ES2256776T3 - Regiones intergenicas como sitios de insercion en el genoma del virus vaccinia ankara modificado (mva). - Google Patents

Regiones intergenicas como sitios de insercion en el genoma del virus vaccinia ankara modificado (mva).

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ES2256776T3 ES03752741T ES03752741T ES2256776T3 ES 2256776 T3 ES2256776 T3 ES 2256776T3 ES 03752741 T ES03752741 T ES 03752741T ES 03752741 T ES03752741 T ES 03752741T ES 2256776 T3 ES2256776 T3 ES 2256776T3
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Abstract

Un Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), que comprende una secuencia heteróloga exógena de DNA insertada en una región intergénica (IGR) del genoma vírico. Es un objeto de la presente invención identificar sitios de inserción adicionales del genoma de MVA y proporcionar vectores de inserción, que dirigen la inserción de secuencias exógenas de DNA en dichos sitios de inserción de nueva identificación del genoma de MVA. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un MVA recombinante que comprende secuencias exógenas de DNA integradas de manera estable en nuevos sitios de inserción del genoma de MVA.

Description

Regiones intergénicas como sitios de inserción en el genoma del virus Vaccinia Ankara modificado (MVA).
La presente invención se refiere a nuevos sitios de inserción útiles para integración de secuencias exógenas de DNA en el genoma de MVA.
Antecedentes de la invención
El virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) es un miembro de la familia Ortopoxvirus y ha sido generado por aproximadamente 570 pasadas en serie en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del virus Vaccinia (CVA) (para revisión véase Mayr, A., et al. [1975], Infection 3, 6-14). Como consecuencia de estas pasadas, el virus MVA resultante contiene 31 kilobases menos de información genómica comparado con CVA y está muy restringido en cuanto a células hospedadoras (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). MVA se caracteriza por su extremada atenuación, es decir por una virulencia o infectividad reducidas, pero mantiene todavía una inmunogenicidad excelente. Cuando se ensayó en una diversidad de modelos animales, se demostró que MVA es avirulento incluso en individuos inmunodeficientes. Y, lo que es más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA han sido demostradas en pruebas clínicas extensas (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987]). Durante estos estudios en más de 120.000 humanos, con inclusión de pacientes de alto riesgo, no se observó efecto secundario alguno (Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).
Se ha encontrado adicionalmente que MVA está bloqueado en la última etapa del ciclo de replicación del virus en células de mamífero (Sutter, G. y Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851). De acuerdo con ello, MVA replica totalmente su DNA, sintetiza los productos génicos iniciales, intermedios y finales pero no es capaz de ensamblar viriones infecciosos maduros, que podrían liberarse de una célula infectada. Por esta razón, es decir por estar restringido en su replicación, fue propuesto el MVA para servir como vector de expresión génica.
Más recientemente, se utilizó MVA para generar vacunas recombinantes, que expresan secuencias antigénicas insertadas sea en el sitio del gen de la timidina-quinasa (tk) (documento US 5.185.146) o en el locus de hemaglutinina (documento EP 0 753 581 A1) o en el sitio de una deleción existente naturalmente dentro del genoma del MVA (documento PCT/EP96/02926).
Aunque el locus de la inserción tk es utilizado ampliamente para la generación de poxvirus recombinantes, particularmente para la generación de virus Vaccinia recombinantes (Mackett, et al. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419), esta tecnología no podía aplicarse para MVA. Se demostró por Scheiflinger et al., que MVA es mucho más sensible a modificaciones del genoma en comparación con otros poxvirus, que pueden utilizarse para la generación de poxvirus recombinantes. Scheiflinger et al. demostraron en particular que uno de los sitios utilizados más comúnmente para la integración de DNA heterólogo en genomas de poxvirus, a saber el locus del gen de timidina-quinasa (tk), no puede utilizarse para generar MVA recombinante. Se demostró que cualquier MVA recombinante tk(-) resultante ara sumamente inestable y durante la purificación delecionaba inmediatamente el DNA insertado junto con partes del DNA genómico de MVA (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141: pp 663-669).
La inestabilidad y, por consiguiente, la alta probabilidad de recombinación genómica es un problema conocido dentro de la poxvirología. De hecho, el MVA se estableció durante pasadas de larga duración aprovechando el hecho de que el genoma vírico de CVA es inestable cuando se propaga in vitro en células de tejidos cultivadas. Varios millares de nucleótidos (31 kb) habían sido delecionados del genoma de MVA que, como consecuencia, se caracteriza por 6 deleciones mayores y numerosas deleciones menores en comparación con el genoma del CVA original.
La organización genómica del genoma de MVA ha sido descrita recientemente (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365-396). El genoma de 178 kb de MVA está densamente compactado y comprende 193 marcos abiertos de lectura (ORFs) individuales, que codifican proteínas de al menos 63 aminoácidos de longitud. En comparación con el virus Variola altamente infeccioso y también con el prototipo del virus Vaccinia, a saber la cepa Copenhagen, la mayoría de los ORFs de MVA están fragmentados o truncados (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365-396). Sin embargo, con muy pocas excepciones todos los ORFs, con inclusión de los ORFs fragmentados y truncados, llegan a transcribirse y traducirse en proteínas. En lo que sigue, se utiliza la nomenclatura de Antoine et al y -en caso apropiado- se indica también la nomenclatura basada en el material digerido con la enzima de restricción Hind III.
Hasta ahora, únicamente la inserción de DNA exógeno en los sitios de deleción existentes naturalmente del genoma de MVA ha conducido a MVAs estables recombinantes (documento PCT/EP96/02926). Lamentablemente, existe sólo un número restringido de sitios de deleción existentes naturalmente en el genoma de MVA. Además, se ha demostrado que otros sitios de inserción, tales como, v.g., el locus del gen tk, apenas son útiles para la generación de MVA recombinante (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141: pp 663-669).
Objeto de la invención
Es un objeto de la presente invención identificar sitios de inserción adicionales del genoma de MVA y proporcionar vectores de inserción, que dirigen la inserción de secuencias exógenas de DNA en dichos sitios de inserción de nueva identificación del genoma de MVA.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un MVA recombinante que comprende secuencias exógenas de DNA integradas de manera estable en nuevos sitios de inserción del genoma de MVA.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han identificado nuevos sitios para la inserción de secuencias exógenas de DNA en el genoma del virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA). Los nuevos sitios de inserción están localizados en las regiones intergénicas (IGRs) del genoma vírico, en donde dichas IGRs están, a su vez, localizadas entre o están flanqueadas por dos marcos abiertos de lectura (ORFs) adyacentes del genoma de MVA.
De acuerdo con ello, la presente invención se refiere a un MVA recombinante que comprende una secuencia exógena de DNA heteróloga insertada en una IGR del genoma vírico. De acuerdo con la presente invención, pueden insertarse una o más secuencias exógenas de DNA en una o más IGRs.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las secuencias exógenas de DNA se mantienen de hecho estables insertadas en las IGRs del genoma de MVA: como ya se ha indicado arriba, el genoma de MVA debe considerarse como sumamente inestable. Parece ser que los genes o secuencias de DNA no esenciales para la propagación del virus están delecionados o fragmentados. Aunque se encontró -también de modo sorprendente- que se obtienen MVAs estables recombinantes cuando se insertan secuencias heterólogas de DNA en los sitios de deleción del genoma de MVA existentes naturalmente (documento PCT/EP96/02926) se encontró -por el contrario- que los genes de rango hospedador como, v.g., el locus tk utilizado ampliamente para la generación de otros poxvirus recombinantes, no son sitios de inserción adecuados en MVA. El hecho de que Vero-MVA tiene una sola deleción genómica suplementaria (documento PCT/EP01/02703) sugiere también que el genoma es dinámico en el sentido de que el mismo deleciona fácilmente genes que no se requieren para la propagación. Por esta razón, se pudo deducir que podría esperarse que la inserción de secuencias de DNA heterólogas no esenciales para la propagación vírica en espacios entre los ORFs sería delecionada asimismo por el virus.
Si bien la secuencia de nucleótidos de un ORF codifica una secuencia de aminoácidos que forma un péptido, polipéptido o proteína, las IGRs entre dos ORFs no tienen capacidad codificante alguna, aunque pueden comprender elementos reguladores, sitios de fijación, secuencias promotoras y/o intensificadoras esenciales para o implicadas en el control de la transcripción de la expresión de los genes víricos. Así pues, la IGR puede estar involucrada en el control regulador del ciclo vital del virus. Sin embargo, los autores de la presente invención han demostrado también que los nuevos sitios de inserción presentan la ventaja inesperada de que pueden insertarse de manera estable secuencias exógenas de DNA en el genoma de MVA sin influir o cambiar las características típicas y la expresión génica de MVA. Los nuevos sitios de inserción son especialmente útiles, dado que no se altera ningún ORF o ninguna secuencia codificante de MVA.
