NO334273B1 - Rekombinant poxvirus, samt anvendelse derav, vaksine, farmasøytisk sammensetning, celle, fremgangsmåte for generering av et rekombinant poxvirus, sett, DNA-sekvens og anvendelse derav - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår et rekombinant poxvirus som er i stand til å uttrykke to eller flere homologe fremmede gener. Nevnte gener er heterologe for det virale genomet, men homologe i sammenligning med hverandre. Genene er spesielt avledet fra nært beslektede varianter eller undertyper av en mikroorganisme. Oppfinnelsen angår videre fremgangsmåter for fremstilling av slikt rekombinant poxvirus og anvendelse av slikt rekombinant poxvirus som medikament eller vaksine. Det beskrives også heri en fremgangsmåte for å påvirke, fortrinnsvis indusere, en immunreaksjon i et levende dyr, inklusive mennesker.

Hver levende organisme blir konstant utsatt for infiserende og patogene organismer så som bakterier, virus, sopp eller parasitter. Det såkalte immunsystemet beskytter organismen mot permanente infeksjoner, sykdommer eller forgiftninger som måtte være forårsaket av slike fremmede organismer.

Pattedyrenes immunsystemer kan deles inn i en spesifikk og en uspesifikk del, skjønt begge deler er nært forbundet med hverandre. Det uspesifikke immunreaksjonssystemet gjør det mulig med et umiddelbart forsvar mot en rekke forskjellige patogene stoffer eller infiserende organismer. Det spesifikke immunsystemet blir aktivert etter en viss forsinkelsen når organismen blir eksponert overfor et stoff eller en mikroorganisme for første gang. En slik spesifikk immunreaksjon er i alt vesentlig basert på produksjon av antigenspesifikke antistoffer og utvikling av makrofager og lymfocytter, for eksempel cytotoksiske T-celler (CTL). Den spesifikke immunreaksjonen er ansvarlig for det faktum at et individ som blir friskt etter en spesifikk infeksjon, er beskyttet mot denne spesifikke infeksjonen, men vil ikke desto mindre være utsatt for andre infeksjonssykdommer. Generelt vil en ny infeksjon med samme eller en lignende infiserende organisme frembringe langt mildere symptomer eller ingen symptomer i det hele tatt. Denne såkalte immuniteten varer svært lenge, i enkelte tilfeller hele livet. Den underliggende effekten blir ofte betegnet som immunologisk hukommelse, og kan brukes for vaksinasjonsformål.

Med begrepet vaksinasjon forstås en fremgangsmåte hvor et individ blir eksponert for en skadelig, delvis eller inaktivert form av den infiserende mikroorganismen for å påvirke, fortrinnsvis indusere, en immunologisk reaksjon i nevnte individ, som fører til lenge varende, hvis ikke livslang, immunitet mot den spesifikke infiserende organismen.

Sykdommen kopper er forårsaket av Variolavirus. Variolavirus hører til familien Poxviridae, en stor familie av komplekse DNA-virus som formerer seg i cytoplasmaet hos både invertebrat- og vertebrat celler.

Familien Poxviridae kan deles inn i to underfamilier, Chordopoxvirinae og Entomopoxvirinae basert på deres forekomst i vertebrater og insekter. Chordopoxvirinae omfatter foruten andre slekter, også slektene Orthopoxvira og Avipoxvira (Fields Virology, redigert av Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, 3. utgave 1996, ISBN: 0-7817-0253-4, kapittel 83).

Slekten Orthopoxvira omfatter variolavirus, det vil si det som frembringer kopper, men også andre virus av økonomisk viktighet som for eksempel kamelkopper, kukopper, sauekopper, geitekopper, apekopper og Vacciniavirus. Alle virus i denne slekten er genetisk beslektede og har lignende morfologi eller vertsutvalg. Restriksjonsendonukleasekart har vist svært høy sekvensidentitet fra opp til 90% mellom de forskjellige artene innenfor slekten Orthopoxvira (Mackett & Archard,

[1979], J Gen Virol, 45: 683-701).

Vacciniavirus (VV) er betegnelsen på det virus som har vært brukt de siste 100 årene for vaksinasjon mot kopper. Det er ikke kjent hvorvidt VV er en ny art avledet fra kukopper eller variolavirus ved langvarige serieoverføringer, en levende representant for en nå utdødd virustype eller eventuelt et produkt av genetisk rekombinasjon. Rent historisk har det også oppstått mange stammer av Vaccinia. Disse forskjellige stammene har varierende immunogenisitet og kan i varierende grad gi farlige komplikasjoner, den mest alvorlige er postvaksinial hjernehinne-betennelse. Mange av disse stammene er imidlertid blitt brukt for vaksinasjon mot kopper. For eksempel er stammene NYCBOH, Western Reserve eller Wyeth primært blitt brukt i de Forente Stater, mens stammene Ankara, Bern, København, Lister og MVA er blitt brukt for vaksinasjon i Europa. Som et resultat av dette verdensomfattende vaksinasjonsprogrammet med disse forskjellige stammene av VV, kunne WHO derfor i 1980 endelig erklære at variolavirus var utryddet.

I dag blir VV i alt vesentlig brukt som en laboratoriestamme, men foruten dette så er nevnte virus ikke desto mindre ansett å være prototypen av Orthopoxvira, noe som er årsaken til at VV er blitt et av de mest intensivt karakteriserte virus. (Fields Virology, utgitt av Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, 3. utgave 1996, ISBN: 0-7817-0253-4, kapitlene 83 og 84).

V V og senere også andre koppevirus er blitt brukt for innsetting og ekspresjon av fremmede gener. Den grunnleggende teknikken for innsetting av fremmede gener i levende infiserende koppevirus innbefatter en rekombinasjon mellom koppe-DNA-sekvenser som er flankert av et fremmed genetisk element i et donorplasmid, og at homologe sekvenser er tilstede i det mottakende koppeviruset. Genetisk rekombinasjon er generelt en utbytting av homologe deler av DNA mellom to tråder av DNA. I visse virus kan RNA erstatte DNA. Homologe deler av nukleinsyre er deler av en nukleinsyre (DNA eller RNA) som har den samme sekvensen av nukleotidbaser. Genetisk rekombinasjon kan skje naturlig under replikasjonen eller fremstillingen av nye virale genomer inne i den infiserte vertscellen. Således kan genetisk rekombinasjon mellom virale gener skje under den virale replikasjons-syklusen som finner sted inne i en vertscelle som samtidig er infisert med to eller forskjellige typer virus eller andre genetiske konstrukter. En del av DNA fra et første genom kan brukes utbyttbart ved konstruksjon av delen av genomet i et andre samtidig infiserende virus, hvor DNA er homologt med tilsvarende DNA i det første virale genomet.

Vellykket ekspresjon av den innsatte DNA-genetiske sekvensen av det modifiserende infiserende viruset krever at to betingelser er oppfylt. For det første må innsettingen skje i et ikke-essensielt område av viruset slik at det modifiserte viruset forblir levedyktig. Den andre betingelsen for ekspresjon av innsatte DNA, er nærværet av en promotor i passende forhold til det innsatte DNA. Regelmessig vil promotoren være plassert oppstrøms for den DNA-sekvensen som skal uttrykkes.

Bruken av rekombinant VV som for eksempel uttrykker hepatitt B-virus overflateantigen (HBsAg), influensavirus hemagglutinin (InfHA) eller Plasmodium knowlesi sporozoitantigen som levende vaksiner for profylakse med hensyn til infiserende sykdommer, er påvist og beskrevet (Smith et al. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407).

En videre fordel med VV er dets evne til å oppta multiple fremmede sekvenser, gener eller antigener innenfor et enkelt VV-genom (Smith & Moss [1983], Gene, 25(1): 21-28). Det er videre blitt rapportert at det er mulig å frembringe immunitet overfor en rekke heterologe infiserende sykdommer med en enkel inokulasjon av en polyvalent vaksine (Perkus et al, [1985], Science, Vol. 229, 981-984).

Et eksempel på ekspresjonen av forskjellige antigener ved hjelp av en enkel VV, er beskrevet av Bray et al. Det ble vist at rekombinant VV som er i stand til å uttrykke tre forskjellige strukturelle proteiner av Denguevirus serotype 4, det vil si kapsid

(C), premembran (prM) og konvolutt (E) protein og to ikke-strukturelle proteiner av Denguevirus serotype 4, nemlig NS1 og NS2a, hadde evnen til å beskytte mus mot

en homolog Denguevirus serotype 4-eksponering (Bray et al, [1989], Virology 2853-2856).

Dengueviruset med sine fire serotyper, Denguevirus serotype 1 (Den-1) til og med Denguevirus serotype 4 (Den-4), er et svært viktig virus i slekten Flavivirus med hensyn til infeksjoner hos mennesker. En Denguevirusinfeksjon vil gi sykdommer som varierer fra influensalignende symptomer til en alvorlig eller dødelig sykdom, Denguefeber (DHF) med sjokksyndrom (DSS). Utbrudd av Denguefeber er stadig et alvorlig helseproblem i tett befolkede områder i forskjellige tropiske og subtropiske områder, hvor forskjellige myggvektorer er svært vanlige.

Bekymringen over spredningen av Dengueinfeksjon og andre sykdommer som er indusert av Flaviviruses i mygg i mange deler av verden, har resultert i store anstrengelser for å kunne utvikle Denguevaksiner som kunne hindre både Denguefeber (DF) og Dengue-blødningsfeber (DHF) i vaksiner som kan brukes for å beskytte vaksinerte individer mot infeksjoner som er indusert av noen eller alle typer flaviviruses i mygg.

Skjønt de fleste tilfeller av Denguefeber er manifestert etter en første infeksjon av enhver av de fire serotypene, så opptrer et stort antall av Dengue blødningsfeber hos individer som er infisert for andre gang av en serotype som er forskjellig fra den første infiserte serotypen av Denguevirus. Disse observasjonene har gitt opphav til en hypotese om at en sekvensmessig infeksjon av et individ med antistoffer mot en Dengue serotype av en annen virusserotype etter et visst tidsrom kan resultere i Dengue blodfeber i et visst antall tilfeller.

