NO336489B1 - Rekombinant modifisert Vaccinia Ankaravirus (MVA), anvendelse derav for fremstilling av medikament og/eller vaksine, vaksine, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte MVA, fremgangsmåte for å introdusere DNA-sekvens i en celle, celle, plasmidvektor, fremgangsmåte for å fremstille MVA, DNA sekvens, anvendelse av plasmidvektor samt anvendelse av DNA. - Google Patents

Rekombinant modifisert Vaccinia Ankaravirus (MVA), anvendelse derav for fremstilling av medikament og/eller vaksine, vaksine, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte MVA, fremgangsmåte for å introdusere DNA-sekvens i en celle, celle, plasmidvektor, fremgangsmåte for å fremstille MVA, DNA sekvens, anvendelse av plasmidvektor samt anvendelse av DNA. Download PDF

Info

Publication number
NO336489B1
NO336489B1 NO20045480A NO20045480A NO336489B1 NO 336489 B1 NO336489 B1 NO 336489B1 NO 20045480 A NO20045480 A NO 20045480A NO 20045480 A NO20045480 A NO 20045480A NO 336489 B1 NO336489 B1 NO 336489B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
igr
mva
sequence
dna sequence
Prior art date
Application number
NO20045480A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20045480L (no
Inventor
Paul Howley
Sonja Leyrer
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of NO20045480L publication Critical patent/NO20045480L/no
Publication of NO336489B1 publication Critical patent/NO336489B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen angår nye innskuddsseter som er anvendelige for integrering av eksogene sekvenser i det modifiserte Vaccinia Ankara (MVA) virusgenomet. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre plasmidvektorer for å sette inn eksogent DNA i MVA-genomet. Videre tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen rekombinant MVA som omfatter en eksogen DNA sekvens satt inn i nevnte nye innskuddssete som medisin eller vaksine.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår nye innskuddsseter som er anvendelige for å integrere eksogene DNA-sekvenser i MVA-genomet.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Modifisert Vacciniavirus Ankara (MVA) er et medlem av ortopoxvirusfamilien og er dannet gjennom omtrent 570 seriepasseringer av Ankarastammen til Vacciniavirus (CVA) i kyllingembryofibroblaster (for en oversikt, se Mayr, A., et al. [1975], Infection 3, 6-14). Som en konsekvens av disse passeringene, inneholder det resulterende MVA-viruset 31 kilobaser mindre genomisk informasjon sammenlignet med CVA og er svært vertscellebegrenset (Meyer, H. et al, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). MVA kjennetegnes ved dets ekstreme svekkelse, nemlig gjennom en svekket virulens eller infeksiøsitet, men med fortsatt en utmerket immunogenisitet. Ved testing i flere dyremodeller, ble det vist at MVA er avirulent, selv i immunundertrykte individer. Enda viktigere, har de gode egenskapene til MVA-stammen blitt vist i utstrakte kliniske studier (Mayr et al., Xbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987]). I løpet av disse studiene som omfattet over 120 000 mennesker, inkludert høyrisikopasienter, ble ingen bivirkninger observert (Stickl et al, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).
Det ble videre funnet at MVA er blokkert i det sene trinnet i
virusreplikasjonssyklusen i pattedyrceller (Sutter, G. og Moss, B [1992] Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 10847-10851). Følgelig kan MVA fullstendig replikere sitt DNA, syntetisere tidlige, mellomliggende og sene genprodukter, men kan ikke kobles sammen til modne infeksiøse virus som kan frigjøres fra en infisert celle. Av denne grunn, nemlig at den er replikasjonsbegrenset, er MVA blitt foreslått som en genekspresj ons vektor.
Nylig ble MVA anvendt for å danne rekombinante vaksiner som uttrykker antigene sekvenser satt inn i enten setet til tymidinkinase (tk)-genet (US 5,185,146) eller ved setet til en naturlig forekommende delesjon inne i MVA-genomet (PCT/EP96/02926).
Selv om tk-innskuddslokus er mye brukt for å danne rekombinante poxvirus, spesielt for dannelsen av rekombinante Vacciniavirus (Mackett, et al, [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419), var ikke denne teknologien anvendelig for MVA. Det ble vist av Scheiflinger et al., at MVA er mye mer følsom for modifikasjoner i genomet sammenlignet med andre poxvirus som kan anvendes for dannelsen av rekombinante poxvirus. Scheiflinger et al. viste spesielt at det vanligst anvendte setet for integrering av heterologt DNA i poxvirusgenomer, nemlig tymidinkinase (tg) -genlokuset, ikke kan anvendes for å danne rekombinant MVA. Ethvert resulterende tk(-)-rekombinant MVA viste seg å være svært ustabilt og ved rensing ble det innsatte DNA sammen med deler av det genomiske DNA til MVA umiddelbart deletert (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141: sidene 663-669). Ustabilitet og følgelig høy sannsynlighet for genomisk rekombinasjon, er et kjent problem innen poxvirologien. Faktisk ble MVA etablert gjennom langtids passeringer der det faktum at det virale genomet til CVA er ustabilt, ble utnyttet når det formeres in vitro i vevsdyrkede celler. Flere tusen nukleotider (31 kb) er blitt deletert fra MVA-genomet som derfor erkarakterisert ved6 store og flere mindre delesjoner sammenlignet med det opprinnelige CVA-genomet.
Den genomiske organiseringen til MVA-genomet er nylig blitt beskrevet (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365-396). Det 178 kb genomet til MVA er tett pakket og omfatter 193 individuelle åpne leserammer (ORF) som koder for proteiner som er i det minste 63 aminosyrer lange. I sammenligning med det svært infeksiøse Variolaviruset og også Vacciniavirusprototypen, nemlig Københavnstammen, er mesteparten av ORF i MVA fragmenterte eller avkortede (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365-396). Med svært få unntak blir imidlertid alle ORF, inkludert de fragmenterte og avkortede ORF'ene, transkribert og translatert til proteiner. I det følgende anvendes nomenklaturen til Antoine et al. og - når det er hensiktsmessig - er nomenklaturen basert på Hindlll-restriksjonsenzymfor døy else også angitt.
Så langt har kun innsettingen av eksogent DNA i de naturlig forekommende delesjonssetene til MVA-genomet medført stabile rekombinante MVA (PCT/EP96/02926). Uheldigvis er det bare et begrenset antall naturlig forekommende delesjonsseter i MVA-genomet. I tillegg er det vist at andre innskuddsseter, slik som for eksempel tk-genlokuset, neppe er anvendelig for dannelsen av rekombinante MVA (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141: sidene 663-669).
WO 97/02355 Al omtaler rekombinant MVA virus som inneholder og er i stand til å uttrykke fremmede gener som er innsatt i setet for en naturlig forekommende delesjon innen MVA genomet, og anvendelse av slike rekombinante MVA virus for fremstilling av polypeptider, f.eks. antigener eller terapeutiske midler, og for
fremstillingen av rekombinante virus for vaksiner eller virale vektorer for genterapi.
EP 0 753 581 Al omhandler et rekombinant eukaryot cytoplasmisk DNA virus som der et fremmed DNA konstrukt er innsatt i genomet. Det fremmede DNA segmentet omfatter fortrinnsvis et gen kodende for et antigen av et patogen som human hepatitt B virus og HIV. Det heterologe DNA konstruktet innsettes i vaccinia MVA hemagglutinin locuset, vaccinia MVA tymidin kinase locuset eller fugleinfluensa tymidin kinase locuset.
EP 1 146 125 Al angår en poxviral partikkel som har en målrettet infeksjonsspesifisitet besørget av en heterolog ligandenhet som er tilstede på overflaten av nevnte poxvirale partikkel og som er i stand til å spesifikt gjenkjenne og binde til et anti-ligandmolekyl som finnes på overflaten av målceller, f.eks. et cellespesifikt antigen eller et sykdomsantigen. Ved anvendelse av MVA vil det fremmede genet som koder for den heterologe liganden innsettes i et sete lokalisert i en hvilken som helst av de identifiserte delesjonene I til VII og fortrinnsvis i delesjonene II eller III så vel som i D4R locuset.
Formål med oppfinnelsen
Det er et formål med den foreliggende oppfinnelsen å identifisere ytterligere innskuddsseter i MVA-genomet og tilveiebringe innskuddsvektorer som dirigerer innsettingen av eksogene DNA-sekvenser i nevnte nylig identifiserte innskuddsseter i MVA-genomet.
Det er videre et formål ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et rekombinant MVA som omfatter eksogene DNA-sekvenser som er stabilt integrert i nye innskuddsseter i MVA-genomet.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelsen er definert i kravene 1 til 55.
Oppfinnerne av den foreliggende oppfinnelsen identifiserte nye seter for innsetting av eksogene DNA-sekvenser i genomet til modifisert Vaccinia Ankara (MVA) virus. De nye innskuddssetene er lokalisert i de intergeniske regionene (IGR) til det virale genomet, hvor nevnte IGR igjen er lokalisert mellom eller er omgitt av to nærliggende åpne leserammer (ORF) i MVA-genomet.
Følgelig angår den foreliggende oppfinnelsen et rekombinant MVA som omfatter en heterolog DNA-sekvens satt inn i et IGR i det virale genomet. Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan en eller flere eksogene DNA-sekvenser settes inn i en eller flere IGR.
Det ble overraskende funnet at eksogene DNA-sekvenser faktisk forble stabilt innsatt i IGR'et i MVA-genomet: Som allerede angitt ovenfor, er MVA-genomet antatt å være svært ustabilt. Det synes som at gener eller DNA-sekvenser som ikke er essensielle for formeringen av viruset deleteres eller fragmenteres. Selv om det også overraskende ble funnet at stabile rekombinante MVA oppnås når heterologe DNA-sekvenser settes inn i de naturlig forekommende delesjonssetene til MVA-genomet (PC17EP96/02926 publisert som WO 97/02355 Al), ble det på den annen side funnet at vertsområdegener som for eksempel tk-lokus som er mye brukt for dannelsen av andre rekombinante poxvirus, ikke er egnet som innskuddsseter i MVA. Det faktum at vero-MVA har en ekstra genomisk delesj on (PCT/EP01/02703), antyder også at genomet er dynamisk i den grad at det lett deleterer gener som ikke kreves for formering. Derfor kunne det konkluderes med at innsetting av heterologe DNA-sekvenser som ikke var essensielle for virusformering i rommene mellom ORFene ville forventes å bli deletert av viruset.
Mens nukleotidsekvensen til en ORF koder for en aminosyresekvens som danner et peptid, polypeptid eller protein, har IGR mellom to ORF ingen kodende kapasitet, men de kan omfatte regulatoriske elementer, bindingsseter, promotor- og/eller forsterkersekvenser som er essensielle for eller er involvert i transkripsjonskontrollen av virusgenekspresjonen. IGR kan følgelig være involvert i den regulatoriske kontrollen til viruslivssyklusen. Oppfinnerne av den foreliggende oppfinnelsen har imidlertid også vist at de nye innskuddssetene har den uventede fordelen at eksogene DNA-sekvenser stabilt kan settes inn i MVA-genomet uten å påvirke eller endre de typiske egenskapene og genekspresjonen til MVA. De nye innskuddssetene er spesielt anvendelig ettersom ingen ORF eller kodende sekvens i MVA endres.
Det ble videre overraskende funnet at ekspresjonsnivået til et fremmed gen satt inn i en IGR er høyere enn ekspresjonsnivået av et fremmed gen satt inn i et delesjonssete i MVA-genomet (se også eksempel 1).
Nukleotidsekvensen til en ORF starter vanligvis med et startkodon og slutter med et stoppkodon. Avhengig av orienteringen av de to nærliggende ORF til IGR, flankeres regionen mellom disse ORF av de to stoppkodonene til de to nærliggende ORF eller av de to startkodonene til de to nærliggende ORF, eller av stoppkodonet til det første ORF og startkodonet til det andre ORF, eller av startkodonet til den første ORF og stoppkodonet til det andre ORF.
Innskuddssetet for den eksogene DNA-sekvensen i IGR kan følgelig være nedstrøms eller 3' til stoppkodonet til en første ORF. I det tilfellet der det nærliggende ORF, også kalt andre ORF, har den samme orienteringen som det første ORF, ligger dette innskuddssetet nedstrøms for stoppkodonet til den første ORF og 5' for startkodonet til den andre ORF.
I det tilfellet der den andre ORF har en motsatt orientering i forhold til den første ORF, noe som betyr at orienteringen av de to nærliggende ORF peker mot hverandre, så ligger innskuddssetet nedstrøms for stoppkodonene til begge ORF.
Som et tredje alternativ, i det tilfellet hvor de to nærliggende ORF avleses i motsatt retning, men hvor orienteringen av de to nærliggende ORF peker bort fra hverandre, noe som tilsvarer en posisjon kjennetegnet ved at startkodonene til de to ORF ligger nær hverandre, da vil det eksogene DNA være satt inn oppstrøms i forhold til begge startkodonene.