Además, se ha encontrado sorprendentemente que el nivel de expresión de un gen extraño insertado en una IGR es mayor que el nivel de expresión de un gen extraño insertado en un sitio de deleción del genoma de MVA (véase también el Ejemplo 1).
La secuencia de nucleótidos de un ORF comienza regularmente con un codón de inicio y termina con un codón de parada. Dependiendo de la orientación de los dos ORFs adyacentes, la IGR, la región entre estos ORFs, está flanqueada sea por los dos codones de parada de los dos ORFs adyacentes, o bien por los dos codones de inicio de los dos ORFs adyacentes, o bien por el codón de parada del primer ORF y el codón de inicio del segundo ORF, o bien por el codón de inicio del primer ORF y el codón de parada del segundo ORF.
De acuerdo con ello, el sitio de inserción para la secuencia exógena de DNA en la IGR puede estar situado aguas abajo o 3' del codón de parada de un primer ORF. En el caso en que el ORF adyacente, denominado también segundo ORF, tenga la misma orientación que el primer ORF, este sitio de inserción aguas abajo del codón de parada del primer ORF se encuentra aguas arriba o 5' del codón de inicio del segundo ORF.
En el caso en que el segundo ORF tenga una orientación opuesta con relación al primer ORF, lo que significa que la orientación de los dos ORFs adyacentes está apuntada uno hacia otro, entonces el sitio de inserción se encuentra aguas abajo de los codones de parada de ambos ORFs.
Como tercera alternativa, en el caso en que los dos ORFs adyacentes lean en dirección opuesta, pero la orientación de los dos ORFs adyacentes apunte alejándose uno del otro, lo que es sinónimo con un posicionamiento que se caracteriza porque los codones de inicio de los dos ORFs son adyacentes uno a otro, entonces el DNA exógeno se inserta aguas arriba con relación a ambos codones de inicio.
Los ORFs en el genoma de MVA se encuentran en dos direcciones codificantes. Por consiguiente, la actividad de polimerasa ocurre de izquierda a derecha, es decir, en dirección hacia delante y, correspondientemente, de derecha a izquierda (dirección inversa). Es práctica común en tecnología de poxvirus y se ha convertido en una clasificación estándar para los virus Vaccinia identificar los ORFs por su orientación y su posición en los diferentes fragmentos de digestión con la enzima de rescisión HindIII del genoma. Para la nomenclatura, los diferentes fragmentos HindIII se nombran por letras mayúsculas descendentes correspondientes a su tamaño descendente. Los ORF se numeran de izquierda a derecha en cada fragmento HindIII y la orientación del ORF se indica por una L (que significa transcripción de derecha a izquierda (Left) o R mayúscula (que significa transcripción de izquierda a derecha (Right). Adicionalmente, existe una publicación más reciente de la estructura del genoma de MVA, que utiliza una nomenclatura diferente, numerando simplemente el ORF desde el extremo izquierdo al derecho del genoma e indicando su orientación con una L o R mayúsculas (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365-396). Como ejemplo, el ORF I4L, de acuerdo con la nomenclatura antigua, corresponde al ORF 064L de acuerdo con Antoine et al.. Si no se indica nada en contrario, la presente invención utiliza la nomenclatura de acuerdo con Antoine et al.
De acuerdo con la presente invención, pueden insertarse secuencias heterólogas de DNA en una o más IGRs intercaladas entre dos ORFs adyacentes seleccionados del grupo que comprende:
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De acuerdo con la nomenclatura antigua, ORF 006L corresponde a C10L, 019L corresponde a C6L, 020L a N1L, 021L a N2L, 023L a K2L, 028R a K7R, 029L a F1L, 037L a F8L, 045L a F15L, 050L a E3L, 052R a E5R, 054R a E7R, 055R a E8R, 056L a E9L, 062L a I1L, 064L a I4L, 065L a I5L, 081R a L2R, 082L a L3L, 086R a J2R, 088R a J4R, 089L a J5L, 092R a H2R, 095R a H5R, 107R a D10R, 108L a D11L, 122R a A11R, 123L a A12L, 125L a A14L, 126L to A15L, 135R a A24R, 136L a A25L, 137L a A26L, 141L to A30L, 148R a A37R, 149L a A38L, 152R a A40R, 153L a A41L, 154R a A42R, 157L a A44L, 159R a A46R, 160L a A47L, 165R a A56R, 166R a A57R, 167R a B1R, 170R a B3R, 176R a B8R, 180R a B12R, 184R a B16R, 185L a B17L, y 187R a B19R.
Preferiblemente, la secuencia heteróloga se inserta en una IGR flanqueada por dos ORFs adyacentes seleccionados del grupo que comprende 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, y 148R-149L.
Las secuencias de DNA heterólogas o exógenas son secuencias que, por su naturaleza, no se encuentran asociadas normalmente con el poxvirus tal como se utiliza de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, la secuencia exógena de DNA comprende al menos una secuencia codificante. La secuencia codificante está enlazada operativamente a un elemento de control de la transcripción, preferiblemente a un elemento de control de la transcripción poxvírico. Adicionalmente, también pueden utilizarse combinaciones entre elementos de control de la transcripción poxvíricos y, v.g., sitios internos de entrada de ribosoma.
De acuerdo con una realización adicional, la secuencia exógena de DNA puede comprender también dos o más secuencias codificantes enlazadas a uno o varios elementos de control de la transcripción. Preferiblemente, la secuencia codificante codifica uno(a) o más proteínas, polipéptidos, péptidos, antígenos extraños o epítopes antigénicos, especialmente los de genes terapéuticamente interesantes.
Genes terapéuticamente interesantes de acuerdo con la presente invención pueden ser genes derivados de u homólogos a genes de patógenos o microorganismos infecciosos que son causantes de enfermedades. De acuerdo con ello, en el contexto de la presente invención tales genes terapéuticamente interesantes se presentan al sistema inmunitario de un organismo a fin de afectar, preferiblemente inducir una respuesta inmunológica específica y, con ello, vacunar o proteger profilácticamente el organismo contra una infección con el microorganismo. En realizaciones adicionalmente preferidas de la presente invención, los genes terapéuticamente interesantes se seleccionan de genes de virus infecciosos, v.g. -pero sin carácter limitante- el virus Dengue, el virus de la Encefalitis Japonesa, el virus de la Hepatitis B o C, o virus de inmunodeficiencia tales como HIV.
Genes derivados del virus Dengue son preferiblemente los genes NS1 y PrM, pudiendo derivarse dichos genes de uno, dos, tres o de la totalidad de los cuatro serotipos del virus Dengue. El gen NS1 se deriva preferiblemente del serotipo 2 del virus Dengue y está insertado preferiblemente en la IGR entre los ORFs 064L-065L (I4L-I5L). Los genes PrM, derivados preferiblemente de la totalidad de los cuatro serotipos del virus Dengue, están insertados preferiblemente en las IGRs entre los ORFs seleccionados de 007R, 008L, 044L-045L, 136L-137L, y 148R-149L. De modo más preferible, el gen PrM derivado del serotipo 1 del virus Dengue (PrM1) está insertado en la IGR de 148R-149L, PrM2 en la IGR 007R-008L, PrM3 en la IGR de los ORFs 044L-045L, y PrM4 en la IGR 136L-137L.
De acuerdo con la característica preferida adicional de la presente invención, la secuencia heteróloga de DNA se deriva de HIV y codifica env de HIV, estando insertado preferiblemente el gen env de HIV en la IGR entre los ORFs 007R-008L.
Adicionalmente, genes terapéuticamente interesantes de acuerdo con la presente invención comprenden también genes relacionados con enfermedades, que tienen un efecto terapéutico sobre trastornos proliferativos, cánceres o enfermedades metabólicas. Por ejemplo, un gen terapéuticamente interesante con relación al cáncer podría ser un antígeno del cáncer que tiene capacidad para inducir una reacción inmunológica anti-cáncer específica.
De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, la secuencia codificante comprende al menos un gen marcador o de selección.
Los genes de selección transducen una resistencia particular a una célula, con lo cual se hace posible un cierto método de selección. El profesional experto está familiarizado con una diversidad de genes de selección, que pueden ser utilizados en un sistema de poxvirus. Entre éstos se encuentran, v.g., el gen de resistencia a la neomicina (NPT) o el gen de la fosforribosil-transferasa (gpt).
Los genes marcadores inducen una reacción de color en las células transducidas, que puede utilizarse para identificar células transducidas. El profesional experto está familiarizado con una diversidad de genes marcadores, que pueden utilizarse en un sistema poxvírico. Entre éstos se encuentran el gen que codifica, v.g., \beta-galactosidasa (\beta-gal), \beta-glucosidasa (\beta-glu), la Proteína de Fluorescencia Verde (EGFP) o la Proteína de Fluorescencia Azul.