En vaksinasjon mot en serotype vil følgelig ikke resultere i en fullstendig beskyttelse mot Denguevirusinfeksjon, men bare mot en infeksjon av den samme Denguevirusstammen. Enda viktigere er det at en person som er vaksinert mot en serotype har en forhøyet risiko for å utvikle alvorlige komplikasjoner så som Dengue blødningsfeber når nevnte person blir infisert med en Denguevirusstamme av en annen serotype.

Det er således ønskelig med en multivalent vaksine som inneholder antigener fra alle de nevnte fire Denguevirus serotypene.

Det har tidligere vært foreslått å fremstille multivalente vaksiner ved å blande et utvalg av rekombinante VV hvor hver VV koder sekvenser fra forskjellige virus (Moss, [1990] Immunology, 2, 317-327). En slik multivalent vaksine har imidlertid flere ulemper. For det første er det arbeidskrevende og komplisert å utvikle flere uavhengige rekombinante VV. Foruten separate produksjonsprosesser, vil også kvalitetskontroll og kvalitetssikring være svært tidkrevende. For det andre vil en infeksjon med en blanding av rekombinante virus som uttrykker forskjellige sekvenser alltid innebære en risiko for at selve infeksjonen ikke er spesielt godt balansert. Hovedrisikoen er at bare individuelle rekombinante virus, men ikke alle de forskjellige rekombinante virus som inngår i den multivalente vaksinen, vil infisere målceller. En årsak til dette kan være en ujevn fordeling av de rekombinante virusene. En annen mulig forklaring kan være at det skjer en interferens mellom forskjellige rekombinante virus under infeksjonen av enkeltceller. Slike interferenser er velkjente og blir ofte betegnet som et superinfeksjonsfenomen. I slike tilfeller vil bare enkelte antigener, men ikke alle de forskjellige antigenene i den multivalente vaksinen, endelig bli uttrykt fra de infiserte cellene og således bli presentert for pasientens immunsystem. Som en konsekvens av dette, vil immunbeskyttelsen bare bli oppnådd mot enkelte av antigenene, og således ikke gi en fullstendig immunbeskyttelse mot de forskjellige antigener som er presentert eller lar seg presentere av den multivalente vaksinen.

I sammenheng med utviklingen av en vaksine mot Denguevirusinfeksjon, vil fremgangsmåten med hensyn til å utvikle en multivalent vaksine ha den ulempen at hvis forskjellige sekvenser blir uttrykt i forskjellige mengder eller på en uforutsigbar måte, noe som er blitt vist for det omsluttende proteinet i Denguevirus 2 (Deuble et al, [1988], J. Virol 65: 2853), så vil en slik vaksinasjon være svært risikofylt for en pasient. En ufullstendig vaksinasjon som bruker et utvalg av rekombinante Vacciniavirus vil bare gi immunbeskyttelse mot noen, men ikke mot alle serotypene av Denguevirus. En ufullstendig vaksinasjon i forbindelse med en Dengueinfeksjon, vil være fullstendig uakseptabel, ettersom den øker risikoen for dødelige komplikasjoner så som Dengue blødningsfeber.

Det er følgelig en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en stabil, effektiv og pålitelig vaksine mot infeksjonssykdommer som er forårsaket av mer enn en stamme, avart, variant, undertype eller serotype av nevnte mikroorganisme som forårsaker infeksjonssykdommen.

Det er videre en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en stabil, effektiv og pålitelig vaksine mot Dengue virusinfeksjoner som gjør det mulig å oppnå en pålitelig vaksinasjon mot alle Denguevirus serotyper.

Den foreliggende oppfinnelsen er basert på ideen å inkludere i et koppevirus homologe gener avledet fra forskjellige stammer, avarter, varianter, undertyper eller serotyper av en mikroorganisme som forårsaker en infeksjonssykdom. Som allerede nevnt ovenfor, er det for eksempel 4 grupper, undergrupper eller serotyper av Denguevirus, som alle omfatter de samme gentypene, for eksempel genet som koder kapsid (C) protein, genet som koder premembran (PrM) genet eller konvolutt (E) proteinet. Nukleinsyresekvensen i den samme gentypen er imidlertid ikke fullstendig identisk og ikke perfekt homolog henholdsvis i alle de 4 serotypene: For eksempel vil en sekvenssammenligning (med Lasergene 4.05 Magalign, Macintosh) mellom PrM-genene i Denguevirus serotype 1, 2, 3 og 4 (PrMl-4), vist en sekvensidentitet på mellom 66,5-72,9%, det vil si en homologi på fra 65 til 75%. Det er antatt at forskjellene og variasjonene i henholdsvis genene hos de forskjellige undertypene av mikroorganismer som forårsaker infeksjonssykdommen, er årsaken til at vaksinasjonen mot én undertype ikke automatisk resulterer i en beskyttelse mot infeksjoner fra andre varianter av den samme mikroorganismen. Det er følgelig en ide å utvikle et rekombinant virus som innbefatter nært beslektede eller homologe gener avledet fra forskjellige stammer, avarter, varianter, undertyper eller serotyper av en mikroorganisme som forårsaker en infeksjonssykdom. Som allerede nevnt ovenfor, så skjer det imidlertid en homolog rekombinasjon mellom homologe sekvenser under hele livssyklusen for viruset, og dette skjer endog mellom deler av DNA som ikke er perfekt homologe. Man kunne således forvente at en innsetting av homologe gener i et enkelt viralt genom ville resultere i en homolog rekombinasjon og følgelig til delesjoner av de innsatte homologe genene.

Når man imidlertid utviklet et rekombinant koppevirus som omfattet i sitt genom minst to fremmede gener med en homologi på minst 60%, så fant man uventet at nevnte homologe gener forblir stabilt innsatt i det virale genomet.

Selv når homologe gener, fortrinnsvis med en homologi på minst 50%, innsettes i forskjellige innsettingsseter i det virale genomet, så forblir genene også i dette tilfellet stabilt innsatt i det virale genomet: I dette tilfellet var det forventet at det ville skje rekombinasjoner mellom nevnte homologe gener som igjen ville resultere i et tap av virale gener som måtte være viktige for oppformeringen av viruset og for den virale livssyklusen henholdsvis, det vil si at det var forventet at det ville oppstå alvorlige skader i virusets livssyklus. Ettersom frekvensen av rekombinasjon er proporsjonal med avstanden mellom to forbundne gener, så var det forventet at frekvensen av rekombinasjoner mellom to eller flere homologe gener plassert i forskjellige innsettingsseter, ville være høy og at dette således ville resultere i delesjoner av nevnte gener og/eller at det ville oppstå alvorlige interferenser. Det var følgelig svært overraskende at det ikke skjedde noen rekombinasjoner, men at de homologe genene forble stabilt innsatt i forskjellige innsettingsseter i det virale genomet.

Man kjenner fra tidligere et rekombinant koppevirus som inneholder fremmede DNA fra flavivirus så som japansk encephalittvirus (JEV), gul febervirus (YFV) og Denguevirus (se US patent nr. 5,514,375). Hvert gen fra nevnte flavivirus er imidlertid bare innsatt en enkelt gang og hver gang i det samme innsettingssetet. En sammenligning mellom sekvensene ved hjelp av egnet dataprogram (Lasergene 4.05 Megalign, Macintosh), viste dessuten at homologien for de gener som var innsatt i koppevirusets genom og avledet fra JEV, varierte fra 20,2 til 29,6%, for YFV fra 29,2 til 45,3% og for Denguevirus fra 22,8 til 29,5%.

En lignende referanse er WO 98/13500 som beskriver innsetting av Denguevirusantigener i det samme innsettingssetet i modifisert Vacciniavirus Ankara (MVA), spesielt i delesjonssete II.

US patent nr. 5,338,683 beskriver innsettingen av gp 13 og 14 fra herpesvirus glykoproteingener i to forskjellige innsettingsseter i et enkelt rekombinant koppevirus, men begge genene har imidlertid bare en homologi på 25,2%.

Sekvenssammenligning mellom influensavirus haemagglutinin og nukleoprotein-gener innsatt i det samme innsettingssetet (delesjonssete III) i modifisert Vacciniavirus Ankara (MVA), resulterte i en homologi på 49,1% (US patent nr. 5,676,950; Sutter et al, [1994], Vaccine 12: 1032).

US patent nr. 5,891,442 beskriver et rekombinant koppevirus som inneholder den kodende sekvenser for polyproteinet VP2, VP3 og VP4 etter infeksjon i leddvæskesekken. Nevnte gener ble fusjonert og således innsatt i et enkelt innsettingssete og har en homologi på fra 41,9 til 50,3%.

Endelig beskriver US patent nr. 6,217,882 en rekombinant svinekoppevirusvektor som inneholder pseudohundegalskapsantigenene gp50 og gp63 med en homologi på 52,7% innsatt i det samme innsettingssetet.

US 5338683 beskriver et vacciniavirus som inneholder DNA-sekvenser som koder for herpes virus glykoproteiner, men nevnte gener har ikke en homologi på minst 50%.

WO 9813500 beskriver et rekombinant MVA virus som uttrykker ulike Denguevirusantigener.

