ES2476990T3 - Sistema para tratar y prevenir cáncer de mama - Google Patents

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Gail P. Mazzara
Linda R. Gritz
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Abstract

Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunológica frente a una célula que expresa un antígeno asociado con cáncer de mama en un ser humano que tiene cáncer de mama o con riesgo de desarrollar cáncer de mama, que comprende: (a) un primer vector que contiene uno o más segmentos de ADN que codifican (i) mucina (MUC) o una porción antigénica de la misma o una versión modificada de la misma, en el que la versión modificada de la misma comprende SEC ID NO: 2, y (ii) antígeno carcinoembriónico (CEA) o una porción antigénica del mismo o una versión modificada del mismo, en el que la versión modificada del mismo comprende SEC ID NO: 4, y (b) al menos un segundo vector que contiene uno o más segmentos de ADN que codifican (i) MUC o una porción antigénica de la misma o una versión modificada de la misma, en el que la versión modificada de la misma comprende SEC ID NO: 2, y (ii) CEA o una porción antigénica del mismo o una versión modificada del mismo, en el que la versión modificada del mismo comprende SEC ID NO: 4, en el que el segundo vector es para la administración al ser humano a intervalos regulares tras la administración del primer vector.

Description

Sistema para tratar y prevenir cáncer de mama
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de inmunizaciones, y al uso de inmunoterapia de direccionamiento específico para tratar cáncer de mama, y/o afectar a la progresión de tal cáncer. La presente invención también se refiere a vectores y métodos que implican inmunoterapia del cáncer humano.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer de mama es una enfermedad que mata alrededor de 45.000 mujeres cada año en los Estados Unidos de América solo. Alrededor de 180.000 nuevos casos de cáncer de mama son diagnosticados anualmente, y se estima que una de cada ocho mujeres desarrollan cáncer de mama anualmente. Sin embargo, el diagnóstico del “cáncer de mama” comprende un número de células cancerosas genéticamente diversas. Como resultado, diferentes tumores de mama tienen diferentes pronósticos y responden de forma diferente a regímenes de tratamiento. Por ejemplo, los tumores de mama que expresan HER-2/neu tienen peor pronóstico que los tumores que no expresan HER-2/neu. Además, debido a la inestabilidad genética conocida, el patrón de expresión g�nica de las células cancerosas cambia durante diferentes etapas de la enfermedad, as� como en respuesta a los regímenes de tratamiento.
Actualmente, un pat�logo clasifica las células tumorales según sus patrones inmunohistol�gicos y usando micromatrices de ADNc y otros métodos de medida de la expresión g�nica, y/o mediante métodos de detección de mutaciones, todos los cuales est�n comercialmente disponibles. La información se usa para clasificar tumores y, en algunos casos, proporcionar pronóstico para pacientes con el tumor. Sin embargo, en sólo unos pocos métodos de tratamiento, la clasificación es de uso práctico cuando se determinan los regímenes de tratamiento, debido a que la mayoría de los métodos terapéuticos actualmente disponibles son no discriminatorios y est�n dirigidos generalmente contra células que se dividen rápidamente. Actualmente, un individuo diagnosticado con cáncer de mama se puede tratar con cirugía, terapia hormonal, quimioterapia, y/o radiación. Si el paciente desarrolla enfermedad metast�sica, se necesita radiación y quimioterapia de dosis elevada para extirpar el cáncer en áreas remotas tales como el cerebro, hueso, e hígado. La mayoría de terapias actualmente disponibles para el tratamiento de cáncer de mama son tóxicas, peligrosas, no específicas, costosas, y muchas son ineficaces, especialmente en el tratamiento de enfermedad metast�sica.
Por lo tanto, aunque la exactitud en el diagnóstico de tipos específicos de cáncer de mama ha mejorado significativamente, sólo unos pocos tratamientos se pueden diseñar actualmente para el usuario para satisfacer las necesidades específicas de un paciente individual, teniendo en cuenta las diferencias en el perfil de expresión y/o mutaciones en los diferentes tipos de células cancerosas. Por ejemplo, el cáncer de mama en el que las células cancerosas expresan un mayor número de receptores de estr�genos es sensible al tratamiento con bloqueadores del receptor de estr�genos, tales como tamoxifeno, mientras que el cáncer con células que no tienen número excesivo de receptores de estr�genos no responder� a tal tratamiento.
Como resultado de los avances en genética, ya se ha identificado un gran número de genes implicados en diferentes tipos de cáncer de mama, incluyendo BRCA1 (Herencia Mendeliana del Hombre en Línea (OMIM) #113705), BRCA2 (OMIM #600185), BRCATA (OMIM #600048), BRCA3 (OMIM #605365), BWSCR1A (OMIM #602631), el gen TP53 (OMIM #191170), el gen BRIP1 (OMIM #605882), y el gen RB1CC1 (OMIM #606837) en 8q11. Se han encontrado mutaciones en el gen del receptor de andr�genos (AR; OMIM #313700) en el cromosoma X en casos de cáncer de mama masculino (OMIM #313700.0016). Se encontr� una mutación en el gen RAD51 (OMIM #179617) en pacientes con cáncer de mama familiar (OMIM #179617.0001). Se ha demostrado que el alelo 1100delC del gen CHEK2 (OMIM #604373.0001) confiere una mayor susceptibilidad a cáncer de mama en mujeres, y especialmente en los hombres. Además, los genes NCOA3 (OMIM #601937) y ZNF217 (OMIM #602967), situados en 20q, sufren amplificación en cáncer de mama; cuando se sobreexpresan, estos genes confieren fenotipos celulares consistentes con un papel en la formación de tumores (Anzick et al., Science 277: 965-968, 1997; Collins et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 8703-8748, 1998). Además, el gen PPM1D (OMIM #605100) en 17q est� normalmente amplificado en cáncer de mama, y parece conducir a la transformación celular al abolir la actividad supresora del tumor p53 (OMIM #191170) (Bulavin et al., Nature Genet. 31: 210-215, 2002). Por lo tanto, sería ventajoso desarrollar un sistema de tratamiento que pudiese utilizar la información específica que se puede obtener del análisis genético y de expresión. Además, sería útil desarrollar un sistema que se pudiese adaptar adicionalmente para tratar todos los tipos diferentes de c�nceres de mama. Tal sistema sería menos tóxico y proporcionaría un tratamiento más eficaz que los regímenes no específicos disponibles hasta la fecha.
Un enfoque reciente al tratamiento del cáncer es la inmunoterapia, que se basa en la observación de que las células tumorales humanas expresan una variedad de ant�genos asociados a tumores (TAAs) que no se expresan, o que se expresan m�nimamente, en tejidos normales. Estos ant�genos, que incluyen ant�genos de tumores v�ricos, proteínas oncog�nicas celulares, y ant�genos de diferenciación específicos de tejidos, pueden servir como dianas para el sistema inmunitario del hospedante y provocar respuestas que dan como resultado la destrucción del tumor. Esta respuesta inmunitaria est� mediada principalmente por linfocitos; las células T en general, y los linfocitos T
citot�xicos restringidos a MHC clase I en particular, desempeñan un papel central en el rechazo de tumores. Desafortunadamente, como se evidencia por la elevada incidencia de cáncer en la población, la respuesta inmunitaria frente a células neopl�sicas fracasa a menudo a la hora de eliminar los tumores. El objetivo de la inmunoterapia activa frente al cáncer es aumentar respuestas antitumorales, particularmente respuestas de células T, a fin de dar como resultado de forma más eficaz una reducción tumoral.
La mayoría de los intentos en la inmunizaci�n activa frente a ant�genos del cáncer han utilizado como inmun�genos células tumorales completas o fragmentos de células tumorales. Sin embargo, este enfoque no proporciona reproducibilidad o control sobre los ant�genos precisos incluidos en cada inmunizaci�n.
La clonaci�n de genes que codifican ant�genos asociados a tumores ha abierto nuevas posibilidades para la inmunoterapia de cáncer basada en el uso de vacunas recombinantes o sintéticas contra el cáncer. Tsang et al., J. Natl. Cancer Inst. 87: 982-90 (1995); Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6458-62 (1994). En años recientes, se ha gastado mucho esfuerzo en la “terapia g�nica” como medio para combatir el cáncer. La expresión “terapia g�nica” se ha usado para describir una amplia variedad de métodos que usan técnicas de biotecnolog�a recombinante para suministrar una variedad de diferentes materiales a una célula. Tales métodos incluyen, por ejemplo, el suministro de un gen, ARN antisentido, un agente citot�xico, etc., mediante un vector a una célula de mamífero, preferiblemente una célula humana, ya sea in vivo o ex vivo. La mayoría del trabajo inicial se ha enfocado en el uso de vectores retrov�ricos para transformar estas células. Este foco ha resultado de la capacidad de los retrovirus para infectar células e integrar su material genético en la célula hospedante con eficiencia elevada. El vector retrov�rico es típicamente un virus modificado, tal como el virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), al que se le han suprimido sus secuencias de empaquetamiento para evitar el empaquetamiento de todo el genoma retrov�rico.
Sin embargo, se han dado a conocer numerosas dificultades con los retrovirus. Un problema que se ha desarrollado se observ� inicialmente como una ventaja clave de los retrovirus, principalmente su capacidad para integrarse en el cromosoma. Sin embargo, tal integración puede ser problem�tica, dependiendo del sitio cromos�mico de la inserción v�rica. Un gran número de otros virus, que se creyó inicialmente que eran enormemente epis�micos en naturaleza, tal como el virus adenoasociado (AAV), también han resultado tener esta propiedad. Aunque es ventajoso a la hora de provocar la expresión a largo plazo, también proporciona el potencial para problemas tales como la transformación celular indeseable. La transformación estable de células somáticas del paciente hace difícil invertir el régimen de tratamiento si los efectos secundarios indeseables obligan a que se detenga.
Tambi�n se han encontrado problemas a la hora de infectar ciertas células. Los retrovirus entran típicamente en las células a través de receptores de la superficie celular. Si tales receptores no est�n presentes en la célula, o no est�n presentes en números suficientes, entonces la infección puede no ser posible o puede ser ineficiente. Estos virus también son relativamente l�biles en comparación con otros virus. También se han dado a conocer brotes de virus de tipo salvaje procedente de estirpes celulares productoras de virus recombinantes, provocando el propio vector una enfermedad. Además, muchos de estos virus sólo permiten la expresión g�nica en células que se dividen. Los vectores v�ricos basados en lentivirus tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) no tienen estos problemas, pero siguen existiendo problemas sobre el uso de tales virus como vectores.
Otros virus se han propuesto como vectores, tales como el virus del herpes. Además, se han propuesto diversos vectores no v�ricos, tales como conjugados de ligandos con ADN. No obstante, estos enfoques plantean todos ellos ciertos problemas. Por ejemplo, un vector no puede ser él mismo una fuente potencial para la infección al individuo tratado. Sin embargo, como ya se ha mencionado, se han dado a conocer en algunas estirpes celulares brotes de retrovirus de tipo salvaje. De forma similar, se ha encontrado que el uso de virus del herpes como vector da como resultado la persistencia del virus. Además, muchos de estos vectores pueden contener y expresar solamente una cantidad relativamente pequeña de material genético. Esto es indeseable para numerosas situaciones en las que se prefiere la capacidad para expresar múltiples productos.
Los poxvirus se han usado durante muchos años como vectores, particularmente con respecto a la provisión de un ant�geno extraño o autoant�geno para generar una respuesta inmunitaria en un hospedante. Las ventajas de los vectores poxv�ricos incluyen: (i) facilidad de generación y producción; (ii) el gran tamaño del genoma, que permite la inserción de múltiples genes, (iii) suministro eficiente de genes a múltiples tipos celulares, incluyendo células que presentan ant�geno; (iv) niveles elevados de expresión proteica; (v) presentación óptima de ant�genos al sistema inmunitario; (vi) la capacidad para provocar respuestas inmunitarias mediadas por células, as� como respuestas de anticuerpos; y (vii) la experiencia a largo plazo ganada con el uso de este vector en seres humanos como una vacuna contra la viruela.
La atención se ha centrado en orthopox, tal como la cepa de Wyeth, NYVAC (patente U.S. n� 5.364.773) y el virus de la vacuna Ankara modificado (MVA). MVA deriv� de la cepa CVA-1 del virus de la vacuna de Ankara, que se us� en los años 1950 como vacuna contra la viruela. En 1958, se iniciaron experimentos de atenuación en el laboratorio del Dr. Anton Mayr (Universidad de Munich), que comprendieron la dilución terminal de CVA en células de fibroblastos de embriones de pollo (CEF), lo que finalmente dio como resultado alrededor de 500 pasadas. El MVA resultante es un virus atenuado, defectuoso en la replicaci�n, que est� restringido a la replicaci�n principalmente en células aviares. La comparación del genoma de MVA con su familiar, CVA, revel� 6 supresiones importantes de
ADN gen�mico (supresión I, II, III, IV, V, y VI), que suman en total 31.000 pares de bases. (Meyer et al., J. Gen. Virol. 72:1031-8 (1991)). MVA se ha administrado a numerosas especies de animales, incluyendo monos, ratones, cerdos, ovejas, ganado vacuno, caballos y elefantes, sin efectos adversos locales o sist�micos. Alrededor de
120.000 seres humanos se han vacunado de forma segura con MVA mediante inyecciones intrad�rmicas, subcutáneas o intramusculares. También se ha dado a conocer que MVA es avirulento entre animales normales e inmunodeprimidos (Mayr et al., Zentralb. Bakteriol. 167:375-90 (1978). En consecuencia, además de la utilidad como una vacuna contra la viruela, las cepas más atenuadas son poxvirus para uso como vectores para modulación inmunitaria y terapia g�nica.
En consecuencia, los poxvirus se pueden manipular genéticamente para contener y expresar ADN extraño, alterando o sin alterar la capacidad de los virus para replicarse. Tal ADN extraño puede codificar ant�genos proteicos que inducen una protección inmunitaria en un hospedante inoculado con tal poxvirus recombinante. Por ejemplo, se han manipulado virus vacunales recombinantes para expresar ant�genos inmunizantes del virus del herpes, hepatitis B, rabia, gripe, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), y otros virus (Kieny et al., Nature 312:163-6 (1984); Smith et al., Nature 302: 490-5 (1983); Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7155-9 (1983); Zagury et al., Nature 326:249-50 (1987); Cooney et al., Lancet 337:567-72 (1991); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992). También se ha demostrado que los virus vacunales recombinantes provocan respuestas inmunitarias frente al virus de la gripe, el virus del dengue, el virus sincitial respiratorio, y el virus de la inmunodeficiencia humana. Los poxvirus también se han usado para generar reacciones inmunitarias frente a ant�genos asociados a tumores, tales como CEA, PSA y MUC. Véase también la patente U.S. n� 5.656.465.
Scholl, S. et al. (J. Biomed. Biotech. 3 (2003), p. 194-201) describen el uso de terapia inmunitaria a base de MUC1 en cáncer de mama, en el que a pacientes con cáncer de mama metast�sico positivo a MUC1 se les administr� repetidamente un virus vacunal recombinante atenuado que contiene secuencias que codifican MUC1 humana y la citocina estimulante inmunitaria IL-2.
Hodge, J.W. et al. (Clin. Cancer. Res. 9 (2003), p. 1837-1849) describen la administración de un virus vacunal recombinante-CEA/[B7.1, ICAM-1, y LFA-3 (TRICOM)] mezclado con GM-CSF y seguido de IL-2 a ratones transg�nicos CEA transplantados con tumores que expresan CEA, y las administraciones de refuerzo con virus de la viruela aviar recombinante-CEA/TRICOM mezclado con GM-CSF y seguido de IL-2.
Todav�a existe la necesidad de tratamientos mejorados para el cáncer de mama. Sería particularmente ventajoso desarrollar un sistema de tratamiento que pudiese utilizar la información específica relacionada con ant�genos asociados a tumores expresados en diferentes c�nceres de mama. Además, sería útil desarrollar un sistema que se pudiese adaptar para tratar todos los tipos diferentes de c�nceres de mama, incluyendo un sistema que se pudiese adaptar o personalizar para tratar a un individuo específico.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha descubierto un nuevo medio para tratar cáncer de mama en seres humanos, que implica el uso de poxvirus recombinantes que contienen ant�genos asociados con cáncer de mama (BCAA) y moléculas moduladoras inmunitarias. En consecuencia, la presente invención proporciona un sistema para identificar individuos para identificar aquellos con riesgo de desarrollar o de sufrir cáncer de mama; preferiblemente, la identificación incluye identificar ant�genos específicos asociados con c�nceres de mama expresados por el individuo. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. El sistema también comprende administrar a ese individuo en riesgo de desarrollar o de sufrir cáncer de mama al menos un primer poxvirus recombinante (o sistema poxv�rico), y, a intervalos regulares, administrar después al menos un segundo poxvirus recombinante (o sistema poxv�rico), en el que los poxvirus recombinantes comprenden al menos un gen que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama. El ant�geno asociado con cáncer de mama preferido incluye CEA y MUC-1, y sus variantes incluyen wCEA(6D) y wMUC-1(6). Otras variantes preferidas tienen cambios de secuencia para crear un ep�topo de CTL más inmun�geno y/o una modificación de ácidos nucleicos para reducir el corte de secuencias de ácidos nucleicos durante recombinación homóloga, dando como resultado un gen más estable. Preferiblemente, el segundo poxvirus recombinante es de un género diferente del primer poxvirus recombinante. Los genes que codifican ant�genos asociados con cáncer de mama se insertan preferiblemente en una región no esencial del genoma poxv�rico. Los poxvirus preferidos incluyen orthopox, tales como el virus de la vacuna, y avipox, tal como viruela aviar y viruela del canario. Un sistema poxv�rico es aquel cuando se usa más de un vector poxv�rico para contener todos los BCAAs deseados y las moléculas moduladoras inmunitarias.