De acuerdo con otra realización adicional de la presente invención, la secuencia exógena de DNA comprende una secuencia espaciadora, que separa el elemento de control de la transcripción del poxvirus y/o la secuencia codificante en la secuencia exógena de DNA del codón de parada y/o del codón de inicio de los ORFs adyacentes. Esta secuencia espaciadora entre el codón de parada/inicio del ORF adyacente y la secuencia codificante insertada en el DNA exógeno tiene la ventaja de estabilizar el DNA exógeno insertado y, por consiguiente, cualquier virus recombinante resultante. El tamaño de la secuencia espaciadora es variable con tal que la secuencia carezca de función codificante o reguladora en sí misma.
De acuerdo con una realización adicional, la secuencia espaciadora que separa el elemento de control de la transcripción poxvírico y/o la secuencia codificante en la secuencia exógena de DNA del codón de parada del ORF adyacente tiene al menos la longitud de un nucleótido.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, la secuencia espaciadora que separa el elemento de control de la transcripción poxvírico y/o la secuencia codificante en la secuencia exógena de DNA del codón de inicio del ORF adyacente tiene una longitud de al menos 30 nucleótidos. Particularmente, en los casos en que un elemento promotor del virus Vaccinia típico está identificado aguas arriba de un codón de inicio, la inserción del DNA exógeno puede no separar el elemento promotor del codón de inicio del ORF adyacente. Un elemento promotor de Vaccinia típico puede identificarse por escaneo para, v.g., la secuencia "TAAAT" para los promotores finales (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) y un dominio rico en A/T para los promotores iniciales. Una secuencia espaciadora de aproximadamente 30 nucleótidos es la distancia preferida para asegurar que un promotor poxvírico localizado aguas arriba del codón de inicio del ORF no se vea influenciado. Adicionalmente, de acuerdo con una realización ulteriormente preferida, la distancia entre el DNA exógeno insertado y el codón de inicio del ORF adyacente es alrededor de 50 nucleótidos, y más preferiblemente alrededor de 100 nucleótidos.
De acuerdo con una realización adicionalmente preferida de la presente invención, la secuencia espaciadora comprende un elemento de control de la transcripción poxvírico adicional que es capaz de controlar la transcripción del ORF adyacente.
Una cepa de MVA típica que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención para generar un MVA recombinante es MVA-575, que ha sido depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales bajo el número de depósito ECACC V00120707.
Otra cepa de MVA preferida es MVA-Vero o un derivado de la misma. Las cepas MVA-Vero han sido depositadas en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales bajo los números de depósito ECACC V99101431 y 01021411. La seguridad de la cepa MVA-Vero se refleja por características biológicas, químicas y físicas como se describen en la Solicitud de Patente Internacional PCT/EP01/02703. En comparación con otras cepas de MVA, Vero-MVA incluye una deleción genómica adicional.
Todavía otra cepa de MVA más preferida es MVA-BN. MVA-BN ha sido depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales con el número de depósito ECACC V00083008. El virus MVA-BN es un virus extremadamente atenuado derivado también del virus Vaccinia Ankara modificado (véase también el documento PCT/EP01/13628).
El término "derivados" de un virus de acuerdo con la presente invención hace referencia a virus de progenie que exhiben los mismos rasgos característicos que el virus parental, pero que presentan diferencias en una o más partes de su genoma. El término "derivado de MVA" describe un virus, que tiene las mismas características funcionales comparado con MVA. Por ejemplo, un derivado de MVA-BN tiene los rasgos característicos de MVA-BN. Una de estas características de MVA-BN o derivados del mismo es su atenuación y carencia de replicación en las células humanas HaCat.
El MVA recombinante de acuerdo con la presente invención es útil como medicamento o vacuna. De acuerdo con una realización adicional, el mismo se utiliza para la introducción de la secuencia codificante exógena en una célula diana, siendo dicha secuencia homóloga o heteróloga al genoma de la célula diana.
La introducción de una secuencia codificante exógena en una célula diana puede realizarse in vitro para producir proteínas, polipéptidos, péptidos, antígenos o epítopes antigénicos. Este método comprende la infección de una célula hospedadora con el MVA recombinante de acuerdo con la invención, cultivo de la célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas, y aislamiento y/o enriquecimiento del polipéptido, péptido, proteína, antígeno, epítope y/o virus producido por dicha célula hospedadora.
Adicionalmente, el método para la introducción de una o más secuencias homólogas o una o más secuencias heterólogas en células puede aplicarse para terapia in vitro e in vivo. Para la terapia in vitro, células aisladas que han sido infectadas previamente (ex vivo) con el MVA recombinante de acuerdo con la invención se administran al cuerpo animal vivo para afectar, preferiblemente inducir una respuesta inmunológica. Para la terapia in vivo, el poxvirus recombinante de acuerdo con la invención se administra directamente al cuerpo animal vivo para afectar, preferiblemente inducir una respuesta inmunológica. En este caso, las células que rodean el sitio de inoculación, pero también las células a las que se transporta el virus por la vía, v.g., del torrente sanguíneo, son infectadas directamente in vivo por el MVA recombinante de acuerdo con la invención. Después de la infección, estas células sintetizan las proteínas, péptidos o epítopes antigénicos de los genes terapéuticos, que son codificados por la secuencias codificantes exógenas y, subsiguientemente, presentan los mismos o partes de los mismos en la superficie celular. Células especializadas del sistema inmunitario reconocen la presentación de tales proteínas, péptidos o epítopes heterólogos y lanzan una respuesta inmunológica específica.
Dado que el MVA está sumamente restringido en crecimiento y, por tanto, muy atenuado, es útil para el tratamiento de una extensa gama de mamíferos con inclusión de humanos, con inclusión de animales o humanos inmunodeficientes. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas y vacunas para inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo animal vivo, con inclusión de un humano.
La composición farmacéutica puede incluir generalmente uno o más vehículos, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables y/o aprobados. Tales sustancias adyuvantes pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH, o análogos. Los vehículos adecuados son típicamente moléculas grandes, que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos, etcétera.
Para la preparación de vacunas, el poxvirus recombinante de acuerdo con la invención se convierte en una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para vacunación contra la viruela (como ha sido descrito por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado se guarda a -80ºC con un título de 5 x 10E8 TCID_{50}/ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM de pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, v.g., se liofilizan 10E2-10E8 partículas del virus en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2% y albúmina humana al 1% en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden producirse por liofilización gradual del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros adyuvantes tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (v.g. seroalbúmina humana) adecuados para administración in vivo. La ampolla de vidrio se sella luego y puede guardarse entre 4ºC y la temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, en tanto que no exista necesidad alguna, la ampolla se guarda preferiblemente a temperaturas inferiores a -20ºC.
Para la vacunación o terapia, el liofilizado puede disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica o tampón Tris, y se administra sistémica o localmente, es decir por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, por escarificación o cualquier otra vía de administración conocida por el profesional experto. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la técnica de manera conocida. Sin embargo, la mayoría de las veces un paciente se vacuna con una segunda dosis aproximadamente 1 a 6 meses después de la primera dosis de vacunación.
La presente invención se refiere adicionalmente a vectores plasmídicos, que pueden utilizarse para generar MVA recombinante de acuerdo con la presente invención, y se refiere también a ciertas secuencias de DNA:
Regularmente, la IGR localizada entre o flanqueada por dos ORFs adyacentes comprende secuencias de nucleótidos en las cuales puede estar insertada la secuencia exógena de DNA de interés. De acuerdo con ello, el vector de plásmido de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de DNA derivada de u homóloga al genoma de MVA, en donde dicha secuencia de DNA comprende un fragmento completo o parcial de una secuencia de IGR localizada entre o flanqueada por dos ORFs adyacentes del genoma vírico. Preferiblemente, el vector de plásmido comprende, insertado en dicha secuencia derivada de IGR, al menos un sitio de clonación para la inserción de una secuencia exógena de DNA de interés y, preferiblemente, para la inserción de un elemento de control de la transcripción poxvírico enlazado operativamente a dicha secuencia de DNA heteróloga. Opcionalmente, el vector de plásmido comprende una casete de gen informador y/o de gen de selección. El vector de plásmido comprende también preferiblemente secuencias de los dos ORFs adyacentes que flanquean dicho fragmento completo o parcial de la secuencia IGR.
Se han identificado algunas IGRs que no incluyen secuencias nucleotídicas. En estos casos, el vector de plásmido comprende secuencias de DNA de las secuencias de IGR flanqueantes, es decir, secuencias de DNA de los dos ORF adyacentes. Preferiblemente, el sitio de clonación para la inserción de la secuencia de DNA heteróloga se inserta en la IGR. El DNA de las secuencias de IGR flanqueantes se utiliza para dirigir la inserción de las secuencias exógenas de DNA en la IGR correspondiente en el genoma del MVA. Un vector de plásmido de este tipo puede incluir adicionalmente un fragmento completo o parcial de una secuencia de IGR que comprende el sitio de clonación para la inserción de la secuencia de DNA heteróloga y, opcionalmente, de la casete del gen informador y/o gen de selección.