Konklusjonen er at de tidligere kjente homologe gener og sekvenser med en homologi på minst 50% alle har vært innsatt i det samme eller i et enkelt innsettingssete i det virale genomet.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et rekombinant poxvirus kjennetegnet ved at det omfatter minst to to homologe fremmede gener med en identitet på minst 50%, der hvert av de nevnte genene er innsatt i et forskjellig innsettingssete i det virale genomet.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen har homologe gener eller sekvenser en homologi på minst 50%, det vil si en homolog på mellom 50 og 100%, det vil si minst 50% identiske nukleotidbaser. Gener eller sekvenser med en homologi under 50% kan anses å være såkalt heterologe. I forhold til den foreliggende oppfinnelsen, så brukes begrepet "homolog" eller "homologi" når gener eller sekvenser sammenlignes med hverandre, mens begrepene "fremmed" gen, "eksogen" eller "heterolog" sekvens brukes når genene eller sekvensene sammenlignes med koppevirusgenomet, det vil si at nevnte begreper refererer seg til en DNA-sekvens som i naturen ikke normalt finnes assosiert med et koppevirus slik dette brukes ifølge oppfinnelsen. Den foreliggende oppfinnelsen angår således rekombinant koppevirus som omfatter minst to gener som er heterologe i sammenligning med det virale genomet, men som er homologe seg imellom. Begrepet "gener" refererer seg til kodende sekvenser som for eksempel koder proteiner, polypeptider, peptider, antigener og lignende. Proteiner, polypeptider eller peptider translatert fra homologe gener, har de samme funksjonene og viser de samme funksjonelle egenskapene. Homologe gener vil vanligvis være avledet fra forskjellige, men nærstående kilder eller organismer. Ifølge en utførelse av oppfinnelsen omfatter det rekombinante poxvirus i følge oppfinnelsen minst to homologe fremmede gener, der nevnte gener har en identitet på minst 60%, så som en identitet på 65-75%. Ettersom rekombinant koppevirus ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter den relevante genetiske informasjonen i en enkelt infiserende enhet eller i bare en viruspartikkel, er det ingen risiko for en ujevn infeksjon eller en ubalansert ekspresjon av de forskjellige homologe sekvensene. Det rekombinante koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter således, og er i stand til å uttrykke, flere svært nærstående gener eller nesten identiske sekvenser i en infisert celle, noe som er spesielt fordelaktig ved utviklingen av multivalente vaksiner.

Denne fordelen er spesielt interessant for utvikling av vaksiner mot sykdommer som er forårsaket av flere svært nærstående stammer eller stereotyper av virus, for eksempel Denguevirus. Rekombinante koppevirus som omfatter homologe gener av forskjellige Denguevirus serotyper, er beskrevet i eksemplene.

De homologe genene eller sekvensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være avledet fra enhver mikroorganisme så som ethvert virus, bortsett fra vektorviruset, enhver bakterie, enhver sopp eller parasitt. De homologe genene eller sekvensene er fortrinnsvis avledet fra en infiserende eller patogen mikroorganisme, og fortrinnsvis fra forskjellige stammer eller avarter, varianter, undertyper eller serotyper av nevnte mikroorganisme.

Begrepene "stamme" eller "avart" er tekniske begreper som er velkjente innenfor mikrobiologien og refererer seg til mikroorganismenes taksonomi. Det taksonomiske systemet klassifiserer alle hittil karakteriserte mikroorganismer i en hierarkisk rekkefølge som består av familier, slekter, arter og stammer (Fields Virology, redigert av Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, 4. utgave 2001). Mens kriteriene for å plassere flere slekter i en familie angår deres fylogenetiske slektskap, så vil en slekt omfatte alle de artene som har visse felles egenskaper, og en art er definert som en polytetisk gruppe som omfatter en repliserende utviklingslinje og inntar en spesiell økologisk nisje. Begrepene "stamme" eller "avart" beskriver en mikroorganisme, det vil si virus, som har visse felles egenskaper som for eksempel grunnleggende morfologi eller genomstruktur og organisering, men som har forskjellige biologiske egenskaper så som vertsutvalg, vevstropisme, geografisk utbredelse, svekkelse eller patogenisitet. Begrepet "varianter" eller "serotyper" skiller videre mellom virus fra den samme stammen, også kalt undertyper, som har individuelle infeksjonsspektra eller antigene egenskaper, noe som skyldes mindre genomiske variasjoner.

Ifølge en ytterligere utførelse av den foreliggende oppfinnelsen, vil de homologe genene eller sekvensene bli valgt fra virus, fortrinnsvis virus som hører til slekten Flaviviruses, mest foretrukket, men ikke begrenset til, Denguevirus, vest-Nilen-virus eller japansk encephalitisvirus; som hører til slekten Retroviruses, fortrinnsvis

- men ikke begrenset til - humant immunsviktvirus (HIV); som hører til slekten Enteroviruses, fortrinnsvis - men ikke begrenset til - munn og klovsyke, EV71; som

hører til slekten Rotaviruses eller som hører til Orthomyxoviruses, fortrinnsvis - men ikke begrenset til - influensavirus. Det er mest foretrukket at de homologe genene er avledet fra et flavivirus.

Ifølge en ytterligere foretrukket utførelse, er de homologe genene valgt fra Denguevirusgener, fortrinnsvis C, NS1 og/eller NS2, eller fortrinnsvis E, mer foretrukket PrM. Det er mest foretrukket at de homologe genene er avledet fra forskjellige serotyper av viruset, og hvor nevnte gener kan være avledet fra en, to tre eller fra alle de fire kjente Denguevirus serotypene.

Ifølge en ytterligere foretrukket utførelse, er de homologe genene valgt fra forskjellige HIV-stammer eller avarter. Fortrinnsvis er de homologe genene valgt fra gag/pol-kodende sekvenser og aller mest foretrukket fra den env-kodende sekvensen eller ytterligere foretrukket fra en kombinasjon av strukturelle og/eller regulerende HIV-kodende sekvenser.

Et vektorvirus som er egnet for bruk i den foreliggende oppfinnelsen kan være valgt fra gruppen av koppevirus, som lett kan dyrkes i utvalgte vertsceller som for eksempel fuglevertsceller, men som har sterkt sviktende replikasjon eller i det hele tatt ikke kan replikeres i mennesker eller menneskeceller.

Ifølge noen foretrukne utførelser, vil koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen være valgt fra gruppen som omfatter kanarifuglkoppevirus (Plotkin et al. [1995] Dev Biol Stand, vol 84: sidene 165-170. Taylor et al. [1995] Vaccine, Vol 13. nr. 6: sidene 539-549), hønsekoppevirus (Afonso et al. [2000] J Virol, sidene 3815-3831. Fields Virology, redigert av Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, 4. utgave 2001, kapittel 85: side 2916), pingvinkoppevirus (Stannard et al. [1998] J Gen Virol, 79, sidene 1637-1649) eller derivater av disse. Ettersom disse virustypene hører til slekten Avipoxvira, kan de lett dyrkes og oppformeres i fugleceller. I pattedyrceller eller i humane celler, har de imidlertid sviktende replikasjon, noe som betyr at det i alt vesentlig eller ikke i det hele tatt blir produsert infiserende virustyper.

Ifølge en ytterligere utførelse av den foreliggende oppfinnelsen, så brukes det et Vacciniavirus, fortrinnsvis et svekket Vacciniavirus, for utviklingen av rekombinante koppevirus som omfatter to eller flere homologe gener.

Skjønt det er kjent at det i Vacciniavirus (VV) kan skje en homolog rekombinasjon av korte homologe sekvenser, noe som kan føre til en delesjon eller fjerning av homologe sekvenser (Howley et al, [1996], Gene 172: 233-237), så tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et rekombinant vacciniavirus som inkluderer homologe sekvenser eller gener som stabilt er innsatt i dets genom. Denne oppdagelsen er spesielt uventet ettersom Howley et al. allerede har vist at korte sekvenser med opp til 300 basepar (bp) var tilstrekkelig til å indusere en genomisk omleiring og delesjon av homologe sekvenser i vacciniavirus. Man ville således forvente at lengre sekvenser ville indusere forskjellige rekombinasjoner med enda høyere sannsynlighet. Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan imidlertid endog sekvenser som omfatter fullstendig homologe gener, stabilt bli innsatt i genomet til vacciniavirus.

Et ikke-begrensende eksempel på et vacciniavirus er den sterkt svekkede og vertsutvalgsbegrensede vacciniastammen modifisert Vaccinia Ankara (MVA)

(Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40). MVA er blitt utviklet ved ca 570 serieoverføringer på kyllingembryofibroblaster av Ankarastammen av vacciniavirus (CVA) (for en oversikt, se Mayr, A., et al. [1975], Infection 3, 6-14). Som en konsekvens av disse langtidspassasjene, er det i CVA blitt fjernet ca. 31 kilobaser fra dens genomiske sekvens. Den resulterende virusstammen MVA er angitt å være sterkt vertscellebegrenset (Meyer, H. et al, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). En typisk MVA-stamme er MVA 575 som er innlevert til den europeiske samling av dyrecellekulturer under innleveringsnummer ECACC V00120707.

I en annen utførelse kan også MVA-Verostammen eller et derivat av denne brukes ifølge den foreliggende oppfinnelsen. MVA-Verostammen er innlevert til den europeiske samling av dyrecellekulturer med innleveringsnummer ECACC V99101431 og ECACC 01021411. Sikkerheten i forbindelse med MVA-Vero er reflektert av dets biologiske, kjemiske og fysiske egenskaper slik disse er beskrevet i internasjonal patentsøknad PCT/EP01/02703.1 sammenligning med normalt MVA, så har MVA-Vero en ytterligere genomisk delesjon.

Begrepet "derivater" av et virus ifølge den foreliggende oppfinnelsen, refererer seg til avkomvirus som har de samme karakteristika som foreldreviruset, men som har enkelte forskjeller i en eller flere deler av sitt genom.

En ytterligere utførelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen, bruker MVA-BN. MVA-BN er innlevert til den europeiske samling av dyrecellekulturer med

innleveringsnummer ECACC V00083008. Ved å bruke MVA-BN eller et derivat av dette, er det mulig å utvikle en spesielt sikker virusvaksine, ettersom det er påvist at MVA-BN-viruset er et ekstremt sterkt svekket virus avledet fra modifisert Vaccinia Ankara-virus. Ifølge den mest foretrukne utførelsen, er således MVA-BN eller derivater av dette som inneholder to eller flere homologe gener ifølge den foreliggende oppfinnelsen, brukt som den virale vektoren. Begrepet "derivat av MVA-BN" beskriver et virus som har de samme funksjonelle egenskapene som forefinnes i MVA-BN. Egenskapene til MVA-BN og en beskrivelse av de biologiske prøver som muliggjør en bedømmelse om hvorvidt MVA-viruset er et MVA-BN-virus eller et derivat av et slikt virus, foruten fremgangsmåter som muliggjør utvikling av MVA-BN eller derivater av dette, er beskrevet i WO 02/42480 (her inkorporert som en referanse). En enkel måte for å undersøke de

funksjonelle egenskapene til MVA-BN eller dets derivater, er dets svekkelse og mangel på replikasjon i humane HaCat-celler.