ORF i MVA-genomet opptrer i to kodende retninger. Følgelig skjer polymeraseaktiviteten fra venstre til høyre, det vil si foroverrettet og, tilsvarende, fra høyre til venstre (motsatt retning). Det er vanlig praksis i poxvirologien og det ble en standard klassifisering for Vacciniavirus for å identifisere ORF enten ved deres orientering og deres posisjon på forskjellige HindUI-restriksjonsfordøyingsfragmenter i genomet. Med hensyn til nomenklaturen, er de forskjellige i/z/fcÆII-fragmentene angitt med nedadstigende store bokstaver som tilsvarer deres nedadstigende størrelse. ORF er nummerert fra venstre til høyre på hvert i/z/fcÆII-fragment, og orienteringen av ORF er angitt med en stor bokstav L (som står for transkripsjon fra høyre til venstre) eller R (som står for transkripsjon fra venstre til høyre). I tillegg er det en nyere publikasjon av MVA-genomstrukturen som anvender en annen nomenklatur, som ganske enkelt nummererer ORF fra den venstre til den høyre enden av genomet og angir deres orientering med en stor bokstav L eller R (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365-396). Som et eksempel, svarer I4L ORF i henhold til den gamle nomenklaturen til 064L ORF i henhold til Antoine et al. Om ikke annet er angitt, anvender den foreliggende oppfinnelsen nomenklaturen i henhold til Antoine et al.
I henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kan heterologe DNA-sekvenser settes inn i en eller flere IGR mellom to nærliggende ORF valgt fra gruppen som består av: 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-020L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
I henhold til den gamle nomenklaturen, svarer ORF 006L til Cl OL, 019L svarer til C6L, 020L til NIL, 021L til N2L, 023L til K2L, 028R til K7R, 029L til FIL, 037L til F8L, 045L til F15L, 050L til E3L, 052R til E5R, 054R til E7R, 055R til E8R, 056L til E9L, 062L til I1L, 064L til I4L, 065L til I5L, 081R til L2R, 082L til L3L, 086R til J2R, 088R til J4R, 089L til J5L, 092R til H2R, 095R til H5R, 107R til DIOR, 108LtilDllL, 122Rtil AUR, 123L til A12L, 125L til A14L, 126Ltil A15L, 135R til A24R, 136L til A25L, 137L til A26L, 141L til A30L, 148Rtil A37R, 149L til A38L, 152R til A40R, 153L til A41L, 154R til A42R, 157L til A44L, 159 R til A46R, 160L til A47L, 165R, til A56R, 166R til A57R, 167R til BIR, 170Rtil B3R, 176RtilB8R, 180RtilB12R, 184RtilB16R, 185LtilB17L og 187R tilB19R.
Fortrinnsvis settes den heterologe sekvensen inn i en IGR som omgis av to nærliggende ORF valgt fra gruppen som omfatter 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Heterologe eller eksogene DNA-sekvenser er sekvenser som naturlig ikke normalt finnes assosiert med poxvirus som anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. I henhold til en ytterligere utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, omfatter den eksogene DNA-sekvensen i det minste én kodende sekvens. Den kodende sekvensen er funksjonelt bundet til et transkripsjonskontrollelement, fortrinnsvis til et poxvirus transkripsjonskontrollelement. I tillegg kan også kombinasjoner mellom poxvirus transkripsjonskontrollelement og for eksempel et internt ribosomalt startsete anvendes.
I henhold til en ytterligere utførelsesform, kan den eksogene DNA-sekvensen også omfatte to eller flere kodende sekvenser bundet til ett eller flere transkripsjonskontrollelementer. Fortrinnsvis koder den kodende sekvensen for ett eller flere proteiner, polypeptider, peptider, fremmede antigener eller antigenepitoper, spesielt slike av terapeutisk interessante gener.
Terapeutisk interessante gener i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan være gener utledet fra eller homologe til gener fra patogene eller infeksiøse mikroorganismer som forårsaker sykdom. I betydningen av den foreliggende oppfinnelsen, presenteres følgelig slike terapeutisk interessante gener for immunsystemet til en organisme for å frembringe, fortrinnsvis indusere, en spesifikk immunrespons for derved å vaksinere eller profylaktisk å beskytte organismen mot en infeksjon av mikroorganismen. I en ytterligere foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, velges de terapeutisk interessante genene fra gener av infeksiøse virus, for eksempel men ikke begrenset til, Denguevirus, japansk encefalitittvirus, Hepatittvirus B eller -C eller immunsviktvirus slik som HIV.
Gener utledet fra Denguevirus er fortrinnsvis NS1- og PrM-gener, hvori nevnte gener kan være utledet fra en, to, tre eller fra alle de 4 Denguevirus serotypene. NS 1-genet utledes fortrinnsvis fra Denguevirus serotype 2 og settes fortrinnsvis inn i IGR mellom ORF 064L-065L (I4L-I5L). PrM-genene, fortrinnsvis utledet fra alle de 4 Denguevirus serotypene, settes fortrinnsvis inn i IGR mellom ORF valgt fra 007R-008L, 044L-045L, 136L-137, 148R-149L. Mer foretrukket er PrM-genet utledet fra Denguevirus serotype 1 (PrM 1) og satt inn i IGR mellom 148R-149L, PrM 2 inn i IGR 007R-008L, PrM 3 inn i IGR til ORF 044L-045L og PrM 4 inn i IGR 136L-137L.
Ifølge en ytterligere foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er den heterologe DNA-sekvensen utledet fra HIV og koder for HIV env, hvori HIV env-genet fortrinnsvis er satt inn i IGR mellom ORF 007R-008L.
Terapeutisk interessante gener, omfatter også sykdomsrelaterte gener som har en terapeutisk virkning på prolifererende sykdommer, kreft og metabolske sykdommer. For eksempel kan et terapeutisk interessant gen knyttet til kreft være et kreftantigen som har evnen til å indusere en spesifikk antikreft immunreaksjon.
I henhold til en ytterligere utførelsesform, omfatter den kodende sekvensen i det minste én markør eller seleksjonsgen.
Seleksjonsgener gir en celle en spesifikk resistens hvorved en spesifikk seleksjonsmetode muliggjøres. Fagfolk på området vil være kjent med en rekke forskjellige seleksjonsgener som kan anvendes i et poxvirussystem. Blant disse er for eksempel neomycinresistensgenet (NPT) eller fosforibosyltransferasegenet (gPt)-
Markørgener induserer en fargereaksjon i de konverterte cellene som kan anvendes for å identifisere konverterte celler. Fagfolk på området vil være kjent med en rekke forskjellige markørgener som kan anvendes i et poxvirussystem. Blant disse er genet som for eksempel koder for P-galaktosidase (fi-gal), P-glukosidase (P-glu), grønt fluorescensprotein (EGFP) eller blått fluorescensprotein.
Ifølge en ytterligere utførelsesform, omfatter den eksogene DNA-sekvensen en avstands sekvens (spacing sequence) som separerer poxvirus
transkripsjonskontrollelementet og/eller kodende sekvens i den eksogene DNA-sekvensen fra stoppkodonet og/eller startkodonet til de nærliggende ORF. Denne avstandssekvensen mellom stopp-/startkodonet til de nærliggende ORF og den innskutte kodende sekvensen i det eksogene DNA har den fordelen at det stabiliserer det innskutte eksogene DNA og følgelig ethvert resulterende rekombinant virus. Størrelsen på avstandssekvensen varierer, ettersom sekvensen er uten egen koding eller regulatorisk funksjon.
Ifølge en ytterligere utførelsesform, er avstandssekvensen som separerer poxvirus transkripsjonskontrollelementet og/eller den kodende sekvensen i den eksogene DNA-sekvensen fra stoppkodonet til den nærliggende ORF, er i det minste én nukleotide lang.
Ifølge en annen utførelsesform er avstandssekvensen som separerer poxvirustranskripsjonskontrollelementet og/eller den kodende sekvensen til den eksogene DNA-sekvensen fra startkodonet til den nærliggende ORF i det minste 30 nukleotider lang. I tilfeller hvor et typisk Vacciniavirus promotorelement er identifisert oppstrøms for et startkodon, kan det være at det innskutte eksogene DNA ikke separerer promotorelementet fra startkodonet til det nærliggende ORF. Et typisk Vaccinia promotorelement kan identifiseres ved hjelp av å skanne etter for eksempel sekvensen "TAAAT" for sene promotorer (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) og et A/T-rikt domene for tidlige promotorer. En avstands sekvens på omtrent 30 nukleotider er den foretrukne avstanden for å sikre at en poxvirus promotor lokalisert oppstrøms for startkodonet til ORF, ikke påvirkes. I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform, kan i tillegg avstanden mellom det innskutte eksogene DNA og startkodonet til den nærliggende ORF være omtrent 50 nukleotider og mer foretrukket rundt 100 nukleotider.
I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter avstandssekvensen et ytterligere poxvirus transkripsjonskontrollelement som kan kontrollere transkripsjonen av den nærliggende ORF.
En typisk MV A-stamme som kan anvendes for å danne et rekombinant MVA, er MVA-575 som er deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures under deponeringsnummeret ECACC V00120707.
En annen MV A-stamme er MVA-Vero eller et derivat derav. MVA-Vero-stammer er deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures under deponeringsnumrene ECACC V99101431 og 01021411. Sikkerheten til MVA-Vero er reflektert gjennom biologiske, kjemiske og fysiske egenskaper som beskrevet i den internasjonale patentsøknaden PCR/EP01/02703. I sammenligning med andre MV A-stammer, inkluderer Vero-MVA en ytterligere genomisk delesj on.
Enda en annen mer foretrukket MVA-stamme, er MVA-BN. MVA-BN er deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures med deponeringsnummer ECACC V00083008. MVA-BN-virus er et ekstremt svekket virus som også er utledet fra modifisert Vaccinia Ankaravirus (se også PCT/EP01/13628).
Uttrykket "derivater" av et virus ifølge den foreliggende oppfinnelsen, viser til stamvirus som viser de samme karakteristiske trekkene som foreldreviruset, men som viser forskjeller i en eller flere deler av genomet. Uttrykket "derivat av MVA" beskriver et virus som har de samme funksjonelle egenskapene sammenlignet med MVA. For eksempel har et derivat av MVA-BN de kjennetegnende trekkene til MVA-BN. Ett av disse kjennetegnene til MVA-BN eller derivater derav er dets svekkelse og mangel på replikasjon i humane HaCat-celler.
Det rekombinante MVA ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendelig for fremstilling av et medikament eller vaksine. Det anvendes ifølge en ytterligere utførelsesform for å introdusere den eksogene kodende sekvensen til en målcelle, hvor nevnte sekvens enten er homolog eller heterolog for genomet i målcellen.
Introduksjonen av en eksogent kodende sekvens i en målcelle, kan utføres in vitro for å fremstille proteiner, polypeptider, peptider, antigener eller antigene epitoper. Denne fremgangsmåten omfatter infeksjon av en vertscelle med det rekombinante MVA ifølge oppfinnelsen, dyrking av de infiserte vertscellene under egnede betingelser og isolering og/eller anrikelse av polypeptidet, peptidet, proteinet, antigenet, epitopen og/eller viruset produsert av nevnte vertscelle.
Videre kan fremgangsmåten for å introdusere en eller flere homologe eller en eller flere heterologe sekvenser inn i celler, anvendes for in vitro og in vivo terapi. For in vitro terapi, administreres isolerte celler som tidligere har blitt ( ex vivo) infisert med det rekombinante MVA ifølge oppfinnelsen til den levende dyrekroppen for å påvirke, fortrinnsvis å indusere, en immunrespons. For in vivo terapi, administreres det rekombinante poxviruset ifølge oppfinnelsen direkte til den levende dyrekroppen for å påvirke, fortrinnsvis å indusere, en immunrespons. I dette tilfellet infiseres cellene som ligger rundt inokuleringssetet, men også celler som viruset transporteres til via for eksempel blodstrømmen, direkte in vivo ved hjelp av det rekombinante MVA ifølge oppfinnelsen. Etter infeksjon, syntetiserer disse cellene proteinene, peptidene eller de antigene epitopene av de terapeutiske genene som blir kodet av den eksogent kodende sekvensen og deretter presenteres disse eller deler derav på den cellulære overflaten. Spesialiserte celler i immunsystemet gjenkjenner presentasjonen av slike heterologe proteiner, peptider eller epitoper og igangsetter en spesifikk immunrespons.
Ettersom MVA er svært vekstbegrenset og følgelig svært svekket, er det anvendelig for behandlingen av rekke forskjellige pattedyr inkludert mennesker, inkludert immunsvekkede dyr eller mennesker. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger og vaksiner for å indusere en immunrespons i et levende dyr inkludert et menneske.
Den farmasøytiske sammensetningen kan generelt inkludere en eller flere farmasøytisk akseptable og/eller godkjente bærere, additivere, antibiotika, konserveringsmidler, adjuvanser, fortynningsmidler og/eller stabiliserende midler. Slike hjelpeforbindelser kan være vann, saltoppløsning, glyserol, etanol, fuktemidler eller emulgeringsmidler, pH-bufferforbindelser og lignende. Egnede bærere er typisk større, langsomt metaboliserende molekyler så som proteiner, polysakkarider, polymelkesyrer, polyglykolsyrer, polymere aminosyrer, aminosyre sampolymerer, lipidaggregater eller lignende.
For fremstillingen av vaksiner, konverteres det rekombinante poxviruset ifølge oppfinnelsen til en fysiologisk akseptabel form. Dette kan gjøres basert på erfaringen med fremstillingen av poxvirusvaksiner anvendt for vaksinering mot kopper (som beskrevet av Stickl, H., et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Det rensede viruset lagres for eksempel ved -80°C med et titer på 5 x 10E8 TCIDso/ml formulert i omtrent 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4. For fremstillingen av vaksineskudd, lyofiliseres for eksempel 10E2-10E8 partikler av viruset i 100 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i nærværet av 2% pepton og 1% humant albumin i en ampulle, fortrinnsvis en glassampulle. Alternativt kan vaksineskuddene fremstilles gjennom trinnvis frysetørking av viruset i en formulering. Denne formuleringen kan inneholde ytterligere additiver slik som mannitol, dekstran, sukker, glysin, laktose eller polyvinylpyrrolidon eller andre syrer slik som antioksidanter eller inert gass, stabilisatorer eller rekombinante proteiner (for eksempel humant serum albumin) egnet for in vivo administrering. Glassampullen forsegles deretter kan lagres mellom 4°C og romtemperatur i flere måneder. Dersom det ikke lenger eksisterer noe behov, lagres imidlertid ampullen fortrinnsvis ved temperaturer under -20°C.