Las secuencias IGR-DNA así como secuencias IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan preferiblemente de IGRs y ORFs, respectivamente, seleccionados del grupo que comprende
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Las secuencias se seleccionan, más preferiblemente, de IGRs y ORFs, respectivamente, seleccionados del grupo que comprende 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148L-149L. Secuencias derivadas de IGR se seleccionan, preferiblemente, del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos:
- no. 527-608 de SeqID No. 32;
- no. 299-883 de SeqID No. 33;
- no. 339-852 de SeqID No. 34;
- no. 376-647 de SeqID No. 35;
- no. 597-855 de SeqID No. 36;
- no. 400-607 de SeqID No. 37.
Las secuencias flanqueantes IGR de los dos ORFs adyacentes se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos:
- no. 1-525 y 609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y 884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y 853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y 648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y 856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y 608-1081 de SeqID No. 37.
Las secuencias de DNA se derivan preferiblemente de o son homólogas al genoma del MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
Para generar un vector de plásmido de acuerdo con la presente invención, las secuencias de aíslan y se clonan a un vector de clonación estándar, tal como pBluescript (Stratagene), en el cual aquéllas flanquean el DNA exógeno a insertar en el genoma de MVA. Opcionalmente, un vector de plásmido de este tipo comprende una casete de gen de selección o informador, que puede delecionarse del virus recombinante final, debido a una secuencia repetitiva incluida en dicha casete.
Métodos para introducir secuencias exógenas de DNA por un vector de plásmido en un genoma de MVA y métodos para obtener MVA recombinante son bien conocidos por las personas expertas en la técnica y, adicionalmente, pueden deducirse de las referencias siguientes:
- Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2ª Edición, por J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: describe técnicas y experiencia en las técnicas estándar de biología molecular tales como clonación de DNA, aislamiento de RNA, análisis por transferencia Western, RT-PCR y técnicas de amplificación PCR;
- Virology Methods Manual. Recopilado por Brian WJ Mahy y Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: describe técnicas para el manejo y la manipulación de virus;
- Molecular Virology: A Practical Approach. Recopilado por AJ Davison y RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Capítulo 9: Expresión de genes por vectores del virus Vaccinia;
- Current Protocols in Molecular Biology. Editor: John Wiley and Sons Inc. 1998. Capítulo 16, sección IV: Expresión de proteínas en células de mamífero utilizando un vector del virus Vaccinia: describe técnicas y experiencia para el manejo, la manipulación y la ingeniería genética del MVA.
El MVA de acuerdo con la presente invención, preferiblemente el MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008, puede producirse por transfección de una célula con un vector de plásmido de acuerdo con la presente invención, infección de la célula transfectada con un MVA y, subsiguientemente, identificación, aislamiento y, opcionalmente, purificación del MVA de acuerdo con la invención.
Las secuencias de DNA de acuerdo con la invención pueden utilizarse para identificar o aislar el MVA o sus derivados de acuerdo con la invención y células o individuos infectados con un MVA de acuerdo con la presente invención. Las secuencias de DNA se utilizan, v.g., para generar iniciadores PCR, sondas de hibridación, o se utilizan en tecnologías de redes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Mapa de restricción de los constructos vectores pBNX39 (Figura 1a), pBNX70 (Figura 1b) y pBN84 (Figura 1c), que comprenden aproximadamente 600 pb de secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción después del ORF I4L. Los plásmidos comprenden adicionalmente DNA exógeno (Ecogpt y hBFP, respectivamente) bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes: Flanco 1 (F1 I4L-I5L) y Flanco 2 (F2 I4L-I5L). F1rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 1 que permite la deleción de la casete informadora de un virus recombinante resultante. pBN84 (Figura 1c) codifica adicionalmente la proteína del virus Dengue NS1 (NS1 DEN). Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; bps = pares de bases.
Figura 2: Mapa de restricción de los constructos vectores pBNX51 (Figura 2a), pBNX67 (Figura 2b) y pBN27 (Figura 2c), que comprende aproximadamente 600 pb de secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción después del ORF 137L (Flanco 1: F1136-137 corresponde a la posición 129340-129930 del genoma de MVA; Flanco 2: F2136-137 corresponde a la posición 129931-130540 del genoma de MVA). Adicionalmente, el vector pBNX67 (Figura 2b) comprende DNA exógeno (gen NPT II = resistencia a la neomicina) bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes. F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un plásmido recombinante resultante. pBN27 (Figura 2c) codifica adicionalmente el PrM4 del virus Dengue bajo control de un promotor de poxvirus. Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; pbs = pares de bases; IRES = sitio de entrada de ribosoma interno; EGFP = gen para la proteína de fluorescencia verde intensificada.
Figura 3: Mapa de restricción de los constructos vectores pBNX79 (Figura 3a), pBNX86 (Figura 3b), pBNX88 (Figura 3c), pBN34 (Figura 3d) y pBN56 (Figura 3e), que comprenden aproximadamente 600 pbs de secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción entre el ORF 007R y 008L (Flanco 1: F1 IGR 07-08 comienza en la posición 12200 del genoma de MVA; Flanco 2: F2 IGR 07-08 termina en la posición 13400 del genoma de MVA). F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un virus recombinante resultante. Adicionalmente, el vector pBNX88 (Figura 3c) y pBNX86 (Figura 3b) comprenden DNA exógeno (BFP + gpt y NPT II + EGFP, respectivamente) bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes. F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un virus recombinante resultante. pBN56 (Figura 3e) codifica adicionalmente la proteína env de HIV-1, y pBN34 (Figura 3d) contiene la secuencia de codificante pRM2 del virus Dengue bajo el control de un promotor de poxvirus. Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; pbs = pares de bases.
Figura 4: Mapa de restricción de los constructos vectores pBNX80 (Figura 4a), pBNX87 (Figura 4b) y pBN47 (Figura 4c) que comprenden aproximadamente 600/640 pbs de secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción entre el ORF 044L y 045L (Flanco 1: F1 IGR44-45 comienza en la posición 36730 del genoma de MVA; Flanco 2: F2 IGR 44-45 termina en la posición 37970 del genoma de MVA). Adicionalmente, el vector pBNX87 (Figura 4b) comprende DNA exógeno (gen NPT II + EGFP) bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes. F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un virus recombinante resultante. PBN47 (Figura 4c) codifica adicionalmente el PrM3 del virus Dengue bajo el control de un promotor de poxvirus.
Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; pbs = pares de bases.
Figura 5: Mapa de restricción de los constructos vectores pBNX90 (Figura 5a), pBNX92 (Figura 5b) y pBN54 (Figura 5c), que comprenden aproximadamente 596-604 pbs de secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción entre el ORF 148R y 149L (Flanco 1: F1 IGR148-149 que comienza en la posición 136900 del genoma de MVA; Flanco 2: F2 IGR148-149 que termina en la posición 138100 del genoma de MVA. Adicionalmente, el vector pBNX92 (Figura 5b) comprende DNA exógeno (gpt + BFP) bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus P) entre las secuencias flanqueantes. PBN54 (Figura 5c) codifica adicionalmente el PrM1 del virus Dengue. F2rpt representa una secuencia repetitiva del Flanco 2 que permite la deleción de la casete informadora de un virus recombinante resultante. Abreviaturas adicionales: AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; pbs = pares de bases.
Figura 6: Presentación esquemática de los sitios de inserción intergénicos de MVA (Genbank Ac. U94848).
Figura 7: Análisis PCR de la IGR I4L-I5L en MVA recombinante con el del virus Dengue NS1 insertado en la IGR I4L-I5L. La pista "BN" muestra el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de NS1 puede detectarse un fragmento de tamaño mayor (1, 2, 3, 4: concentraciones diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular, H_{2}O = control negativo de agua.
Figura 8: Figura 8a: análisis PCR de la IGR 136-137 en MVA recombinante con el PrM4 del virus Dengue insertado en la IGR 136-137. La pista "BN" muestra el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM4 puede detectarse un fragmento de mayor tamaño (mBN23, 1/10, 1/100: concentraciones diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular, H_{2}O = control negativo de agua, pBN27 = control positivo de plásmido.
Figura 8b: curva de crecimiento escalonado múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con PrM4 insertado en la IGR 136-137 (MVA-mBN23).
Figura 9: Figura 9a: análisis PCR de la IGR 07-08 en MVA recombinante con el PrM2 del virus Dengue insertado en la IGR 07-08. La pista 3 muestra el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM2 puede detectarse un fragmento de mayor tamaño (pista 2). M = marcador de peso molecular, pista 1 = control negativo de agua.
Figura 9b: curva de crecimiento escalonado múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con PrM2 insertado en la IGR 07-08 (MVA-mBN25).
Figura 10: análisis PCR de la IGR 07-08 en MVA recombinante con la env de HIV insertada en la IGR 07-08. La pista BN muestra el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM2 puede detectarse un fragmento de mayor tamaño (pista 1, 2, 3). M = marcador de peso molecular, - = control negativo de agua, + = control positivo de plásmido.