I et rekombinant koppevirus ifølge den foreliggende oppfinnelsen er ekspresjonen av de eksogene sekvensene fortrinnsvis kontrollert ved hjelp av et koppeviralt transkriberende kontrollelement, mer foretrukket av et MVA, kanarifuglkoppe-, hønsekoppe- eller pingvinkoppe transkriberende kontrollelement, eller mest foretrukket, en vacciniaviruspromotor. Koppevirale transkriberende kontrollelementer ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter videre ethvert transkriberende kontrollelement som fungerer i et koppeviralt system.

Innsettingen av de eksogene sekvensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen bør fortrinnsvis skje i et ikke-essensielt område av virusgenomet. Ikke-essensielle områder er for eksempel loci eller åpne leserammer (ORF) i koppevirale gener, og som ikke er essensielle for den koppevirale livssyklusen. Også intergenetiske områder som beskriver rommet mellom to åpne leserammer anses å være ikke-essensielle områder ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Ifølge en annen utførelse av oppfinnelsen, blir de eksogene sekvensene innsatt i et naturlig forekommende delesjonssete i MVA-genomet (beskrevet i PCR/EP02926 og her inkorporert som en referanse).

Orienteringen på det innsatte DNA har ingen påvirkning med hensyn til funksjonalitet eller stabilitet for det rekombinante viruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Ettersom det rekombinante koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen er sterkt vekstbegrenset og således sterkt svekket, så er det en ideell kandidat for behandlingen av en rekke forskjellige pattedyr så som mennesker, til og mennesker med svekket immunsystem. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer således også en farmasøytisk sammensetning og en vaksine for å indusere en immunreaksjon i en levende dyrekropp, heri inngår også et menneske.

Den farmasøytiske sammensetningen vil generelt omfatte en eller flere farmasøytisk akseptable og/eller godkjente bærere, additiver, antibiotika, konserveringsmidler, adjuvanser, fortynningsmidler og/eller stabilisatorer. Slike hjelpestoffer kan være vann, saltløsning, glyserol, etanol, fuktemidler eller emulgeringsmidler, pH-bufferstoffer eller lignende. Egnede bærerstoffer er vanligvis store, langsomt metaboliserte molekyler så som proteiner, polysakkarider, polymelkesyrer, polyglykolsyrer, polymere aminosyrer, aminosyrekopolymerer, lipidaggregater eller lignende.

For fremstillingen av vaksiner, vil det rekombinante koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen bli omdannet til en fysiologisk akseptabel form. Dette kan gjøres basert på erfaring fra fremstillingen av koppevirusvaksiner av den typen som brukes for vaksinasjon mot kopper (som beskrevet av Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). For eksempel kan det rensede viruset lagres ved -80°C med en titreringsverdi på 5 x 10E8 TCIDso/ml opparbeidet i ca 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4. For fremstillingen av en enkeltvaksine for injeksjon, kan for eksempel 10E2-10E8 partikler av viruset frysetørkes i 100 ml fosfatbufret saltløsning (PBS) i nærværet av 2% pepton og 1% humant albumin i en ampulle, fortrinnsvis en glassampulle. Alternativt kan vaksinen fremstilles ved en trinnvis frysetørking av viruset i et preparat. Et slikt preparat kan inneholde ytterligere additiver så som mannitol, dekstran, sukker, glysin, laktose eller polyvinylpyrrolidon, eller andre hjelpemidler så som antioksidanter eller en inert gass, stabilisatorer eller rekombinante proteiner (for eksempel humant serum albumin) som er egnet for en in vivo administrering. Glassampullen kan så lukkes og lagres mellom 4°C og romtemperatur i flere måneder. Hvis det imidlertid ikke er noe øyeblikkelig behov, kan ampullen fortrinnsvis lagres ved temperaturen under -20°C.

For vaksinasjon eller terapi, kan det frysetørkede produktet løses i fra 0,1 til 0,5 ml av en vandig løsning, fortrinnsvis en fysiologisk saltløsning eller Tris-buffer og så administreres, enten systemisk eller lokalt, for eksempel parenteralt, subkutant, intravenøst eller intramuskulært, ved skarifikasjon (rissing) eller ved hjelp av enhver annen kjent administrasjonsvei. Administrasjonsveien, dosen og antallet administreringer kan lett optimaliseres av den behandlende legen på kjent måte. Mest vanlig vil imidlertid en pasient bli vaksinert med en supplerende vaksine fra ca. 1 måned til 6 uker etter den første vaksinasjonen.

Det rekombinante viruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen, brukes for å innføre eksogene kodende sekvenser i en målcelle. Innføringen av en eksogen kodende sekvens i en målcelle kan brukes for å fremstille in vitro henholdsvis proteiner, polypeptider, peptider, antigener og epitoper. Videre kan fremgangsmåten for å innføre en homolog eller heterolog sekvens i en celle brukes for in vitro og in vivo terapi. For in vitro terapi, kan isolerte celler som på forhånd { ex vivo) er blitt infisert med det rekombinante koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen, administreres pasienten for å indusere en immunreaksjon. For in vivo terapi, kan det rekombinante koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen direkte administreres den levende dyrekroppen for å indusere en immunreaksjon. I dette tilfellet vil de cellene som omgir inokulasjonsstedet direkte bli infisert in vivo av viruset eller dets rekombinant ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Etter infeksjonen vil cellene syntetisere proteinene, polypeptidene, peptidene eller antigenene som ligger innkodet i de eksogene kodende sekvensene og deretter presentere dem helt eller delvis på den cellulære overflaten. Spesialiserte celler i immunsystemet vil gjenkjenne presentasjonen av slike fremmede proteiner, polypeptider, peptider, antigener og epitoper og utløse en spesifikk immunreaksjon. Fremgangsmåter for å fremstille rekombinante koppevirus eller å sette inn eksogene kodende sekvenser i et koppeviralt genom, er velkjente innenfor genteknologien. Videre er fremgangsmåten beskrevet i eksemplene og kan dessuten deduseres eller finnes mer detaljert beskrevet i de følgende referanser: - Molecular Clorting, A laboratory Manual. 2. utgave. Av J. Sambrook, E.F. Fritsch og T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: Beskriver generelle teknikker og standard molekylære biologiske fremgangsmåter så som kloning av DNA, DNA- og RNA-isolering, western blottanalyse, RT-PCR- og PCR-amplifiseringsteknikker.

Virology Methods Manual. Redigert av Brian WJ Mahy og Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: Beskriver teknikker for behandling og manipulering av virus. - Molecular Virology: A Practical Approach. Redigert av AJ Davison og RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press ved Oxford University Press. Oxford 1993. Kapittel 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors. - Current Protocols in Molecular Biology. Utgiver: John Wiley and Son Inc. 1998. Kapittel 16, seksjon IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector: Beskriver teknikker og fremgangsmåter for behandling, manipulering og genetisk endring av MVA.

For utvikling av rekombinante koppevirus ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan man anvende forskjellige fremgangsmåter: DNA-sekvensen som skal settes inn i nevnte virus kan plasseres i et E. coli plasmidkonstrukt hvor det er innsatt DNA som er homologt til en del av DNA i koppeviruset. Separat kan den DNA-sekvensen som skal settes inn, ligeres til en promoter. Promotergenforbindelsen plasseres i plasmidkonstruktet slik at nevnte promotorgenbinding er flankert i begge ender av DNA som er homologt til en DNA-sekvens som flankerer et område av det virus DNA som inneholder et ikke-essensielt locus. Det resulterende plasmidkonstruktet blir så amplifisert eller oppformert ved at det dyrkes inne i E. cø//-bakterier og deretter kan isoleres. Det isolerte plasmidet som inneholder den DNA-gensekvensen som skal innsettes blir så transfektert over i en celle kultur, for eksempel kyllingembryofibroblaster (CEF) sammen med koppeviruset. En rekombinasjon mellom homologt koppe-DNA i plasmidet og det virale genomet henholdsvis, gir et koppevirus som er modifisert ved nærværet av en fremmed DNA-sekvens.

Ifølge en mer foretrukket utførelse, blir en celle i en egnet cellekultur som for eksempel CEF-celler, infisert med et koppevirus. Den infiserte cellen blir deretter transfektert med en første plasmidvektor som omfatter det fremmede genet, fortrinnsvis under en transkriberende kontroll av et koppevirus ekspresjonskontrollelement. Som nevnt ovenfor, vil plasmidvektoren også omfatte sekvenser som er i stand til å styre innsettingen av den eksogene sekvensen i en utvalgt del av det koppevirale genomet. Eventuelt kan plasmidvektoren også inneholde en kassett som inneholder en markør og/eller et seleksjonsgen som operativt er forbundet til en koppeviral promotor. Egnede markører eller seleksjonsgener er for eksempel genene som koder det grønne fluorescerende proteinet, P-galaktosidase, neomycin, fosforibosyltransferase eller andre markører. Bruken av seleksjons- eller markørkassetter forenkler identifiseringen og isoleringen av det utviklede rekombinante koppeviruset. Et rekombinant koppevirus kan imidlertid også identifiseres ved hjelp av PCR-teknologi. Videre kan en celle som er infisert med det rekombinante koppeviruset fremstilt som beskrevet ovenfor, bli transfektert med en ny vektor som omfatter et gen som er homologt til det genet som inngår i den første vektoren. I dette tilfellet må dette genet innsettes i et annet innsettingssete i det koppevirale genomet, og den andre vektoren skiller seg også med hensyn til den sekvensen som styrer integreringen av det homologe genet i koppevirusets genom. Etter en homolog rekombinasjon, kan man så isolere det rekombinante viruset som omfatter de to homologe genene. For å innføre mer enn to homologe gener i det rekombinante viruset, så kan man gjenta de trinnene som er beskrevet ovenfor for infeksjon og transfeksjon ved å bruke det rekombinante viruset isolert i de foregående trinnene for infeksjon, og deretter bruke en ytterligere vektor som omfatter et ytterligere homologt gen for transfeksjon.