For vaksinering eller terapi, kan lyofilisatet oppløses i fra 0,1 til 0,5 ml av en vandig løsning, fortrinnsvis fysiologisk saltvann eller Tris-buffer og administreres enten systemisk eller lokalt, det vil si parenteralt, subkutant, intramuskulært, gjennom riss i huden eller enhver annen administreringsmåte kjent for fagfolk på området. Administreringsmåten, dosen og antallet administreringer kan optimaliseres av fagfolk på området på en kjent måte. Imidlertid vaksineres vanligvis en pasient med et andre skudd fra omtrent en måned til seks uker etter den første vaksineringen.
Den foreliggende oppfinnelsen angår videre plasmidvektorer som kan anvendes for å danne rekombinant MVA ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og angår også visse DNA-sekvenser: IGR lokalisert mellom eller omgitt av to nærliggende ORF omfatter vanligvis nukleotidsekvenser som den eksogene DNA-sekvensen av interesse kan settes inn i. Plasmidvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen, omfatter følgelig en DNA-sekvens utledet fra eller homolog til MVA-genomet, hvori nevnte DNA-sekvens omfatter en fullstendig eller del av et fragment av en IGR-sekvens lokalisert mellom eller omgitt av to nærliggende ORF i det virale genomet. Plasmidvektoren omfatter fortrinnsvis i det minste ett kloningssete for innskudd av en eksogen DNA-sekvens av interesse inn i nevnte IGR-utledede sekvens og, fortrinnsvis, for innskudd av et poxvirus transkripsjonskontrollelement funksjonelt bundet til nevnte heterologe DNA-sekvens. Plasmidvektoren omfatter eventuelt en reporter og/eller seleksjonsgenkassett. Plasmidvektoren omfatter fortrinnsvis også sekvenser av de to nærliggende ORF som omgir nevnte fullstendige eller del av fragment av IGR-sekvensen.
Visse IGR er blitt identifisert som ikke inkluderer nukleotidsekvenser. I disse tilfellene, omfatter plasmidvektoren DNA-sekvenser av IGR-omliggende sekvenser, det vil si DNA-sekvenser av de to nærliggende ORF. Kloningssetet for innskudd av den heterologe DNA-sekvensen settes fortrinnsvis inn i IGR. DNA av IGR-omliggende sekvenser anvendes for å dirigere innsettingen av eksogene DNA-sekvenser inn i det korresponderende IGR i MVA-genomet. En slik plasmidvektor kan videre inkludere en fullstendig eller en del av et fragment av en IGR-sekvens som omfatter kloningssetet for innsettingen av den heterologe DNA-sekvensen og eventuelt av reporter- og/eller seleksjonsgenkassetten.
IGR-DNA-sekvenser så vel som IGR-omliggende sekvenser av de to nærliggende ORF velges fortrinnsvis fra henholdsvis IGR og ORF som er valgt fra gruppen som omfatter
001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-020L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
Sekvensene velges fortrinnsvis fra henholdsvis IGR og ORF valgt fra gruppen som omfatter 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L, 065L, 136L-137L, 148L-149L. IGR-utledede sekvenser velges fortrinnsvis fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene
- nr. 527-608 i sekv.id. nr. 32; - nr. 299-883 i sekv.id. nr. 33; - nr. 339-852 i sekv.id. nr. 34; - nr. 376-647 i sekv.id. nr. 35; - nr. 597-855 i sekv.id. nr. 36;
- nr. 400-607 i sekv.id. nr. 37.
IGR-omliggende sekvenser av de to nærliggende ORF velges fortrinnsvis fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene: - nr. 1-525 og 609-1190 i sekv.id. nr. 32; - nr. 101-298 og 884-1198 i sekv.id. nr. 33; - nr. 1-338 og 853-1200 i sekv.id. nr. 34; - nr. 1-375 og 648-1200 i sekv.id. nr. 35; - nr. 1-596 og 856-1200 i sekv.id. nr. 36;
- nr. 1-399 og 608-1081 i sekv.id. nr. 37.
DNA-sekvensene utledes fortrinnsvis fra eller er homologe til MVA-genomet deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
For å danne en plasmidvektor ifølge den foreliggende oppfinnelsen, isoleres sekvensene og klones inn i en standard kloningsvektor slik som pBluescript (Stratagene), hvor de omgir det eksogene DNA som skal settes inn i MVA-genomet. En slik plasmidvektor kan eventuelt omfatte en seleksjons- eller reportergenkassett som kan deleteres fra det endelige rekombinante viruset som følge av en repeterende sekvens inkludert i nevnte kassett.
Fremgangsmåter for å introdusere eksogene DNA-sekvenser ved hjelp av en plasmidvektor inn i et MVA-genom og fremgangsmåter for å oppnå rekombinant MVA, er velkjente for fagfolk på området og kan i tillegg utledes fra de følgende referansene: - Molecular Cloning, A laboratory Manual. 2. utgave. Av J. Sambrook, E.F. Fritsch og T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: beskriver teknikker og kunnskap for standard molekylære biologiske teknikker slik som kloning av DNA, RNA-isolering, western blotanalyser, RT-PCR og PCR-amplifiseringsteknikker;
Virology Methods Manual. Utgitt av Brian WJ Mahy og Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: beskriver teknikker for håndtering og manipulering av virus; - Molecular Virology: A Practical Approach. Utgitt av AJ Davison og RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press ved Oxford University Press. Oxford 1993. Kapittel 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors; - Current Protocols in Molecular Biology. Utgiver: John Wiley and Son Inc. 1998. Kapittel 16, seksjon IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector: beskriver teknikker og kunnskap for håndtering, manipulering og genetisk konstruksjon av MVA.
MVA i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, fortrinnsvis det MVA som er deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008, kan fremstilles ved å transfektere en celle med en plasmidvektor ifølge den foreliggende oppfinnelsen, infisere den transfekterte cellen med et MVA og deretter identifisere, isolere og eventuelt rense MVA ifølge oppfinnelsen.
DNA-sekvensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes for å identifisere eller å isolere MVA eller dets derivater ifølge oppfinnelsen og celler eller individer infisert med et MVA ifølge oppfinnelsen. DNA-sekvensene er for eksempel anvendt for å danne PCR-primere, hybridiseringsprober eller anvendes i sammenstillingsteknologier.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1: Restriksjonskart over vektorkonstruktene pBNX39 (figur la), pBNX70 (figur lb) og pBN84 (figur lc) som omfatter omtrent 600 bp MVA-sekvenser som omgir innskuddssetet etter I4L ORF. Plasmidene omfatter i tillegg eksogent DNA (henholdsvis Ecogpt og hBFP) under transkripsjonskontrollen av en poxviruspromotor P) mellom de omliggende sekvensene: Flank 1 (Fl I4L-I5L) og Flank 2 (F2 I4L-I5L). Flrpt står for en repeterende sekvens av Flank 1 for å tillate delesjon av reporterkassetten fra et resulterende rekombinant virus. pBN84 (figur lc) koder i tillegg for Denguevirus NS 1-proteinet (NS1 DEN). Andre forkortelser: AmpR = ampicillinresistensgen; bps = basepar. Figur 2: Restriksjonskart over vektorkonstruktene pBNX51 (figur 2a), pBNX67 (figur 2b) og pBN27 (figur 2c) som omfatter omtrent 600 bp MVA-sekvenser som omgir innskuddssetet etter ORF 137L (Flank 1: F1136-137 som tilsvarer posisjon 129340-129930 av MVA-genomet; Flank 2: F2136-137 som tilsvarer posisjon 129931-130540 i MVA-genomet). Vektoren pBNX67 (figur 2b) omfatter i tillegg eksogent DNA (NPT II-genet = neomycinresistens) satt under transkripsjonskontroll av en poxviruspromotor P) mellom de omliggende sekvensene. F2rpt står for en repeterende sekvens av Flank 2 for å tillate delesjon av reporterkassetten fra et resulterende rekombinant virus. pBN27 (figur 2c) koder i tillegg for Denguevirus PrM4 under kontroll av en poxviruspromotor. Ytterligere forkortelser: AmpR = ampicillinresistensgen; bps = basepar; IRES = internt ribosomalt adgangssete; EGFP = gen for det forsterkede grønne fluorescensproteinet. Figur 3: Restriksjonskart over vektorkonstruktene pBNX79 (figur 3a), pBNX86 (figur 3b), pBNX88 (figur 3c), pBN34 (figur 3d) og pBN56 (figur 3e) som omfatter omtrent 600 bps MVA-sekvenser som omgir innskuddssetet mellom ORF 007R og 008L (Flank 1: Fl IGR 07-08 starter ved posisjon 12200 i MVA-genomet; Flank 2: F2 IGR 07-08 stopper ved posisjon 13400 i MVA-genomet). F2rpt står for en repeterende sekvens av Flank 2 for å tillate delesjon av reporterkassetten fra et resulterende rekombinant virus. Vektoren pBNX88 (figur 3c) og pBNX86 (figur 3b) omfatter i tillegg eksogent DNA (henholdsvis BFP + gpt og NPT II + EGFP) under transkripsjonskontroll av en poxviruspromotor P) mellom de omliggende sekvensene. F2rpt står for en repeterende sekvens av Flank 2 for å tillate delesjon av reporterkassetten fra et resulterende rekombinant virus. pBN56 (figur 3e) koder i tillegg for HIV-1 env-proteinet og pBN34 (figur 3d) inneholder den Denguevirus PrM2-kodende sekvensen under kontroll av en poxviruspromotor. Ytterligere forkortelser: AmpR = ampicillinresistensgen; bps = basepar. Figur 4: Restriksjonskart over vektorkonstruktene pBNX80 (figur 4a), pBNX87 (figur 4b) og pBN47 (figur 4c) som omfatter omtrent 600/640 basepar av MVA-sekvenser som omgir innskuddssetet mellom ORF 044L og 045L (Flank 1: Fl IGR44-45 starter ved posisjon 36730 i MVA-genomet; Flank 2: F2 IGR44-45 stopper ved posisjon 37970 i MVA-genomet). Vektoren pBNX87 (figur 4b) omfatter i tillegg eksogent DNA (NPT II-gen + EGFP) under transkripsjonskontroll av en poxviruspromotor P) mellom de omliggende sekvensene. F2rpt står for en repeterende sekvens av Flank 2 som tillater delesjon av reporterkassetten fra et resulterende rekombinant virus. pBN47 (figur 4c) koder i tillegg for Dengueviruset PrM3 under kontroll av en poxviruspromotor.
Ytterligere forkortelser: AmpR = ampicillinresistensgen; bps = basepar.
Figur 5: Restriksjonskart over vektorkonstruktene pBNX90 (figur 5a), pBNX92 (figur 5b) og pBN54 (figur 5c) som omfatter omtrent 596/604 basepar av MVA-sekvenser som omgir innskuddssetet mellom ORF 148R og 149L (Flank 1: Fl IGR148-149 starter ved posisjon 136900 i MVA-genomet; Flank 2: F2 IGR148-149 stopper ved posisjon 138100 i MVA-genomet). Vektoren pBNX92 (figur 5b) omfatter i tillegg eksogent DNA (gpt + BFP) under transkripsjonskontroll av en poxviruspromotor P) mellom de omliggende sekvensene. pBN54 (figur 5c) koder i tillegg for Dengueviruset PrMl. P2rpt står for en repeterende sekvens av Flank 2 for å tillate delesjon av reporterkassetten fra et resulterende rekombinant virus. Ytterligere forkortelser: AmpR = ampicillingresistensgen; bps = basepar. Figur 6: Skjematisk presentasjon av det intergeniske innskuddssetet i MVA (Genbank tilgangsnummer U94848). Figur 7: PCR-analyse av IGR I4L-I5L i rekombinant MVA med Dengueviruset NS1 satt inn i IGR I4L-I5L. Bane "BN" viser PCR-produktet ved å anvende tom MVA-BN-vektor. Ved anvendelse av det NS1 rekombinante MVA, var et større fragment påviselig (1, 2, 3, 4: forskjellige konsentrasjoner av DNA).
M = molekylvektsmarkør, H20 = negativ vannkontroll.
Figur 8: Figur 8a: PCR-analyse av IGR 136-137 i rekombinant MVA med Dengueviruset PrM4 satt inn i IGR 136-137. Bane "BN" viser PCR-produktet ved anvendelse av MVA-BN tom vektor. Ved anvendelse av PrM4 rekombinant MVA, var et fragment med større størrelse påvisbart (mBN23, 1/10, 1/100: Forskjellige konsentrasjoner av DNA). M = molekylvektsmarkør, H20 = negativ vannkontroll, pBN27 = positiv plasmidkontroll. Figur 8b: Flertrinns vekstkurve for MVA-BN tom vektor og det rekombinante MVA med PrM4 satt inn i IGR 136-137 (MVA-mBN23). Figur 9: Figur 9a: PCR-analyse av IGR 07-08 i rekombinant MVA med Dengueviruset PrM2 satt inn i IGR 07-08. Bane 3 viser PCR-produktet ved anvendelse av en tom MVA-BN-vektor. Ved anvendelse av PrM2 rekombinant MVA, var et fragment av større størrelse påvisbart (bane 2).
M = molekylvektsmarkør, bane 1 = negativ vannkontroll.
Figur 9b: Flertrinns vekstkurve for tom MVA-BN-vektor og det rekombinante MVA med PrM2 satt inn i IGR 07-08 (MVA-mBN25). Figur 10: PCR-analyse av IGR 07-08 i rekombinant MVA med HIV env satt inn i IGR 07-08. Bane BN viser PCR-produktet ved anvendelse av en tom MVA-BN-vektor. Ved anvendelse av det PrM2 rekombinante MVA, ble et fragment av større størrelse påvist (bane 1, 2, 3). M = molekylvektsmarkør, - = negativ vannkontroll, + = positiv plasmidkontroll. Figur 11: Figur lia: PCR-analyse av IGR 44-45 i rekombinant MVA med Dengueviruset PrM3 satt inn i IGR 44-45. Bane BN viser PCR-produktet ved anvendelse av en tom MVA-BN-vektor. Ved anvendelse av PrM3 rekombinant MVA, var et fragment med større størrelse påvisbart (bane 1-4 forskjellige konsentrasjoner av DNA). M = molekylvektsmarkør, - = negativ vannkontroll. Figur 11b: Flertrinns vekstkurve for tom MVA-BN-vektor og det rekombinante MVA med PrM3 satt inn i IGR 44-45 (MVA-mBN28). Figur 12: Figur 12a: PCR-analyse av IGR 148-149 i rekombinant MVA med Dengueviruset PrMl satt inn i IGR 148-149. Bane BN viser PCR-produktet ved anvendelse av en tom MVA-BN-vektor. Ved anvendelse av PrMl rekombinant MVA, var et fragment av større størrelse påvisbart (bane 1).