Figura 11: Figura 11a: análisis PCR de la IGR 44-45 en MVA recombinante con el PrM3 del virus Dengue insertado en la IGR 44-45. La pista BN muestra el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM3 puede detectarse un fragmento de mayor tamaño (pista 1-4, concentraciones diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular, - = control negativo de agua.
Figura 11b: curva de crecimiento escalonado múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con PrM3 insertado en la IGR 44-45 (MVA-mBN28).
Figura 12: Figura 12a: análisis PCR de la IGR 148-149 en MVA recombinante con el PrM1 del virus Dengue insertado en la IGR 148-149. La pista BN muestra el producto PCR utilizando el vector vacío MVA-BN. Utilizando el MVA recombinante de PrM1 puede detectarse un fragmento de mayor tamaño (pista 1). M = marcador de peso molecular, - = control negativo de agua, + = control positivo de plásmido.
Figura 12b: curva de crecimiento escalonado múltiple para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con PrM1 insertado en la IGR 44-45 (MVA-mBN33).
Los ejemplos que siguen ilustrarán adicionalmente la presente invención. Debe quedar bien entendido por cualquier persona experta en la técnica que los ejemplos que se proporcionan no deben interpretarse de modo que limite la presente invención a estos ejemplos. El alcance de la invención debe considerarse limitado únicamente por el alcance global de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1 Vectores de inserción pBNX39, pBNX70 y pBN84
Para la inserción de secuencias exógenas en la región intergénica adyacente al ORF 065L (el sitio de inserción se encuentra en la posición 56760 del genoma) de MVA, se construyó un vector que comprende aproximadamente 1200 pb de las secuencias flanqueantes adyacentes al sitio de inserción. Estas secuencias flanqueantes están separadas en dos flancos que comprenden en un flanco aproximadamente 610 pb del ORF 065L (nomenclatura alternativa: ORF I4L) y por otra parte aproximadamente 580 pb de la región intergénica detrás del ORF 065L, así como partes del ORF próximo. Entre estas secuencias flanqueantes está localizado un gen Ecogpt (gpt significa el gen de fosforribosil-transferasa aislado de E. coli) y una BFP (proteína de fluorescencia azul), respectivamente, bajo el control de transcripción de un promotor de poxvirus. Adicionalmente, existe al menos un sitio de clonación para la inserción de genes o secuencias adicionales a insertar en la región intergénica detrás del ORF I4L. Constructos vectores ilustrativos de acuerdo con la presente invención se describen en la Figura 1 a) y b) (pBNX39, pBNX70). En el vector pBN84 (Figura 1c), la región codificante para del virus Dengue NS1 está insertada en el sitio de clonación de pBNX70 (Figura 1b).
Generación del MVA recombinante por recombinación homóloga
Pueden insertarse genes extraños en el genoma de MVA por recombinación homóloga. Para dicho propósito, el gen extraño de interés se clona en un vector de plásmido, como se ha descrito arriba. Este vector se transfecta en células infectadas con MVA. La recombinación tiene lugar en el citoplasma de las células infectadas y transfectadas. Con ayuda de la casete de selección y/o informadora, que está contenida también en el vector de inserción, se identifican y aíslan las células que comprenden virus recombinantes.
Para recombinación homóloga, se siembran células BHK (riñón de cría de hámster) o CEF (fibroblastos primarios de embrión de pollo) en placas de 6 pocillos utilizando DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco, Gibco BRL) + 10% de suero de ternero fetal (FCS) o VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/l de L-glutamina para un proceso de producción exento de suero.
Las células precisan estar todavía en la fase de crecimiento y por tanto deberían alcanzar 60-80% de confluencia el día de la transfección. Las células se contaron antes de la siembra, dado que el número de células tiene que ser conocido para determinación de la multiplicidad de infección (moi) para la infección.
Para la infección, el stock de MVA se diluye en DMEM/FCS o VP-SFM/L-glutamina de tal modo que 500 \mul de la dilución contengan una cantidad apropiada de virus que dé una moi de 0,1-1,0. Se supone que las células se han dividido una sola vez después de la siembra. Se separa el medio de las células y se infectan las células con 500 \mul de virus diluido durante 1 hora de agitación mediante sacudidas a la temperatura ambiente. Se separa el inoculante y se lavan las células con DMEM/VP-SFM. Las células infectadas se dejan en 1,6 ml de DMEM/FCS y VP-SFM/L-glutamina, respectivamente, mientras se dispone la reacción de transfección (Kit Qiagen Effectene).
Para la transfección, se utiliza el kit de transfección "Effectene" (Qiagen). Se prepara una mezcla de transfección de 1-2 \mug de vector de inserción linealizado (cantidad total para transfección múltiple) con tampón EC para dar un volumen final de 100 \mul. Se añaden 3,2 \mul de Enhancer, se agita enérgicamente y se incuba a la temperatura ambiente durante 5 min. A continuación, se añaden 10 \mul de Effectene después de agitar enérgicamente el tubo con el stock, y la solución se mezcla concienzudamente por agitación enérgica y se incuba a la temperatura ambiente durante 10 min. Se añaden 600 \mul de DMEM/FCS y VP-SFM/L-glutamina, respectivamente, se mezcla y se añade subsiguientemente la mezcla de transfección total a las células, las cuales están ya cubiertas con el medio. La cápsula se agita suavemente para mezclar la reacción de transfección. La incubación tiene lugar a 37ºC con 5% de CO_{2} durante una noche. Al día siguiente se retira el medio y se reemplaza con DMEM/FCS de nuevo aporte o VP-SFM/L-glutamina. La incubación se continúa hasta el día 3.
Para la recogida, las células se pasan por raspado al medio, y después de ello se transfiere la suspensión de células a un tubo adecuado y se congela a -20ºC para almacenamiento a corto plazo o a -80ºC para almacenamiento a largo plazo.
Inserción de Ecogpt en el Sitio de Inserción I4L de MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBNX39 (Figura 1a) que contenía el gen Ecogpt (Ecogpt, o abreviadamente gpt, significa el gen de fosforribosil-transferasa) como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por 3 tandas de purificación de placas bajo selección del metabolismo de la fosforribosil-transferasa por adición de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. El ácido micofenólico (MPA) inhibe la monofosfato-deshidrogenasa de inosina y da como resultado el bloqueo de la síntesis de purina y la inhibición de la replicación vírica en la mayoría de las líneas de células. Este bloqueo puede contrarrestarse por expresión de Ecogpt de un promotor constitutivo y proporcionando los sustratos xantina e hipoxantina.
Se identificaron los virus recombinantes resultantes por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplifican selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción I4L se utilizaron el par de iniciadores BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1) y BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 328 nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA recombinante, que tiene DNA exógeno incorporado en el sitio de inserción I4L, el fragmento está alargado correspondientemente.
Inserción de NS1 en el Sitio de Inserción IGR064L-065L (I4L-I5L) de MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBN84 (Figura 1c) que contenía el gen Ecogpt para selección y BFP (proteína de fluorescencia azul) como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por 7 tandas de purificación en placas bajo selección del metabolismo de la fosforribosil-transferasa por adición de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. El ácido micofenólico (MPA) inhibe la monofosfato-deshidrogenasa de inosina y da como resultado el bloqueo de la síntesis de la purina y la inhibición de la replicación vírica en la mayoría de las líneas de células. Este bloqueo puede contrarrestarse por expresión de Ecogpt a partir de un promotor constitutivo y proporcionando los sustratos xantina e hipoxantina.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplifican selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción I4L se utilizaron el par de iniciadores BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1) y BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 328 nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA recombinante para NS1, que tiene incorporada la región codificante del virus Dengue NS1 en el sitio de inserción I4L, se espera que el fragmento tenga una longitud de 1683 pb. Los resultados de la PCR en la Fig. 7 muestran claramente la inserción estable de NS1 en el sitio de inserción I4L después de 17 tandas de amplificación del virus.
Ensayo de recMVA que incluye NS1 (MVA-BN22) in vitro
Un matraz T25 con monocapas de células BHK confluyentes aproximadamente en un 80% se inoculó con 100 \mul del stock de virus diluidos en relación 1 x 10^{7} en MEM\alpha con 1% de FCS y se agitó a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron a cada matraz 5 ml de MEM\alpha con 3% de FCS y se incubaron a 30ºC en una incubadora de CO_{2}. El matraz se cosechó después de 48 horas. Se retiró el sobrenadante del matraz y se centrifugó a 260 g durante 10 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se guardaron en partes alícuotas a -80ºC. El sedimento se lavó con 5 ml de 1 x PBS 2 veces y se resuspendió luego en 1 ml de tampón de homogeneización hipotónico con 1% de TX100. Los lisados de células se cosecharon y se centrifugaron durante 5 minutos a 16.000 g, y los sobrenadantes se guardaron en un tubo de microcentrífuga a -80ºC.
Los matraces inoculados con MVA que incluía GFP, MVA que incluía el gen de NS1 en un sitio de deleción (MVA-BN07), y matraces falsamente infectados se trataron también del mismo modo que se ha descrito arriba.