Alternativt kan man bytte om de trinnene for infeksjon og transfeksjon som er beskrevet ovenfor, det vil si at en egnet celle først kan transfekteres med plasmidvektoren som omfatter det fremmede genet og deretter bli infisert med koppeviruset.

Som et ytterligere alternativ, er det også mulig å innføre hvert homologe gen i forskjellige virus, deretter saminfisere en celle med alle de fremstilte rekombinerte virusene og deretter undersøke for et rekombinant virus som inneholder alle de homologe genene.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre et sett som omfatter to eller flere plasmidvektor-konstrukter som er i stand til å styre integreringen av de uttrykkbare homologe genene i koppevirusgenomet. Foruten et egnet kloningssete, så kan slike plasmid-vektorer også omfatte sekvenser som er i stand til å styre innsettingen av den eksogene sekvensen i utvalgte deler av det koppevirale genomet. Eventuelt kan slike vektorer omfatte seleksjons- eller markørergenkassetter. Settet kan ytterligere omfatte anordninger og beskrivelser på hvordan det er mulig å velge ut virus som er rekombinante for en eller flere av de homologe genene, og eventuelt et seleksjons-eller markørgen som innettes via nevnte vektorkonstrukter.

Ifølge en annen ytterligere utførelse, omfatter også oppfinnelsen DNA-sekvenser eller deler av disse som er avledet fra eller homologe til det rekombinante koppeviruset ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Slike sekvenser omfatter i det minste en del av den eksogene sekvensen som omfatter i det minste et fragment av ett eller flere av de homologe genene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og i det minst et fragment av den genomiske koppevirussekvensen ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og hvor nevnte genomiske koppevirussekvensen fortrinnsvis flankerer den eksogene sekvensen.

Slike DNA-sekvenser kan brukes for å identifisere eller isolere viruset eller dets derivater, for eksempel ved å bruke dem for å utvikle PCR-primere eller hybridiseringsprober, eller de kan brukes i matriseteknologier.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1: Skjematisk presentasjon av innsettingssetene for de fire PrM

(= premembran) genene (serotype 1-4) i MVA-genomet ifølge eksempel 1.

Figurene 2-9 og 12-17: Innsettingsplasmidvektorkonstrukter som indikerer vektorens navn, dens størrelse og plasseringen av sekvenser av interesse så som: AmpR = ampicillinresistensgen, bfp = blått fluorescerende proteingen, dA = delesjon A, dE = delesjon E, d2 = delesjon 2, Ecogpt = E. coli guanosinfosforibosyltransferasegen, EGFP = forsterket grønt fluorescerende proteingen, Fl = flankerende sekvens 1, F2 = flankerende sekvens 2,14L = intergenetisk område I4L, IGR = intergenetisk område, NPT II = neomycinresistensgen, P = koppeviruspromoter, pr7.5 = vacciniapromotor 7.5, PrM = premembrangen for Denguevirus, og hvor tallet indikerer fra hvilken av de fire serotypene det er avledet, rtp = repetisjon av flankerende sekvens. Figur 10: PCR-verifisering av vektorkloningsstrategier for fire forskjellige innsettingsvektorer (pBN49, pBN50, pBN50 og pBN39). Hvert av plasmidene ble testet med 4 forskjellige PCR-primerkombinasjoner. Hver kombinasjon er spesifikk for en distinkt PrM-sekvens som er integrert i distinkte innsettingsseter. Figur 11: PCR-verifisering av det rekombinante koppeviruset som inkluderer fire homologe Denguevirus PrM-gener (eksempel 1). Skjønt den øvre delen av gelen viser de forskjellige PCR-resultatene av de rekombinante virusene, så viser den nedre delen resultatene av de samme PCR-reaksjonene for de angitte kontrollplasmidene. De plasmidene som inneholder de homologe sekvensene, et betegnet pBN39, pBN49 eller pBN50. PrM står for innsatte premembrangener fra Denguevirus, og hvor tallene indikerer fra hvilke av de fire serotypene genene er avledet. dA = delesjon A, dE = delesjon E, d2 = delesjon 2,14L = intergenetisk område I4L beskriver innsettingssetet for det eksogene DNA. Figur 18: Skjematisk presentasjon av innsettingssetene for de tre PrM-genene (serotype 2-4) i MVA-genomet ifølge eksempel 2. Figur 19: PCR-verifisering av det rekombinante koppeviruset som inkluderer tre homologe Denguevirus PrM-gener innsatt i intergenetiske områder (eksempel 2). Den øvre figuren viser resultatene av PCR-reaksjonene som er spesifikke for PrM2; mens den midtre figuren viser resultatene av PCR-reaksjonene som er spesifikke for PrM3; mens den nedre figuren viser resultatene av PCR-reaksjonene som er spesifikke for PrM4. Kolonne 8 viser de samme PCR-reaksjonene for kontrollplasmidene. Kolonne 2 viser den tomme vektorkontrollen MVA. PrM står for de innsatte premembrangenene fra Denguevirus, og hvor tallene indikerer fra hvilke av de fire serotypene genene er avledet. M = molekylvektmarkør.

De følgende eksemplene vil ytterligere illustrere den foreliggende oppfinnelsen. Det er underforstått at de angitte eksemplene på ingen måte kan tolkes slik at de begrenser anvendbarheten av den teknologien som her er angitt til eksemplene som sådan.

Eksempel 1

Innsettingsvektorer

Innsettingsvektor for delesjon A

For innsettingen av eksogene sekvenser i MVA-genomet i den såkalte delesjon A eller delesjon 1 henholdsvis som tilsvarer genomposisjon 7608-7609, ble det konstruert en plasmidvektor som omfatter ca. 600 bp av de flankerende nabosekvensene til delesjonssetet A. For å isolere de flankerende sekvensene fra det genomiske MVA-BN DNA, ble det utformet egnede PCR-primere ved hjelp av egnet programvare (DNAsis, Hitashi software engeneering, San Bruno, USA). Slike primere omfatter forlengelser med restriksjonsenzymseter som kan brukes for å klone de flankerende sekvensene inn i et vektorplasmid. Mellom disse flankerende sekvensene ble det innført en seleksjonsgenkassett, for eksempel et NPT II-gen (neomycinresistens) under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor. Videre er det et kloningssete for innsetting av ytterligere gener eller eksogene sekvenser som eventuelt kan settes inn i delesjonssete A. Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er vist på figur 2 (pBNXlO).

Innsettingsvektor for delesjon E

For innsettingen av eksogene sekvenser i MVA-genomet i den såkalte delesjon E eller delesjon 4 henholdsvis som tilsvarer genomposisjonen 170480-170481, ble det konstruert en vektor som omfatter ca. 600 bp av flankerende nabosekvenser til delesjonssete E. Vektoren ble utformet og konstruert som beskrevet ovenfor. Mellom de flankerende sekvensene er det plassert et EGFP-gen (grønt fluorescerende protein, Clonetech) under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor. Videre er det et kloningssete for innsettingen av ytterligere gener eller sekvenser som kan settes inn i delesjonssete A. Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er vist på figur 3 (pBNX32).

Innsettingsvektor for delesjon 2

For innsettingen av eksogene sekvenser i MVA-genomet i den såkalte delesjon 2 som tilsvarer genomposisjonen 20718-20719, ble det konstruert en vektor som omfatter ca. 600 bp av de flankerende nabosekvensene til delesjonssetet 2. Vektoren ble utformet og konstruert som beskrevet ovenfor. Mellom de flankerende sekvensene er det plassert et hbfp-gen (humanisert blått fluorescerende protein, Pavalkis GN et al.) under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor. Ytterligere er det et kloningssete for innsettingen av ytterligere gener eller sekvenser som eventuelt skal settes inn i delesjonssetet 2. Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er vist på figur 4 (pBNX36).

Innsettingsvektor for intergenetisk område, I4L

For innsettingen av eksogene sekvenser i det intergenetiske området mellom ORF I3L og I4L som tilsvarer genomposisjonen 56760, ble det konstruert en vektor som omfatter ca. 600 bp av de flankerende nabosekvensene til det intergenetiske området ved I4L-locuset. Vektoren ble utformet og konstruert på lignende måte som beskrevet ovenfor. Mellom de flankerende sekvensene er det plassert et iscogpt-gen (eller gpt som står for fosforibosyltransferasegenet isolert fra E. coli) under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor. Videre er det kloningssete for innsettingen av ytterligere gener eller sekvenser som eventuelt kan innsettes i det intergenetiske området etter I4L ORF. Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er vist på figur 5 (pBNX39).

Konstruksjon av rekombinant koppevirus som omfatter flere homologe gener integrert i dets genom.

Innsettingsvektor er

For innsettingen av de fire PrM-genene for de fire serotypene av Denguevirus i MVA-genomet, ble det brukt fire uavhengige rekombinasjonsvektorer.

Disse vektorene inneholder - som beskrevet detaljert ovenfor - sekvenser som er homologe til MVA-genomet for målsøkende innsetting ved hjelp av homolog rekombinasjon. Videre inneholder hver vektor en seleksjons- eller reportergenkassett.

PrM-sekvensene for de fire Denguevirus serotypene ble syntetisert ved hjelp av oligohybridisering og PCR-amplifisering. PrM-sekvensene ble klonet nedstrøms for koppeviruspromotorelementene for derved å få dannet en ekspresjonskassett. Denne ekspresjonskassetten ble så klonet inn i kloningssetet i de relevante innsettings vektorkonstruktene.

Som et resultat av dette, inneholdt innsettingsvektorkonstruktet for delesjon A PrM-genet for Denguevirus serotype 2 (figur 6 - pBN39). Innsettingsvektorkonstruktet for delesjon 2 inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 1 (figur 7 - pBN49). Innsettingsvektorkonstruktet for det intergenetiske området I4L inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 3 (figur 8 - pBN50), mens innsettingsvektorkonstruktet for delesjon E inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 4 (figur 9 - pBN40).