M = molekylvektsmarkør, - = negativ vannkontroll, + = positiv plasmidkontroll.
Figur 12b: Flertrinns vekstkurve for tom MVA-BN-vektor og det rekombinante MVA med PrMl satt inn i IGR 44-45 (MVA-mBN33).
De følgende eksemplene vil videre illustrere den foreliggende oppfinnelsen. Fagfolk på området vil forstå at de tilveiebrakte eksemplene ikke på noen måte skal forstås slik at de begrenser den foreliggende oppfinnelsen til disse eksemplene. Rammen av oppfinnelsen begrenses bare av den fulle bredden til de vedlagte kravene.
Eksempel 1
Innskuddsvektorene pBNX39, pBNX70 og pBN84
For å sette inn eksogene sekvenser i de intergeniske regionene ved siden av 065L ORF (innskuddssetet er ved genomposisjon 56760) i MVA, ble en vektor konstruert som omfatter omtrent 1200 bp av de omliggende sekvensene ved siden av innskuddssetet. Disse omliggende sekvensene separeres i to omliggende sekvenser som omfatter på en side omtrent 610 bp av 065L ORF (alternativ nomenklatur: I4L ORF) og på den andre delen omtrent 580 bp av den intergeniske regionen bak 065L ORF så vel som deler av det nærliggende ORF. Mellom disse omliggende sekvensene, er henholdsvis et Ecogpt-gen ( gpt står for fosforibosyltransferasegenet isolert fra E. coli) og et BFP (blått fluorescensprotein), er lokalisert under transkripsjonskontroll av en poxviruspromotor. I tillegg er i det minste ett kloningssete for innsetting av ytterligere gener eller sekvenser som skal settes inn i den intergeniske regionen bak I4L ORF. Eksempler på vektorkonstruksjoner i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er beskrevet i figurene 1 a) og b)
(pBNX39, pBNX70). I vektor pBN84 (figur lc), er den kodende regionen til Denguevirus NS1 satt inn i kloningssetet til pBNX70 (figur lb).
Dannelse av det rekombinante MVA via homolog rekombinasjon Fremmede gener kan settes inn i MVA-genet ved hjelp av homolog rekombinasjon. For det formålet, ble det fremmede genet av interesse klonet inn i en plasmidvektor som beskrevet ovenfor. Denne vektoren ble transfektert i MVA-infiserte celler. Rekombinasjonen skjer i cytoplasmaet i de infiserte og transfekterte cellene. Ved hjelp av seleksjonen og/eller reporterkassetten som også er satt inn i innskuddsvektoren, identifiseres og isoleres celler som omfatter rekombinante virus.
For homolog rekombinasjon, sås BHK (babyhamsternyre) -celler eller CEF (primære kyllingembryofibroblaster) i 6-brønners plater ved anvendelse av DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, Gibco BRL) + 10% fosterkalveserum (FCS) eller VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/1 L-glutamin for en serumfri produksjonsprosess.
Cellene må fortsatt være i vekstfasen og derfor bør nå 60-80% sammenflytning på transfeksj onsdagen. Cellene ble talt før utsåing, ettersom antallet celler må være kjent for å bestemme infeksjonsmengden (moi) for infeksjonen.
For infeksjonen fortynnes MVA-beholdningen i DMEM/FCS eller VP-SFM/L-glutamin slik at 500 ul fortynning inneholder en passende mengde virus som vil gi en moi på 0,1-1,0. Det antas at cellene har delt seg en gang etter utsåing. Mediet ble fjernet fra cellene og cellene ble infisert med 500 ul fortynnet virus i 1 time ved risting ved romtemperatur. Podestoffet ble fjernet og cellene ble vasket med DMEM/VP-SFM. Infiserte celler ble etterlatt henholdsvis i 1,6 ml DMEM/FCS og VP-SFM/L-glutamin mens transfeksjonsreaksjonen ble satt opp (Qiagen Effectene sett).
For transfeksj onen, ble "Effectene" transfeksj onssett (Qiagen) anvendt. En transfeksjonsblanding ble klargjort med 1-2 \ ig linearisert innskuddsvektor (total mengde for multippel transfeksj on) med EC-buffer, noe som ga et endelig volum på 100 ul. 3,2 ul forsterker ble tilsatt, blandingen virvlet (vortex) og innkubert ved romtemperatur i 5 minutter. Deretter ble 10 ul av Effectene tilsatt etter blanding av beholdningsrøret, og løsningen ble blandet grundig ved virvling og innkubert ved romtemperatur i 10 minutter. 600 ul av henholdsvis DMEM/FCS og VP-SFM/L-glutamin ble tilsatt, blandet og deretter ble hele transfeksjonsblandingen tilsatt til cellene som allerede var dekket med medium. Forsiktig ble platen ristet for å blande transfeksj onsreaksj onen. Innkubering fant sted ved 37°C med 5% C02over natten. Den neste dagen ble mediet fjernet og erstattet med friskt DMEM/FCS eller VP-SFM/L-glutamin. Innkuberingen fortsatt til dag 3.
For høsting, ble cellene skrapet over i medium, deretter ble cellesuspensjonen overført til et egnet rør og frosset til -20°C for korttids lagring eller til -80°C for langtids lagring.
Innsetting av Ecogpt i I4L-innskuddssetet til MVA
I en første runde ble cellene infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble ytterligere transfektert med innskuddsvektor pBNX39 (figur la) som inneholdt Ecogpt- genet ( Ecogpt, eller forkortet gpt, står for fosforibosyltransferasegen) som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset ved 3 runder med plakkrensing under fosforibosyltransferase metaboliske seleksjon ved tilføring av mycofenolsyre, xantin og hypoxantin. Mycofenolsyre (MPA) hemmer inosinmonofosfatdehydrogenase og resulterer i blokkering av purinsyntese og hemming av viral replikasjon i de fleste cellelinjer. Denne blokkeringen kan overvinnes ved ekspresjon av Ecogpt fra en konstitutiv promotor og tilveiebringe substratene xantin og hypoxantin.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere I4L-innskuddssetet, ble primerparene BN499
(CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEKV.ID. NR. 1) og BN500 (CGA TCA
AAG TCA ATC TAT G, SEKV.ID. NR. 2) anvendt. I tilfelle av et MVA-virus med DNA fra den tomme vektoren, amplifiseres det forventede PCR-fragmentet 328 nukleotider (nt) langt, i tilfelle et rekombinant MVA amplifiseres, som har inkorporert eksogent DNA ved I4L-innskuddssetet, er fragmentet tilsvarende forstørret.
Innsetting av NS1 i IGR064L-065L (I4L-I5L) innskuddssete til MVA
I en første runde ble celler infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble i tillegg transfektert med innskuddsvektor pBN84 (figur lc) som inneholdt Ecogpt- genet for seleksjon og BFP (blått fluorescensprotein) som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset ved 7 runder plakkrensing under fosforibosyltransferase metabolismeseleksjon ved tilsetning av mycofenolsyre, xantin og hypoxantin. Mycofenolsyre (MPA) hemmer inosinmonofosfatdehydrogenase og resulterer i purinsynteseblokkering og hemmer virusreplikasjon i de fleste cellelinjer. Denne blokkeringen kan overvinnes ved ekspresjon av Ecogpt fra en konstitutiv promotor og tilveiebringe substratene xantin og hypoxantin.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere I4L-innskuddssetet, ble primerpar BN499 (CAA
CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEKV.ID. NR. 1) og BN500 (CGA TCA AAG TCA
ATC TAT G, SEKV.ID. NR. 2) anvendt. I tilfelle av amplifisering av MVA-virus med DNA med tom vektor, er det forventede PCR-fragmentet 328 nukleotider (nt) langt. I tilfelle av et rekombinant MVA for NS 1, amplifiseres, som har inkorporert Denguevirus NS 1-kodende region ved I4L-innskuddssetet, er fragmentet forventet å være 1683 bp. PCR-resultatene i figur 7 viser klart den stabile innsettingen av NS1 i I4L-innskuddssetet etter 17 runder med virusamplifisering.
Testing av recMVA som inkluderer NS1 (MVA-BN22) in vitro En T25-flaske med omtrent 80% sammenflytende monolag av BHK-celler ble inokulert med 100 ul av virusbeholdningen fortynnet til 1 x IO<7>i MEMoc med 1% FCS og ristet ved romtemperatur i 30 minutter. 5 ml MEMoc med 3% FCS ble tilsatt til hver flaske og innkubert ved 30°C i en CC>2-innkubator. Flasken ble høstet etter 48 timer. Supernatanten ble fjernet fra flasken og sentrifugert ved 260 g i 10 minutter ved 4°C. Supernatantene ble lagret i porsjoner ved -80°C. Pelleten ble vasket med 5 ml av 1 x PBS to ganger og deretter igjen suspendert i 1 ml hypoton "douncing" buffer med 1% TX100. Cellelysatene ble høstet og sentrifugert i 5 minutter ved 16000 g, og supernatantene ble lagret i et mikrosentrifugerør ved -80°C.
Flasker inokulert med MVA inkludert GFP, MVA inkludert NS 1-genet i et delesjonssete (MVA-BN07) og liksom infiserte flasker, ble også behandlet på samme måte som beskrevet ovenfor.
Celle/viruslysatet og supernatanten ble behandlet i ikke-reduserende/reduserende prøvebuffer under ikke-oppvarmede/oppvarmede betingelser. Proteinene ble separert på 10% SDS PAGE og overført på nitrocellulosemembraner. Blotene ble probet over natten med samlede sera fra rekonvalesenspasienter (PPCS) i en fortynning på 1:500. Etter vasking 3 ganger med IX PBS, ble blotene innkubert med anti-humant IgG-HRP (DAKO) i 2 timer ved romtemperatur. Etter at blotene var vasket som beskrevet ovenfor, ble fargen utviklet ved anvendelse av 4-klor-l-naftol.
Western blotresultatene viste at NS1 i MVA-BN22 uttrykkes i store mengder. NS1 ble uttrykt i riktig konfirmasjon som en dimer under ikke-oppvarmede betingelser og som en monomer under oppvarmede betingelser.
NS 1-ekspresjonen ble sammenlignet i både MVA-BN22 og MVA-BN07. BHK-cellene ble inokulert med den samme pfu og høstet etter 48 timer. Resultatene viste at ekspresjonen av NS1 var mye høyere i BN22 enn i BN07. Western blotresultatene viste også at mer NS 1 utskilles i supernatanten med BN22-konstruktet sammenlignet med BN07.
Resultatene viste også at NS 1 uttrykt i celler infisert med BN22 er antigene og gjenkjennes av de samlede sera fra rekonvalesenspasienter.
Det kan konkluderes med at NS1 uttrykkes i store mengder og i riktig konfirmasjon i BHK-celler infisert med BN22. Både dimeren og monomeren er antigene og gjenkjennes av de samlede ser fra rekonvalesenspasienter.
Eksempel 2
Innsettingsvektorene pBNX og pBN27
MVA-sekvens ene som ligger ved siden av det nye innskuddssetet (ved genomposisjon 129940) mellom ORF 136L og 137L ble isolert ved hjelp av standard PCR-amplifisering av sekvensen av interesse ved anvendelse av de følgende primerne:OBN543 (TCCCCGCGGAGAGGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT; SEKV.ID. NR. 3) og oBN44 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT; SEKV.ID.
NR. 4) for isolering av Flank 1;
OBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEKV.ID. NR. 5) ogOBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEKV.ID. NR. 6)
for isolering av Flank 2.
PCR-fragmentet som omfatter Flank 1 ble behandlet med restriksjonsenzymene Sadl og Xbal og ligert til en SacII/Xbal-fordøyd og defosforylert basisvektor, slik som pBluescript (Stratagene).
Det resulterende plasmidet ble XhoI/Apal-fordøyd, defosforylert og ligert til det XhoI/Apal-fordøyde PCR-fragmentet som omfatter Flank 2.
Eventuelt ble en repeterende sekvens av Flank 2 som var blitt isolert ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerne oBN545
(CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEKV.ID. NR. 7) ogOBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEKV.ID. NR. 8)
og som var blitt Hindlll/Pstl-fordøyd, satt inn i Hindlll/Pstl-setet til den resulterende vektoren. Figur 2a) viser vektoren (pBNX51).
En reporterkassett som omfatter en syntetisk promotor, NPT II-genet (neomycinresistens), poly-A-region, IRES, EGFP-gen (Ps-NPTII-polyA-IRES-EGFP) ble fordøyd med Ecl 13611/XhoI og satt inn i Hindlll/XhoI-setet til innsettingsvektoren, hvori Hindlll-setet hadde stump ende med T4 DNA-polymerase (Roche). Et restriksjonskart over et eksempel på vektorkonstrukt i henhold til dette eksempelet er vist i figur 2b) (pBNX67).
For konstruksjon av pBN27 (figur 2c), ble Dengueviruset PrM av serotype 4 satt inn i det enkle Pacl-setet i pBNX67.
Dannelse av det rekombinante MVA via homolog rekombinasjon Vektoren pBN67 (figur 2b) kan anvendes for å danne et rekombinant MVA ved anvendelse av den ovenfor nevnte protokollen - for eksempel resulterer anvendelsen av pBN27 (figur 2c) for homolog rekombinasjon i et rekombinant MVA som bærer Denguevirus PrM4 i den intergeniske regionen mellom de to nærliggende ORF.
Innsetting av PrM4 i IGR136-137-innskuddssetet til MVA
I en første runde ble cellene infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble i tillegg transfektert med innsettingsvektor pBN27 (figur 2c) som inneholdt NPT- genet for seleksjon og EGFP (forsterket grønt fluorescensprotein) som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset ved 4 runder med plakkrensing under G418-seleksjon.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere IGR136-137-innskuddssetet, ble primerparene BN900 (cgttcgcatgggttacctcc, SEKV.ID. NR. 9) og BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEKV.ID. NR. 10) anvendt. I tilfelle DNA til det tomme vektor virus MVA ble amplifisert, er det forventede PCR-fragmentet 88 nukleotider (nt) langt. I tilfelle et rekombinant MVA for PrM4 amplifiseres, som har inkorporert Dengueviruset PrM4-kodende region ved IGR136-137-innskuddssetet, er det forventet at fragmentet er 880 bp. PCR-resultatene i figur 8a) viser klart den stabile innsettingen av PrM4 i IGR136-137-innskuddssetet etter 22 runder med virusamplifisering. Det rekombinante MVA viser fortsatt de samme vekstkarakteristika som MVA-BN. Det replikerer i kyllingembryofibroblaster (CEF-celler) og vokser svekket i pattedyrceller (figur 8b).
Eksempel 3
Innsettingsvektorene pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 og pBN56