El lisado célula/virus y el sobrenadante se trataron en tampón de muestra no reductor/reductor en condiciones no calentadas/calentadas. Las proteínas se separaron en SDS PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se sondaron durante una noche con sueros agrupados de pacientes convalecientes (PPCS) a dilución 1:500. Después de lavar 3 veces con 1X PBS, las transferencias se incubaron con IgG-HRP anti-humana (DAKO) durante 2 horas a la temperatura ambiente. Después de lavar las transferencias como se ha descrito arriba, se reveló el color utilizando 4-cloro-1-naftol.
Los resultados de la transferencia Western demostraron que NS1 se expresa en grandes cantidades en MVA-BN22. NS1 se expresaba en la configuración correcta, como un dímero en condición no calentada y como un monómero en condición calentada.
La expresión de NS1 se comparó en MVA-BN22 y MVA-BN07. Las células BHK se inocularon con la misma pfu y se cosecharon después de 48 horas. Los resultados demostraron que la expresión de NS1 era mucho mayor en BN22 que en BN07. Los resultados de las transferencias Western demostraron también que hay más NS1 secretado en el sobrenadante con el constructo BN22 en comparación con BN07.
Los resultados indicaban también que NS1 expresado en células infectadas con BN22 es antigénico y es reconocido por los sueros agrupados de los pacientes convalecientes.
En conclusión, NS1 se expresa en grandes cantidades y en la configuración correcta en las células BHK infectadas con BN22. Tanto el dímero como el monómero son antigénicos y son reconocidos por los sueros agrupados de los pacientes convalecientes.
Ejemplo 2 Vectores de Inserción pBNX67 y pBN27
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 129940 del genoma) entre el ORF 136L y 137L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés utilizando los iniciadores siguientes:
oBN543 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT; SEQ ID NO.: 3) y
oBN544 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAATGCGGAGGT; SEQ ID NO.: 4) para el flanco de aislamento 1;
oBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 5) y
oBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID NO.: 6) para el flanco de aislamiento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y XbaI y se ligó a un vector básico digerido con SacII/XbaI y desfosforilado, tal como pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con XhoI/ApaI, se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con XhoI/ApaI que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del Flanco 2 que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores oBN545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 7) y oBN546 (CGGAAGCTTTA
TATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID NO.:8) y que había sido digerida con HindIII/PstI, se insertó en el sitio HindIII/PstI del vector resultante. La Figura 2a) muestra el vector (pBNX51).
Una casete informadora que comprendía un promotor sintético, el gen NPT II (resistencia a la neomicina), la región poli-A, IRES, el gen EGFP (Ps-NPTII-poli A-IRES-EGFP) se digirió con Ec1136II/XhoI y se insertó en el sitio HindIII/XhoI del vector de inserción, en el cual el sitio HindIII se terminó con extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche). Un mapa de restricción de un constructo vector ilustrativo de acuerdo con este ejemplo se expone en la Figura 2b) (pBNX67).
Para la construcción de pBN27 (Figura 2c) se insertó PrM del virus Dengue de serotipo 4 en el sitio único PacI de pBNX67.
Generación del MVA recombinante por recombinación homóloga
El vector pBNX67 (Figura 2b) puede utilizarse para generar un MVA recombinante. La utilización del protocolo arriba mencionado - v.g. utilizando pBN27 (Figura 2c) para la recombinación homóloga, da como resultado un MVA recombinante que lleva PrM4 del virus Dengue en la región intergénica entre dos ORFs adyacentes.
Inserción de PrM4 en el sitio de inserción IGR136-137 de MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBN27 (Figura 2c) que contenía el gen NPT para selección y EGFP (proteína de fluorescencia verde intensificada) como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por cuatro tandas de purificación en placas bajo selección con G418.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplificaba selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción IGR136-137 se utilizaron el par de iniciadores BN900 (cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID NO.: 9) y BN901 (gacgcatgaaggctgaac , SEQ ID NO.: 10). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 88 nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA recombinante para PrM4, que tiene incorporada la región codificante de PrM4 del virus Dengue en el sitio de inserción IGR136-137, se espera que el fragmento tenga una longitud de 880 pb. Los resultados de la PCR en la Fig. 8a) muestran claramente la inserción estable de PrM4 en el sitio de inserción IGR136-137 después de 22 tandas de amplificación del virus. El MVA recombinante exhibe todavía las mismas características de crecimiento que MVA-BN. El mismo se replica en fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en células de mamífero (Fig. 8b).
Ejemplo 3 Vectores de inserción pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 y pBN56
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 12800 del genoma) entre el ORF 007R y 008L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés utilizando los iniciadores siguientes:
IGR 07/08 F1up (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ ID NO.: 11) e
IGR 07/08 F1end (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEQ ID NO.: 12) para el flanco de aislamiento 1;
IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) e
IRG 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID NO.: 14) para el flanco de aislamiento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y SacI y se ligó a un vector básico digerido con SacII/SacI y desfosforilado, tal como pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con XhoI/ApaI, se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con XhoI/ApaI que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del Flanco 2 que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) e IGR 07/08F2 mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA; SEQ ID NO.: 15) y que se digiere con BaMHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier gen informador o terapéutico que comprenda casete, que tenga v.g. un promotor de poxvirus, un gen marcador, una región poli-A y opcionalmente un elemento IRES, un gen ulterior, v.g. que exprese una sustancia o producto génico terapéuticamente activo(a), puede dotarse de extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche) después de una digestión de restricción e insertarse en un sitio de clonación adecuado del vector de plásmido. Un mapa de restricción de un constructo vector ilustrativo de acuerdo con este ejemplo se describe en la Figura 3a) (pBNX79). La inserción de la casete de selección NPT/EGFP dio como resultado el vector pBNX86 (Fig. 3b) y la inserción de la casete de selección gpt/BFP el vector pBNX88 (Fig. 3c), respectivamente. Considerando una unidad de expresión para un gen terapéutico, que comprende un gen terapéutico y un promotor enlazado operativamente, esta unidad de expresión se inserta en el sitio PacI. Para la construcción de pBN34 (Fig. 3d), se clonó el PrM2 del virus Dengue se clonó en pBNX88 (Fig. 3c) y para la síntesis de pBN56 (Fig. 3e) la región codificante env de HIV con PacI en pBNX86 (Fig. 3b).
Generación del MVA recombinante por recombinación homóloga
Los vectores pBNX86 (Fig. 3b) y pBNX88 (Fig. 3c), respectivamente, pueden utilizarse para generar un MVA recombinante utilizando el protocolo arriba mencionado. La utilización de pBN34 (Fig. 3d) para la recombinación homóloga da como resultado un MVA recombinante que lleva el PrM2 del virus Dengue en la región intergénica entre dos ORFs adyacentes. La recombinación de pBN56 (Figura 3e) con el genoma de MVA-BN da como resultado un MVA recombinante, que contiene el gen env de HIV en la IGR correspondiente.
Inserción de PrM2 en el sitio de inserción IGR07-08 de MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBN34 (Fig. 3d) que contenía el gen gpt para selección y BFP como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por 3 tandas de purificación en placas bajo selección por ácido micofenólico como se describe en el Ejemplo 1.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplificaban selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción IGR07-08, se utilizaron el par de iniciadores BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) y BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 190 nucleótidos (nt), y en el caso en que amplifica un MVA recombinante para PrM2, que tiene incorporada la región codificante de PrM2 del virus Dengue en el sitio de inserción IGR07-08, se espera que el fragmento tenga una longitud de 950 pb. Los resultados de la PCR en Fig. 9a) muestran claramente la inserción estable de PrM2 en el sitio de inserción IGR07-08 después de 20 tandas de amplificación del virus. El MVA recombinante exhibe todavía las mismas características de crecimiento que MVA-BN. El virus se replica en fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en células de mamífero (Fig. 9b).
Inserción de env de HIV en el sitio de inserción IGR07-08 del MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBN56 (Fig. 3e) que contenía el gen NPT para selección y EGFP como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por 6 tandas de purificación en placas bajo la selección con G418.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplificaba selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción IR07-08, se utilizaron el par de iniciadores BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) y BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 190 nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA recombinante para env, que tiene incorporada en el sitio de inserción IGR07-08 la región codificante env de HIV, se espera que el fragmento tenga una longitud de 2,6 kb. Los resultados de la PCR en Fig. 10 muestran claramente la inserción estable de env en el sitio de inserción IGR07-08 después de 20 tandas de amplificación del virus.