PCR- verifisering av innsettingsvektor ene

For å få verifisert kloningsstrategiene, ble det utført PCR-prøver. For disse PCR-prøvene er de valgte primerparene en kombinasjon av en primer som spesifikt binder seg til den spesifikke flankerende sekvensen i forhold til innsettingssetet, mens den andre primeren binder seg spesifikt til en av det sterkt homologe Denguevirus PrM-genene.

Innsettingsvektoren for delesjon A som inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 2, ble screenet med primerne oBN93

Innsettingsvektoren for delesjon 2 som inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 1, ble screenet med primerne oBN194 Innsettingsvektoren for det intergenetiske området I4L som inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 3, ble screenet med primerne oBN255

Innsettingsvektoren for delesjon E som inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 4, ble screenet med primerne oBN210

PCR-eksperimentene ble utført i et Thermal cycler GeneAmp 9700-apparat (Perkin Eimer) ved å bruke Taq DNA-polymerasesettet som inneholdt 10x PCR-buffer, MgCh-buffer og Taq DNA-polymerase (Roche, katalognr. 201205) eller tilsvarende. Generelt ble PCR-reaksjonene utført med et totalt reaksjonsvolum på 50 ul som inneholdt 45 ul av masterblandingen, prøve-DNA og ddH20 etter behov. Masterblandingen bør fremstilles med 30,75 jllI DdH20, 5 jllI 10x buffer, 1 u.1 dNTP-blanding (10 mM hver), 2,5 ul av hver primer (5 pmol/ul), 3 ul MgCb (25 mM) og 0,25 ul Taq-polymerase (5 U/ul).

Amplifiseringen ble utført ved å bruke det følgende programmet:

Basert på størrelsen av det innsatte genet, bør forlengelsestiden være minst

1 minutt/kb.

De PCR-resultatene som er vist på figur 10, viser spesifisiteten for de primer-kombinasjonene som ble brukt for de enkle innsettingene.

Primerkombinasjonen oBN194/oBN476 er spesifikk for delesjon 2 og PrMl som innsetting. Det forventede PCR-fragmentet av plasmid pBN49 har en størrelse på 678 bp (vist i kolonne 3, øvre del av gelen).

Primerkombinasjonen oBN255/oBN479 er spesifikk for det intergenetiske området I4L og PrM3 som innsetting. Det forventede PCR-fragmentet av plasmid pBN50 har en størrelse på 825 bp (vist i kolonne 9, øvre del av gelen).

Primerkombinasjonen oBN210/oBN478 er spesifikk for delesjon E og PrM4 som innsetting. Det forventede PCR-fragmentet av plasmid pBN40 har en størrelse på 607 bp (vist i kolonne 4, nedre del av gelen).

Primerkombinasjonen oBN93/oBN477 er spesifikk for delesjon A og PrM2 som innsetting. Det forventede PCR-fragmentet av plasmid pBN39 har en størrelse på 636 bp (vist i kolonne 11, nedre del av gelen).

Utvikling av rekombinant MVA via homolog rekombinasjon

For ekspresjon av fremmede gener ved hjelp av et rekombinant MVA, må disse genene være innsatt i det virale genomet ved hjelp av en fremgangsmåte som kalles homolog rekombinasjon. For dette formålet ble det fremmede genet av interesse klonet inn i en innsettingsvektor slik det er beskrevet ovenfor. Denne vektoren må så transfekteres etter infeksjon av cellene med MVA-BN. Rekombinasjonen vil da skje i det cellulære cytoplasmaet i de infiserte og transfekterte cellene. Med hjelp av seleksjons- og/eller reporterkassetten som også forefinnes i innsettingsvektoren, så vil det være mulig å identifisere og isolere celler som omfatter rekombinante virus.

Homolog rekombinasjon

For homolog rekombinasjon ble BHK (nyfødt hamsternyre) -celler eller CEF (primære kyllingembryofibroblaster) -celler tilsatt 6 brønners plater ved å bruke DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, Gibco BRL) + 10% fosterkalveserum (FCS) eller VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/1 L-glutamin for en serumfri produksjonsprosess.

Cellene må være i vekstfasen og bør derfor nå en sammenflytning på fra 60 til 80% på transfeksjonsdagen. Cellene ble telt før tilsetning til platene, ettersom celletallet må være kjent for å kunne bestemme multiplisiteten ved infeksjonen (moi) for infeksjon.

For infeksjon ble MVA-lageret fortynnet i DMEM/FCS eller VP-SFM/L-glutamin slik at 500 u.1 av fortynningen inneholdt et passende antall virus som vil gi en moi på 0,01. Det ble antatt at cellene delte seg en gang etter at de ble tilsatt platene. Mediet ble fjernet fra cellene, og cellene ble infisert med 500 ul av fortynnet virus i 1 time ved forsiktig risting ved romtemperatur. Inokulum ble fjernet og cellene ble vasket med DMEM/VP-SFM. De infiserte cellene ble hensatt i 1,6 ml av henholdsvis DMEM/FCS og VP-SFM/L-glutamin mens transfeksjonsreaksjonen ble forberedt (Qiagen Effectenesett).

For transfeksjon brukte man "Effectene" transfeksjonssett (Qiagen). Det ble fremstilt en transfeksjonsblanding av 1 -5 jag av linearisert innsettingsvektor (total mengde for multippel transfeksjon) med buffer EC til et sluttvolum på 150 ul. Det ble så tilsatt 0,8 °1 forsterkende medium pr jag DNA, hvoretter blandingen ble rørt og innkubert ved romtemperatur i 5 minutter. Deretter ble 25 ul Effectene tilsatt pr |j,g DNA etter fornyet røring, og blandingen ble skikkelig blandet ved kraftig røring og deretter innkubert ved romtemperatur i 10 minutter. 600 ul av henholdsvis DMEM/FCS og VP-SFM/L-glutamin ble tilsatt, blandet og deretter ble hele transfeksjonsblandingen tilsatt cellene som allerede var dekket med medium. Forsiktig risting av platene ble utført for å blande transfeksjonsreaksjonsblandingen. Innkuberingen finner sted ved 37°C med 5% CO2over natten. Den neste dagen ble mediet fjernet og erstattet med friskt DMEM/FCS eller VP-SFM/L-glutamin. Innkuberingen ble fortsatt inntil dag 3.

For høsting ble cellene skrapet over i medium, hvoretter cellesuspensjonen ble overført til et passende rørt og frosset ved -20°C for korttids lagring eller ved -80°C for langtids lagring.

Innsetting av PrM4 i MVA

I en første runde ble cellene infisert med MVA-BN ved hjelp av den protokollen som er beskrevet ovenfor, og ble så ytterligere transfektert med innsettingsvektoren pBN40 som inneholdt PrM-genet av Denguevirus serotype 4 og EGPF-genet som reportergen. Ettersom transfeksjonsvektoren inneholder et reportergen, EGFP, så vil det syntetiserte proteinet la seg påvise senest på dag tre i celler som var infisert med et rekombinant virus. De resulterende rekombinante virus ble deretter renset ved hjelp av plakkrensing.

For nevnte plakkrensing, ble nevnte infiserte celler (fluorescerende eller fargede) isolert med en pipettetupp, igjen suspendert og gjennomluftet i 200 ul PBS eller medium. Deretter ble en frisk kulturplate som inneholdt 10E6 celler infisert med 100 u.1 av de resuspenderte plakk. Etter 48 timer ble cellene tatt over i 300 ul PBS. DNA ble ekstrahert fra suspensjonen og screenet ved hjelp av PCR-analyse. En klon som viste de forventede båndene ble valgt ut og friske 6 brønners plater ble infisert med forskjellige mengder av dette viruset. Brønnene ble dekket med 1% agarose, og dette hindrer ytterligere spredning av virus. Etter 48 timer ble det isolert infiserte celler som omfatter en rekombinant virusklon.

Denne fremgangsmåten ble gjentatt inntil man ikke kunne påvise noe villtype MVA-BN i en PCR-analyse.

Etter 4 runder med plakkrensing, ble rekombinante virus, det vil si MVA-PrM4, identifisert ved PCR-prøver ved å bruke et primerpar som selektivt amplifiserer den forventede innsettingen (pBN210 og oBN478 som beskrevet ovenfor) og som kontroll, et primerpar som spesifikt gjenkjenner innsettingssetet for delesjon E

Innsetting av PrM2 i MVA- PrM4

Celler ble infisert med MVA-PrM4 ved hjelp av den ovenfor angitte protokollen, og ble så ytterligere transfektert med innsettingsvektor pBN39 som inneholdt PrM-genet av Denguevirus serotype 2 og som seleksjonsgen, NPT II, som er et neomycinresistensgen. For rensing av rekombinante MVA som uttrykker et antibiotikaresistensgen, er det anbefalt med tre runder med virusamplifisering under selektive betingelser før man utfører en plakkrensing. For neomycinfosfotransferaseseleksjon, ble G418 tilsatt mediet. G418 er et derivat av neomycin og hemmer proteinbiosyntesen ved å interferere med ribosomenes virkning. NPT-genaktivitet vil inaktivere G418 ved hjelp av fosforylering.

Etter 16 runder med plakkrensing under neomycinseleksjon, ble det identifisert rekombinante virus, MVA-PrM4/PrM2, ved hjelp av PCR-prøver og ved å bruke et primerpar som selektivt amplifiserer den forventede innsettingen (oBN93 og oBN477 som beskrevet ovenfor) og som kontroll, et primerpar som spesifikt gjenkjenner innsettingssetet for delesjon A (oBN477: som beskrevet ovenfor og0BN452: GTTTCATCAGAAATGACTCCATGAAA, SEKV.ID. NR. 11). I tillegg ble også innsettingen av PrM4 i delesjon E verifisert ved hjelp av primerparene:OBN210 -0BN478 og oBN453 - oBN454.

Innsetting av PrMl i MVA

I en første runde ble cellene infisert med MVA-BN som beskrevet ovenfor, og så ytterligere transfektert med innsettingsvektoren pBN49 som inneholder PrM-genet for Denguevirus serotype 1 og hbfp som reportergen, det vil si genet for humanisert blått fluorescerende protein. Det syntetiserte hbfp-proteinet lar seg påvise på dag tre i celler infisert med et rekombinant virus. De resulterende rekombinante virus ble renset ved plakkrensing.