MVA-sekvens ene ved siden av de nye innskuddssetene (ved genomposisjon 12800) mellom ORF 007R og 008L, ble isolert ved hjelp av standard PCR-amplifisering av sekvensene av interesse ved anvendelse av de følgende primerne: IGR 07/08 Flup (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEKV.ID. NR. 11) og IGR 07/08 F lend (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEKV.ID. NR. 12) for isolering av Flank 1;
IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC;
SEKV.ID. NR. 13) og IGR 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEKV.ID. NR. 14) for isolering av Flank 2.
PCR-fragmentet som omfatter Flank 1 ble behandlet med restriksjonsenzymene SacII og SacI og ligert til en SacII/SacI-fordøyd og defosforylert basisvektor, slik som pBluescript (Stratagene).
Det resulterende plasmidet ble XhoI/Apal-fordøyd, defosforylert og ligert til det XhoI/Apal-fordøyde PCR-fragmentet som omfatter Flank 2.
Eventuelt ble en repeterende sekvens av Flank 2 som var blitt isolert ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerne IGR 07/08 F2up
(CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEKV.ID. NR. 13)
OG IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA; SEKV.ID. NR. 15) og som var BamHI/Pstl-fordøyd, satt inn i BamHI/Pstl-setet til den resulterende vektoren.
Ethvert reporter- eller terapeutisk gen som omfatter kassett med for eksempel en poxviruspromotor, et markørgen, en poly-A-region og eventuelt et IRES-element, et ytterligere gen som for eksempel uttrykker en terapeutisk aktiv forbindelse eller genprodukt, kan gjøres stumpendet (blunt ended) med T4 DNA-polymerase (Roche) etter en restriksjonsfordøying og settes inn i et egnet kloningssete i plasmidvektoren. Et restriksjonskart over et eksempel på vektorkonstrukt i henhold til dette eksempelet, er vist i figur 3 a) (pBNX79). Innsetting av NPT/EGFP seleksjonskassetten, resulterer i vektor pBNX86 (figur 3b) og innsetting av gpt/BFP seleksjonskassetten i vektor pBNX88 (figur 3c). Ved å betrakte ekspresjonsenheten for et terapeutisk gen som omfatter et terapeutisk gen og en funksjonelt bundet promotor, settes denne ekspresjonsenheten inn i Pacl-setet. For konstruksjon av pBN34 (figur 3d), ble Dengueviruset PrM2 klonet inn i pBNX88 (figur 3c) og for syntese av pBN56 (figur 3e), ble HIV env-kodende region Pacl-klonet i pBNX86 (figur 3b).
Dannelse av det rekombinante MVA via homolog rekombinasjon Vektorene pBNX86 (figur 3b) og pBNX88 (figur 3c) henholdsvis, kan anvendes for å danne et rekombinant MVA ved anvendelse av den ovenfor nevnte protokollen. Anvendelse av pBN34 (figur 3d) for homolog rekombinasjon resulterer i et rekombinant MVA som bærer Denguevirus PrM2 i den intergeniske regionen mellom to nærliggende ORF. Rekombinasjon av pBN56 (figur 3e) med MVA-BN-genomet resulterer i et rekombinant MVA som inneholder HIV env-genet i det korresponderende IGR.
Innsetting av PrM2 i IGR07-08-innskuddssetet til MVA
I en første runde ble cellene infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble i tillegg transfektert med innsettingsvektor pBN34 (figur 3d) som inneholdt gpt-genet for seleksjon og BFP som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset gjennom 3 runder med plakkrensing under seleksjon ved hjelp av mycofenolsyre som beskrevet i eksempel 1.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere IGR07-08-innskuddssetet, ble primerparene BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEKV.ID. NR. 16) og BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEKV.ID. NR. 17) anvendt. I tilfelle DNA av det tomme vektor virus MVA amplifiseres, er det forventede PCR-fragmentet 190 nukleotider (nt) langt, i tilfelle av et rekombinant MVA for PrM2 amplifiseres, som har inkorporert Denguevirus PrM2-kodende region ved IGR07-08-innskuddssetet, er det forventede fragmentet 950 bp. PCR-resultatene i figur 9a) viser klart den stabile innsettingen av PrM2 i IGR07-08-innskuddssetet etter 20 runder med virusamplifisering. Det rekombinante MVA viser fortsatt de samme vekstkarakteristika som MVA-BN. Det replikerer i kyllingembryofibroblaster (CEF-celler) og vokser svekket i pattedyrceller (figur 9b).
Innsetting av HIV env i IGR07-08-innskuddssetet til MVA
I en første runde ble cellene infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble i tillegg transfektert med innsettingsvektor pBN56 (figur 3e) som inneholdt NPT-genet for seleksjon og EGFP som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset gjennom 6 runder med plakkrensing under G418-seleksjon.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere IGR07-08-innskuddssetet, ble primerparene BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEKV.ID. NR. 16) og BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEKV.ID. NR. 17) anvendt. I tilfelle av DNA til den tomme vektor virus MVA amplifiseres, er det forventede PCR-fragmentet 190 nukleotider (nt) langt, i tilfelle av et rekombinant MVA for env amplifiseres som har inkorporert HIV env-kodende region ved IGR07-08-innskuddssetet, er det forventede fragmentet 2,6 kb. PCR-resultatene i figur 10 viser klart den stabile innsettingen av env i IGR07-08-innskuddssetet etter 20 runder med virusamplifisering.
Eksempel 4
Innsettingsvektorene pBNX80, pBNX87 og pBN47
MVA-sekvens ene ved siden av det nye innskuddssetet (ved genomposisjon 37330) mellom ORF 044L og 045L, ble isolert ved hjelp av standard PCR-amplifisering av sekvensen av interesse ved anvendelse av de følgende primerne: IGR44/45Flup (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEKV.ID. NR. 18) og IGR44/45Flend (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEKV.ID. NR. 19) for isolering av Flank 1;
IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT;
SEKV.ID. NR. 20) og IGR44/45F2end (CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT; SEKV.ID. NR. 21) for isolering av Flank 2.
PCR-fragmentet som omfatter Flank 1 ble behandlet med restriksjonsenzymene SacII og SacI og ligert til en SacII/SacI-fordøyd og defosforylert basisvektor, slik som pBluescript (Stratagene).
Det resulterende plasmidet ble XhoI/Apal-fordøyd, defosforylert og ligert til ZhoI/Apal-fordøyd PCR-fragment som omfatter Flank 2.
Eventuelt ble en repeterende sekvens av Flank 2 som hadde blitt isolert ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerne IGR44/45F2up
(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEKV.ID. NR. 20) og
IGR44/45F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG; SEKV.ID. NR 22) og som var blitt BamHI/Pstl-fordøyd, satt inn i BamHI/Pstl-setet til den resulterende vektoren.
Ethvert reporter- eller terapeutisk gen som omfatter kassett med for eksempel en poxviruspromotor, et markørgen, en poly-A-region og eventuelt et IRES-element, et ytterligere gen som for eksempel uttrykker en terapeutisk aktiv forbindelse eller genprodukt, kan oppnås med butte ender med T4 DNA-polymerase (Roche) etter en restriksjonsfordøying og settes inn i et egnet kloningssete i plasmidvektoren. Ved å betrakte en reportergenkassett, er Pstl-, EcoRI-, EcoRV-, Hindlll-, Aval- eller Xhol-restriksjonsenzymsetet mellom Flank 2 og Flank 2-repeteringen, foretrukket som kloningssete. For konstruksjonen av pBNX87 (figur 4b), ble NPT/EGFP seleksjonskassetten satt inn i pBNX80 (figur 4a).
Ved å betrakte en ekspresjonsenhet for et terapeutisk gen som omfatter et terapeutisk gen og en funksjonelt bundet promotor, settes denne ekspresjonsenheten inn i Pacl-setet.
Et restriksjonskart over eksempler på vektorkonstrukter i henhold til dette eksempelet, er vist i figur 4a) og b) (pBNX80, pBNX87).
Vektoren kan anvendes for å danne et rekombinant MVA - ved å følge den ovenfor nevnte protokollen - som bærer en eksogen sekvens i den intergeniske regionen mellom to nærliggende ORF. For konstruksjonen av pBN47 (figur 4c), ble PrM til Denguevirus serotype 3 klonet inn i pBNX87 (figur 4b).
Innsetting av PrM3 i IGR44-45-innskuddssetet til MVA
I en første runde ble cellene infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble ytterligere transfektert med innsettingsvektor pBN47 (figur 4c) som inneholdt NPT-genet for seleksjon og EGFP som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset ved 3 runder med plakkrensing under G418-seleksjon.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere IGR44-45-innskuddssetet, ble primerparene BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEKV.ID. NR. 23) og BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEKV.ID. NR. 24) brukt. I tilfelle hvor DNA til den tomme vektor virus MVA amplifiseres, er det forventede PCR-fragmentet 185 nukleotider (nt) langt, i tilfelle av et rekombinant MVA for PrM3 amplifiseres som har inkorporert Denguevirus PrM3-kodende region ved IGR44-45-innskuddssetet, er det forventede fragmentet 850 bp. PCR-resultatene i figur lia) viser klart den stabile innsettingen av PrM3 i IGR44-45-innskuddssetet etter 19 runder med virusamplifisering. Det rekombinante MVA viser fortsatt de samme vekstkarakteristika som MVA-BN. Det replikerer i kyllingembryofibroblaster (CEF-celler) og vokser svekket i pattedyrceller (figur 11b).
Eksempel 5
Innsettingsvektor pBNX90, pBNX92 og pBN54
MVA-sekvens ene ved siden av det nye innskuddssetet (ved genomposisjon 137496) mellom ORF 148R og 149L ble isolert ved hjelp av standard PCR-amplifisering av sekvensene av interesse ved anvendelse av de følgende primerne: IGR148/149Flup (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG; SEKV.ID. NR.
25) og IGR148/149Flend
(CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEKV.ID. NR. 26) for
isolering av Flank 1;
IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEKV.ID. NR. 27) og IGR148/149F2end
(TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEKV.ID. NR. 28) for isolering av Flank 2.
PCR-fragmentet som omfatter Flank 1 ble behandlet med restriksjonsenzymene SacII og Xbal og ligert til en SacII/Xbal-fordøyd og defosforylert basisvektor, slik som pBluescript (Stratagene).
Det resulterende plasmidet ble Hindlll/Apal-fordøyd, defosforylert og ligert til det Hindlll/Apal-fordøyde PCR-fragmentet som omfatter Flank 2.
Eventuelt ble en repeterende sekvens av Flank 2 som var blitt isolert ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerne IGR148/149F2up
(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEKV.ID. NR. 27) og IGR148/149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEKV.ID. NR. 29) og som var blitt BamHI/Pstl-fordøyd, satt inn i BamHI/Pstl-setet til den resulterende vektoren.
Ethvert reporter- eller terapeutisk gen som omfatter kassett med for eksempel en poxviruspromotor, et markørgen, en poly-A-region og eventuelt et IRES-element, et ytterligere gen som for eksempel uttrykker en terapeutisk aktiv forbindelse eller genprodukt, kan påføres butte ender med R4 DNA-polymerase (Roche) etter en restriksjonsfordøying og settes inn i et egnet kloningssete i plasmidvektoren. For konstruksjon av pBNX92 (figur 5b), ble gpt/BFP-ekspresjonskassetten satt inn i dette kloningssetet. Ved å betrakte en reportergenkassett, er Pstl-, EcoRI-, EcoRV-og Hindlll-restriksjonsenzymsetet mellom Flank 2 og Flank 2-repeteringen, foretrukket som kloningssete. Ved å betrakte en ekspresjonsenhet for et terapeutisk gen som omfatter et terapeutisk gen og en funksjonelt bundet promotor, settes denne ekspresjonsenheten inn i Pacl-setet. For konstruksjon av pBN54 (figur 5c), ble Denguevirus PrMl satt inn i dette Pacl-setet.
Et restriksjonskart over et eksempel på vektorkonstrukt i henhold til dette eksempelet er vist i figur 5a) og b) (pBNX90, pBNX92).
Vektoren kan anvendes for å danne et rekombinant MVA - ved å følge den ovenfor nevnte protokollen - som bærer en eksogen sekvens i den intergeniske regionen mellom to nærliggende ORF. For dannelsen av et rekombinant MVA som uttrykker Denguevirus PrMl pBN54 (figur 5c), anvendt for en homolog rekombinasjon.
Innsetting av PrMl i IGR148-149-innskiiddssetet til MVA
I en første runde ble cellene infisert med MVA i henhold til den ovenfor beskrevne protokollen og ble i tillegg transfektert med innsettingsvektor pBN54 (figur 5c) som inneholdt gpt-genet for seleksjon og BFP som reportergen. Resulterende rekombinante virus ble renset gjennom 3 runder med plakkrensing under seleksjon med mycofenolsyre.
Resulterende rekombinante virus ble identifisert ved hjelp av standard PCR-analyser ved anvendelse av et primerpar som selektivt amplifiserer det forventede innskuddssetet. For å amplifisere IGR148-149-innskuddssetet, ble primerparene BN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEKV.ID. NR. 30) og BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEKV.ID. NR. 31) anvendt. I tilfelle DNA til den tomme vektor virus MVA amplifiseres, er det forventede PCR-fragmentet 450 nukleotider (nt) langt, i tilfelle av et rekombinant MVA for PrMl amplifiseres som har inkorporert Denguevirus PrMl-kodende region ved IGR148-149-innskuddssetet, er det forventede fragmentet 1200 bp. PCR-resultatene i figur 12a) viser klart den stabile innsettingen av PrMl i IGR148-149-innskuddssetet etter 23 runder med virusamplifisering. Det rekombinante MVA viser fortsatt de samme vekstkarakteristika som MVA-BN. Det replikerer i kyllingembryofibroblaster (CEF-celler) og vokser svekket i pattedyrceller (figur 12b).