La invención también proporciona la coadministraci�n de factor estimulante de granulocitos y macr�fagos (GM-CSF) con los poxvirus recombinantes, as� como la coadministraci�n de moléculas moduladoras inmunitarias, tales como al menos una molécula coestimulante, tal como LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Preferiblemente, se usa una combinación de LFA-3, ICAM-1, y B7.1 (TRICOM™).
El sistema de la presente invención proporciona una nueva herramienta de tratamiento que se puede adaptar para seleccionar como dianas a diferentes tipos de células malignas usando los mismos bloques de construcción principales para permitir un régimen eficiente aunque direccionado específicamente para tratar los tumores de la mama. El sistema de la presente invención permite que el tratamiento se personalice al individuo particular y al
estado de morbidez. En una realización, el ant�geno de cáncer de mama usado se puede particularizar al paciente individual determinando qué ant�genos de cáncer de mama est�n siendo expresados en niveles elevados en las células cancerosas del paciente. Los ant�genos adecuados del cáncer de mama pueden incluir MAGE-3, MAGE-6, NY-ESO-1, Her2neu y p53, as� como ant�genos de cáncer de mama recientemente definidos, por ejemplo cinesina 2, factor 1 modulador del elemento TATA, proteína tumoral D52 y MAGE D, y nuevos productos g�nicos adicionales, por ejemplo NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, y NY-BR-96. Como alternativa, o además de, el tipo y etapa actual del cáncer de mama se pueden evaluar usando métodos histoqu�micos, inmunohistoqu�micos y genéticos. Este dato puede dar información adicional sobre la expresión antig�nica que se puede anticipar a medida que la enfermedad progresa. Tales ant�genos adicionales se pueden incluir en el vector poxv�rico.
Debido a su gran genoma, los poxvirus recombinantes según la presente invención se pueden construir como un único vehículo para suministrar todas las moléculas terapéuticamente necesarias, incluyendo ant�genos asociados con cáncer de mama y/o moléculas coestimulantes, en el mismo vector.
En una realización, el sistema comprende administrar a un individuo una “sensibilizaci�n” inicial con una composición que contiene uno o más poxvirus recombinantes, seguido de una o preferiblemente múltiples “revacunaciones” con una composición que contiene uno o más vectores poxv�ricos.
La vacunación de sensibilizaci�n inicial puede comprender uno o más vectores poxv�ricos. En una realización preferida, se usa un único vector poxv�rico para suministrar los PTAAs y moléculas coestimulantes. En otra realización, dos o más vectores poxv�ricos comprenden la vacunación de sensibilizaci�n, que se administra simultáneamente en una única inyección. Por ejemplo, administrando simultáneamente a un hospedante una mezcla de dos vectores poxv�ricos, al menos uno de los cuales es competente para la replicaci�n. Si ambos vectores son defectuosos en la replicaci�n, entonces no habr� tantas células que se verán transducidas por ambos virus. Un ejemplo de una estrategia de mezclamiento es usar un primer vector que comprende un ADN que codifica al menos un ant�geno asociado con cáncer de mama, y un segundo vector que comprende un ADN que codifica al menos una, preferiblemente tres, moléculas coestimulantes tales como TRICOM.
Las vacunaciones de refuerzo también pueden comprender uno o más vectores poxv�ricos. En una realización preferida, se usa un único vector poxv�rico para suministrar los PTAAs y moléculas coestimulantes de la vacunación de refuerzo. En otra realización, dos o más vectores poxv�ricos comprenden la vacunación de refuerzo, que se administran simultáneamente en una única inyección, como se describe anteriormente para la estrategia de mezclamiento.
En una realización preferida, se pueden usar diferentes poxvirus para proporcionar un protocolo de sensibilizaci�n/refuerzo heter�logo usando vectores poxv�ricos que poseen diferentes conjuntos de moléculas terapéuticas, para inoculaciones a diferentes intervalos. Una combinación preferida heter�loga de sensibilizaci�n/refuerzo es la sensibilizaci�n con una primera composición de vector orthopoxv�rico, y el refuerzo con una segunda composición de un vector avipoxv�rico. El vector de refuerzo se puede administrar cada 2-4 semanas, por ejemplo, durante un total de al menos 5-15 vacunaciones de refuerzo. Por ejemplo, un protocolo de 3 administraciones de virus de la vacuna a intervalos regulares, por ejemplo mensualmente, seguidas de múltiples administraciones de viruela aviar a intervalos regulares, por ejemplo mensualmente. En una realización preferida, el orthopox es el virus de la vacuna, más preferiblemente un virus de la vacuna tal como Wyeth o MVA o NYVAC. También se pueden añadir otros componentes al protocolo, tal como la administración adicional de refuerzo o de sensibilizaci�n de ADN o proteína. En una realización alternativa, los genes pueden estar en múltiples vectores poxv�ricos que se administran aproximadamente al mismo tiempo, en lugar de un único vector.
El ant�geno de cáncer de mama usado se personaliza preferiblemente según las necesidades de un paciente individual determinando qué ant�genos est�n siendo expresados a niveles elevados en las células cancerosas del paciente. El tipo y etapa presente del cáncer de mama se evalúa usando, por ejemplo, métodos histoqu�micos y/o inmunohistoqu�micos y/o un patrón de transcripción y/o análisis de mutación de las células cancerosas.
Se puede usar cualquier poxvirus con la presente invención. Se prefieren poxvirus atenuados o con replicaci�n alterada, tales como avipox, viruela del cerdo, y orthopox. En una realización preferida, el vector poxv�rico es virus de la vacuna Wyeth, MVA, o NYVAC.
En otra realización, el poxvirus recombinante que codifica el ant�geno o ant�genos asociados con cáncer de mama también codifica al menos una molécula coestimulante. Las moléculas coestimulantes son conocidas en la técnica, e incluyen B7 y otros activadores de CD4+ y CD8+. En una realización preferida, la molécula coestimulante es una combinación de ácidos nucleicos que codifican B7 (por ejemplo B7-1), ICAM-1, y LFA-3, que inducen activación de células T tanto CD4+ como CD8+. En una realización preferida, se añade un ácido nucleico que codifica OX40L al vector poxv�rico, además de la combinación de TRICOM.
En una realización preferida, tanto los ácidos nucleicos que codifican el ant�geno o ant�genos asociados con cáncer de mama seleccionado como la molécula o moléculas coestimulantes se insertan en el mismo vector poxv�rico.
En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos que codifican el ant�geno o ant�genos tumorales y la molécula o moléculas coestimulantes se insertan en dos vectores poxv�ricos diferentes. Los vectores poxv�ricos primero y
segundo pueden ser de diferentes géneros, permitiendo inoculaciones consecutivas de los dos vectores recombinantes sin invocar la reacción inmunitaria potencial del hospedante frente al vector v�rico. Los vectores poxv�ricos recombinantes primero y segundo se pueden administrar al individuo que lo necesite simultáneamente o a intervalos que oscilan de horas a días, o incluso semanas.
Por ejemplo, una realización del sistema usa una sensibilizaci�n/refuerzo personalizado para el estado enfermo. Por ejemplo, la sensibilizaci�n se puede dirigir a un amplio intervalo de ant�genos asociados con cáncer de mama, aprovechando la capacidad del genoma del poxvirus para alojar múltiples genes extraños. El refuerzo puede estar dirigido a ant�genos específicos para la etapa particular de la enfermedad. Por ejemplo, monitorizando la progresión de la enfermedad, se podría personalizar un refuerzo para generar una reacción inmunitaria específica que refleja la expresión antig�nica para esa etapa particular de la enfermedad.
En una realización preferida, el vector poxv�rico recombinante que codifica el ant�geno tumoral se administra primero, y después se administran TRICOM o TRICOM y OX40L. En otra realización, el vector poxv�rico recombinante que contiene la molécula o moléculas coestimulantes se administra antes de administrar el vector poxv�rico que contiene el ant�geno o ant�genos.
En una realización preferida, se administra GM-CSF al paciente antes de la administración inicial del ant�geno. GM-CSF se puede administrar usando un vector v�rico tal como un vector de poxvirus o una proteína aislada en una formulación farmacéutica. Existen mundialmente varias formas de fármaco de GM-CSF recombinante, incluyendo sargramostim, que se vende con la marca LEUKINE� en los Estados Unidos por Berlex, Inc.
En una realización preferida, los vectores poxv�ricos de la presente invención se usan en combinación con quimioterapia. En una realización preferida, el agente de la quimioterapia es docetaxel.
La presente descripción también comprende tratar cáncer de mama, que comprende realizar el perfil de expresión de una muestra de célula tumoral obtenida de un individuo, administrar un vector poxv�rico recombinante que comprende un primer conjunto de ant�genos tumorales y/o moléculas coestimulantes, seleccionado basado en el análisis de las células/tipo tumoral en la primera etapa del tratamiento, y administrar dichos vectores al individuo. Además, se realiza el perfil de expresión de las posibles células tumorales que quedan, para construir un segundo poxvirus recombinante que expresa un segundo conjunto de ant�genos asociados a tumores y/o moléculas coestimulantes para la administración al individuo.
La presente descripción también proporciona un sistema para prevenir o retrasar el comienzo de cáncer de mama en un individuo con riesgo elevado de desarrollar cáncer de mama, por ejemplo debido a una mutación hereditaria que predispone al individuo a cáncer de mama (por ejemplo, identificado usando un ensayo de identificación de cáncer de mama). El sistema comprende administrar al individuo con una predisposición a cáncer de mama un vector poxv�rico recombinante que codifica al menos un ant�geno tumoral específico para el factor de predisposición, y/o una o más moléculas coestimulantes. Preferiblemente, el ant�geno tumoral y las moléculas coestimulantes son codificados por el mismo vector poxv�rico recombinante. Como alternativa, se puede usar un sistema que comprende dos o más vectores poxv�ricos.
La presente descripción también proporciona un kit que comprende uno o más vectores poxv�ricos recombinantes que codifican cada uno al menos una molécula coestimulante, en un vehículo farmac�uticamente aceptable, y uno o más vectores poxv�ricos recombinantes que codifican al menos un ant�geno asociado con cáncer de mama, en un vehículo farmac�uticamente aceptable. El kit comprende además instrucciones sobre qué combinación de los poxvirus recombinantes “listos para el uso” es apropiada para tratar diferentes tipos y etapas de cáncer de mama. Como alternativa, el kit también comprende un componente de diagnóstico que comprende, por ejemplo, un chip de ADN de detección de mutaciones y/o un chip de ADNc que mide el patrón de expresión, para permitir la determinación del tipo y/o etapa del cáncer de mama procedente de una muestra biológica obtenida del individuo que necesita tratamiento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra el mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT2137, que se us� para la generación de la vacuna recombinante rV-MUC-1.
La Figura 2 muestra el vector rV-MUC-1 esquemático. pT2137 dirige la inserción de la secuencia codificante de MUC-1 en el gen TK, que est� situado en la región Hind III J del genoma del virus de la vacuna. El gen MUC-1 est� bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna. Además, se incluye el gen lacZ de E. coli, bajo el control del promotor C1 del virus de la viruela aviar, como una identificación para la progenie recombinante. Se us� un aislado purificado en placas procedente de la cepa Wyeth (New York City Board of Health) del virus de la vacuna como el virus parental para esta vacuna recombinante. La recombinación in vivo entre el vector plasm�dico y el ADN v�rico dio como resultado la formación de un virus recombinante en el que la secuencia del gen TK del virus de la vacuna se interrumpió mediante el gen MUC1, bajo la dirección transcripcional del promotor 40K, y el gen lacZ como bajo el control del promotor C1.
La Figura 3 muestra el mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT8016, que se us� para la
generaci�n de la vacuna recombinante rV-CEA(6D)/TRICOM.
La Figura 4 muestra el vector rV-CEA(6D)/TRICOM esquemático. rV-CEA(6D)/TRICOM se construyó vía recombinación homóloga in vivo entre el ADN del virus de la vacuna parental y un vector plasm�dico, pT8016 (véase la Figura 3), que contiene los genes CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. El vector plasm�dico también posee el gen lacZ de E. coli, que se insert� simultáneamente en el genoma recombinante con los genes CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Se us� un ensayo cromog�nico para !-galactosidasa, codificada por el gen lacZ, para seleccionar el candidato a vacuna final, que se verificó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica.
La Figura 5 muestra el mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT2187, que se us� para la generación de la vacuna recombinante rF-CEA(6D)/TRICOM.
La Figura 6 muestra el vector rF-CEA(6D)/TRICOM esquemático. rF-CEA(6D)/TRICOM se construyó vía recombinación homóloga in vivo entre el ADN de la viruela aviar parental y un vector plasm�dico que contiene los genes CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. El vector plasm�dico también posee el gen lacZ de E. coli, que se insert� simultáneamente en el genoma recombinante con los genes CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Se us� un ensayo cromog�nico para !-galactosidasa, codificada por el gen lacZ, para seleccionar el candidato a vacuna final, que se verificó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica.
La Figura 7 muestra la secuencia nucleot�dica de MUC-1 bamboleada usada en vectores de la presente invención, que incluye PANVAC-VF, también conocida como wMUC-1(6), como SEC ID NO:1.
La Figura 8 muestra la secuencia de amino�cidos de MUC-1 bamboleada usada en vectores de la presente invención, que incluye PANVAC-VF, también conocida como MUC-1(6), como SEC ID NO:2.
La Figura 9 muestra la secuencia nucleot�dica de CEA bamboleado usado en vectores de la presente invención, que incluye PANVAC-VF, también conocido como wCEA(6D), como SEC ID NO:3.
La Figura 10 muestra la secuencia de amino�cidos de CEA bamboleado usado en vectores de la presente invención, que incluye PANVAC-VF, también conocido como wMUC-1(6), como SEC ID NO:4.
La Figura 11 muestra el vector recombinante PANVAC-F esquemático. Para generar PANVAC-F, se usaron dos vectores plasm�dicos. El primer pl�smido, denominado pT1154, dirige la inserción de las secuencias codificantes de wCEA(6D) y wMUC-1(6) en la región FP 14 del genoma del virus de la viruela aviar. El segundo pl�smido, denominado pT8150, dirige la inserción de las secuencias codificantes de LFA-3, ICAM-1, y B7.1 (colectivamente conocidas como TRICOM) en la región BamH I J del genoma del virus de la viruela aviar. El gen wCEA(6D) est� bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna. El gen wMUC-1(6) est� bajo el control transcripcional del promotor temprano/tardío sintético (sE/L). El gen LFA-3 est� bajo el control transcripcional del promotor 30K del virus de la vacuna, el gen ICAM-1 est� bajo el control transcripcional del promotor I3 del virus de la vacuna, y el gen B7.1 est� bajo el control transcripcional del promotor temprano/tardío sintético (sE/L). Además, pT1154 contiene el gen lacZ de E. coli, bajo el control del promotor 40K del virus de la vacuna, que se incluye como una identificación para la progenie recombinante, y pT8150 contiene el gen GUS, bajo el control del promotor 7.5, para uso en la identificación de la progenie recombinante.
La Figura 12 muestra el vector recombinante PANVAC-V esquemático. Se us� una cepa de Wyeth (New York City Board of Health) del virus de la vacuna como el virus parental para esta vacuna recombinante, denominada TBC-vTRICOM. Este virus parental, denominado TBC-vTRICOM, contiene las secuencias codificantes de LFA-3, ICAM-1, y B7.1 insertadas en la región Hind III F del genoma del virus de la vacuna. La recombinación entre el vector plasm�dico y el ADN v�rico da como resultado la formación de un virus recombinante en el que el gen wCEA(6D), bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna, el gen wMUC-1(6), bajo el control transcripcional del promotor sE/L, y el gen lacZ, bajo el control del promotor 40K, se insertaron en la región Hind III J del genoma del virus de la vacuna. El gen lacZ de E. coli insertado estaba flanqueado por secuencias de poxvirus duplicadas. La recombinación intramolecular entre estas secuencias dio como resultado la supresión del gen lacZ. Los virus recombinantes, de los que se suprimió el gen lacZ, dieron lugar a placas incoloras que se seleccionaron y se purificaron en placas. El poxvirus recombinante purificado final contenía sólo los genes deseados que codifican las proteínas CEA, MUC-1, LFA-3, ICAM-1 y B7.1 y ningún gen marcador (lacZ).
La Figura 13 muestra el mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT1153, que se us� para la generación de la vacuna recombinante PANVAC-V. El vector plasm�dico pT1153 dirige la inserción de secuencias codificantes de CEA y MUC-1 modificadas en la región Hind III J del genoma del virus TBCvTRICOM. El gen CEA modificado, denominado wCEA(6D), est� bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna, y el gen MUC-1 modificado, denominado wMUC-1(6), est� bajo el control transcripcional del promotor sintético temprano/tardío (sE/L). El pl�smido también contiene una porción de la región Hind III J del virus de la vacuna, que codifica el gen de timidina cinasa (TK). Además, el gen lacZ de E. coli, bajo el control del promotor 40K del virus de la vacuna, est� incluido como una identificación transitoria
para la progenie recombinante.