Etter 10 runder med plakkrensing, ble de rekombinante virus, det vil si MVA-PrMl, identifisert ved hjelp av PCR-prøver hvor man brukte primerpar som selektivt amplifiserer den forventede innsettingen (oBN194 og oBN476 som beskrevet ovenfor) og som kontroll, et primerpar som spesifikt gjenkjenner innsettingssetet for delesjon 2 (oBN54:

Innsetting av PrM3 i MVA

I en første runde ble celler infisert med MVA-BN ved hjelp av den protokollen som er beskrevet ovenfor og ble ytterligere transfektert med innsettingsvektoren pBN50 som inneholdt PrM-genet for Denguevirus serotype 3 og som reportergen, Ecogpt-genet ( Ecogpt eller forkortet til gpt, står for fosforibosyltransferasegenet). De resulterende rekombinante virus ble renset ved hjelp av 3 runder med plakkrensing under fosforibosyltransferase metabolismeseleksjon ved å tilsette mycofenolsyre, xantin og hypoxantin. Mycofenolsyre (MPA) hemmer inosinmonofosfatdehydrogenase og resulterer i en blokkering av purinsyntesen og hemmer dessuten viral replikasjon i de fleste cellelinjer. Denne blokkeringen kan unngås ved å uttrykke Ecogpt fra en konstitutiv promotor og tilveiebringe substratene xantin og hypoxantin.

De resulterende rekombinante virus, MVA-PrM3, ble identifisert ved hjelp av PCR-prøver hvor man brukte et primerpar som selektivt amplifiserer den forventede innsettingen (oBN255 og oBN479 som beskrevet ovenfor) og som kontroll, et primerpar som spesifikt gjenkjenner innsettingssetet for I4L (oBN499:

Saminfeksjon av MVA- PrMl og MVA- PrM3

Cellene ble infisert med like mengder av MVA-PrMl og MVA-PrM3 ved hjelp av den protokollen som er beskrevet ovenfor. Etter 3 runder med plakkrensing under fosforibosyltransferase metabolismeseleksjon, ble blått fluorescerende kloner av rekombinante virus analysert ved hjelp av PCR ved å bruke primerparene (oBN255 og0BN479,0BN499 og oBN500, oBN194 og oBN476, oBN54 og oBN56 som beskrevet ovenfor). De resulterende rekombinante virus ble betegnet MVA-PrMl/PrM3.

Saminfeksjon av MVA- PrMl/ PrM3 og MVA- PrM2/ PrM4

Cellene ble infisert med like mengder av MVA-PrMl/PrM3 og MVA-PrM2/PrM4 ifølge den ovenfor angitte protokollen. Plakkrensing ble utført under fosforibosyltransferase metabolisme og neomycinseleksjon. Rekombinante virus som induserte en grønn og blå fluorescens ble isolert og analysert ved hjelp av PCR og ved å bruke primerparene (oBN255 og oBN479, oBN499 og oBN500, oBN194 og0BN476, oBN54 og oBN56, oBN93 og oBN477, oBN477 og oBN452, oBN210 og oBN478, oBN453 og oBN454 som beskrevet ovenfor).

PCR-analysen av det rekombinante viruset (klon 20) som omfatter alle fire PrM-genene, er vist på figur 11. Mens den øvre delen av gelen viser de forskjellige PCR-resultatene av de rekombinante virus, så gir den nedre delen resultatene av de samme PCR-reaksjonene for kontrollplasmidene (som angitt). Banene 1, 10 og 11 viser en 1 kb og en 100 bp molekylær markør.

Primerkombinasjonen oBN210/oBN478 er spesifikk for delesjon E og PrM4 som innsettinger. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset og plasmidet pBN40 har en størrelse på 607 bp (vist i kolonne 2).

Primerkombinasjonen oBN453/oBN454 er spesifikk for delesjon E. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset er 2,7 kb, og det forventede båndet av villtypeviruset er på 2,3 kb (vist i kolonne 3). Også i den øvre delen av gelen er det mulig å identifisere et bånd som er spesifikt for et villtypevirus. Dette betyr at det rekombinerte viruspreparatet ikke er fullstendig fritt for villtypevirus. I dette tilfellet er det nødvendig med ytterligere plakkrensing.

Primerkombinasjonen oBN93/oBN477 er spesifikk for delesjon A og PrM2 som innsettinger. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset og plasmidet pBN39 har en størrelse på 636 bp (vist i kolonne 4).

Primerkombinasjonen oBN477/oBN452 er spesifikk for delesjon A. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset er 4,1 kb, det forventede båndet av villtypeviruset er på 2,7 kb (vist i kolonne 5). I den øvre delen av gelen er det mulig å identifisere et bånd som er spesifikt for et villtypevirus.

Primerkombinasjonen oBN255/oBN479 er spesifikk for det intergenetiske området I4L og PrM3 som innsettinger. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset og plasmidet pBN50 har en størrelse på 825 bp (vist i kolonne 6).

Primerkombinasjonen oBN499/oBN500 er spesifikk for det intergenetiske området av I4L. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset er 1,0 kb, og det forventede båndet for villtypeviruset er på 0,3 kb (vist i kolonne 7).

Primerkombinasjonen oBN194/oBN476 er spesifikk for delesjon 2 og PrMl som innsettinger. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset og plasmidet pBN49 har en størrelse på 678 bp (vist i kolonne 8).

Primerkombinasjonen oBN54/oBN56 er spesifikk for delesjon 2. Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset er 1,6 kb, og det forventede båndet av villtypeviruset er på 0,9 kb (vist i kolonne 9). I den øvre delen av gelen er det mulig å identifisere et bånd som er spesifikt for et villtypevirus.

Alternativt er det mulig å produsere 4 forskjellige virus, og deretter saminfisere cellene med alle nevnte fire virus og så utføre en screening for å finne et rekombinant virus.

Det kan også oppnås forbedringer ved hjelp av rekombinasjonsvektorer som inneholder ytterligere seleksjons- eller resistensmarkører.

Eksempel 2

Innsettingsvektorer

Rekombinasjonsvektorfor det intergenetiske området 136- 137 ( IGR 136- 137)

For innsettingen av eksogene sekvenser i MVA-genomet i det såkalte intergenetiske området (IGR) 136-137 som tilsvarer genomposisjonen 129.940, ble det konstruert en plasmidvektor som omfatter ca 600 bp av de flankerende nabosekvensene til innsettingssetet. For å isolere de flankerende sekvensene fra det genomiske MVA-BN DNA, ble det utformet egnede PCR-primere. Slike primere omfatter forlengelser med restriksjonsenzymseter som så vil kunne brukes for å klone de flankerende sekvensene inn i et vektorplasmid. Mellom disse flankerende sekvensene ble det innført en seleksjonsgenkassett, det vil si NPT II-gen (neomycinresistens) under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor (P). Dessuten er det et kloningssete for innsetting av ytterligere gener eller eksogene sekvenser som skal isettes inn i IGR 136-137 (PacI). Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er vist på figur 12 (pBNX67).

Rekombinasjonsvektor for det intergenetiske området 07- 08 ( IGR 07- 08)

For innsettingen av eksogene sekvenser i MVA-genomet i det intergenetiske området (IGR) 07-08 som tilsvarer den genomiske posisjonen 12.800, ble det konstruert en plasmidvektor som omfatter ca 600 bp av de flankerende nabosekvensene til innsettingssetet. For å isolere de flankerende sekvensene fra det genomiske MVA-BN DNA, ble det utformet egnede PCR-primere. Slike primere omfatter forlengelser med restriksjonsenzymseter som vil kunne brukes for å klone de flankerende sekvensene inn i et vektorplasmid. Mellom disse flankerende sekvensene er det innført en seleksjonsgenkassett, for eksempel Ecogpt-gen (guanin-fosforibosyltransferase) under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor (P). I tillegg er det et kloningssete for innsetting av ytterligere gener eller eksogene sekvenser som skal settes inn i IGR 07-08 (PacI). Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er vist på figur 13 (pBNX88).

Rekombinasjonsvektor for det intergenetiske området 44- 45 ( IGR 44- 45)

For innsettingen av eksogene sekvenser i MVA-genomet i det intergenetiske området (IGR) 44-45 som tilsvarer den genomiske posisjonen 37.330, ble det konstruert en plasmidvektor som omfatter ca 600 bp av de flankerende nabosekvensene til innsettingssetet. For å isolere de flankerende sekvensene fra det genomiske MVA-BN DNA, ble det utformet egnede PCR-primere. Slike primere omfatter forlengelser med restriksjonsenzymseter som vil kunne brukes for å klone de flankerende sekvensene inn i et vektorplasmid. Mellom disse flankerende sekvensene er det innført en seleksjonsgenkassett, for eksempel NPT II-gen (neomycinresistens), under transkriberende kontroll av en koppeviral promotor (P). I tillegg er det et kloningssete for innsettingen av ytterligere gener eller eksogene sekvenser som skal settes inn i IGR 44-45 (PacI). Et slikt vektorkonstrukt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er vist på figur 14 (pBNX87).

Konstruksjon av rekombinant koppevirus som omfatter flere homologe gener integrert i dets genom

Innsettingsvektorer

For innsettingen av de tre PrM-genene av serotype 2, 3 og 4 av Denguevirus i MVA-genomet, ble det brukt tre uavhengige rekombinasjonsvektorer.

Disse vektorene inneholder - som detaljert beskrevet ovenfor - sekvenser som er homologe til MVA-genomet for å målrette innsettingen ved hjelp av homolog rekombinasjon. Videre inneholder hver vektor en seleksjons- og reportergenkassett. PrM-sekvensene for de tre Denguevirus serotypene ble syntetisert som beskrevet i eksempel 1.