Ejemplo 4 Vectores de Inserción pBNX80, pBNX87 y pBN47
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 37330 del genoma) entre el ORF 044L y 045L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés utilizando los iniciadores siguientes:
IGR44/45F1up (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ ID NO.: 18) y
IGR44/45F1end (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEQ ID NO.: 19) para el flanco de aislamiento 1
IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID NO.: 20) y
IGR44/45F2end (CAGGGCCCTAAATGCGCTTCTCAAG; SEQ ID NO.: 21) para el flanco de aislamento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y SacI y se ligó a un vector básico digerido con SacII/SacI y desfosforilado, tal como pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con XhoI/ApaI, se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con XhoI/ApaI que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del Flanco 2, que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT, SEQ ID NO.: 20) e IGR44/45F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG, SEQ ID NO.: 22) y que se digirió con BamHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier gen informador o terapéutico que comprenda casete, que tenga v.g. un promotor de poxvirus, un gen marcador, una región poli-A y opcionalmente un elemento IRES, un gen ulterior, v.g., que exprese una sustancia o producto génico terapéuticamente activo(a), puede dotarse de extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche) después de una digestión de restricción e insertarse en un sitio de clonación adecuado del vector de plásmido. Considerando una casete de gen informador, se prefiere como sitio de clonación el sitio de las enzimas de restricción PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII, AvaI o XhoI entre el Flanco 2 y la repetición del Flanco 2. Para la construcción de pBNX87 (Fig. 4b) se insertó la casete de selección NPT/EGFP en pBNX80 (Fig. 4a). Considerando una unidad de expresión para un gen terapéutico que comprende un gen terapéutico y un promotor enlazado operativamente, esta unidad de expresión se inserta en el sitio PacI.
Un mapa de restricción de constructos vectores ilustrativos de acuerdo con este ejemplo se expone en la Figura 4a) y b) (pBNX80, pBNX87).
El vector puede utilizarse para generar un MVA recombinante -siguiendo el protocolo arriba mencionado- que lleva una secuencia exógena en la región intergénica entre dos ORFs adyacentes. Para la construcción de pBN47 (Fig. 4c) el PrM del serotipo 3 del virus Dengue se clonó en pBNX87 (Fig. 4b).
Inserción de PrM3 en el sitio de inserción IGR44-45 de MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBN47 (Fig. 4c) que contenía el gen NPT para selección y EGFP como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por 3 tandas de purificación en placas bajo selección con G418.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplificaban selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción IGR44-45, se utilizaron el par de iniciadores BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID NO.: 23) y BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID NO.: 24). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 185 nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA recombinante para PrM3, que tiene incorporada la región codificante del virus Dengue PrM3 en el sitio de inserción IGR44-45, se espera que el fragmento tenga una longitud de 850 pb. Los resultados de la PCR en Fig. 11a) muestran claramente la inserción estable de PrM3 en el sitio de inserción de IGR44-45 después de 19 tandas de amplificación del virus. El MVA recombinante exhibe todavía las mismas características de crecimiento que MVA-BN. El virus se replica en fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece de modo atenuado en células de mamífero (Fig. 11b).
Ejemplo 5 Vectores de inserción pBNX90, pBNX92 y pBN54
Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 137496 del genoma) entre el ORF 148R y 149L se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés utilizando los iniciadores siguientes:
IGR148/149F1up (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG; SEQ ID NO.:25) y
IGR148/149F1end (CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID NO.: 26) para el flanco de aislamiento 1;
IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) y
IGR148/1492end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEQ ID NO.: 28) para el flanco de aislamiento 2.
El fragmento PCR que comprendía el Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y XbaI y se ligó a un vector básico digerido con SacII/XbaI digerido y desfosforilado, tal como pBluescript (Stratagene).
El plásmido resultante se digirió con HindIII/ApaI, se desfosforiló y se ligó al fragmento PCR digerido con HindIII/ApaI que comprendía el Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del Flanco 2, que se había aislado por PCR utilizando los iniciadores IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) e IGR148/
149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID NO.: 29) y que se digirió con BamHI/PstI, se insertó en el sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier gen informador o terapéutico que comprenda casete, que tenga v.g. un promotor poxvírico, un gen marcador, una región poli-A y opcionalmente un elemento IRES, un gen ulterior, v.g. que exprese una sustancia o producto génico terapéuticamente activo(a), puede dotarse de extremos romos con DNA-polimerasa T4 (Roche) después de una digestión de restricción e insertarse en un sitio de clonación adecuado del vector de plásmido. Para construcción de pBNX92 (Fig. 5b) se insertó en este sitio de clonación la casete de expresión gpt/BFP. Considerando una casete de gen informador, se prefiere como sitio de clonación el sitio de las enzimas de restricción PstI, EcoRI, EcoRV y HindIII entre el Flanco 2 y la repetición del Flanco 2. Considerando una unidad de expresión para un gen terapéutico, que comprende un gen terapéutico y un promotor enlazado operativamente, esta unidad de expresión se inserta en el sitio PacI. Para construcción de pBN54 (Fig. 5c) se insertó en este sitio PacI el PrM1 del virus Dengue.
Un mapa de restricción de un constructo vector ilustrativo de acuerdo con este ejemplo se describe en la Figura 5a) y b) (pBNX90, pBNX92).
El vector puede utilizarse para generar un MVA recombinante -siguiendo el protocolo arriba mencionado- que lleva una secuencia exógena en la región intergénica entre dos ORFs adyacentes. Para la generación de un MVA recombinante que exprese el PrM1 del virus Dengue (Fig. 5c) se utilizó pBN54 para una recombinación homóloga.
Inserción de PrM1 en el sitio de inserción IGR148-149 de MVA
En una primera tanda, se infectaron células con MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito y se transfectaron adicionalmente con el vector de inserción pBN54 (Fig. 5c) que contiene el gen gpt para selección y BFP como gen informador. Los virus recombinantes resultantes se purificaron por tres tandas de purificación en placas bajo selección con ácido micofenólico.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar utilizando un par de iniciadores que amplificaban selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el sitio de inserción IGR148-149, se utilizaron el par de iniciadores pBN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID NO.: 30) y BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEQ ID NO.: 31). En el caso en que se amplifica el DNA del virus vector vacío MVA, el fragmento PCR esperado tiene una longitud de 450 nucleótidos (nt), y en el caso en que se amplifica un MVA recombinante para PrM1, que tiene incorporada la región codificante del virus Dengue PrM1 en el sitio de inserción IGR148-149, se espera que el fragmento tenga una longitud de 1200 pb. Los resultados de la PCR en Fig. 12a) muestran claramente la inserción estable de PrM1 en el sitio de inserción IGR148-149 después de 23 tandas de amplificación del virus. El MVA recombinante exhibe todavía las mismas características de crecimiento que MVA-BN. Se replica en fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y se desarrolla atenuadamente en células de mamíferos (Fig. 12b).
<110> Bavarian Nordic A/S
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<120> Regiones Intergénicas como Nuevos Sitios de Inserción en el Genoma del Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA)
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<130> BN45PCT
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<150> DK PA 2002 00752
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<151> 2002-05-16
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<160> 37
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> primer
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<400> 1
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caactctctt cttgattacc 
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20 
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<210> 2
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cgatcaaagt caatctatg 
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19 
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<212> DNA
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<213> primer
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tccccgcgga gaggcgtaaa agttaaatta gat 
\hfill
33 
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tgatctagaa tcgctcgtaa aaactgcgga ggt 
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33 
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<212> DNA
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ccgctcgagt tcacgttcag ccttcatgc 
\hfill
29 
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<212> DNA
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<213> primer
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<400> 6
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cgggggccct attttgtata atatctggta ag 
\hfill
32 
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<212> DNA
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<213> primer
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cggctgcagg gtaccttcac gttcagcctt catgc 
\hfill
35 
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<210> 8
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<212> DNA
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<213> primer
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<400> 8
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cggaagcttt atatggttta ggatattctg tttt 
\hfill
34 
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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cgttcgcatg ggttacctcc 
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20 
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<212> DNA
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<213> primer
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gacgcatgaa ggctgaac 
\hfill
18 
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<212> DNA
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<213> primer
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<400> 11
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cgcgagctca ataaaaaaaa gttttac 
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27 
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<212> DNA
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aggccgcgga tgcatgttat gcaaaatat 
\hfill
29 
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<212> DNA
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ccgctcgagc gcggatccca atatatggca tagaac 
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36 
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<212> DNA
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<213> primer
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cagggccctc tcatcgcttt catg 
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24 
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<212> DNA
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<213> primer
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<400> 15
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tttctgcagt gatatttatc caatacta 
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28 
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<212> DNA
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<213> primer
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<400> 16
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ctggataaat acgaggacgt g 
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21 
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<212> DNA
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<213> primer
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gacaattatc cgacgcaccg 
\hfill
20 
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<213> primer
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cgcgagctca tttcttagct agagtgata 
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29 
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<213> primer
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aggccgcgga gtgaaagcta gagaggg 
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<212> DNA
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ccgctcgagc gcggatccta aactgtatcg attatt 
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36 
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<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagggcccct aaatgcgctt ctcaat 
\hfill
26 
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<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
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tttctgcagc cttcctgggt ttgtattaac g 
\hfill
31 
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<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
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cgttagacaa cacaccgacg atgg 
\hfill
24 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggatgaaaa atttttggaa g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
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tccccgcggg gactcataga ttatcgacg 
\hfill
29 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
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ctagtctaga ctagtctatt aatccacaga aatac 
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35 
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<210> 27
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<211> 39
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<212> DNA
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<213> primer
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cccaagcttg ggcgggatcc cgtttctagt atggggatc 
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39 
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<211> 26
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<213> primer
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tagggcccgt tattgccatg atagag 
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26 
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<210> 29
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> primer
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tttctgcagt gtataatacc acgagc 
\hfill
26 
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<210> 30
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
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22 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> primer
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctagtagac gtggaaga 
\hfill
18 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 64L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(526)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 64-65
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (527)..(608)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 65L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (609)..(1190)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 135R
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(96)
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<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ORF C 136L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101)..(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 136-137
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (299)..(883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 137L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (884)..(1198)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 07R
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(338)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 07-08
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (339)..(852)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 08L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (853)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<213> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 44L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(375)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 1GR 44-45
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376)..(647)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 45L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (648)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 148R
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (596)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 148-149
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (597)..(855)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 149L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (856)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> vaccinia virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF 018L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(399)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> IGR 018L-019L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (400)..(607)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragment of ORF C 019L
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (608)..(1081)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> non-coding region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1082)..(1200)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> "primer": iniciador (todas las veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> "Fragment of": Fragmento de (todas las veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> "vaccinia virus": virus vaccinia (todas las veces)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> "non-coding region": región no codificante

Claims (46)

1. Un Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), que comprende una secuencia heteróloga exógena de DNA insertada en una región intergénica (IGR) del genoma vírico.