La Figura 14 muestra la derivación del virus parental PANVAC-V, TBC-vTRICOM. Este virus deriv� de la cepa de la vacuna de Wyeth. En primer lugar, la vacuna de Wyeth se purificó en placas por Flow Laboratories, y después se expandió en células CV-1, para crear TBC-Wy. A continuación, el pl�smido pT1068 se insert� usando células CV-1, para suprimir F13L (37K), creando TBC-Wy-Delta37. Entonces se insertaron LFA-3, ICAM-1, B7.1 y F13L en este virus usando el pl�smido pT5132 en células CED, creando TBC-vTRICOM.
La Figura 15 muestra un repaso amplio de opciones de tratamiento típicas para cada etapa de cáncer de mama, incluyendo el número estimado de nuevos casos para 2004 y las tasas de supervivencia de 5 años estimadas (basadas en SEER Cancer Statistics Review, 1975-2001, NCDB, CoC, ACoS, American Cancer Society, AJCC Cancer Staging Manual, Quinta Edición).
DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha descubierto un nuevo medio para tratar cáncer de mama en seres humanos, que implica el uso de poxvirus recombinantes que contienen ant�genos asociados con cáncer de mama y moléculas moduladoras inmunitarias. En consecuencia, la presente invención proporciona un sistema para identificar individuos para identificar aquellos con riesgo de desarrollar o sufrir cáncer de mama; preferiblemente, la identificación incluye identificar ant�genos específicos asociados con cáncer de mama expresados por el individuo. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. El sistema también comprende administrar a ese individuo en riesgo de desarrollar o sufrir cáncer de mama al menos un primer poxvirus recombinante, y después, a intervalos regulares, administrar al menos un segundo poxvirus recombinante, en el que los poxvirus recombinantes comprenden al menos un gen que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama. El ant�geno asociado con cáncer de mama preferido incluye CEA y MUC-1, y sus variantes que incluyen wCEA(6D) y wMUC-1(6). La variantes preferidas tienen cambios de secuencia para crear un ep�topo de CTL más inmun�geno y/o cambios en la secuencia de ácido nucleico para reducir el corte durante la recombinación homóloga. Preferiblemente, el segundo poxvirus recombinante procede de un género diferentes del primer poxvirus recombinante. Los genes que codifican los ant�genos asociados con cáncer de mama se insertan preferiblemente en una región no esencial del genoma poxv�rico. Los poxvirus preferidos incluyen orthopox, tal como virus de la vacuna, y avipox, tal como viruela aviar y viruela del canario. Los ant�genos adecuados de cáncer de mama pueden incluir MAGE-3, MAGE-6, NY-ESO-1, Her2neu y p53, as� como ant�genos de cáncer de mama recientemente definidos, por ejemplo cinesina 2, factor 1 modulador del elemento TATA, proteína tumoral D52 y MAGE D, y nuevos productos g�nicos adicionales, por ejemplo NY-BR-62, NY-BR-75, NYBR-85, y NY-BR-96.
La invención también proporciona la coadministraci�n de un adyuvante tal como GM-CSF (por ejemplo, sargramostim) con los poxvirus recombinantes, as� como la coadministraci�n de moléculas moduladoras inmunitarias, tales como al menos una molécula coestimulante, tal como LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Preferiblemente, se usa la combinación de LFA-3, ICAM-1, y B7.1 (TRICOM).
En una realización preferida, el poxvirus que comprende al menos un ácido nucleico que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama también codifica al menos una molécula coestimulante o inmunoestimulante. Como alternativa, la molécula o moléculas coestimulantes y el ant�geno o ant�genos son codificados por un sistema de vector poxv�rico que comprende múltiples vectores poxv�ricos recombinantes.
El sistema de la presente invención proporciona una nueva herramienta de tratamiento que se puede adaptar para seleccionar como diana diferentes tipos de células malignas usando los mismos bloques de construcción principales para permitir un régimen eficiente pero direccionado específicamente a tratar los tumores de la mama. El sistema de la presente invención permite que el tratamiento se personalice al individuo particular y al estado mórbido. En una realización, el ant�geno de cáncer de mama usado se puede personalizar al paciente individual determinando qué ant�genos de cáncer de mama est�n siendo expresados en niveles elevados en las células cancerosas del paciente. Diferentes ant�genos asociados con cáncer de mama son expresados anormalmente o se expresan en niveles anormalmente elevados en las diferentes células cancerosas o precancerosas del individuo. Los ant�genos útiles según el sistema de la presente invención también se pueden seleccionar según el tipo y/o etapa de las células de cáncer de mama del paciente. Además, el ant�geno expresado por un individuo puede cambiar a medida que progresa la enfermedad. El tipo y la etapa actual del cáncer de mama se puede evaluar usando métodos histoqu�micos, inmunohistoqu�micos y genéticos. Este dato puede dar información adicional.
De este modo, los vectores se pueden personalizar para reflejar aquellos ant�genos expresados por los ant�genos de cáncer de mama expresados por el paciente individual, la etapa de cáncer de mama, y/o los ant�genos expresados a medida que progresa la enfermedad del paciente. En general, se usan datos farmacogen�ticos y farmacogen�micos, as� como datos inmunohistoqu�micos procedentes de las células del individuo, para determinar la selección de ant�genos preferidos asociados con cáncer de mama en el sistema de la presente invención. En una realización preferida, el paciente tiene más de un tipo de cáncer, y los ant�genos apropiados se seleccionan basándose en el cáncer específico expresado por el paciente.
Ant�genos asociados a tumor de mama
Cualquier ant�geno asociado con cáncer de mama se puede usar en el presente sistema de vectores. Hay numerosos ant�genos que est�n asociados con cáncer de mama, que se denominan aquí como ant�genos asociados con cáncer de mama (BCAAs), o TAAs. Los ant�genos asociados con cáncer de mama particularmente preferidos incluyen CEA y MUC-1, as� como otras mucinas tales como mini-MUC y MUC-4.
Los ant�genos adecuados de cáncer de mama pueden incluir MAGE-3, MAGE-6, NY-ESO-1, Her2neu y p53, as� como ant�genos de cáncer de mama recientemente definidos, por ejemplo cinesina 2, factor 1 modulador del elemento TATA, proteína tumoral D52 y MAGE D, y nuevos productos g�nicos adicionales, por ejemplo NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, y NY-BR-96.
Algunos ant�genos asociados con cáncer de mama preferidos, útiles según la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, mini-MUC (mini-MUC se refiere a variantes de MUC en las que se ha reducido el número de unidades de repetición en t�ndem); MUC-1 (Marshall et al., J. Clin. Oncol. 18:3964-73 (2000); HER2/neu; receptor de HER2 (documento US 5.772.997); mamoglobulina (documento US 5.922.836); labirintina (documento US 6.166.176); SCP1 (documento US 6.140.050); NY-ESO-1 (documento US 6.140.050); SSX-2 (documento US 6.140.050); citoqueratina soluble bloqueada N-terminal (documento US 4.775.620); ant�geno de cáncer humano de 43 kD (documento US 6.077.950); ant�geno asociado a tumor humano (PRAT) (documento US 6.020.478); ant�geno asociado a tumor humano (TUAN) (documento US 5.922.566); ant�geno L6 (documento US 5.597.707); ant�geno carcinoembri�nico (análisis de RT-PCR para el pronóstico de cáncer de mama en Clin Cancer Res 6:4176-85, 2000); poliadenilato polimerasa (PAP) (factor de pronóstico desfavorable independiente en Cancer Res 60:5427-33, 2000); p53 (Clin Cancer Res 6:3103-10, 2000); mdm-2 (Clin Cancer Res 6:3103-10, 2000); p21 (Clin Cancer Res 6:3103-10, 2000); CA15-3 (Eur J Gynaecol Oncol 21:278-81, 2000); oncoprote�na 18/estatmina (Op18) (Br J. Cancer 83:311-8, 2000); calicre�na glandular humana (hK2) (Breast Cancer Res Treat 59:263-70, 2000); ant�genos NY-BR (Cancer Immun. Mar 30; 1:4, 2001), proteína tumoral D52 (Cancer Immun. Mar 30; 1:4, 2001), y ant�geno específico de la pr�stata (Breast Cancer Res Treat 59:263-70, 2000). Todavía otros ant�genos preferidos asociados con cáncer de mama incluyen p�ptido de telomerasa, B899, y ant�genos STn, mammaglobina, CA 15-3, CA 125, NY-ESO1, y fragmento 19 de citoqueratina (CYFRA 21-1).
Adem�s, el número de ant�genos asociados con cáncer de mama aumenta constantemente, particularmente dados los avances usando técnicas de formación de perfiles gen�micos. Por ejemplo, se ha identificado a Epstil como un gen inducido por interacción epitelial-estr�mica en cáncer de mama humano (Publicación de Solicitud de Patente US n� 20040219551, publicada el 4 de noviembre de 2004). De forma similar, los perfiles de expresión g�nica de tejido de cáncer de mama humano se han usado para identificar grupos de genes, por ejemplo 50 genes, que est�n aumentados en células de cáncer de mama (véanse, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente US n� 20040214179, publicada el 28 de octubre de 2004; la Publicación de Solicitud de Patente US n� 20040209290, publicada el 21 de octubre de 2004). Cualquier ant�geno asociado con cáncer de mama se puede usar en los vectores poxv�ricos de la presente invención.
En una realización, el sistema vectorial de la presente invención tiene al menos un ant�geno asociado con cáncer de mama. Por ejemplo, MUC-1 o CEA. Incluso más preferiblemente, al menos dos ant�genos asociados con cáncer de mama. Por ejemplo, MUC-1 y CEA.
Se puede usar un único vector poxv�rico para expresar CEA, MUC-1, mini-MUC, etc., si se desea, o los ant�genos asociados con cáncer de mama se pueden expresar en múltiples vectores. También se pueden expresar múltiples copias de ciertos ant�genos asociados con cáncer de mama, ya sea en los mismos vectores o en múltiples vectores.
Un ant�geno asociado con cáncer de mama particularmente preferido es CEA. CEA es una glucoprote�na oncofetal que se expresa en niveles elevados en la superficie de casi todos los tumores del tubo digestivo, incluyendo carcinomas colorrectal, gástrico y de mama humanos, as� como en muchos carcinomas mamarios y adenocarcinomas pulmonares. Muraro et al., Cancer Res. 45:5769-89 (1985). En una realización, el CEA es un CEA de longitud completa. Un CEA particularmente preferido tiene una modificación en un ep�topo inmunodominante restringido HLA-A2. Este ep�topo, denominado CAP1-6d, o algunas veces CEA-6D, se une con afinidad potenciada al receptor e induce CTL in vitro más eficientemente que el ep�topo nativo. Estos CTL son capaces de lisar células tumorales humanas que expresan CEA nativo. Zaremba et al., Cancer Res. 57:4570-7 (1997). Otras variantes preferidas incluyen porciones de CEA que provocan una respuesta particular de MHC clase I o II. En algunas realizaciones, estas secuencias pueden estar enlazadas juntas. Se conocen patrones que provocan reacciones particulares de MHC clase I o MHC clase II. Adicionalmente, se pueden introducir cambios en la secuencia de ácido nucleico para hacer al gen más estable y menos tendente al corte durante la recombinación homóloga.
Una secuencia de CEA particularmente preferida se denomina wCEA(6D), secuencia la cual se representa en la Figura 9 como SEC ID NO:3.
Otro ant�geno asociado con cáncer de mama preferido es una mucina. Una mucina particularmente preferida es la mucina epitelial polim�rfica humana, denominada MUC-1. El polimorfismo de MUC-1 deriva de una variación en el número de secuencias de amino�cidos repetidas en t�ndem situadas en la porción extracelular de la glucoprote�na.
MUC-1 se expresa sobre la superficie apical de células epiteliales y glandulares normales. Los adenocarcinomas de mama y de ovario malignos glucosilan de forma aberrante, as� como también sobreexpresan MUC-1. La glucosilaci�n anormal expone ep�topos pept�dicos, haciendo a la mucina derivada del tumor antig�nicamente distinta de la mucina normal. Se han identificado respuestas de células T frente a MUC-1 en pacientes con cáncer de mama y ovárico. Jerome et al., Cancer Res. 51: 2908-16 (1991); Ioannides et al., J. Immunol. 151: 3693-3703 (1993).
En una realización, los vectores poxv�ricos de la presente invención contienen un fragmento de ADN que codifica un fragmento de MUC-1, algunas veces denominado como mini-MUC. El fragmento del gen MUC-1 codificar� una porción suficiente de MUC-1 para generar una reacción inmunitaria frente a MUC-1, pero no sufre corte amplio como resultado de recombinación homóloga. Preferiblemente, el fragmento tiene aproximadamente 5 a 25 unidades de repetición en t�ndem de MUC-1, más preferiblemente entre aproximadamente 6 y 15 unidades de repetición en t�ndem de MUC-1, y lo más preferible alrededor de 6 a 12 unidades de repetición en t�ndem de MUC-1. Un fragmento de MUC-1 inmunog�nico especialmente preferido tiene alrededor de 6 unidades de repetición en t�ndem de MUC-1. Se entiende que, como se usa aquí, la frase “aproximadamente 6-15 repeticiones en t�ndem de MUC-1” pretende incluir cada número posible de repeticiones en ese intervalo, es decir, un fragmento con 6 repeticiones en t�ndem; un fragmento con 7 repeticiones en t�ndem, etc., hasta e incluyendo un fragmento con 15 repeticiones en t�ndem. Los fragmentos de MUC-1 preferidos tienen la secuencia de ADN de MUC-1 humana. Un fragmento de MUC-1 preferido tienen seis repeticiones en t�ndem y la secuencia de ácido nucleico modificada como se explica más abajo, para reducir el corte de secuencias durante sucesos de recombinación. También se prefieren cualesquiera cambios, tales como aquellos diseñados para potenciar la inmunogenicidad. Una secuencia de ADN de MUC-1 ejemplar es la secuencia de ADNc de MUC-1 humana que tiene las unidades repetidas descritas, por ejemplo, por Gendler et al. (J. Biol. Chem. 265:15286-93 (1990)).
El ant�geno asociado con cáncer de mama, por ejemplo, las secuencias de repetición de mucina, se pueden alterar (algunas veces denominado bambolear) para minimizar la homología nucleot�dica sin cambiar la secuencia de amino�cidos. Por ejemplo, la secuencia nucleot�dica del segmento de ADN que codifica las repeticiones en t�ndem de mucina se altera a partir de la secuencia nativa de tal manera para reducir duplicaciones de los codones. Por ejemplo, los amino�cidos tienen típicamente dos o más codones que codificarán el mismo resto (por ejemplo, la glicina es codificada por GGT, GGA, GGG, o GGC). Usando otros codones que codifican el mismo amino�cido, se puede reducir adicionalmente la posibilidad de sucesos de recombinación indeseados que dan como resultado el corte al reducir la homología a nivel del ácido nucleico. Adicionalmente, también se pueden introducir algunos cambios de amino�cidos conservativos en diferentes grupos de las repeticiones en t�ndem para reducir adicionalmente la recombinación indeseada (por ejemplo, glicina/serina, valina/leucina), teniendo cuidado de no alterar un ep�topo pept�dico que reduciría su inmunogenicidad. La homología nucleot�dica también se puede reducir introduciendo cambios en la secuencia de amino�cidos, preferiblemente sustituciones de amino�cidos conservativas en algunas de las repeticiones en t�ndem.
Tambi�n se pueden introducir cambios en otros amino�cidos para potenciar la inmunogenicidad. Por ejemplo, una secuencia de MUC-1 particularmente preferida se denomina wMUC-1(6), secuencia la cual se representa en la Figura 7 como SEC ID NO:1. Esta variante contiene un cambio que convierte un cod�n de treonina en un cod�n de leucina, para crear un ep�topo de CTL más inmunog�nico, y 87 nucleótidos silenciosos que se introdujeron en la región de repetición para incrementar la estabilidad del gen de MUC-1 sin cambiar la secuencia de amino�cidos. Además, se observa un número de diferencias nucleot�dicas al comienzo y al final de la región de repetición entre wMUC-1(6) y la secuencia nucleot�dica de Genbank de MUC-1 (número de acceso J05581). Esto es debido a la degeneración de la secuencia repetida al comienzo y al final de la región de repetición. En contraste, el gen wMUC1(6) se dise�� para contener repeticiones idénticas sin degeneración. Otras diferencias nucleot�dicas, que consisten en 11 nucleótidos en 8 codones, son mutaciones silenciosas, y no dan como resultado cambios de amino�cidos.
Las composiciones farmacéuticas descritas aquí se pueden usar para el tratamiento de cáncer, particularmente para la inmunoterapia de cáncer de mama, como se describe con más detalle más abajo. Preferiblemente, primero se identifica el tumor para determinar qué tipo de cáncer tiene un paciente. Por ejemplo, con los vectores que contienen CEA y MUC descritos anteriormente, se pueden seleccionar individuos que tienen un cáncer de mama que expresa TAA. Si el individuo tiene c�nceres distintos o además de cáncer de mama, se pueden añadir ant�genos adicionales asociados a tumores que est�n asociados con esas afecciones.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para prevenir el desarrollo de un cáncer, particularmente en un individuo con mayor riesgo de desarrollar tal cáncer que otros individuos, o para tratar un paciente aquejado de cáncer de mama. Las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar antes o después de la eliminación quirúrgica de tumores primarios y/o del tratamiento tal como administración de radioterapia o fármacos quimioterap�uticos convencionales. Como se explica más abajo, la administración de las composiciones farmacéuticas puede ser mediante cualquier método adecuado, incluyendo administración por vías intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intranasal, intrad�rmica, anal, vaginal, típica y oral.