Claims (55)

1. Rekombinant modifisert Vaccinia Ankaravirus (MVA), omfattende en heterolog, eksogen DNA-sekvens satt inn i en intergenisk region (IGR) i det virale genomet.
2. MVA ifølge krav 1, hvori den heterologe DNA-sekvensen er satt inn i en IGR mellom to nærliggende åpne leserammer (ORF) valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
3. MVA ifølge krav 1 eller 2, hvori den heterologe DNA-sekvensen omfatter i det minste én kodende sekvens, fortrinnsvis under transkripsjonskontroll av et poxvirus transkripsjonskontrollelement.
4. MVA ifølge kravene 1 til 3, hvori den heterologe DNA-sekvensen koder for ett eller flere proteiner, polypeptider, peptider, fremmede antigener eller antigene epitoper.
5. MVA ifølge kravene 1 til 4, hvori den heterologe DNA-sekvensen er utledet fra Denguevirus, japansk encefalitittvirus, Hepatitt virus B, Hepatitt virus C og/eller immunsviktvirus, fortrinnsvis humant immunsviktvirus (HIV).
6. MVA ifølge krav 5, hvori den heterologe DNA-sekvensen utledet fra Denguevirus er valgt fra gruppen som omfatter NS1 og PrM.
7. MVA ifølge krav 6, hvori NS 1-genet er satt inn i IGR mellom ORF 064L-065L.
8. MVA ifølge krav 6 eller 7, hvori PrM-genet er utledet fra en eller flere av de 4 Denguevirus serotypene.
9. MVA ifølge kravene 6 til 8, hvori PrM-genet er satt inn i IGR mellom ORF valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
10. MVA ifølge krav 5, hvori den heterologe DNA-sekvensen er utledet fra immunsviktvirus som koder for HIV env.
11. MVA ifølge krav 10, hvori HIV env-genet er satt inn i IGR mellom ORF 007R-008L.
12. MVA ifølge kravene 1 til 11, hvori MVA er deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
13. MVA ifølge kravene 1 til 12 for anvendelse som et medikament og/eller vaksine.
14. Anvendelse av MVA ifølge kravene 1 til 13 for fremstillingen av et medikament og/eller vaksine for behandlingen og/eller profylaksen av en virusinfeksjon og/eller en prolifererende sykdom.
15. Anvendelse ifølge krav 14 for behandlingen eller profylaksen av Denguevirusinfeksjon eller immunsviktvirus infeksjon, fortrinnsvis HIV-infeksjon.
16. Vaksine, karakterisert vedå omfatte MVA ifølge kravene 1 til 13.
17. Farmasøytisk sammensetning, omfattende MVA ifølge kravene 1 til 13 og en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel, adjuvans og/eller additiv.
18. Fremgangsmåte for å fremstille et protein, polypeptid, peptid, antigen eller epitop in vitro, karakterisert vedå omfatte trinnene: infisere en vertscelle med det rekombinante MVA ifølge kravene 1 til 13, dyrke den infiserte vertscellen under egnede betingelser, isolere og/eller anrike polypeptidet, proteinet, peptidet, antigenet, epitopen og/eller viruset fremstilt av nevnte vertscelle.
19. Fremgangsmåte for å introdusere en DNA-sekvens i en celle in vitro, hvor nevnte DNA-sekvens er homolog og/eller heterolog i forhold til genomet til nevnte celle, hvori cellen infiseres med MVA i henhold til kravene 1 til 13.
20. Fremgangsmåte for å introdusere en DNA-sekvens i en celle ex vivo, hvori nevnte DNA-sekvens er homolog og/eller heterolog til genomet til nevnte celle, hvori cellen infiseres med MVA ifølge kravene 1 til 13 og hvori den infiserte cellen deretter administreres til et levende dyr, inkludert et menneske.
21. Celle, omfattende MVA ifølge kravene 1 til 13.
22. Plasmidvektor, omfattende en DNA-sekvens som dirigerer innsettingen av en DNA-sekvens som er heterolog til genomet til et MVA-virus ("heterolog sekvens") via homolog rekombinasjon inn i en IGR lokalisert mellom to nærliggende ORF i MVA-genomet, nevnte heterologe sekvens og, eventuelt en reporter- og/eller seleksjonsgenkassett.
23. Plasmidvektor ifølge krav 22, hvori nevnte DNA-sekvens omfatter et fullstendig eller en del av et fragment av IGR-sekvensen.
24. Plasmidvektor ifølge krav 22 eller 23, hvori nevnte DNA-sekvens omfatter IGR-omliggende sekvenser av to nærliggende ORF.
25. Plasmidvektor ifølge kravene 22 til 24, hvori IGR-sekvensen er utledet fra en IGR mellom ORF valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
26. Plasmidvektor ifølge kravene 22 til 25, hvori den IGR-utledede sekvensen omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 527-608 i sekv.id. nr. 32; - nr. 299-883 i sekv.id. nr. 33; - nr. 339-852 i sekv.id. nr. 34; - nr. 376-647 i sekv.id. nr. 35; - nr. 597-855 i sekv.id. nr. 36; - nr. 400-607 i sekv.id. nr. 37.
27. Plasmidvektor ifølge kravene 22 til 26, hvori de IGR-omliggende sekvensene av de to nærliggende ORF er valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
28. Plasmidvektor ifølge kravene 22 til 27, hvori de IGR-omliggende sekvensene av de to nærliggende ORF omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 1-526 og 609-1190 i sekv.id. nr. 32; - nr. 101-298 og 853-1198 i sekv.id. nr. 33; - nr. 1-338 og 853-1200 i sekv.id. nr. 34; - nr. 1-375 og 648-1200 i sekv.id. nr. 35; - nr. 1-596 og 856-1200 i sekv.id. nr. 36; - nr. 1-399 og 608-1081 i sekv.id. nr. 37.
29. Plasmidvektor ifølge kravene 22 til 28, hvori DNA-sekvensen dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn en IGR i genomet til MVA deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
30. Fremgangsmåte for å fremstille MVA ifølge kravene 1 til 13,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene transfeksj on av en celle med en plasmidvektor ifølge kravene 24 til 31; infisering av den transfekterte cellen med et MVA; identifisering, isolering og eventuelt rensing MVA ifølge kravene 1 til 13.
31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert vedat cellen infiseres med MVA deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
32. DNA, omfattende en DNA-sekvens som dirigerer innsettingen av en DNA-sekvens som er heterolog til genomet til et MVA-virus ("heterolog sekvens") via homolog rekombinasjon inn i et IGR lokalisert mellom to nærliggende ORF i MVA-genomet, og nevnte heterologe sekvens.
33. DNA-sekvens ifølge krav 32, hvori DNA-sekvensen som dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i IGR i MVA-genomet omfatter et fullstendig eller en del av et fragment av IGR-sekvensen.
34. DNA-sekvens ifølge krav 32 eller 33, hvori DNA-sekvensen som dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i IGR i MVA-genomet omfatter IGR-omliggende sekvenser til to nærliggende ORF.
35. DNA-sekvens ifølge kravene 32 til 34, hvori IGR-sekvensen er utledet fra en IGR mellom ORF valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
36. DNA-sekvens ifølge kravene 32 til 35, hvori den IGR-utledede sekvensen omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 527-608 i sekv.id. nr. 32; - nr. 299-883 i sekv.id. nr. 33; - nr. 339-852 i sekv.id. nr. 34; - nr. 376-647 i sekv.id. nr. 35; - nr. 597-855 i sekv.id. nr. 36; - nr. 400-607 i sekv.id. nr. 37.
37. DNA-sekvens ifølge kravene 32 til 36, hvori den IGR-omliggende sekvensene til de to nærliggende ORF er valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
38. DNA-sekvens ifølge kravene 32 til 37, hvori de IGR-omliggende sekvensene til de to nærliggende ORF omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 1-526 og 609-1190 i sekv.id. nr. 32; - nr. 101-298 og 884-1198 i sekv.id. nr. 33; - nr. 1-338 og 853-1200 i sekv.id. nr. 34; - nr. 1-375 og 648-1200 i sekv.id. nr. 35; - nr. 1-596 og 856-1200 i sekv.id. nr. 36; - nr. 1-399 og 608-1081 i sekv.id. nr. 37.
39. DNA-sekvens ifølge kravene 32 til 38, hvori DNA-sekvensen dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i et IGR i genomet til MVA deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
40. Anvendelse av en plasmidvektor, omfattende en DNA-sekvens som dirigerer innsettingen av en DNA-sekvens som er heterolog til et MVA-virusgenom ("heterolog sekvens") via homolog rekombinasjon inn i et IGR lokalisert mellom to nærliggende ORF til MVA-genomet, og innsetting av et kloningssete for innsetting av nevnte heterologe sekvens i nevnte IGR-sekvens, og eventuelt en reporter- og/eller seleksjonsgenkassett for dannelse og/eller fremstilling av et rekombinant MVA ifølge kravene 1 til 13.
41. Anvendelse ifølge krav 40, hvori nevnte DNA-sekvens omfatter en fullstendig eller en del av et fragment av IGR-sekvensen.
42. Anvendelse ifølge krav 40 eller 41, hvori nevnte DNA-sekvens omfatter IGR-omliggende sekvenser til to nærliggende ORF.
43. Anvendelse ifølge kravene 40 til 42, hvori IGR-sekvensen er utledet fra et IGR mellom ORF valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
44. Anvendelse ifølge kravene 40 til 43, hvori den IGR-utledede sekvensen omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 527-608 i sekv.id. nr. 32; - nr. 299-883 i sekv.id. nr. 33; - nr. 339-852 i sekv.id. nr. 34; - nr. 376-647 i sekv.id. nr. 35; - nr. 597-855 i sekv.id. nr. 36; - nr. 400-607 i sekv.id. nr. 37.
45. Anvendelse ifølge kravene 40 til 44, hvori de IGR-omliggende sekvensene til de to nærliggende ORF er valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
46. Anvendelse ifølge kravene 40 til 45, hvori de IGR-omliggende sekvensene til de to nærliggende ORF omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 1-526 og 609-1190 i sekv.id. nr. 32; - nr. 101-298 og 884-1198 i sekv.id. nr. 33; - nr. 1-338 og 853-1200 i sekv.id. nr. 34; - nr. 1-375 og 648-1200 i sekv.id. nr. 35; - nr. 1-596 og 856-1200 i sekv.id. nr. 36; - nr. 1-399 og 608-1081 i sekv.id. nr. 37.
47. Anvendelse ifølge kravene 40 til 46, hvori DNA-sekvensen dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i en IGR til genomet til MVA deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
48. Anvendelse av et DNA som dirigerer innsettingen av en DNA-sekvens som er heterolog til genomet til et MVA-virus ("heterolog sekvens") via homolog rekombinasjon inn i et IGR lokalisert mellom to nærliggende ORF i MVA-genomet for dannelse og/eller fremstilling av en plasmidvektor ifølge kravene 22 til 29 og/eller for dannelse og/eller fremstilling av et rekombinant MVA ifølge kravene 1 til 13.
49. Anvendelse ifølge krav 48, hvori DNA-sekvensen som dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i IGR i MVA-genomet omfatter en fullstendig eller en del av et fragment av IGR-sekvensen.
50. Anvendelse ifølge krav 48 eller 49, hvori DNA-sekvensen som dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i IGR i MVA-genomet omfatter IGR-omliggende sekvenser av to nærliggende ORF.
51. Anvendelse ifølge kravene 48 til 50, hvori IGR-sekvensen er utledet fra en IGR mellom ORF valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
52. Anvendelse ifølge kravene 48 til 51, hvori den IGR-utledede sekvensen omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 527-608 i sekv.id. nr. 32; - nr. 299-883 i sekv.id. nr. 33; - nr. 339-852 i sekv.id. nr. 34; - nr. 376-647 i sekv.id. nr. 35; - nr. 597-855 i sekv.id. nr. 36; - nr. 400-607 i sekv.id. nr. 37.
53. Anvendelse ifølge kravene 48 til 52, hvori de IGR-omliggende sekvensene til de to nærliggende ORF er valgt fra gruppen som omfatter: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
54. Anvendelse ifølge kravene 48 til 52, hvori de IGR-omliggende sekvensene til de to nærliggende ORF omfatter en sekvens valgt fra gruppen som omfatter nukleotidsekvensene - nr. 1-526 og 609-1190 i sekv.id. nr. 32; - nr. 101-298 og 884-1198 i sekv.id. nr. 33; - nr. 1-338 og 853-1200 i sekv.id. nr. 34; - nr. 1-375 og 648-1200 i sekv.id. nr. 35; - nr. 1-596 og 856-1200 i sekv.id. nr. 36; - nr. 1-399 og 608-1081 i sekv.id. nr. 37.
55. Anvendelse ifølge kravene 48 til 54, hvori DNA-sekvensen dirigerer innsettingen av den heterologe sekvensen inn i en IGR i genomet til MVA deponert ved ECACC under deponeringsnummer V00083008.
NO20045480A 2002-05-16 2004-12-16 Rekombinant modifisert Vaccinia Ankaravirus (MVA), anvendelse derav for fremstilling av medikament og/eller vaksine, vaksine, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte MVA, fremgangsmåte for å introdusere DNA-sekvens i en celle, celle, plasmidvektor, fremgangsmåte for å fremstille MVA, DNA sekvens, anvendelse av plasmidvektor samt anvendelse av DNA. NO336489B1 (no)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200752 2002-05-16
DKPA200200753 2002-05-16
PCT/EP2003/005045 WO2003097845A1 (en) 2002-05-16 2003-05-14 Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (mva)
US10/514,761 US7550147B2 (en) 2002-05-16 2003-05-14 Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (MVA)
US12/468,127 US8034354B2 (en) 2002-05-16 2009-05-19 Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (MVA)
US13/234,230 US8435543B2 (en) 2002-05-16 2011-09-16 Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (MVA)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20045480L NO20045480L (no) 2004-12-16
NO336489B1 true NO336489B1 (no) 2015-09-07