2. El MVA de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA está insertada en una IGR entre dos marcos abiertos de lectura (ORFs) adyacentes seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
3. El MVA de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA comprende al menos una secuencia codificante, preferiblemente bajo el control de transcripción de un elemento de control de la transcripción poxvírico.
4. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA codifica uno(a) o más proteínas, polipéptidos, péptidos, antígenos extraños o epítopes antigénicos.
5. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la secuencia heteróloga exógena de DNA se deriva del virus Dengue, el virus de la Encefalitis Japonesa, el virus de la Hepatitis B, el virus de la Hepatitis C y/o virus de inmunodeficiencia, preferiblemente virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV).
6. El MVA de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la secuencia heteróloga exógena del DNA derivada del virus Dengue se selecciona del grupo que comprende NS1 y PrM.
7. El MVA de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual el gen NS1 se inserta en la IGR entre los ORFs 064L- 065L.
8. El MVA de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el cual el gen PrM se deriva de uno o más de los cuatro serotipos del virus Dengue.
9. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, en el cual el gen PrM está insertado en la IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, y 148R-149L.
10. El MVA de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la secuencia de DNA heteróloga exógena derivada del virus de inmunodeficiencia codifica env de HIV.
11. El MVA de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el gen env de HIV se inserta en la IGR entre los ORFs 007R-008L.
12.- El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, que es el MVA depositado en el ECACC bajo el número de depósito V00083008.
13. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 para uso como medicamento y/o vacuna.
14. Uso del MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de un medicamento y/o vacuna para el tratamiento y/o la profilaxis de una infección vírica y/o una enfermedad proliferante.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual dicha infección vírica es una infección por el virus Dengue o infección por virus de inmunodeficiencia, preferiblemente infección por HIV.
16. Una vacuna que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
17. Una composición farmacéutica que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo, diluyente, adyuvante y/o aditivo farmacéuticamente aceptable.
18. Un método para producir un(a) proteína, polipéptido, péptido, antígeno o epítope in vitro que comprendelos pasos de:
-
infección de una célula hospedadora con el MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13,
-
cultivo de la célula hospedadora infectada en condiciones adecuadas,
-
aislamiento y/o enriquecimiento del polipéptido, la proteína, el péptido, el antígeno, el epítope y/o el virus producido por dicha célula hospedadora.
19. Un método para introducir una secuencia de DNA en una célula in vitro o ex vivo, siendo dicha secuencia de DNA homóloga y/o heteróloga al genoma de dicha célula, en el cual la célula se infecta con el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
20. Una célula in vitro o ex vivo que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
21.- Un vector de plásmido que comprende
-
una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
a)
una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma vírico de un MVA, y/o
b)
una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma vírico de un MVA;
c)
una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico;
-
una secuencia heteróloga y,
-
opcionalmente, una casete de gen informador y/o de selección.
22. El vector de plásmido de acuerdo con la reivindicación 21, en el cual la secuencia de IGR se deriva de una IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
23. El vector de plásmido de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en el cual la secuencia derivada de IGR comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No. 32;
- no. 299-883 de SeqID No. 33;
- no. 339-852 de SeqID No. 34;
- no. 376-647 de SeqID No. 35;
- no. 597-855 de SeqID No. 36;
- no. 400-607 de SeqID No. 37.
24. El vector de plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 23, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
25. El vector de plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 24, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 1-526 y 609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y 884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y 853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y 648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y 856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y 608-1081 de SeqID No. 37.
26. El vector de plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 25, en el cual dicho virus MVA es el MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
27. Un método para producir el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 in vitro, que comprende los pasos de
-
transfectar una célula con un vector de plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 26;
-
infectar la célula transfectada con un MVA;
-
identificar, aislar y, opcionalmente, purificar el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual la célula se infecta con el MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
29. Un DNA que comprende
-
una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
a)
una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA, y/o
b)
una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA;
c)
una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico;
-
una secuencia heteróloga.
30. La secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 29, en la cual la secuencia de IGR se deriva de una IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
31. La secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 29 ó 30, en la cual la secuencia derivada de IGR comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No. 32;
- no. 299-883 de SeqID No. 33;
- no. 339-852 de SeqID No. 34;
- no. 376-647 de SeqID No. 35;
- no. 597-855 de SeqID No. 36;
- no. 400-607 de SeqID No. 37.
32. La secuencia de DNA de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 31, en la cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
33. La secuencia de DNA de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 32, en la cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 1-526 y 609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y 884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y 853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y 648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y 856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y 608-1081 de SeqID No. 37.
34. La secuencia de DNA de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 33, en la cual dicho virus MVA es el MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
35. Uso de un vector de plásmido que comprende
-
una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
\newpage
a)
una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA, y/o
b)
una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA;
c)
una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico; e
-
insertado en dicha secuencia de IGR un sitio de clonación para la inserción de dicha secuencia heteróloga, y
-
opcionalmente, una casete de gen informador y/o de selección
para generar y/o producir un MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
36. El uso de acuerdo con la reivindicación 35, en el cual la secuencia de IGR se deriva de una IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36, en el cual la secuencia derivada de IGR comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No. 32;
- no. 299-883 de SeqID No. 33;
- no. 339-852 de SeqID No. 34;
- no. 376-647 de SeqID No. 35;
- no. 597-855 de SeqID No. 36;
- no. 400-607 de SeqID No. 37.
38. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 35 a 37, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
39. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 35 a 38, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 1-526 y 609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y 884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y 853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y 648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y 856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y 608-1081 de SeqID No. 37.
40. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 35 a 39, en el cual dicho virus MVA es el MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
41. Uso de un DNA que comprende una secuencia de DNA seleccionada del grupo que comprende:
a)
una secuencia de DNA que comprende una secuencia de IGR localizada entre dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA, y/o
b)
una secuencia de DNA que comprende secuencias de IGR flanqueantes de dos ORFs adyacentes del genoma de un MVA;
c)
una secuencia de DNA que es homóloga a la secuencia de DNA a) y/o b), en la cual dicha secuencia homóloga dirige la inserción de una secuencia de DNA que es heteróloga al genoma del virus MVA ("secuencia heteróloga") por recombinación homóloga a la IGR del genoma vírico;
para generar y/o producir un vector de plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 26 y/o
para generar y/o producir un MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
42. El uso de cuerdo con la reivindicación 41, en el cual la secuencia de IGR se deriva de una IGR entre los ORFs seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
43. El uso de acuerdo con la reivindicación 41 ó 42, en el cual la secuencia derivada de IGR comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 527-608 de SeqID No. 32;
- no. 299-883 de SeqID No. 33;
- no. 339-852 de SeqID No. 34;
- no. 376-647 de SeqID No. 35;
- no. 597-855 de SeqID No. 36;
- no. 400-607 de SeqID No. 37.
44. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 41 a 43, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes se seleccionan del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L y 148R-149L.
45. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 41 a 44, en el cual las secuencias de IGR flanqueantes de los dos ORFs adyacentes comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de nucleótidos
- no. 1-526 y 609-1190 de SeqID No. 32;
- no. 101-298 y 884-1198 de SeqID No. 33;
- no. 1-338 y 853-1200 de SeqID No. 34;
- no. 1-375 y 648-1200 de SeqID No. 35;
- no. 1-596 y 856-1200 de SeqID No. 36;
- no. 1-399 y 608-1081 de SeqID No. 37.
46. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 41 a 45, en el cual dicho virus MVA es el MVA depositado en ECACC bajo el número de depósito V00083008.
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