Pacientes/sujetos con cáncer de mama para administración
Las composiciones farmacéuticas descritas aquí se pueden usar para el tratamiento de cáncer, particularmente para
la inmunoterapia de cáncer de mama. En la presente invención, en primer lugar se identifica el paciente para determinar la presencia de cáncer de mama. Preferiblemente, también se identifica el paciente para determinar qué etapa de cáncer de mama tiene el paciente. El número estimado de nuevos casos de cada etapa de cáncer de mama, desde la etapa 0-IV, se muestra en la Figura 12. En otra realización preferida, se identifica el paciente para determinar qué ant�genos asociados con cáncer de mama est�n siendo expresados por las células tumorales del paciente, a fin de personalizar el tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas, vectores poxv�ricos y métodos de la presente invención se pueden usar para tratar a un individuo con cualquier tipo y/o etapa de cáncer de mama. Hay varios tipos de cáncer de mama. Además, hay varias etapas de cáncer de mama.
La presente invención se puede usar para tratar un paciente con cualquier tipo de cáncer de mama. Los c�nceres de mama incluyen carcinoma in situ, carcinoma ductal infiltrante (o invasivo), carcinoma lobular infiltrante (o invasivo), carcinoma medular, carcinoma coloideo, carcinoma tubular, y carcinoma inflamatorio.
En el carcinoma in situ, el cáncer todavía est� en los conductos o lóbulos en los que comenzó, y no se ha extendido a tejidos grasos circundantes en la mama o a otros órganos en el cuerpo. Hay 2 tipos de carcinoma de mama in situ. Carcinoma lobular in situ (LCIS): (también denominado neoplasia lobular) comienza en los lóbulos, pero no crece a través de las paredes de los lóbulos. La mayoría de los especialistas en cáncer de mama piensan que el propio LCIS no se convierte habitualmente en un cáncer invasivo, pero las mujeres con esta afección s� padecen un mayor riesgo de desarrollar un cáncer invasivo en cualquier mama. El carcinoma ductal in situ es el tipo más habitual de cáncer de mama no invasivo. Las células cancerosas dentro de los conductos no se extienden a través de las paredes de los conductos al tejido graso de la mama. éstas se tratan con cirugía y algunas veces radiación, lo que habitualmente es curativo. El hecho de tener DCIS sin tratar aumenta enormemente el riesgo de cáncer de mama invasivo.
El carcinoma ductal infiltrante (o invasivo) comienza en un pasaje, o conducto, de leche de la mama, pero entonces las células cancerosas pasan a través de la pared del conducto y se extienden al tejido graso de la mama. Entonces pueden invadir canales linfáticos o vasos sanguíneos de la mama y extenderse a otras partes del cuerpo. Alrededor del 80% de todos los c�nceres de mama son carcinoma ductal infiltrante o invasivo.
El carcinoma lobular infiltrante (o invasivo) (ILC) comienza en las glándulas productoras de leche. Al igual que el cáncer de mama ductal infiltrante, este cáncer se puede extender más all� de la mama a otras partes del cuerpo. Alrededor de 10% a 15% de los c�nceres de mama invasivos son carcinomas lobulares invasivos.
El carcinoma medular es un tipo especial de cáncer ductal infiltrante que tiene una frontera distinta, relativamente bien definida, entre tejido tumoral y tejido de mama normal. También tiene un número de otras características especiales, incluyendo el gran tamaño de las células cancerosas y la presencia de células del sistema inmunitario en los bordes del tumor. Da cuenta de alrededor del 5% de todos los c�nceres de mama.
El carcinoma coloideo es un tipo raro de cáncer de mama ductal invasivo, también denominado carcinoma mucinoso, formado por células cancerosas productoras de moco. El carcinoma coloideo tiene un pronóstico ligeramente mejor y una ocasión ligeramente menor de metástasis que los c�nceres lobular invasivo o ductal invasivo del mismo tamaño.
El carcinoma tubular es un tipo especial de carcinoma de mama ductal infiltrante. Alrededor del 2% de todos los c�nceres de mama son carcinomas tubulares. Las mujeres con este tipo de cáncer de mama tienen un mejor pronóstico debido a que es menos probable que el cáncer se extienda fuera de la mama que los c�nceres lobular invasivo o ductal invasivo del mismo tamaño.
El cáncer de mama inflamatorio es un tipo poco común de cáncer de mama invasivo que da cuenta de alrededor de 1-3% de todos los c�nceres de mama. La piel de la mama afectada es roja, est� caliente, y tiene el aspecto de piel de naranja. Estos cambios no est�n provocados por la inflamación, sino por las células cancerosas que bloquean los vasos linfáticos en la piel. El cáncer de mama inflamatorio tiene mayor ocasión de extenderse y un peor pronóstico que los c�nceres ductal o lobular invasivos t�picos. El cáncer de mama inflamatorio es clasificado siempre como etapa IIIB, excepto que ya se haya extendido a otros órganos en el momento del diagnóstico, lo que lo colocaría entonces en la etapa IV.
Adem�s de los diferentes tipos de cáncer de mama, también hay diferentes etapas de cáncer de mama, denominadas etapas 0-IV. El sistema usado más a menudo para describir el crecimiento y extensión de cáncer de mama es el sistema de clasificación de etapas TNM, también conocido como el sistema del American Joint Committee on Cancer (AJCC). En la clasificación de la etapa TNM, la información sobre el tumor, ganglios linfáticos cercanos, y metástasis de órganos distantes se combina, y se asigna una etapa a los agrupamientos de TNM específicos. Las etapas agrupadas se describen usando números romanos desde I hasta IV. La etapa clónica se determina mediante los resultados del examen físico y los ensayos. La etapa patológica incluye los hallazgos del pat�logo tras la cirugía. En la mayoría del tiempo, la etapa patológica es la etapa más importante debido a que habitualmente no se sabe que el cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos hasta que el pat�logo los examina bajo el microscopio. En el sistema de clasificación de etapas de TNM, T representa el tamaño del cáncer (medido en centímetros; 2,54 centímetros = 1 pulgada); N representa la extensión a los ganglios linfáticos en el área de la
mama, y M representa metástasis (extensión a órganos distantes del cuerpo).
La categoría T describe el tumor original (primario). Tis: Tis se usa sólo para carcinoma in situ o cáncer de mama no invasivo, tal como carcinoma ductal in situ (DCIS) o carcinoma lobular in situ (LCIS). T1: El cáncer tiene 2 cm de diámetro (alrededor de 3/4 pulgadas) o más pequeño. T2: El cáncer tiene más de 2 cm pero no más de 5 cm de diámetro. T3: El cáncer tiene más de 5 cm de diámetro. T4: El cáncer tiene cualquier tamaño y se ha extendido a la pared del pecho, a la piel, o a los ganglios linfáticos.
La categoría N se basa en cuál de los ganglios linfáticos cerca de la mama, si lo est�n, se ven afectados por el cáncer. N0: El cáncer no se ha extendido a los ganglios linfáticos. N1: El cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos bajo el brazo en el mismo lado que el cáncer de mama. Los ganglios linfáticos no se han unido todavía entre s� o al tejido circundante. N2: El cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos bajo el brazo en el mismo lado que el cáncer de mama y est�n unidos entre s� o al tejido circundante, o est�n alargados. O, se puede observar que el cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos mamarios internos (cerca del esternón), pero no a los ganglios linfáticos bajo el brazo. N3: El cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos por encima o justo por debajo de la clavícula en el mismo lado que el cáncer, y puede haberse extendido o no a los ganglios linfáticos bajo el brazo. O, el cáncer se ha extendido a los ganglios linfáticos mamarios internos y a los ganglios linfáticos bajo el brazo, ambos en el mismo lado que el cáncer.
Categor�as M: La categoría M depende de si el cáncer se ha extendido a cualesquiera tejidos y órganos distantes. M0: No se ha extendido el cáncer a distancia. M1: El cáncer se ha extendido a órganos distantes.
Agrupamiento de etapas para el cáncer de mama. Una vez que se han asignado las categorías T, N y M, esta información se combina para asignar una etapa global de 0, I, II, III, o IV. Una vez que se determinan T, N, y M, se combinan, y se asigna una “etapa” global de I, II, III, o IV. (Algunas veces, estas etapas se subdividen igualmente, usando letras tales como IIIA y IIIB). Los c�nceres de la etapa I son los menos avanzados, y a menudo tienen un mejor pronóstico (resultado de supervivencia). Los c�nceres de mayores etapas son a menudo más avanzados pero, en muchos casos, todavía se pueden tratar con éxito. El número estimado de nuevos casos en 2004 para cada etapa de cáncer de mama, desde la etapa 0-IV, se muestra en la Figura 15.
Etapa global
Categoría T Categoría N Categoría M
Etapa 0
Tis N0 M0
Etapa I
T1 N0 M0
Etapa IIA
T0 T1 T2 N1 N1 N0 M0 M0 M0
Etapa IIB
T2 T3 N1 N0 M0 M0
Etapa IIIA
T0 T1 T2 T3 T3 N2 N2 N2 N1 N2 M0 M0 M0 M0 M0
Etapa IIIB
T4 Cualquier N M0
Etapa IIIC
Cualquier T N3 M0
Etapa IV
Cualquier T Cualquier N M1
Hay tres tipos diferentes de clasificación de etapas. La clasificación clónica de etapas estima cuánto cáncer hay basándose en los resultados del examen físico, ensayos de formación de imágenes (rayos X, barridos de CT, etc.), y algunas veces biopsias de áreas afectadas. Para ciertos c�nceres, los resultados de otros ensayos, tales como ensayos de sangre, también se usan en la clasificación de las etapas. La clasificación patológica de las etapas sólo se puede realizar en pacientes que han pasado por cirugía para eliminar o explorar el grado del cáncer. Combina los
resultados de la clasificación clónica de las etapas (examen físico, ensayos de formación de imágenes, etc.) con los resultados de la cirugía. En algunos casos, la etapa patológica puede ser diferente de la etapa clónica (por ejemplo, si la cirugía muestra que el cáncer es más amplio que lo que se pens� que era previamente). A menudo se usa una reclasificaci�n de las etapas para determinar el grado de la enfermedad si reaparece (vuelve) un cáncer tras el tratamiento. Esto se hace para ayudar a determinar qué opción de tratamiento mejor sería en este momento.
En una realización preferida, los vectores poxv�ricos de la presente invención se usan para tratar pacientes con cáncer de mama de etapa IIIB, es decir, pacientes con varios tumores locales. Los vectores poxv�ricos de la presente invención se pueden usar conjuntamente con otros tratamientos, que se describen con detalle más abajo. Por ejemplo, el paciente de la etapa IIIB puede tener quimioterapia neoadyuvante para reducir el tamaño del tumor, seguido de lumpectom�a o de mastectom�a radical modificada, seguido de quimioterapia, terapia de radiación, o quimioterapia más terapia hormonal.
En una realización preferida, los vectores poxv�ricos de la presente invención se usan para tratar pacientes con cáncer de mama de etapa IV, es decir, pacientes con cáncer metast�sico.
En una realización, el paciente que tiene cáncer de mama ya ha fracasado en otros regímenes de tratamiento, por ejemplo quimioterapia.
Si el individuo tiene otros c�nceres, se a�adir�a preferiblemente ant�genos adicionales asociados con tumores, que est�n asociados con esas afecciones. En tales métodos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran a un paciente, típicamente a un animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano.
En una realización, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para prevenir el desarrollo de un cáncer, particularmente en un individuo con mayor riesgo de desarrollar tal cáncer que otros individuos, o para tratar un paciente afligido con cáncer de mama.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas se pueden administrar antes o después de la eliminación quirúrgica de tumores primarios y/o del tratamiento tal como administración de radioterapia o fármacos quimioterap�uticos convencionales. Como se explica más abajo, la administración de las composiciones farmacéuticas puede ser mediante cualquier método adecuado, incluyendo la administración por vías intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intrad�rmica, anal, vaginal, típica y oral.
El sistema de tratamiento del cáncer de mama que usa poxvirus recombinantes descritos aquí se puede usar para cualquier hospedante. Preferiblemente, el hospedante es un mamífero. Los mamíferos preferidos incluyen primates tales como seres humanos y chimpancés, animales domésticos tales como caballos, vacas, cerdos, etc., y mascotas tales como perros y gatos. Más preferiblemente, el mamífero hospedante es un primate o animal doméstico. Todavía más preferiblemente, el mamífero hospedante es un ser humano.
Vectores a la medida
En una realización, el sistema de la presente invención permite que el tratamiento se personalice al individuo particular y estado mórbido. En esta realización, el ant�geno asociado con cáncer de mama usado se puede personalizar al paciente individual determinando qué ant�genos est�n siendo expresados en niveles elevados en las células cancerosas del paciente.
Con el desarrollo de farmacogen�tica y de farmacogen�mica, ahora es factible obtener información detallada sobre el tipo de cáncer de mama que afecta a un individuo (Hedenfalk, I. et al. J. Trent. 2001. Gene-expression profiles in hereditary breast cancer. New England Journal of Medicine 344(Feb. 22):539).
El diseño a la medida de los ant�genos del cáncer de mama para ajustarse a las necesidades de un paciente individual se puede llevar a cabo usando información obtenida de, por ejemplo, análisis inmunohistoqu�mico de una biopsia de tumor de mama. Como alternativa, se puede llevar a cabo un análisis de matriz de ácidos nucleicos del perfil de expresión de la muestra de tumor de mama particular usando ARNm aislado procedente de la muestra de tejido de cáncer de mama como se describe en Pollack et al. (Proc Natl Acad Sci. USA 99:12963-12968, 2002).
Con el desarrollo de la farmacogen�tica y farmacogen�mica, ahora es factible obtener información detallada sobre el tipo de cáncer de mama que afecta a un individuo. En consecuencia, el tipo y etapa presente del cáncer de mama se pueden evaluar usando métodos histoqu�micos, inmunohistoqu�micos y genéticos. Este dato puede dar información adicional sobre la expresión del ant�geno que se puede anticipar a medida que progresa la enfermedad. De esta manera, se pueden añadir ant�genos adicionales asociados con cáncer de mama que se espera que sean expresados a medida que avanza la enfermedad para maximizar la respuesta inmunitaria.
Los ant�genos de cáncer de mama útiles según la presente invención se personalizan preferiblemente al paciente individual determinando qué ant�genos est�n siendo anormalmente expresados o expresados a niveles anormalmente elevados en las células cancerosas o precancerosas del individuo. Los ant�genos útiles según el sistema de la presente invención también se pueden seleccionar según la etapa de las células cancerosas. Generalmente, se usa farmacogen�tica y farmacogen�mica, as� como datos inmunohistoqu�micos procedentes de
las células individuales, para determinar la selección de ant�genos preferidos asociados con cáncer de mama en el sistema de la presente invención. En una realización preferida, el paciente tiene más de un tipo de cáncer, y los ant�genos apropiados se seleccionan basándose en el cáncer específico expresado por el paciente.
El diseño a la medida de los ant�genos de cáncer de mama para ajustarse a las necesidades de un paciente individual se puede realizar usando información obtenida de, por ejemplo, análisis inmunohistoqu�mico de una biopsia de tumor de mama. Como alternativa, se puede llevar a cabo un análisis de matriz de ácidos nucleicos del perfil de expresión de la muestra de tumor de mama particular usando ARNm aislado procedente de la muestra de tejido de cáncer de mama.
Otras matrices de ácidos nucleicos útiles adecuadas para diseñar a la medida los ant�genos para los métodos de la presente invención que usan vectores poxv�ricos incluyen, por ejemplo, una matriz de cáncer que permite la caracterización de perfiles de expresión de genes implicados en c�nceres de mama.
La administración del poxvirus recombinante de la invención puede ser profiláctica o terapéutica, dependiendo del sujeto. Cuando se proporciona profil�cticamente, el poxvirus recombinante de la presente invención se proporciona antes de la formación del tumor, para permitir que el sistema inmunitario del individuo luche contra un tumor que el individuo es susceptible de desarrollar. Por ejemplo, los individuos con susceptibilidad hereditaria al cáncer son un grupo preferido de pacientes tratados con tal inmunizaci�n profiláctica, y otro grupo es aquel que se ha expuesto a agentes medioambientales que est�n relacionados con tal cáncer o viven en un “punto caliente” o agrupamiento de tumores de mama. Tales individuos incluyen, por ejemplo, portadores de mutaciones que incluyen BRCA1 (Herencia Mendeliana del Hombre en Línea (OMIM) #113705) en 17q, BRCA2 (OMIM #600185) en 13q12, BRCATA (OMIM #600048) en 11q, BRCA3 (OMIM #605365) en 13q21, BWSCR1A (OMIM #602631) en 11p15.5, el gen TP53 (OMIM #191170) en 17p, el gen BRIP1 (OMIM #605882) en 17q22, y el gen RB1CC1 (OMIM #606837) en 8q11. Se han encontrado mutaciones en el gen del receptor de andr�genos (AR; OMIM #313700) en el cromosoma X en casos de cáncer de mama masculino (OMIM #313700.0016). Se encontr� una mutación en el gen RAD51 (OMIM #179617) en pacientes con cáncer de mama familiar (OMIM #179617.0001). Se ha demostrado que el alelo 1100delC del gen CHEK2 (OMIM #604373.0001) confiere una mayor susceptibilidad a cáncer de mama en mujeres, y especialmente en los hombres. Los genes NCOA3 (OMIM #601937) y ZNF217 (OMIM #602967), situados en 20q, sufren amplificación en cáncer de mama. Cuando se sobreexpresan, estos genes confieren fenotipos celulares consistentes con un papel en la formación de tumores (Anzick et al., Science 277: 965-968, 1997; Collins et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 8703-8708, 1998).