Family

ID=29551228

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20044940A NO334273B1 (no) 2002-05-16 2004-11-12 Rekombinant poxvirus, samt anvendelse derav, vaksine, farmasøytisk sammensetning, celle, fremgangsmåte for generering av et rekombinant poxvirus, sett, DNA-sekvens og anvendelse derav
NO20045480A NO336489B1 (no) 2002-05-16 2004-12-16 Rekombinant modifisert Vaccinia Ankaravirus (MVA), anvendelse derav for fremstilling av medikament og/eller vaksine, vaksine, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte MVA, fremgangsmåte for å introdusere DNA-sekvens i en celle, celle, plasmidvektor, fremgangsmåte for å fremstille MVA, DNA sekvens, anvendelse av plasmidvektor samt anvendelse av DNA.
NO20111324A NO20111324A1 (no) 2002-05-16 2011-09-29 Rekombinant MVA-virus

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20044940A NO334273B1 (no) 2002-05-16 2004-11-12 Rekombinant poxvirus, samt anvendelse derav, vaksine, farmasøytisk sammensetning, celle, fremgangsmåte for generering av et rekombinant poxvirus, sett, DNA-sekvens og anvendelse derav

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20111324A NO20111324A1 (no) 2002-05-16 2011-09-29 Rekombinant MVA-virus

Country Status (23)