Som et resultat inneholdt innsettingsvektorkonstruktet for IGR136-137 PrM fra Denguevirus serotype 4 (figur 15 - pBN27). Innsettingsvektorkonstruktet for IGR 07-08 inneholdt PrM fra Denguevirus serotype 2 (figur 16 - pBN34), og innsettingsvektorkonstruktet for IGR 44-45 inneholdt PrM fra Denguevirus serotype 3 (figur 17 - pBN47).

Utvikling av det rekombinante MVA via homolog rekombinasjon

Utviklingen av rekombinant MVA ved hjelp av homolog rekombinasjon ble utført som beskrevet i eksempel 1.

Innsettingssetene for PrM4, PrM3 og PrM2 i MVA-genomet er vist i figur 18.

Innsetting av PrM4 i MVA

I en første runde ble cellene infisert med MVA-BN ifølge den ovenfor beskrevne protokollen og ble dessuten transfektert med innsettingsvektoren pBN27 som inneholdt PrM-genet fra Denguevirus serotype 4 og som et reportergen, EGFP-genet. Ettersom den transfekterte vektoren inneholder et reportergen, det vil si EGFP, lar det syntetiserte proteinet seg påvise på dag tre i celler infisert med et rekombinant virus. De resulterende rekombinante virus ble renset ved plakkrensing som beskrevet i eksempel 1. Etter fire runder med plakkrensing, ble de rekombinante virus, MVA-PrM4, identifisert ved hjelp av PCR-prøver ved å bruke primerpar som selektivt amplifiserer innsettingssetet IGR136-137 (0BNIOO8: gataccgatcacgttcta, SEKV.ID. NR. 16; og oBN1009: ggatatgattatgtagag, SEKV.ID. NR. 17).

Innsetting av PrM2 i MVA

Celler ble infisert med MVA-PrM4 ifølge den ovenfor beskrevne protokollen og ble dessuten transfektert med innsettingsvektoren pBN34 som inneholdt PrM-genet fra Denguevirus serotype 2 og som et reportergen, BFP-genet. Ettersom den transfekterte vektoren inneholder et reportergen, det vil si BFP, så lar det syntetiserte proteinet seg påvise senest på dag tre i celler infisert med et rekombinant virus. Resulterende rekombinante virus kan renses ved plakkrensing som beskrevet i eksempel 1. Etter seks runder med plakkrensing, ble det rekombinante virus MVA-PrM4+PrM2 ytterligere overført og amplifisert, og det ble fremstilt et urent lagerpreparat. De rekombinante virus ble identifisert ved PCR-prøver ved å bruke et primerpar som selektivt amplifiserer innsettingssetet IGR07-08 (oBN903: ctggataaatacgaggacgtg, SEKV.ID. NR. 18; og oBN904: gacaattatccgacgcaccg, SEKV.ID. NR. 19).

Innsetting av PrM3 i MVA

Celler ble infisert med MVA-PrM2+4 ved hjelp av den ovenfor beskrevne protokollen og ble dessuten transfektert med innsettingsvektoren pBN47 som inneholdt PrM-genet fra Denguevirus serotype 3 og som et reportergen, EGFP-genet. Ettersom den transfekterte vektoren inneholder et reportergen, det vil si EGFP, så lar det syntetiserte proteinet seg påvise senest på dag tre i celler infisert med et rekombinant virus. De resulterende rekombinante virus må renses ved plakkrensing som beskrevet i eksempel 1. Etter tre runder med plakkrensing, ble de rekombinante virus, MVA-PrM4+3+2, identifisert ved hjelp av PCR-prøver som brukte et primerpar som selektivt amplifiserer innsettingssetet IGR44-45 (oBN904: cgttagacaacacaccgacgatgg, SEKV.ID. NR. 20; og oBN905 cggatgaaaaatttttggaag, SEKV.ID. NR. 21).

PCR-analysene av de rekombinante virus som omfatter de tre Denguevirus PrM-genene er vist på figur 19. PCR-eksperimentene ble utført som beskrevet i eksempel 1. Primerkombinasjonen0BNIOO8 og oBN1009 er spesifikke for IGR136-137 som inneholder PrM4-innsettingen (figur 19, nederste bilde). Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset har en størrelse på 1 kb (vist i kolonnene 4, 5 og 6) som den positive plasmidkontrollen (kolonne 8). Den tomme vektorkontrollen som mangler PrM4 viser det forventede fragmentet på 190 bp (kolonne 2). Kolonne M viser molekylvektmarkøren og kolonnene 1, 3 og 7 er tomme. Primerkombinasjonen oBN902 og oBN903 er spesifikk for IGR07-08 som inneholder PrM2-innsettingen (figur 19, øvre bilde). Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset har en størrelse på 960 bp (vist i kolonnene 4-6) som den positive plasmidkontrollen (kolonne 8). Den tomme vektorkontrollen som mangler PrM2, viser det forventede fragmentet på 190 bp (kolonne 2). Primerkombinasjonen oBN904 og oBN905 er spesifikk for IGR44-45 som inneholder PrM3-innsettingen (figur4 19, midtre bilde). Det forventede PCR-fragmentet av det rekombinante viruset har en størrelse på 932 bp (vist i kolonnene 4-6) som den positive plasmidkontrollen (kolonne 8). Den tomme vektorkontrollen som mangler PrM2, viser det forventede fragmentet på 185 bp (kolonne 2).

Claims (25)

1. Rekombinant poxvirus, karakterisert vedat det omfatter minst to homologe fremmede gener med en identitet på minst 50%, der hvert av de nevnte genene er innsatt i et forskjellig innsettingssete i det virale genomet.

2. Rekombinant poxvirus, karakterisert vedat det omfatter minst to homologe fremmede gener, der nevnte gener har en identitet på minst 60%.

3. Rekombinant poxvirus ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat genene har en identitet på 65-75%.

4. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert vedat genene er avledet fra et flavivirus.

5. Rekombinant poxvirus ifølge krav 4, karakterisert vedat nevnte flavivirus er et Denguevirus.

6. Rekombinant poxvirus ifølge krav 4 eller 5, karakterisert vedat genene er minst to homologe gener avledet fra minst to forskjellige serotyper av viruset.

7. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 4 til 6, karakterisert vedat genene er minst to PrM-gener.

8. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 4 til 7, karakterisert vedat genene er 4 PrM-gener.

9. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert vedat nevnte poxvirus er et Vacciniavirus.

10. Rekombinant poxvirus ifølge krav 9, karakterisert vedat Vacciniaviruset er et Modifisert Vaccinia Ankara (MVA) virus.

11. Rekombinant poxvirus ifølge krav 10, karakterisert vedat nevnte MVA som blir benyttet til å generere det rekombinante viruset er MVA-BN som er deponert hos the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) under nummer V00083008.

12. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 11,karakterisert vedat nevnte poxvirus er replikasjonssviktende eller er replikasjonsinkompetent i pattedyrceller, inklusive humane celler.

13. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 12,karakterisert vedat genene er innsatt i et naturlig forekommende delesjonssete og/eller i en intergenetisk region i det poxvirale genomet.

14. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 13 som et medikament eller vaksine.

15. Vaksine, karakterisert vedat den omfatter det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13.

16. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat den omfatter det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13 og en farmasøytisk akseptabelt bærer, fortynningsmiddel, adjuvant og/eller additiv.

17. Rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 13, vaksinen ifølge krav 15 eller sammensetningen ifølge krav 16 for å påvirke en immunreaksjon i et levende dyr, inklusive et menneske.

18. Anvendelse av det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13 for fremstillingen av et medikament eller vaksine.

19. Anvendelse av det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1-14, av vaksinen ifølge krav 15 eller av sammensetningen ifølge krav 16, for fremstillingen av et medikament for å påvirke en immunreaksjon i et levende dyr, inklusive et menneske.

20. Celle, karakterisert vedat den omfatter det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13.

21. Fremgangsmåte for generering av et rekombinant poxvirus ifølge ethvert av kravene 1 til 13, karakterisert vedat den omfatter trinnene infisere en celle in vitro eller ex vivo med et poxvirus; transfektere den infiserte cellen med et første vektorkonstrukt som omfatter et gen som er heterologt til poxvirusgenomet, og en genomisk poxvirussekvens som er i stand til å styre integreringen av det heterologe genet i et innsettingssete i poxvirusgenomet; identifisere, isolere og eventuelt rense det genererte, rekombinante poxviruset; gjenta de ovennevnte trinnene ved å bruke det rekombinante poxviruset fra de foregående trinnene for å infisere cellen og et ytterligere vektorkonstrukt som omfatter et ytterligere gen som er heterologt til poxvirusgenomet og homologt med genet i det første vektorkonstruktet.

22. Sett for dannelse av det rekombinante poxviruset i følge hvilket som helst av kravene 1-13, karakterisert vedat det omfatter to eller flere vektorkonstrukter hvor hvert konstrukt omfatter et gen under transkriberende kontroll av et poxvirusekspresjonskontrollelement, og hvor de genene som inngår i de forskjellige vektorene er homologe gener med en identitet på minst 50 %, og hvor hvert gen er flankert av en poxvirus-DNA-sekvens som er i stand til å styre integreringen av genet i innsettingssetet i poxvirusgenomet, og anordninger for å identifisere og/eller selektere rekombinante poxvirus som har inkorporert nevnte homologe gener i sine genomer.

23. DNA-sekvens omfattende det rekombinante poxvirusgenomet til det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13, karakterisert vedat nevnte DNA-sekvens omfatter de minst to homologe genene med en homologi på i det minste 50% som er satt inn i ulike innsettingsseter og i det minste en del av sekvensen fra poxvirusgenomet, der nevnte del av sekvensen til poxvirusgenomet flankerer nevnte homologe gener.

24. Anvendelse av DNA-sekvensen i følge krav 23 for å påvise celler infisert med det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13, hvori DNA-sekvensen i følge krav 23 administreres til nevnte celler og celler infisert med det rekombinante poxvirus detekteres.

25. Anvendelse av DNA-sekvensen i følge krav 23 for å identifisere det rekombinante poxviruset ifølge ethvert av kravene 1 til 13, hvori DNA-sekvensen i følge krav 23 administreres til nevnte virus og det rekombinante poxvirus identifiseres.