Mol�culas coestimulantes
Otra realización particularmente preferida proporciona la coadministraci�n de al menos una molécula coestimulante, incluyendo LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Preferiblemente, dos moléculas coestimulantes. Incluso más preferiblemente tres moléculas coestimulantes. Es muy preferido que los PTAA(s) se coadministren con LFA-3, ICAM-1, y B7.1 (TRICOM). Se pueden usar moléculas moduladoras inmunitarias adicionales tales como OX40L. Adicionalmente, en realizaciones alternativas, se puede administrar solamente una molécula coestimulante (por ejemplo B7, LFA-3, ICAM-1), o sus combinaciones, tales como B7.1 y LFA-3, B7.1 e ICAM-1, y LFA-3 e ICAM-1.
En una realización preferida, el poxvirus que comprende al menos un ácido nucleico que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama también codifica al menos una molécula coestimulante o inmunoestimulante. Como alternativa, la molécula o moléculas coestimulantes y el ant�geno o ant�genos est�n codificados por un sistema de vectores poxv�ricos que comprende múltiples vectores poxv�ricos recombinantes.
Un grupo preferido de ácidos nucleicos para la inserción en el poxvirus incluye moléculas coestimulantes, moléculas accesorias, y/o genes que codifican una citocina. Los términos “coestimulante” e “inmunoestimulante” se usan de forma intercambiable en esta memoria descriptiva. Los ejemplos de moléculas coestimulantes incluyen, pero no se limitan a, B7-1, B7-2, ICAM-1, LFA-3, CD72, OX40L (con o sin OX40), y similares. Los ejemplos de citocinas englobadas por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, IL-2, GM-CSF, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-12, RANTES, y similares. Las moléculas coestimulantes se pueden administrar usando un vector poxv�rico recombinante que codifica las moléculas coestimulantes o sin el vector como proteínas en un vehículo farmac�uticamente aceptable. Por ejemplo, los agonistas de OX40, incluyendo OX40L y anticuerpos frente a OX40, previenen la formación de tolerancia mediante la reacción inmunitaria a ant�genos presentados (Weinberg et al. J Immunol. 164:2160-2169, 2000). Por lo tanto, para incrementar la respuesta inmunitaria frente a un ant�geno, el sistema de la presente invención puede suministrar un poxvirus recombinante que expresa OX40L o un anticuerpo frente a OX40 en un vehículo farmac�uticamente aceptable antes, después o simultáneamente con el suministro de un vector poxv�rico recombinante que codifica un ant�geno asociado con cáncer. Para potenciar los efectos de OX40L, se puede añadir a un vector poxv�rico un ácido nucleico que codifica OX40. La secuencia de ácido nucleico de OX40 se puede obtener fácilmente a partir de la Entrez Nucleic Acid Database con un número de acceso AJ277151, y la secuencia de OX40L se puede obtener fácilmente a partir de la Entrez Nucleic Acid Database con un número de acceso SEG_AB042987S. Homo sapiens OX40...[gi:14279071].
No se tiene que usar un gen que codifica una proteína coestimulante completa o ant�geno asociado con cáncer de mama, sino más bien sólo el dominio deseado. Por ejemplo, si se desea una reacción inmunitaria, sólo es necesario
codificar el fragmento necesario para estimular la reacción inmunitaria.
En una realización preferida, se administra un vector poxv�rico que contiene B7, LFA-3 e ICAM-1 junto con el ant�geno asociado al tumor.
Los poxvirus que expresan B7-1, ICAM-1, y LFA-3 inducen activación tanto en células T CD4+ como CD8+. (Patente
U.S. n� 6.045.802; Hodge et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1228-39 (2000); Hodge et al., Cancer Research 59: 5800-07 (1999)). OX40 es un coestimulante primario de células T que han encontrado un ant�geno, en lugar de células T sin tratamiento, y promueve la expansión de células T después de que se induce la tolerancia de las células T. (Bansal-Pakal et al., Nature Med. 7: 907-12 (2001)). OX40L desempeña un papel durante la activación de células T a) sosteniendo la proliferaci�n a largo plazo de células T CD4+ y CD8+, b) potenciando la producción de citocinas Th1 tales como IL-2, IGN-∀, y TNF-# a partir de células T tanto CD4+ como CD8+ sin cambiar la expresión de IL-4, c) protegiendo las células T de la apoptosis. La combinación de B7-1, ICAM-1, LFA-3, y OX40L potencia la activación inicial, y después potencia adicionalmente la activación sostenida de células T sin tratamiento y efectoras.
Adyuvantes
Las formulaciones de vacuna de la presente invención pueden incluir cualesquiera composiciones adyuvantes. Las moléculas coestimulantes, moléculas accesorias, y citocinas de la presente invención son útiles como adyuvantes biológicos, que se pueden administrar sist�micamente al hospedante insertando ácidos nucleicos que codifican tales en los mismos vectores poxv�ricos recombinantes o diferentes. Como alternativa, los adyuvantes se pueden administrar mediante otros medios no vectoriales.
El adyuvante se puede administrar usando un vector v�rico o como una proteína aislada en una formulación farmacéutica. En una realización preferida, el adyuvante se administra como una proteína aislada, tal como una proteína recombinante.
En una realización preferida, los métodos de la presente invención proporcionan que el adyuvante se administre al paciente a aproximadamente a la vez que se administra al paciente el vector o vectores poxv�ricos. Los métodos de la invención también proporcionan la administración del adyuvante durante varios días antes o después de la administración del vector poxv�rico. Por ejemplo, el adyuvante se puede administrar cada día en el que se administre al paciente un vector poxv�rico, y cada día después durante alrededor de 1 a alrededor de 5 días. Preferiblemente, durante alrededor de 3 días.
En otra realización preferida, el adyuvante se administra al paciente antes de la administración inicial del ant�geno.
Se puede usar cualquier adyuvante junto con el presente sistema de vectores. Un adyuvante particularmente preferido es GM-CSF, que se ha demostrado que es un adyuvante de vacuna eficaz debido a que potencia el procesamiento y presentación de ant�genos por las células dendr�ticas. Estudios experimentales y cl�nicos sugieren que GM-CSF recombinante puede reforzar la inmunidad del hospedante dirigida a una variedad de inmun�genos. Morrissey, J. Immunol. 139:113-119 (1987); Dranoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-40 (1983); Vieweg, Cancer Res. 54:1760-65 (1994). Otro adyuvante preferido es una saponina y/o una molécula inmunoestimulante que contiene un dinucle�tido CG no metilado (patente U.S. n� 6.544.518).
Una realización preferida proporciona el uso de GM-CSF como adyuvante. Por ejemplo, el GM-CSF recombinante (sargramostim), vendido por Berlex Labs, Inc. con la marca LEUKlNE�. GM-CSF se puede administrar usando un vector v�rico o una proteína aislada en una formulación farmacéutica. En una realización particularmente preferida, la proteína de GM-CSF recombinante se administra al paciente en cada día de la vacunación con el vector o vectores poxv�ricos, y para cada uno de los siguientes tres días (es decir, un total de 4 días). Preferiblemente, se administran 50-500 ∃g de GM-CSF recombinante por día, por ejemplo 100 ∃g por día. Preferiblemente, el GM-CSF recombinante se administra subcut�neamente o cerca del sitio de la vacunación del poxvirus.
En otra realización, el gen que codifica GM-CSF o una variante activa conocida del mismo se inserta en un poxvirus
o en otro vector para el suministro del gen al hospedante.
Vectores poxv�ricos
Los poxvirus de la presente invención se denominan algunas veces aquí como vector v�rico o sistema vectorial, o simplemente un vector. Los poxvirus que tienen utilidad en la presente invención incluyen vectores replicantes y no replicantes. Tales poxvirus incluyen, pero no se limitan a, orthopox tal como virus de la vacuna, avipox, por ejemplo viruela aviar y viruela del canario, viruela del mapache, viruela del conejo y similar, suipox, por ejemplo viruela del cerdo, capropox, por ejemplo viruela de las ovejas, leporipox, e iridovirus. Otros virus de ADN incluyen iridovirus y similares.
Los poxvirus parentales útiles en el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, orthopoxvirus tales como virus de la vacuna replicante (Perkus et al Science 229:981-984, 1985; Kaufman et al Int. J. Cancer 48:900-907, 1991, Moss Science 252:1662, 1991), virus de la vacuna Wyeth, y virus de la vacuna muy atenuados tales como el virus de la vacuna de Ankara modificado (MVA) (Sutter y Moss, Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A.,
89:10847-10851; Sutter et al Virology 1994) o NYVAC; avipoxvirus tales como virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario, tales como ALVAC y similares (Baxby y Paoletti, Vaccine 10:8-9, 1992; Rinns, M.M. et al (Eds) Recombinant Poxviruses CRC Press, Inc, Boca Raton 1992-Paoletti, E. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 93:11349111353, 1996), y suipoxvirus, capripoxvirus, y similares.
Un virus de la vacuna preferido es una cepa de Wyeth o derivado de la misma. Un derivado de la cepa de Wyeth incluye, pero no se limita a, derivados que carecen de un gen K1L funcional, y similares. En todavía otra realización, el virus es DryVax, disponible como una vacuna de la viruela procedente del Centers for Disease Control, Atlanta, GA. En otra realización, el poxvirus parental es una cepa de la viruela aviar, por ejemplo POXVAC-TC (Schering-Plough Corporation), y similar.
El poxvirus de la presente invención es capaz de infectar, transfectar o transducir células hospedantes en un hospedante. El hospedante incluye, pero no se limita a, mamíferos, incluyendo seres humanos, pájaros, peces y similares. Las células hospedantes son cualquier célula susceptible de infección, transfecci�n o transducci�n por el poxvirus y capaces de expresar el poxvirus, incluyendo cualesquiera genes extraños insertados en él, a niveles funcionales.
El poxvirus de la presente invención tiene preferiblemente una baja eficiencia replicativa en la célula diana. Esto significa preferiblemente que no se producir� más de alrededor de 1 progenie por célula, todavía más preferiblemente, no más de 0,1 progenie por célula. La eficiencia de la replicaci�n se puede determinar fácilmente de forma empírica determinando el título del virus tras la infección de la célula diana.
Como resultado de la baja eficiencia de replicaci�n y de la naturaleza citopl�smica no integrante del vector, el sistema del vector no dar� como resultado la replicaci�n sostenida y la infección de otras células. De este modo, el vector poxv�rico y las células transformadas no afectarán de forma adversa a células en el animal hospedante en localizaciones distantes de donde se encuentra la célula diana.
Para asegurar además que el vector poxv�rico usado para un animal hospedante particular es avirulento en ese animal, se puede identificar fácilmente un vector v�rico observando el intervalo de hospedantes del virus y la especificidad tisular. Por ejemplo, un método sería observar un intervalo de hospedantes naturales del virus. Preferiblemente, el vector v�rico seleccionado procede de un virus cuyo intervalo primario de infección es para un animal hospedante distinto del animal en el que se va a usar el sistema de suministro g�nico. Por ejemplo, se puede usar viruela del cerdo como vector v�rico cuando el hospedante es un primate tal como un ser humano. Sin embargo, para fines veterinarios en los que el hospedante es un cerdo, no sería preferible. Sin embargo, se pueden usar ciertas cepas muy atenuadas o modificadas tales como orthopoxvirus modificado (por ejemplo, la cepa MVA o NYVAC del virus de la vacuna o cepas genéticamente modificadas o seleccionadas para ser no virulentas en su intervalo de hospedantes normal o en una célula hospedante deseada) que no son virulentas en su intervalo de hospedantes normal. También se puede usar la especificidad tisular para identificar de forma preliminar la infecciosidad y la eficiencia de la replicaci�n.
Cuando el hospedante es un ser humano, los vectores preferidos incluyen vectores poxv�ricos, por ejemplo suipox, tal como viruela del cerdo, avipox tal como viruela aviar, viruela del canario, o viruela de la paloma, y capripoxvirus. Además, también se prefieren iridovirus, tales como virus de la rana, y virus de la fiebre del cerdo africano. En una realización, los vectores v�ricos preferidos para uso con células humanas son poxvirus avirulentos, no l�ticos, tales como avipox (Taylor, et al., Vaccine, 6:497-503 (1985) y Jenkins, et al., AIDS Research And Human Retroviruses 7:991-998 (1991)) y suipox (Feller, et al., Virology 183:578-585 (1991)).
Seg�n la presente invención, cualquier ácido nucleico que codifique un ant�geno asociado con cáncer de mama y/o una molécula inmunoestimulante se puede insertar en el vector poxv�rico. Debido a que los poxvirus tienen un gran genoma, se pueden usar fácilmente para suministrar un amplio intervalo de material genético, incluyendo múltiples genes (es decir, actúan como un vector multivalente). Los tamaños de los vectores poxv�ricos oscilan entre alrededor de 130-300 kpb con hasta 300 genes, dependiendo de la cepa del virus. Por lo tanto, es posible insertar grandes fragmentos de ADN extraño en estos virus y todavía mantener la estabilidad del genoma v�rico. El tamaño del genoma poxv�rico permite la construcción de los vectores de “arco iris” diseñados a la medida que codifican combinaciones individualizadas de ant�geno/molécula inmunoestimulante para proporcionar un tratamiento diseñado a la medida para individuos con diferentes tipos o etapas de cáncer de mama.
En una realización, al menos se inserta en un vector poxv�rico un fragmento de ácido nucleico que codifica una molécula que tiene valor terapéutico en el tratamiento del cáncer de mama. En otra realización, al menos se insertan en el vector poxv�rico dos y hasta alrededor de diez ácidos nucleicos diferentes que codifican diferentes moléculas.
Por lo tanto, los vectores poxv�ricos recombinantes útiles según la presente invención codifican uno o más ant�genos asociados con cáncer de mama y, preferiblemente, también una o más moléculas coestimulantes se pueden evaluar
o tratar mediante métodos descritos en la presente solicitud. Por ejemplo, el gen que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama se incorpora en el genoma del poxvirus recombinante o porción del mismo junto con un gen que codifica una o más moléculas inmunoestimulantes. Como alternativa, el gen que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama y el gen que codifica una o más moléculas inmunoestimulantes se incorporan en poxvirus
recombinantes distintos. El ant�geno asociado con cáncer de mama se puede expresar sobre la superficie de una célula cancerosa, o puede ser un ant�geno interno. En una realización, el ant�geno asociado con el cáncer de mama es un ant�geno asociado a tumores (TAA) o una porción del mismo.
No hace falta usar un gen o ácido nucleico que codifica una proteína completa, sino más bien sólo el dominio deseado, para los genes que codifican los PTAAs, moléculas coestimulantes, moléculas accesorias, y citocinas de la presente invención. Por ejemplo, si se desea una reacción inmunitaria, sólo es necesario codificar el fragmento necesario para estimular la reacción inmunitaria.
Protocolos de sensibilizaci�n-refuerzo
La presente invención emplea un régimen de sensibilizaci�n-refuerzo, en el que un paciente recibe una “sensibilizaci�n” inicial con una composición que contiene uno o más vectores poxv�ricos, seguido de uno o preferiblemente múltiples “refuerzos” con una composición que contiene uno o más vectores poxv�ricos.
En un ejemplo de una sensibilizaci�n, un vector poxv�rico individual se usa para el suministro de los PTAAs y moléculas coestimulantes. En otra realización, dos o más vectores poxv�ricos comprenden la vacunación de sensibilizaci�n, que se administra simultáneamente en una única inyección. Por ejemplo, la administración simultánea a un hospedante de una mezcla de dos vectores poxv�ricos, al menos uno de los cuales es competente para la replicaci�n. Si ambos vectores son defectuosos para la replicaci�n, entonces no se verán transducidas tantas células por ambos virus. Un ejemplo de estrategia de mezclamiento es usar un primer vector que comprende un ADN que codifica al menos un ant�geno asociado con cáncer de mama, y un segundo vector que comprende un ADN que codifica al menos una, preferiblemente tres, moléculas coestimulantes tales como TRICOM.
Las vacunaciones de refuerzo también pueden comprender uno o más vectores poxv�ricos. En una realización preferida, un vector poxv�rico individual se usa para el suministro de los PTAAs y moléculas coestimulantes de la vacunación de refuerzo. En otra realización, dos o más vectores poxv�ricos comprenden la vacunación de refuerzo, que se administran simultáneamente en una única inyección. Por ejemplo, administrando simultáneamente a un hospedante una mezcla de dos vectores poxv�ricos, al menos uno de los cuales es competente para la replicaci�n. Si ambos vectores son defectuosos para la replicaci�n, entonces no habr� tantas células que ser�n transducidas por ambos virus. Un ejemplo de una estrategia de mezclamiento es usar un primer vector que comprende un ADN que codifica al menos un ant�geno asociado con cáncer de mama, y un segundo vector que comprende un ADN que codifica al menos una, preferiblemente tres, moléculas coestimulantes tales como TRICOM.