Country Link
US (14) US7550147B2 (no)
EP (3) EP1407033B1 (no)
JP (4) JP4895505B2 (no)
KR (4) KR101005630B1 (no)
CN (6) CN102199628A (no)
AT (1) ATE315660T1 (no)
AU (4) AU2003236646B2 (no)
BR (2) BRPI0311178B8 (no)
CA (3) CA2812019A1 (no)
DE (1) DE60303218T2 (no)
DK (2) DK1506301T3 (no)
EA (3) EA020230B1 (no)
ES (1) ES2256776T3 (no)
HK (2) HK1076642A1 (no)
IL (4) IL164172A0 (no)
MX (2) MXPA04011194A (no)
NO (3) NO334273B1 (no)
NZ (2) NZ536502A (no)
PL (2) PL216760B1 (no)
PT (1) PT1407033E (no)
SI (1) SI1407033T1 (no)
UA (1) UA82479C2 (no)
WO (2) WO2003097846A1 (no)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4101327C1 (no) * 1991-01-18 1991-10-24 Mercedes-Benz Aktiengesellschaft, 7000 Stuttgart, De
CN101676389A (zh) 2000-11-23 2010-03-24 巴法里安诺迪克有限公司 改良安卡拉痘苗病毒变体
DE60314823T3 (de) * 2002-04-19 2017-11-16 Bavarian Nordic A/S Modifizierte variante des vaccinia ankara virus als impfstoff für neugeborene
AU2003236646B2 (en) 2002-05-16 2009-01-15 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
DK1434858T4 (en) * 2002-09-05 2019-04-01 Bavarian Nordic As PROCEDURE FOR AMPLIFICATION OF A POXVIRUS UNDER SERUM-FREE CONDITIONS
US7638134B2 (en) 2003-02-20 2009-12-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Insertion sites in fowlpox vectors
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
EP1807508A4 (en) * 2004-11-05 2008-03-12 Us Gov Health & Human Serv METHODS FOR PREPARING CELLS AND VIRUSES
EP1855720B2 (en) * 2005-02-23 2023-04-26 Bavarian Nordic A/S Use of a modified proxvirus for the rapid induction of immunity against a poxvirus or other infectious agents
JP5424871B2 (ja) * 2006-05-19 2014-02-26 グライコフィ， インコーポレイテッド 組換えベクター
DK2402451T3 (en) * 2006-08-25 2018-06-25 The Government Of The Us Secretary Department Of Health And Human Services Method for Stabilizing a DNA Insert in a Recombinant Vaccine Vector
US20090098529A1 (en) * 2006-10-16 2009-04-16 Nanhai Chen Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses
EP2462930B1 (en) * 2006-11-09 2017-05-31 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using prime-boost approach
US8440202B2 (en) * 2006-11-09 2013-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
PE20081723A1 (es) * 2007-01-30 2008-12-14 Transgene Sa Vacuna contra el papilomavirus
US8268327B2 (en) 2007-04-27 2012-09-18 Bavarian Nordic A/S Immediate protection against pathogens via MVA
BRPI0810305A2 (pt) * 2007-05-15 2018-07-10 Transgene Sa "vetor, molécula de ácido nucléico substancialmente isolada, célula hospedeira, composição farmacêutica, uso de uma molécula de ácido nucléico, uso de um vetor, uso de uma célula hospedeira e uso de uma composição"
TW200907058A (en) * 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
CA2681183A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Wyeth Raccoon poxvirus expressing genes of feline antigens
DK2207564T3 (en) 2007-10-18 2017-01-16 Bavarian Nordic As USE OF VAT FOR TREATMENT OF PROSTATACANCES
EP2303322A1 (en) * 2008-06-20 2011-04-06 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
KR100894430B1 (ko) * 2008-11-11 2009-04-22 시스템디엔디(주) 초음파, 음향 및 온도변화를 이용한 밸브의 유체누설 측정장치 및 이를 이용한 유체누설 측정방법
MX2011005171A (es) * 2008-11-21 2011-05-30 Bavarian Nordic As Vector que comprende multiples secuencias de nucleotidos homologas.
AU2010305030A1 (en) 2009-10-08 2012-05-10 Bavarian Nordic A/S Generation of a broad T-cell response in humans against HIV
WO2011047324A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The U.S.A. As Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services . Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites
WO2011087839A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Baxter International Inc. Vaccine to influenza a virus
EP2552490A4 (en) * 2010-03-26 2013-12-18 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc INFLUENZA MATRIX 2 PROTEIN ECKTOMOMAS, EXPRESSION SYSTEM THEREFOR AND USES THEREOF
US10087423B2 (en) 2010-07-20 2018-10-02 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
CA2811739A1 (en) * 2010-09-23 2012-03-29 Baxter International Inc. Recombinant viral vectors and methods for inducing an immune response to yellow fever virus
EP2627774B1 (en) 2010-10-15 2018-11-21 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) influenza vaccine
CN114262690A (zh) 2011-04-15 2022-04-01 吉恩勒克斯公司 减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
DK2788021T3 (en) 2011-12-09 2017-04-10 Bavarian Nordic As POXVIRUS VECTOR FOR EXPRESSION OF BACTERIAL ANTIGENES CONNECTED TO TETANANOX INFRAGMENT C
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
KR20150021088A (ko) 2012-06-05 2015-02-27 디 오스트레일리언 내셔널 유니버시티 인터루킨-4 길항제를 이용한 백신접종
JP6523955B2 (ja) 2012-08-01 2019-06-05 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ｒｓウイルス（ｒｓｖ）ワクチン
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
WO2014055960A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 Genelux Corporation Energy absorbing-based diagnostic and therapeutic methods employing nucleic acid molecules encoding chromophore-producing enzymes
CA2888367A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
KR102212253B1 (ko) * 2013-03-15 2021-02-04 세멘티스 리미티드 면역 조절
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
KR101645642B1 (ko) 2014-10-16 2016-08-11 대한민국 Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스
KR101623498B1 (ko) 2014-10-16 2016-05-24 대한민국 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３
CN107735103B (zh) 2015-02-25 2022-05-27 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 使用灭活的非复制型的修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)作为实体肿瘤的单一免疫疗法或与免疫检查点阻断剂的组合
CN116173193A (zh) 2015-04-17 2023-05-30 纪念斯隆凯特琳癌症中心 Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
KR20160140075A (ko) * 2015-05-29 2016-12-07 코오롱생명과학 주식회사 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터
CA2987159A1 (en) * 2015-06-15 2016-12-22 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) foot and mouth disease virus (fmdv) vaccine
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用
US11278607B2 (en) 2016-01-08 2022-03-22 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
WO2017129765A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) equine encephalitis virus vaccine
WO2017136419A1 (en) * 2016-02-03 2017-08-10 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus
JP7034080B2 (ja) 2016-02-25 2022-03-11 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ヒトｆｌｔ３ｌを発現する組換えｍｖａまたはｍｖａδｅ３ｌおよび固形腫瘍に対する免疫療法薬としてのそれらの使用
WO2017147553A2 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Replication competent attenuated vaccinia viruses with deletion of thymidine kinase with and without the expression of human flt3l or gm-csf for cancer immunotherapy
WO2017192418A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
KR20190050787A (ko) * 2016-08-19 2019-05-13 세멘티스 리미티드 바이러스 백신
EP3518656A4 (en) * 2016-09-30 2020-09-30 Monsanto Technology LLC METHOD OF SELECTING TARGETS FOR SITE-SPECIFIC GENOME MODIFICATION IN PLANTS
WO2018209315A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
CN110958887B (zh) * 2017-06-15 2023-10-31 扬森疫苗与预防公司 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
EP3790578A4 (en) 2018-05-11 2022-04-06 City of Hope GENETICALLY MODIFIED RECOMBINANT VACCINIA-ANKARA (RMVA) VACCINE WITH IMPROVED STABILITY AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION
CN112512569A (zh) * 2018-05-11 2021-03-16 希望之城 表达多个巨细胞病毒(cmv)抗原的mva载体及其用途
CN111979204B (zh) * 2019-05-24 2023-10-13 杭州功楚生物科技有限公司 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途
EP4058058A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Aelix Therapeutics S.L. Dosage regimens for vaccines
TW202203966A (zh) * 2020-03-31 2022-02-01 澳大利亞商賽門蒂斯公司 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗
WO2024011250A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
JPH0795956B2 (ja) * 1986-09-22 1995-10-18 京都大学長 ポックスウイルス由来発現制御領域
US5093258A (en) * 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
US5225336A (en) * 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
US5651972A (en) 1989-04-21 1997-07-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5514375A (en) 1990-08-15 1996-05-07 Virogenetics Corporation Flavivirus recombinant poxvirus vaccine
US6893845B1 (en) * 1990-09-28 2005-05-17 Applied Molecular Evolution, Inc. Surface expression libraries of heteromeric receptors
KR100242671B1 (ko) * 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
BE1004877A3 (fr) * 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
FR2679249B1 (fr) * 1991-07-15 1993-11-26 Centre Nal Recherc Scientifique Souches de levure avec integration stable de genes heterologues.
JPH06509235A (ja) 1991-07-26 1994-10-20 ヴァイロジェネティクス　コーポレイション 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス組換えポックスウイルスワクチン
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome
DK0538496T3 (da) 1991-08-26 2004-02-23 Baxter Healthcare Sa Rekombinant fjerkrækoppevirus med intakt FPV tk-gen
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
EP0753581A1 (en) * 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
DE19629828A1 (de) * 1996-07-24 1998-01-29 Bayer Ag Carbanilide
EP0951555A2 (en) * 1996-09-24 1999-10-27 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
AUPP380598A0 (en) * 1998-05-29 1998-06-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genetically manipulated entomopoxvirus
US6252871B1 (en) 1998-07-01 2001-06-26 Powerwave Technologies, Inc. Switchable combiner/splitter
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US6682742B1 (en) * 1999-05-28 2004-01-27 Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
SI1263936T1 (sl) * 2000-03-14 2006-06-30 Bavarian Nordic As Spremenjen sev modificiranega virusa vakcinacije Ankara (MVA)
CA2341356C (en) * 2000-04-14 2011-10-11 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity
IL154169A0 (en) * 2000-08-29 2003-07-31 Wyeth Corp Packaging of positive-strand rna virus replicon particles
CN101676389A (zh) 2000-11-23 2010-03-24 巴法里安诺迪克有限公司 改良安卡拉痘苗病毒变体
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
AU2003236646B2 (en) 2002-05-16 2009-01-15 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome
CN1717488A (zh) * 2002-11-25 2006-01-04 巴法里安诺迪克有限公司 包含至少两个牛痘ati启动子的重组痘病毒

Also Published As

Publication number Publication date
EA200401506A1 (ru) 2005-04-28
CA2812019A1 (en) 2003-11-27
AU2009200380B2 (en) 2009-10-01
HK1076836A1 (en) 2006-01-27
IL193087A (en) 2012-10-31
US7338662B2 (en) 2008-03-04
US20110250693A1 (en) 2011-10-13
WO2003097846A1 (en) 2003-11-27
HK1076642A1 (en) 2006-01-20
KR20100110901A (ko) 2010-10-13
KR20040108798A (ko) 2004-12-24
PL372093A1 (en) 2005-07-11
US20110053260A1 (en) 2011-03-03
DE60303218D1 (de) 2006-04-06
US20120039936A1 (en) 2012-02-16
JP2005525822A (ja) 2005-09-02
CN102703393A (zh) 2012-10-03
EP2253709B1 (en) 2018-04-11
CN1653183B (zh) 2012-07-25
US20100303856A1 (en) 2010-12-02
PT1407033E (pt) 2006-05-31
SI1407033T1 (sl) 2006-06-30
ATE315660T1 (de) 2006-02-15
US20120082696A1 (en) 2012-04-05
US9109233B2 (en) 2015-08-18
UA82479C2 (uk) 2008-04-25
US20090311746A1 (en) 2009-12-17
CN1653184A (zh) 2005-08-10
CA2481521A1 (en) 2003-11-27
AU2003236646B2 (en) 2009-01-15
ES2256776T3 (es) 2006-07-16
PL216760B1 (pl) 2014-05-30
JP2005525823A (ja) 2005-09-02
AU2003242540A1 (en) 2003-12-02
AU2009200380A1 (en) 2009-02-19
BR0311178A (pt) 2005-03-29
DK1506301T3 (da) 2014-07-21
KR20120002627A (ko) 2012-01-06
IL164172A0 (en) 2005-12-18
CA2481521C (en) 2012-04-17
US20120178157A1 (en) 2012-07-12
DE60303218T2 (de) 2006-09-14
US20100173388A1 (en) 2010-07-08
US8034354B2 (en) 2011-10-11
JP4895505B2 (ja) 2012-03-14
EA200900180A1 (ru) 2009-08-28
US20130243813A1 (en) 2013-09-19
CA2481799C (en) 2014-01-28
JP5777199B2 (ja) 2015-09-09
EP1407033B1 (en) 2006-01-11
NO20111324A1 (no) 2011-09-29
EA020230B1 (ru) 2014-09-30
NZ536502A (en) 2005-10-28
US8288125B2 (en) 2012-10-16
US8309326B2 (en) 2012-11-13
IL193088A (en) 2015-02-26
EA012160B1 (ru) 2009-08-28
NZ536501A (en) 2006-08-31
JP4693092B2 (ja) 2011-06-01
US20050244428A1 (en) 2005-11-03
PL218318B1 (pl) 2014-11-28
US8741308B2 (en) 2014-06-03
BR0310051A (pt) 2005-02-15
NO20045480L (no) 2004-12-16
US20110053259A1 (en) 2011-03-03
MXPA04010713A (es) 2005-03-07
EP2253709A1 (en) 2010-11-24
NO20044940L (no) 2004-11-12
BRPI0311178B8 (pt) 2021-05-25
US20060165727A1 (en) 2006-07-27
US8435543B2 (en) 2013-05-07
PL372088A1 (en) 2005-07-11
IL193087A0 (en) 2009-02-11
CN102719408A (zh) 2012-10-10
AU2008255213A1 (en) 2009-01-08
US20120135501A1 (en) 2012-05-31
IL193088A0 (en) 2009-02-11
EP1407033A1 (en) 2004-04-14
CN1653183A (zh) 2005-08-10
BRPI0311178B1 (pt) 2020-11-17
MXPA04011194A (es) 2005-02-14
IL164177A0 (en) 2005-12-18
DK1407033T3 (da) 2006-05-22
US7550147B2 (en) 2009-06-23
EA200401507A1 (ru) 2005-06-30
CN101831411A (zh) 2010-09-15
US20110244574A1 (en) 2011-10-06
AU2003236646A1 (en) 2003-12-02
CN100494388C (zh) 2009-06-03
EP1506301B1 (en) 2014-04-30
JP2010259446A (ja) 2010-11-18
WO2003097845A1 (en) 2003-11-27
EP1506301A1 (en) 2005-02-16
US7964374B2 (en) 2011-06-21
KR101138067B1 (ko) 2012-04-24
NO334273B1 (no) 2014-01-27
CN102199628A (zh) 2011-09-28
EA007811B1 (ru) 2007-02-27
KR101041691B1 (ko) 2011-06-14
KR101005630B1 (ko) 2011-01-05
US8414900B2 (en) 2013-04-09
AU2009200380C1 (en) 2010-03-11
CA2481799A1 (en) 2003-11-27
KR20040108809A (ko) 2004-12-24
AU2008255213B2 (en) 2011-10-06
JP2011004755A (ja) 2011-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8741308B2 (en) Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (MVA)
US8029800B2 (en) Recombinant modified vaccinia virus ankara (MVA) comprising human immunodeficiency virus (HIV) genes inserted into one or more intergenic regions (IGRs)
AU2007200016B2 (en) Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of modified vaccinia virus ankara

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired