利要求18、19或20任何一项所述的方法，其特征在于，所述培育过程进行15-30个小时。
24.如权利要求18、19或20任何一项所述的方法，其特征在于，所述培育过程进行10、16、18.5或24小时。
25.如权利要求18、19或20任何一项所述的方法，其特征在于，所述培育过程进行24小时。
26.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述IFN的pH值保持在3.0-6.0范围内。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述pH值为4.7。
28.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述IFN的浓度约为10μg/ml-2000μg/ml。
29.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述IFN的浓度约为500μg/ml或约810μg/ml。
30.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度约为5mM-500mM。
31.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度约为10mM或约50mM。
32.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述等渗剂的浓度约为0.5mg/ml-500mg/ml。
33.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述等渗剂的浓度约为55mg/ml或约150mM、或约300mM、或约600mM。
34.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述Tween20的浓度约为0.01mg/ml-10mg/ml。
35.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述Tween20的浓度约0.5mg/ml。
36.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂的浓度约为0.01mg/ml-5.0mg/ml。
37.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂的浓度约为0.12mg/ml或约0.24mg/ml。
38.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的浓度约为20mg/ml-200mg/ml。
39.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述赖氨酸的浓度约为27mg/ml，或约55mg/ml、或约82mg/ml、或约164mg/ml。
40.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述精氨酸的浓度约为32mg/ml或约63mg/ml。
41.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述抑菌剂的浓度约为0.01mg/ml-200mg/ml。
42.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述抑菌剂的浓度约为5mg/ml或约10mg/ml。
43.通过以上权利要求任何一项所述的方法获得的预配制的本体蛋白质。
44.一种提高和/或保持单体蛋白质稳定性的方法，其特征在于，该方法包括权利要求1-42任何一项所述的蛋白质本体预配制方法。
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