Por ejemplo, el individuo se puede inmunizar al menos una vez con un primer vector poxv�rico recombinante (sensibilizaci�n), tal como un vector poxv�rico que posee el PTAA y preferiblemente al menos una molécula inmunomoduladora o coestimulante. En una realización preferida, se usan TRICOM o TRICOM y OX40L o TRICOM y OX40L y OX40. Las inmunizaciones subsiguientes se consideran parte del protocolo de refuerzo. Preferiblemente, los refuerzos se llevan a cabo con un segundo vector poxv�rico recombinante usando un tipo diferente de poxvirus que codifica el ant�geno o ant�genos, y preferiblemente también la molécula o moléculas coestimulantes. Las inoculaciones se dan típicamente al menos un mes de diferencia. Se pueden incluir otras variaciones en el protocolo, incluyendo el uso de ADN que codifica el PTAA o una porción inmunog�nica del mismo, la administración directa del PTAA o una porción inmunog�nica del mismo, u otros vectores que contienen tales moléculas. Tal protocolo puede tener el p�ptido administrado como un refuerzo.
Preferiblemente, se usa un vector que no se replica o que tiene una replicaci�n defectuosa, tanto para la sensibilizaci�n como para el refuerzo. En una combinación preferida, el refuerzo es un orthopox, por ejemplo el virus de la vacuna, preferiblemente un virus de la vacuna tal como la cepa del virus de la vacuna Wyeth. La revacunación es preferiblemente un vector avipox, tal como viruela aviar o una viruela del canario tal como ALVAC.
En seres humanos, los vectores del virus de la vacuna que incluyen vectores de vacunas atenuadas tales como MVA y NYVAC se pueden administrar varias veces. Otros poxvirus, tales como avipox, no provocan una respuesta de anticuerpo neutralizante en seres humanos, y de este modo se pueden administrar repetidamente sin ningún efecto adverso. A la hora de planificar un protocolo, esto se debe tener en cuenta. Típicamente, con estos tipos de c�nceres, es necesaria la administración repetida. De este modo, se puede determinar si el sujeto ha sido expuesto previamente al virus de la vacuna (como en una vacuna de viruela), y a qué factor.
Un protocolo puede ser una sensibilizaci�n con un virus de la vacuna, tal como Wyeth o MVA, que codifica un PTAA(s) y al menos una molécula coestimulante, seguido de al menos 6 refuerzos con un avipox tal como viruela aviar que codifica un PTAA(s) y preferiblemente al menos una molécula coestimulante.
Como alternativa, las moléculas inmunoestimulantes se pueden administrar en un vehículo farmac�uticamente aceptable sin el vector poxv�rico. Por ejemplo, un anticuerpo frente a OX40 se puede administrar a un individuo antes, después o simultáneamente con la inoculación con un poxvirus recombinante que codifica un ant�geno asociado con cáncer.
En una realización preferida, el sistema de la presente invención comprende administrar a un hospedante un poxvirus recombinante que comprende un ADN que codifica al menos un ant�geno relacionado con cáncer de mama
y al menos una molécula coestimulante.
En una realización particularmente preferida, descrita adicionalmente más abajo como Ejemplo 11, el vector de sensibilizaci�n es el virus de la vacuna Wyeth que posee los genes para wMUC-1(6), wCEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1, y el vector de refuerzo es viruela aviar que posee los genes para wMUC-1(6), wCEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1.
En otra realización, la presente invención proporciona un sistema que comprende administrar simultáneamente a un hospedante una mezcla de dos vectores poxv�ricos, uno de los cuales es competente para la replicaci�n. Si ambos vectores son defectuosos para la replicaci�n, entonces no habr� tantas células que se verán transducidas por ambos virus. Un ejemplo de una estrategia de mezclamiento es usar un primer vector que comprende un ADN que codifica al menos un ant�geno asociado con cáncer de mama, y un segundo vector que comprende un ADN que codifica al menos una molécula coestimulante. En una realización preferida, los dos ADN diferentes se insertan en vectores poxv�ricos de diferentes géneros. Por ejemplo, el ADN que codifica el ant�geno o ant�genos asociados con cáncer de mama se inserta en un vector derivado de suipox, y el ADN que codifica la molécula o moléculas coestimulantes se inserta en un vector derivado de avipox.
El calendario para administrar los poxvirus de sensibilizaci�n y los virus de refuerzo incluyen típicamente la administración repetida a lo largo de intervalos regulares. El vector de refuerzo se puede administrar después de cada 2-4 semanas, por ejemplo durante un total de al menos 5-15 vacunaciones de refuerzo. Como se usa aquí, el número de refuerzos incluye todas las variantes dentro del intervalo de 5-15 refuerzos, incluyendo al menos 5, al menos 6, al menos 7 veces, etc. En una realización preferida, el sujeto recibe una vacunación con el vector se sensibilizaci�n, seguido después cada 2 semanas con el vector de refuerzo durante 6 refuerzos, seguido después por cada 4 semanas de refuerzos y continuando dependiendo de la progresión de la enfermedad.
El sistema de la presente invención es particularmente útil para generar reacciones inmunitarias mediadas por células frente a células cancerosas. En consecuencia, la presente descripción proporciona además un kit que tiene al menos un primer poxvirus recombinante que tiene incorporado en su genoma o porción del mismo un gen que codifica un ant�geno específico de células de cáncer de mama, en un vehículo farmac�uticamente aceptable. El primer poxvirus recombinante también puede comprender uno o más genes que codifican una o más moléculas inmunoestimulantes o coestimulantes. Se describe además un kit que tiene, además del primer poxvirus recombinante, un segundo poxvirus recombinante que comprende uno o más genes que codifican una o más moléculas inmunoestimulantes, en un vehículo farmac�uticamente aceptable. El kit proporciona además recipientes, agujas para inyección, e instrucciones sobre cómo usar el kit. Adicionalmente, el kit también puede comprender un componente de diagnóstico que incluye sistemas de detección de mutaciones y/o sistemas para realizar perfiles de expresión. En un aspecto, el kit proporciona además un adyuvante, tal como GM-CSF, y/o instrucciones para uso de un adyuvante comercialmente disponible con los componentes del kit adquirido.
Una célula hospedante infectada con ambos virus recombinantes expresa tanto el ant�geno o ant�genos de cáncer de mama como la molécula o moléculas inmunoestimulantes. El ant�geno se puede expresar en la superficie celular de la célula hospedante infectada. La molécula inmunoestimulante se puede expresar en la superficie celular, o se puede segregar activamente por la célula hospedante. La expresión tanto del ant�geno como de la molécula inmunoestimulante proporciona el p�ptido restringido a MHC necesario a células T específicas, y la señal apropiada de la célula T para ayudar en el reconocimiento y proliferaci�n del ant�geno o expresión clonal de células T específicas del ant�geno. El resultado global es un aumento del sistema inmunitario. En una realización preferida, el aumento de la respuesta inmunitaria es un incremento en linfocitos auxiliares T específicos del ant�geno y/o linfocitos citot�xicos, que son capaces de exterminar o inhibir el crecimiento de una célula de cáncer de mama. En la realización preferida, la molécula o moléculas inmunoestimulantes y el ant�geno o ant�genos de cáncer de mama se proporcionan en el mismo vector poxv�rico.
Construcci�n de vectores v�ricos
Las técnicas básicas para insertar genes en virus con conocidas por el experto, e implican, por ejemplo, la recombinación entre las secuencias de ADN v�rico que flanquean un gen en un pl�smido donante y las secuencias homólogas presentes en el virus parental (Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982)). Por ejemplo, un virus recombinante, tal como un poxvirus para uso en el suministro del gen, se puede construir en dos etapas conocidas en la técnica y análogas a los métodos para crear recombinantes sintéticos del virus de la viruela aviar descritos en la patente U.S. n� 5.093.258. Otras técnicas incluyen usar un sitio de endonucleasas de restricción único que est� naturalmente presente o artificialmente insertado en el vector v�rico parental.
En primer lugar, el ácido nucleico insertado en el virus se puede colocar en un pl�smido, por ejemplo un constructo plasm�dico de E. coli, en el que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN tal como la del poxvirus. De forma separada, la secuencia g�nica de ADN a insertar se liga a un promotor. El enlazamiento promotor-gen se coloca en el constructo plasm�dico de manera que el enlazamiento promotor-gen est� flanqueado en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una región del ADN del poxvirus que est� en la región de inserción deseada. El constructo plasm�dico resultante se amplifica entonces mediante crecimiento en bacterias de E. coli, y se aísla. Preferiblemente, el pl�smido también contiene un origen de replicaci�n, tal como el
origen de replicaci�n de E. coli, y un marcador tal como un gen de resistencia a antibióticos, para la selección y propagación en E. coli.
En segundo lugar, el pl�smido aislado que contiene la secuencia g�nica de ADN a insertar se transfiere a un cultivo celular, por ejemplo fibroblastos de embrión de pollito, junto con el poxvirus. La recombinación entre ADN de poxvirus homólogo en el pl�smido y el genoma v�rico da como resultado un poxvirus modificado por la presencia de un constructo de promotor-gen en su genoma, en un sitio que no afecta a la viabilidad del virus.
El gen se inserta en un sitio o región (región de inserción) en el virus que no afecta a la viabilidad v�rica del virus recombinante resultante. El experto puede identificar fácilmente tales regiones en un virus, por ejemplo, ensayando al azar segmentos de ADN v�rico en busca de regiones que permitan la formación recombinante sin afectar seriamente a la viabilidad v�rica del recombinante.
Una región de inserción que se puede usar fácilmente y est� presente en muchos virus es el gen de timidina cinasa, también denominado aquí como gen de TK. Por ejemplo, se ha encontrado en todos los genomas poxv�ricos examinados [leporipoxvirus: Upton, et al., J. Virology, 60:920 (1986) (virus del fibroma de Chope); capripoxvirus: Gershon, et al., J. Gen. Virol., 70:525 (1989) (oveja-1 de Kenia); orthopoxvirus: Weir, et al., J. Virol., 46:530 (1983) (virus de la vacuna); Esposito, et al., Virology, 135:561 (1984) (virus de la viruela del mono y de la viruela); Hruby, et al., PNAS, 80:3411 (1983) (virus de la vacuna); Kilpatrick, et al., Virology, 143:399 (1985)(virus del tumor del mono de Java); avipoxvirus: Binns, et al., J. Gen. Virol. 69:1275 (1988) (viruela aviar); Boyle, et al., Virology, 156:355 (1987) (viruela aviar); Schnitzlein, et al., J. Virological Methods, 20:341 (1988) (viruela aviar, viruela de la codorniz); entomopox (Lytvyn, et al., J. Gen. Virol. 73:3235-3240 (1992)].
En la viruela aviar, además de la región de TK, otras regiones de inserción incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a lo siguiente: el fragmento de BamHI J [Jenkins, et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998 (1991)] el fragmento de EcoRI-HindIII, fragmento de BamHI, fragmento de EcoRV-HindIII, fragmento de BamHI y el fragmento HindIII expuesto en la Solicitud EPO n� 0308220 A1. (Calvert, et al., J. of Virol. 67:3069-3076 (1993); Taylor, et al., Vaccine 6:497-503 (1988); Spehner, et al., (1990) y Boursnell, et al., J. of Gen. Virol. 71:621-628 (1990)). Otro poxvirus preferido útil según el sistema de tratamiento de la presente invención es un avipox, que incluye, pero no se limita a, viruela aviar, y viruela del canario, incluyendo ALVAC. Un virus avipox particularmente preferido es la viruela aviar.
Otros sitios de inserción de la viruela aviar particularmente preferidos de la presente invención se denominan el sitio de inserción de LUS, el sitio de inserción de FP14, y el sitio de inserción de 43K. Estos sitios también se denominan algunas veces como FPV006/FPV007 (sitio de inserción de LUS), FPV254/FPV255 (sitio de inserción de LUS), FPV060/FPV061 (sitio de inserción de FP14), y FPV107/FPV108 (sitio de inserción de 43K).
En una realización preferida, el sitio de inserción en la viruela aviar se denomina el sitio de inserción LUS. En la viruela aviar, hay dos secuencias únicas largas (LUS) en cada extremo del genoma v�rico (número de acceso de Genbank AF 198100), y de este modo hay dos sitios de inserción LUS en cada genoma. El sitio de inserción de LUS en el extremo izquierdo del genoma est� entre las posiciones 7470-7475 en la secuencia gen�mica de la viruela aviar, y se encuentra 3’ de FPV006 y 5’ de FPV007 125L. El sitio de inserción de LUS en el extremo derecho del genoma est� entre las posiciones 281065 y 281070 en la secuencia gen�mica de la viruela aviar, y se encuentra 5’ de FPV254 y 3’ de FPV255. En esta realización, un inserto que representa una secuencia de interés se puede insertar en cualquier posición dentro del sitio de inserción especificado.
En otra realización preferida, el sitio de inserción en la viruela aviar se denomina el sitio de inserción FP14. Este sitio est� entre las posiciones 67080-67097 en la secuencia gen�mica de la viruela aviar, y se encuentra en 5’ de FPV060 y 3’ de FPV061. En esta realización, la secuencia de ADN en el sitio de inserción específico, es decir, entre los nucleótidos, est� suprimida en el virus recombinante y se sustituye por insertos definidos que representan una secuencia de interés.
En todavía otra realización preferida, el nuevo sitio de inserción en viruela aviar se denomina el sitio de inserción 43K. Este sitio est� en la posición 128178 de la secuencia gen�mica de la viruela aviar, y se encuentra en 5’ de FPV107 y 5’ de FPV108. Estos genes se transcriben de forma divergente, y el sitio de inserción se encuentra entre los dos elementos promotores para los dos ORFs. En esta realización, un inserto que representa una secuencia de interés se puede insertar en esta posición dentro del genoma de la viruela aviar.
Las regiones de inserción de la viruela aviar particularmente preferidas son la región FP 14 y la región BamHI J. En un vector preferido, los ant�genos asociados con cáncer de mama CEA y MUC-1 se insertan en la región FP14, y las moléculas coestimulantes LFA-3, ICAM-1, y B7.1 se insertan en la región BamHI J.
En una realización preferida, el sitio de inserción en el virus de la vacuna se denomina sitio de inserción 44/45. Este sitio de inserción se identificó primeramente en MVA, en el que el sitio de inserción 44/45 se encuentra entre ORFs 044L y 045L, y el sitio de inserción est� entre las posiciones 37346-37357 en la secuencia gen�mica de MVA (número de acceso de Genbank U94848). Esta región est� 5’ del cod�n de partida traduccional de MVA 044L y 3’ del cod�n de parada traduccional de MVA 045L. En el virus de la vacuna Copenhague, para el sitio de inserción 44/45 los ORFs correspondientes son F14L (homólogo a MVA 044L) y F15L (MVA 045L), y el sitio de inserción est�
5’ del cod�n de partida traduccional del virus de la vacuna F14L y 3’ del cod�n de parada traduccional del virus de la vacuna F15L. El virus de la vacuna Copenhague, que contiene esta región y tiene secuencia disponible como número de acceso Genbank M35027, es un virus de la vacuna protot�pico. El sitio de inserción análogo a sitios tales como 44/45 también se puede usar en otras cepas del virus de la vacuna, incluyendo el virus de la vacuna Wyeth, NYVAC (en el que no se sabe que el sitio de inserción est� modificado) y TROYVAC. En esta realización, la secuencia de ADN en el sitio de inserción específico, es decir, entre los nucleótidos, est� suprimida en el virus recombinante y est� sustituida por insertos definidos que representan una secuencia de interés.
Otro sitio de inserción útil según la presente invención es el sitio de inserción en el virus de la vacuna denominado sitio de inserción 49/50. Este sitio de inserción se identificó primeramente en MVA, en el que el sitio de inserción 49/50 est� entre los ORFs 049L y 050L, y el sitio de inserción est� entre las posiciones 42687-42690 en la secuencia gen�mica de MVA (número de acceso Genbank U94848). Esta región est� 5’ del cod�n de partida traduccional de MVA 049L y 3’ del cod�n de parada traduccional de MVA 050L. En el virus de la vacuna Copenhague, para el sitio de inserción 49/50, los ORFs correspondientes son E2L (homólogo a MVA 049L) y E3L (MVA 050L), y el sitio de inserción est� 5’ del cod�n de partida traduccional de E2L del virus de la vacuna y 3’ del cod�n de parada traduccional de E3L del virus de la vacuna. El virus de la vacuna Copenhague es un virus de la vacuna protot�pico. De forma similar, el sitio de inserción 49/50 también se puede usar en otras cepas del virus de la vacuna, incluyendo NYVAC (en el que no se conoce que el sitio de inserción est� modificado) y TROYVAC. En esta realización, la secuencia de ADN en el sitio de inserción específico, es decir, entre los nucleótidos, est� suprimida en el virus recombinante y est� sustituida por insertos definidos que representan una secuencia de interés.
En todavía otra realización preferida, el sitio de inserción en el virus de la vacuna se denomina sitio de inserción 124/125. Este sitio de inserción se identificó primeramente en MVA, en el que el sitio de inserción 124/125 est� entre los ORFs 124L y 125L, y el sitio de inserción est� entre las posiciones 118481 – 118482 en la secuencia gen�mica de MVA (número de acceso Genbank U94848). Esta región est� 5’ del cod�n de partida traduccional de MVA 124L y 3’ del cod�n de parada traduccional de MVA 125L. En el virus de la vacuna Copenhague, para el sitio de inserción 124/125, los ORFs correspondientes son A13L (homólogo a MVA 124L) y A14L (MVA 125L), y el sitio de inserción est� 5’ del cod�n de partida traduccional de A13L del virus de la vacuna y 3’ del cod�n de parada traduccional de A14L del virus de la vacuna. De forma similar, el sitio de inserción 124/125 también se puede usar en otras cepas del virus de la vacuna, incluyendo NYVAC (en el que no se conoce que el sitio de inserción est� modificado) y TROYVAC. En esta realización, la secuencia de ADN en el sitio de inserción especificado, es decir, entre los nucleótidos, est� suprimida en el virus recombinante y est� sustituida por insertos definidos que representan una secuencia de interés.
Adem�s del requisito de que el gen est� insertado en un sitio de inserción, la expresión exitosa del gen o genes insertados por el poxvirus recombinante modificado requiere la presencia de un promotor enlazado operablemente al gen deseado, es decir, en la relación apropiada al gen insertado. El promotor se debe colocar de manera que est� situado en dirección 5’ del gen a expresar. Los promotores son bien conocidos en la técnica y se pueden seleccionar dependiendo del hospedante y del tipo celular que se desea seleccionar como diana.
Por ejemplo, en poxvirus, se pueden usar promotores poxv�ricos, incluyendo, pero sin limitarse a, el promotor 7.5K del virus de la vacuna, el promotor 30K del virus de la vacuna, el promotor 40K del virus de la vacuna, el promotor I3 del virus de la vacuna. Otros promotores preferidos incluyen el promotor temprano/tardío sintético (sE/L) y el promotor 7.5. También se pueden usar elementos potenciadores en combinación, para incrementar el nivel de expresión. Además, en algunas realizaciones se prefiere el uso de promotores inducibles, que también son bien conocidos en la técnica.
Los promotores útiles según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, promotores poxv�ricos tales como un promotor entomopox, un promotor avipox, o un promotor orthopox tal como un promotor del virus de la vacuna, por ejemplo, HH, 11K o Pi. Por ejemplo, el promotor Pi de la región Ava I H del virus de la vacuna, se describe en Wachsman et al., J. of Inf. Dis. 155, 1188-1197 (1987). Más particularmente, este promotor deriva del fragmento Ava I H(Xho I G) de la cepa del virus de la vacuna WR variante L, en el que el promotor dirige la transfecci�n de derecha a izquierda. La localización del promotor en el mapa es aproximadamente 1,3 Kpb (kilopares de bases) desde el extremo 5’ de Ava IH, aproximadamente 12,5 Kpb desde el extremo 5’ del genoma del virus de la vacuna, y alrededor de 8,5 Kpb de 5’ de la unión Hind III C/N. La secuencia del promotor Hind III H (también “HH” y “H6” aquí) est� en dirección 5’ del marco de lectura abierto H6 por Rosel et al., J. Virol. 60, 436-449 (1986). El promotor 11K es como se describe por Wittek, J. Virol. 49, 371-378 (1984) y Bertholet, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 20962100 (1985). Se puede aprovechar si el promotor es un promotor temprano o tardío para cronometrar la expresión de genes particulares. Adicionalmente, como se explica más abajo, se pueden usar promotores inducibles.
La presente invención también proporciona un vector poxv�rico en el que el promotor est� modulado por un factor o pista externo, que permite el control del nivel de polip�ptido que se produce por los vectores mediante la activación de ese factor o pista externo. Por ejemplo, las proteínas de choque térmico son proteínas codificadas por genes en los que el promotor est� regulado por la temperatura. El promotor del gen que codifica la proteína que contiene metal metalotione�na es sensible a iones Cd+. La incorporación de este promotor u otro promotor influido por pistas externas también hace posible regular la producción de las proteínas.
En otra realización preferida, el genoma poxv�rico se modifica para que posea un ácido nucleico que codifica un ant�geno asociado con cáncer de mama que est� operablemente enlazado a un promotor “inducible”. Tales sistemas inducibles permiten la regulaci�n cuidadosa de la expresión g�nica. Véase, Miller y Whelan, Human Gene Therapy, 8:803-815 (1997). La frase “promotor inducible” o “sistema inducible”, como se usa aquí, incluye sistemas en los que la actividad del promotor se puede regular usando un agente suministrado de forma externa. Tales sistemas incluyen, por ejemplo, sistemas que usan el represor lac de E. coli como modulador de la transcripción para regular la transcripción a partir de promotores de células de mamífero que poseen el operador lac (Brown et al. Cell, 49:603612, 1987); sistemas que usan el represor de tetraciclina (tetR) (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551, 1992; Yao et al., Human Gene Ther. 9:1939-1950, 1998; Shokelt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-6526, 1995). Otros de tales sistemas incluyen el d�mero FK506, VP16 o p65 que usa castradiol, RU486/mifepristona, difenol muristerona o rapamicina (véase, Miller y Whelan, más arriba, en la Figura 2). Aún otro ejemplo es un sistema inducible por ecdisona (véase, por ejemplo, Karns et al, MBC Biotechnology 1:11,2001). Los sistemas inducibles est�n disponibles, por ejemplo, de Invitrogen, Clontech, y Ariad. Se prefieren sistemas que usan un represor con el oper�n. Se podrían adaptar estos promotores sustituyendo porciones de los promotores poxv�ricos para el promotor de mamífero.
Una realización de la presente invención proporciona el uso de un elemento regulador tal como un elemento regulador transcripcional o un potenciador.
En una realización preferida de la presente invención, un “elemento regulador transcripcional” o “TRE” se introduce para la regulaci�n del gen de interés. Como se usa aquí, un TRE es una secuencia polinucleot�dica, preferiblemente una secuencia de ADN, que regula (es decir, controla) la transcripción de una secuencia polinucleot�dica enlazada operablemente mediante una ARN polimerasa para formar ARN. Como se usa aquí, un TRE aumenta la transcripción de una secuencia polinucleot�dica enlazada operablemente en una célula hospedante que permite que funcione el TRE. El TRE comprende un elemento potenciador y/o un elemento promotor poxv�rico, que puede derivar o no del mismo gen. Los componentes promotor y potenciador de un TRE pueden estar en cualquier orientación y/o distancia de la secuencia codificante de interés, y comprenden mult�meros de los anteriores, en tanto que se obtenga la actividad transcripcional deseada. Como se explica aquí, un TRE puede carecer o no de un elemento silenciador. Por ejemplo, el elemento regulador específico de la glándula mamaria proporciona un grupo de TRE útil según la presente invención. Un ejemplo es un promotor de alfa-lactalb�mina (ALA) humana (para el constructo específico, véase, por ejemplo, Anderson et al. Cancer Gene Ther 7:845-852, 2000).
Otra realización preferida de la presente invención proporciona un “potenciador” para la regulaci�n del gen de interés. Un potenciador es un término bien comprendido en la técnica, y es una secuencia polinucleot�dica derivada de un gen que incrementa la transcripción de un gen que est� enlazado operablemente a un promotor en un grado que es mayor que la activación de transcripción efectuada por el propio promotor cuando est� enlazado operablemente al gen, es decir, incrementa la transcripción desde el promotor.
La activación transcripcional se puede medir de muchas maneras conocidas en la técnica (y descritas con más detalle más abajo), pero generalmente se mide mediante detección y/o cuantificación de ARNm o el producto proteico de la secuencia codificante bajo control de (es decir, enlazada operativamente a) el elemento regulador. Como se explica aquí, el elemento regulador puede tener longitudes variables, y puede ser de composición de secuencia variable. Mediante activación transcripcional, se pretende que la transcripción se incrementar� por encima de los niveles basales en la célula diana en al menos alrededor de 2 veces, preferiblemente al menos alrededor de 5 veces, preferiblemente al menos alrededor de 10 veces, más preferiblemente al menos alrededor de 20 veces. Más preferiblemente al menos alrededor de 50 veces, más preferiblemente al menos alrededor de 100 veces, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 200 veces, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 400 a alrededor de 500 veces, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 1000 veces. Los niveles basales son generalmente el nivel de actividad, si la hay, en células no diana, o el nivel de actividad (si la hay) de un constructo informador que carece del TRE de interés según se ensaya en un tipo de célula diana.
En la presente invención, los vectores poxv�ricos dirigidos a células diana de cáncer específicas también se pueden generar con el uso de TREs que son preferentemente funcionales en las células tumorales diana. En esta realización, el vector o vectores poxv�ricos se administran directamente al sitio del tumor (es decir, inyecciones intratumorales), y se desea una reacción directa local. Los ejemplos no limitantes de TREs heter�logos específicos de células tumorales, y los ejemplos no limitantes de células de cáncer de mama diana potenciales respectivas, incluyen TREs de los siguientes genes: glucoprote�na similar a mucina DF3 (MUC-1), ant�geno carcinoembri�nico (CEA), urocinasa de activador de plasmin�geno (uPA) y su gen receptor (c�nceres de mama, colon e hígado), y HER-2/neu (c-erbB2/neu).
En la presente invención, los TREs específicos del tumor se pueden usar conjuntamente con TREs específicos del tumor tales como receptor del factor de crecimiento endotelial vascular. Otros TREs específicos tisulares son conocidos en la técnica.
Genes adicionales
Un grupo preferido de ácidos nucleicos para inserción en el vector poxv�rico útil según la presente invención codifica
anticuerpos. Los anticuerpos se han usado desde hace mucho tiempo en la ciencia biom�dica como herramientas in vitro para la identificación, purificación y manipulación funcional de ant�genos diana. Los anticuerpos se han explotado in vivo para aplicaciones tanto de diagnóstico como terapéuticas. En muchos casos se conocen el amino�cido específico e incluso las secuencias nucleot�dicas de las porciones relevantes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se puede producir un poxvirus que codifica al menos las CDRs de los fármacos contra el cáncer de tipo anticuerpo monoclonal rituximab, trastuzumab y cetuximab. Un poxvirus puede codificar anticuerpos tetr�meros de longitud completa o anticuerpos monocatenarios. En una realización, los avances recientes en ingeniería de anticuerpos han permitido ahora que se manipulen genes que codifican anticuerpos de manera que el dominio de unión al ant�geno se pueda expresar también intracelularmente. Estos anticuerpos se llaman “intracuerpos” (Marasco et al. Gene Therapy, 4:11-15, 1997; patentes U.S. nos 5.965.371; 5.851.829; 6.329.173; y 6.072.036). Preferiblemente, los ácidos nucleicos que codifican intracuerpos codifican un anticuerpo humanizado monocatenario. Un anticuerpo preferido es un anticuerpo contra OX40 como se describe anteriormente (intracuerpo de OX40).
Administraci�n de vectores poxv�ricos
La introducción del vector v�rico que posee el gen a suministrar a la célula hospedante diana se puede efectuar por cualquier método conocido por aquellos de pericia en la técnica.
La administración del poxvirus recombinante de la invención puede ser “profiláctica” o “terapéutica”, dependiendo del sujeto. Cuando se proporciona profil�cticamente, el poxvirus recombinante de la presente invención se proporciona antes de la formación del tumor, para permitir que el sistema inmunitario del individuo luche contra un tumor que el individuo es susceptible de desarrollar. Por ejemplo, los individuos con susceptibilidad a cáncer hereditario son un grupo preferido de pacientes tratados con tal inmunizaci�n profiláctica, otro grupo es aquel que se ha expuesto a agentes medioambientales que est�n relacionados con tal cáncer o viven en un “punto caliente” o agrupamiento de tumores de mama.
La administración profiláctica del poxvirus recombinante sirve para prevenir, mejorar o retrasar el cáncer de mama. Cuando se proporciona terapéuticamente, el poxvirus recombinante se proporciona en o después del diagnóstico de cáncer de mama. De este modo, la presente invención se puede proporcionar ya sea antes del cáncer de mama anticipado o después del inicio de la formación del tumor de mama.
Para la administración a un sujeto, el poxvirus de la presente invención se prepara como un in�culo. El in�culo se prepara típicamente como una disolución en un diluyente tolerable (aceptable) tal como disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato u otro diluyente fisiológicamente tolerable, y similar, para formar una composición farmacéutica acuosa. La formulación también puede contener glicerol al 10% como estabilizante o crioprotector, puesto que muchas preparaciones v�ricas requieren el almacenamiento en un estado congelado.
La vía de inoculación puede ser escarificaci�n, intravenosa (I.V.), intramuscular (I.M.), subcutánea (S.C.), intrad�rmica (I.D.), intraperitoneal (I.P.), intratumoral, y similar, que da como resultado la provocación de una respuesta protectora frente al agente que provoca la enfermedad. En una realización preferida, se usa la administración subcutánea. La dosis se administra al menos una vez. Se pueden administrar dosis subsiguiente según se indique.
El poxvirus se puede administrar directamente en el tumor, por ejemplo mediante inyección intratumoral, en el que se desea una reacción local directa, o el poxvirus se puede administrar en un sitio distinto del tumor, por ejemplo mediante inyección subcutánea. La inyección subcutánea ofrece conveniencia y es la vía de administración particularmente preferida.
A la hora de proporcionar a un mamífero con el poxvirus recombinante de la presente invención, preferiblemente un ser humano, la dosis de poxvirus recombinante administrado variar� dependiendo de factores tales como la edad, peso, altura, sexo, estado m�dico general, historial m�dico previo, progresión de la enfermedad, carga tumoral, y similares, del mamífero.
La expresión “dosis unitaria”, según pertenece al in�culo, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de poxvirus recombinante calculada para producir el efecto inmunog�nico deseado en asociación con el diluyente requerido. Las especificaciones para la nueva dosis unitaria de un in�culo de esta invención est�n dictadas por, y dependen de las características únicas del virus recombinante y del efecto inmunol�gico particular a lograr.
En general, es deseable proporcionar al receptor una dosis de virus recombinante en el intervalo de alrededor de 105 a alrededor de 1010 unidades formadoras de placas (pfu), aunque se puede administrar una dosis más pequeña o más grande. Una dosis preferida es alrededor de 2 x 108 pfu, por ejemplo en un volumen de alrededor de 0,5 ml.
Se podría inyectar una cantidad suficiente de los vectores v�ricos para obtener una concentración s�rica en el órgano de interés de la proteína que oscile entre alrededor de 1 pg/ml a 20 ∃g/ml. Más preferiblemente, entre alrededor de 0,1 ∃g/ml a 10 ∃g/ml. Todavía más preferiblemente, entre alrededor de 0,5 ∃g/ml y 10 ∃g/ml.
Los ejemplos de métodos para administrar el poxvirus recombinante a mamíferos incluyen, pero no se limitan a, exposición de las células tumorales al virus recombinante ex vivo, o inyección del virus recombinante en el hospedante afectado mediante administración intravenosa, S.C., I.D. o I.M. del virus. Como alternativa, el virus recombinante o combinaciones de vectores recombinantes se puede administrar localmente mediante inyección directa en la lesión cancerosa o tumor, o mediante aplicación típica en un vehículo farmac�uticamente aceptable. La cantidad de poxvirus recombinante que posee la secuencia de ácido nucleico de uno o más ant�genos en combinación con las secuencias de ácido nucleico que codifican múltiples moléculas coestimulantes a administrar se basa en el título de las partículas v�ricas. Un intervalo preferido del inmun�geno a administrar es alrededor de 105 a 1012 (por ejemplo, alrededor de 107 a 1010 unidades formadoras de placa (pfu) por sujeto. La equivalencia de pfu a partículas v�ricas difiere según el método de titulación de pfu específico usado, aunque habitualmente un pfu es igual a alrededor de 5 a 100 partículas v�ricas. Si el mamífero a inmunizar ya est� afectado con cáncer o cáncer metast�sico, la vacuna se puede administrar conjuntamente con otros tratamientos terapéuticos, tal como quimioterapia o radiación.
El calendario para la administración de los vectores poxv�ricos implica típicamente la administración repetida del vector de refuerzo, como se describe anteriormente. Por ejemplo, el vector de sensibilizaci�n inicial se puede administrar 1-3 veces, por ejemplo cada 2-4 semanas, durante un total de 6-12 semanas. El vector de refuerzo se administra entonces cada 2-4 semanas después, por ejemplo durante un total de al menos 5-15 vacunaciones de refuerzo. En una realización preferida, el sujeto recibe una vacunación con el vector de sensibilizaci�n, seguido después cada 2 semanas con el vector de refuerzo durante 6 refuerzos, seguido de cada 4 semanas después y continuando dependiendo del progreso de la enfermedad.
El sistema de la invención se puede usar ventajosamente en combinación con otro régimen de tratamiento para cáncer de mama. Los tratamientos para cáncer de mama son bien conocidos en la técnica, y continúan desarrollándose. Los tratamientos incluyen, pero no se limitan a, cirugía, incluyendo disecci�n axilar, biopsia del ganglio linfático centinela, cirugía reconstructiva, cirugía para aliviar los síntomas de cáncer avanzado, lumpectom�a (también denominada terapia de conservación de mama), mastectom�a parcial (segmentaria), mastectom�a simple o total, mastectom�a radical modificada, y mastectom�a radical; terapia hormonal usando un fármaco tal como tamoxifeno, que bloquea los efectos de estr�geno; inhibidores de aromatasa, que impiden que el cuerpo forme estr�genos; inmunoterapia, por ejemplo usando Herceptin™ (trastuzumab), y anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2, desarrollado para bloquear el receptor de HER2; transplante de médula ósea; terapia de células madre de sangre periférica; biofosfonatos; agentes de quimioterapia adicionales; terapia de radiación; acupresi�n; y acupuntura. Cualquier combinación de terapias se puede usar conjuntamente con la presente invención.
La Figura 12 proporciona un sumario amplio de opciones de tratamiento típicas para cada etapa de cáncer de mama, incluyendo el número estimado de nuevos casos para el año 2004 y las tasas de supervivencia de 5 años estimadas (basadas en SEER Cancer Statistics Review, 1975-2001, NCDB, CoC, ACoS, American Cancer Society, AJCC Cancer Staging Manual, Quinta Edición).
Contin�an desarrollándose nuevos tratamientos para c�nceres, incluyendo c�nceres de mama. Los vectores poxv�ricos de la presente invención se pueden usar con cualquiera de tales nuevas terapias. Por ejemplo, Gemzar, Tarceva, Avastina, y Targretina.
Los agentes de quimioterapia particularmente preferidos para uso en combinación con los vectores poxv�ricos de la presente invención incluyen doxorrubicina, paclitaxel, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida, y tamoxifeno.
En una realización particularmente preferida, el sistema del vector poxv�rico PANVAC™-VF, descrito más abajo en el Ejemplo 11 y en la Tabla 1, se usa en combinación con quimioterapia. En una realización preferida, el agente de quimioterapia es docetaxel.
El sistema de la presente invención es particularmente ventajoso a la hora de tratar individuos cuyas células cancerosas no son sensibles a hormonas y por lo tanto no responden a, por ejemplo, tratamiento con tamoxifeno o a ovariectom�a. La invención también se puede usar en el tratamiento de cáncer que no sobreexpresa HER2 y por lo tanto no es sensible al tratamiento anti-HER2. La invención también proporciona una opción de tratamiento útil para etapas tempranas de cáncer y cáncer recurrente. Otro cáncer diana útil es una forma heredada de cáncer de mama provocada por mutaciones, tales como las mutaciones descritas anteriormente.
Adem�s, como se sabe en la técnica, el diagnóstico del cáncer de mama se divide en diversas etapas, cáncer de mama inflamatorio y cáncer recurrente. La etapa temprana se denomina Etapa 0, que incluye carcinoma ductal in situ (DCIS) y carcinoma lobular in situ (LCIS) o más apropiadamente “neoplasia lobular”. DCIS es una neoplasia no invasiva de origen ductal que puede progresar hasta cáncer invasivo en algunos casos. Tradicionalmente, la mastectom�a se ha usado para tratar DCIS. Recientemente también se ha usado lumpectom�a (cirugía de conservación de mama) con terapia de irradiación consiguiente. No se sabe que LCIS sea una lesión premaligna, sino más bien un marcador que identifica a las mujeres con un riesgo creciente de desarrollo subsiguiente de cáncer de mama invasivo. Los pacientes son tratados a menudo con tamoxifeno, que se ha demostrado que previene la aparición de cáncer en grupos de riesgo. En algunos casos se lleva a cabo la mastectom�a total.
Por ejemplo, si el paciente se diagnostica con DCIS, el sistema de la presente invención se puede usar en combinación con lumpectom�a con o sin irradiación, preferiblemente sin irradiación. El sistema de la presente invención es particularmente útil a la hora de tratar LCIS en casos en los que la neoplasia no est� asociada con células precancerosas sensibles a estr�genos. El sistema de la presente invención se puede usar en combinación con o en lugar de terapia de tamoxifeno en pacientes diagnosticados con LCIS, preferiblemente en combinación con tamoxifeno, para evitar intervenciones quirúrgicas radicales y el sufrimiento físico y psicológico asociado por el paciente.
El tratamiento de cáncer de mama metast�sico implica habitualmente la terapia hormonal y/o la quimioterapia con o sin trastuzumab. La terapia de radiación y/o cirugía pueden estar indicadas para pacientes con metástasis sintom�ticas limitadas. La presente invención proporciona una herramienta adicional o alternativa a intervenciones quimioterap�uticas más tóxicas al proporcionar un sistema para provocar al propio sistema inmunitario del hospedante contra a las células tumorales. El sistema de la presente invención es particularmente útil para tratar etapas avanzadas del cáncer de mama (metast�sico) conjuntamente con agentes anti-angiog�nicos y/o terapia hormonal, debido a que tales agentes y terapia, a diferencia de los agentes quimioterap�uticos, no afectan de manera adversa al sistema inmunitario.
Otros ejemplos de fármacos anticancerosos que se pueden usar en las diversas realizaciones de la invención, incluyendo composiciones farmacéuticas y formas de dosificación y kits de la invención, incluyen, pero no se limitan
a: acivicina; aclarrubicina; hidrocloruro de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; hidrocloruro de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sodio; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; hidrocloruro de carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; hidrocloruro de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; hidrocloruro de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; hidrocloruro de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; hidrocloruro de epirrubicina; erbulozol; hidrocloruro de esorrubicina; estramustina; fosfato de estramustina sádica; etanidazol; etop�sido; fosfato de etop�sido; etoprina; hidrocloruro de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sodio; gemcitabina; hidrocloruro de gemcitabina; hidroxiurea; hidrocloruro de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo interleucina II recombinante, o rIL2), interfer�n alfa-2a; interfer�n alfa-2b; interfer�n alfa-n1 ; interfer�n alfa-n3; interfer�n beta-I a; interfer�n gamma-I b; iproplatino; hidrocloruro de irinotec�n; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; hidrocloruro de liarozol; lometrexol sodio; lomustina; hidrocloruro de losoxantrona; masoprocol; maitansina; mecloretamina, hidrocloruro de �xideo de mecloretamina, hidrocloruro de retamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfal�n; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; hidrocloruro de mitoxantrona; ácido micofen�lico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfano; hidrocloruro de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimer sodio; porfiromicina; prednimustina; hidrocloruro de procarbazina; puromicina; hidrocloruro de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; hidrocloruro de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sodio; esparsomicina; hidrocloruro de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sodio; tegafur; hidrocloruro de teloxantrona; temoporfina; tenip�sido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; hidrocloruro de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfm; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorrelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; hidrocloruro de zorrubicina, improsulfano, benzodepa, carboquona, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, clornafazina, novembiquina, fenesterina, trofosfamida, estermustina, clorozotocina, gemzar, nimustina, ranimustina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, aclacinomicinas, actinomicina F(1), azaserina, bleomicina, carubicina, carzinofilina, cromomicina, daunorrubicina, daunomicina, 6diazo-5-oxo-1-norleucina, doxorrubicina, olivomicina, plicamicina, porfiromicina, puromicina, tubercidina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, 6-mercaptopurina, ancitabina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, enocitabina, pulmozima, aceglatona, aldofosfamida gluc�sido, bestrabucilo, defofamida, demecolcina, elfornitina, acetato de eliptinio, etoglucida, flutamida, hidroxiurea, lentinano, fenamet, ácido podofil�nico, 2-etil-hidrazida, razoxano, espirogermanio, tamoxifeno, ácido tenuaz�nico, triaziquona, 2,2’,2”-triclorotrietilamina, uretano, vinblastina, vincristina, vindesina y agentes relacionados. 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarrubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevul�nico; amrrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiog�nesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética antidorsalizante 1; antiandr�geno, carcinoma prost�tico; antiestr�geno; antineoplastona; oligonucle�tidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores del gen de apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apur�nico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetr�n; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL;
benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betul�nico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; IL-2 de la viruela del canario; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxyimidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citol�tico; citostatina; dacliximab; decitabina; dehidrodidemnina B; deslorrelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamilo; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetr�n; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirrubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estr�geno; antagonistas de estr�geno; etanidazol; fosfato de etop�sido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; hidrocloruro de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolinio texafirina; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametilen bisacetamida; hipericina; ácido ibandr�nico; idarrubicina; idoxifeneo; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; p�ptidos immunostimulantes; inhibidor del receptor del factor 1 de crecimiento semejante a insulina; agonistas de interfer�n; interfer�nes; interleucinas; yobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetr�n; jasplacinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolestatina; letrozol; factor inhibidor de leucemia; alfa interfer�n de leucocitos; leuprolida+estr�geno+progesterona; leuprorrelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; p�ptido disac�rido lip�filo; compuestos de platino lip�filos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotec�n; lutecio texafirina; lisofilina; p�ptidos l�ticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasas de la matriz; menogarilo; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN bicatenario desemparejado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina factor de crecimiento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotrofina cori�nica humana; monofosforil lípido A+pared celular de miobacteria sk; mopidamol; inhibidor del gen de resistencia a múltiples fármacos; terapia a base de supresor 1 de múltiples tumores; agente de mostaza antic�ncer; micaper�xido B; extracto de pared celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas Nsustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; ácido neridr�onico; endopeptidasa neutral; nilutamida; nisamicina; moduladore de de óxido nítrico; antioxidante de nitr�xido; nitrulina; 06-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucle�tidos; onapristona; ondansetr�n; ondansetr�n; oracina; inductor de citosina oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; taxel; análogos de taxel; derivados de taxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidr�nico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; pentosan polisulfato de sodio; pentostatina; pentrozol; perflubr�n; perfosfamida; alcohol peril�lico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanilo; hidrocloruro de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador de plasmin�geno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfimer sodio; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; modulador inmunitario a base de proteína A; inhibidor de proteína cinasa C; inhibidores de proteína cinase C, microalgal; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucle�sido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polietileno y hemoglobina piridoxilado; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetr�n; inhibidores de ras farnesil proteína transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucle�tidos sentido; inhibidores de la transducci�n de señales; moduladores de la transducci�n de señales; proteína de unión a ant�geno de una sola cadena; sizofir�n; sobuzoxano; borocaptato sádico; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermina; ácido esparf�sico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; esqualamina; inhibidor de células madre; inhibodres de la división de células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina; esulfinosina; antagonista del p�ptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramin; swainsonina; glucosaminoglucanos sintéticos; talimustina; tamoxifeno metioduro; tauromustina; tazaroteno; tecogal�n sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenip�sido; tetraclorodeca�xido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinano; hormona estimulante de tiroide; estaño etil etiopurpurina; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de células madre totipotentes; inhibidores de la traducción; tretino�na; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetr�n; turosterida; inhibidores de tirosina cinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor de crecimiento deribado del seno urogenital; antagonistas del receptor de urocinasa; vapreotida; variolina B; sistema vectorial, terapia g�nica eritroc�tica; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorrelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y zinostatina estimalamer. Los fármacos contra el cáncer adicionales preferidos son 5-fluorouracilo y leucovorina. Las sustancias terapéuticas contra el cáncer adicionales incluyen anticuerpos monoclonales tales como rituximab, trastuzumab y cetuximab.
La magnitud de una dosis profiláctica o terapéutica de cada ingrediente activo en el tratamiento de un paciente con un tumor sólido variar� típicamente con los ingredientes activos específicos, la gravedad y tipo de tumor, y la vía de administración. La dosis y la frecuencia de la dosis pueden variar según la edad, peso corporal, respuesta, y la historia m�dica pasada del paciente; igualmente se debe considerar la probabilidad de recurrencia metast�sica. Los regímenes de dosificación adecuados se pueden seleccionar fácilmente por aquellos expertos en la técnica con la consideración debida de tales factores siguiendo, por ejemplo, dosificaciones dadas a conocer en la bibliografía y recomendadas en el Physician’s Desk Reference� (54� ed., 2000). Excepto que se indique de otro modo, la magnitud de una dosis profiláctica o terapéutica de cada sustancia farmacéutica usada en una realización de la invención ser� aquella que los expertos en la técnica saben que es segura y eficaz, o est� aprobada en la normativa.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un poxvirus recombinante, incluyendo un poxvirus recombinante, y un vehículo farmac�uticamente aceptable.
Adem�s de ser un sistema de tratamiento sin prácticamente efectos secundarios tóxicos, el efecto del material genético suministrado usando el sistema de la invención se puede monitorizar y regular fácil y cuidadosamente. Los vectores poxv�ricos preferidos, tales como viruela del cerdo, sólo expresan el material genético durante alrededor de dos semanas. De este modo, si se proporciona tratamiento eficaz dentro de ese marco de tiempo y debido a que el sistema vectorial es autolimitante, no se producir� material innecesario después de ese período de tiempo. Cuando se necesiten dosificaciones adicionales, la administración adicional del material se puede lograr repitiendo la inyección. Como se describe anteriormente, en ciertos casos, la adición de un segundo, tercer, etc., material antig�nico o inmunoestimulante también se puede añadir con los vectores subsiguientes.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: rV-MUC-1
rV-MUC-1 consiste en un virus de la vacuna recombinante vivo que expresa el ant�geno tumoral MUC-1 humano. MUC-1 est� sobreexpresado en un número de c�nceres, incluyendo mama, ovario, y carcinomas pancreáticos. Además, la glucosilaci�n anormal de MUC-1 en células de carcinoma hace a MUC-1 derivada de tumores antig�nicamente distinta de MUC-1 normal.
En resumen, el virus parental usado para la generación de la vacuna de rV-MUC-1 se fue un aislado en placas procedente del lote de siembra de virus usado por Wyeth para producir la vacuna de la viruela Dryvax� autorizada. rV-MUC-1 se construyó vía recombinación homóloga in vivo entre el ADN del virus de la vacuna parental y un vector plasm�dico que contiene el gen de MUC-1. El vector plasm�dico también tiene el gen lacZ de E. coli, que se insert� simultáneamente en el genoma recombinante con el gen de MUC-1. Se us� un ensayo cromog�nico para !galactosidasa, codificada por el gen lacZ, para seleccionar el candidato de vacuna final, que se verificó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica. El virus recombinante se us� entonces para generar un lote de virus maestro, que se caracterizó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica y mediante ensayo en busca de la potencia, esterilidad, micoplasma, y actividad de transcriptasa inversa. Todos los resultados de los ensayos han sostenido la identidad y seguridad del virus recombinante para uso en la producción de la vacuna.
El vector plasm�dico (pT2137) usado para la inserción del gen de MUC-1 en el genoma del virus de la vacuna parental mediante recombinación in vivo se ilustra en la Figura 1. Este vector contiene los siguientes elementos: (1) un origen de replicaci�n procariota para permitir la amplificación del vector en un hospedante bacteriano; (2) el gen que codifica resistencia al antibiótico ampicilina, para permitir la selección de las células hospedantes procariotas que contienen el pl�smido; (3) secuencias de ADN homólogas a la región Hind III J del genoma del virus de la vacuna, que dirige la inserción de secuencias extra�as en esta región vía recombinación homóloga; (4) un gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 40K del virus de la vacuna enlazado al gen de MUC-1; (5) un segundo gen quimérico que comprende el promotor transcripcional C1 de la viruela aviar enlazado al gen lacZ de E. coli.
El esqueleto plasm�dico, que incluye el origen bacteriano de replicaci�n y el gen de resistencia a ampicilina, deriv� del vector plasm�dico pUC8 mediante supresión de un fragmento Hae II de 442 pares de bases (pb) que contiene los poliligadores de pUC8 y el gen lacZ. Un ligador que contiene un único sitio Hind III se insert� en el sitio Nde I único en este vector para facilitar la clonaci�n adicional. Las secuencias de Hind III J del virus de la vacuna y el promotor 40K se aislaron de ADN gen�mico preparado a partir de la cepa WR (Panicali et al., 1981) del virus de la vacuna. Las secuencias de la región Hind III J, que flanquean los genes de MUC-1 y lacZ, incluyen un fragmento Dra I-EcoR I de 508 pb en dirección 5’ de la secuencia 40K-MUC-1, y un fragmento EcoR I-Dra I de 633 pb en dirección 3’ de la secuencia C1-lacZ. El elemento promotor 40K se aisl� como un fragmento Dra I-FnuD II de 161 pb a partir de la región Hind III H del virus de la vacuna (Rosel et al., J. Virol. 60:436-49 (1986)). El elemento promotor C1 se aisl� como un fragmento Sau3A I de 240 pb a partir del virus de la viruela aviar (Jenkins et al., 1991). El gen lacZ de E. coli se aisl� como un fragmento BamH I de 3100 pb a partir de pDP500 (Panicali et al., 1986).
El gen que codifica MUC-1 se aisl� en el Dana-Farber Cancer Institute a partir de una biblioteca de ADNc derivada de ARN procedente de la estirpe celular de carcinoma de mama MCF-7 (Siddiqui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2320-23 (1989)). Se us� una versión truncada del gen, que consiste en la secuencia señal, seis secuencias de
repetici�n en t�ndem relacionadas pero no idénticas, y la secuencia codificante única de 3’. El gen estaba contenido en un fragmento de 1831 pb que incluye la secuencia codificante truncada, 6 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 298 nucleótidos de la región no traducida de 3’ (Gendler et al., J. Biol. Chem. 265:15286-93 (1990)).
La estructura del vector de transferencia plasm�dico se verificó mediante digestión con endonucleasas de restricción usando Hind III y Xba I. Además, los productos de digestión con estas enzimas se sometieron a análisis de transferencia Southern usando sondas marcadas que corresponden al gen de MUC-1 y a las secuencias de Hind III J del virus de la vacuna. Los fragmentos de ADN visualizados mediante estos métodos tuvieron los tamaños predichos, y se demostr� inequívocamente la presencia del gen de MUC-1, confirmando as� la estructura predicha del pl�smido.
Se us� un aislado purificado en placas a partir de la cepa Wyeth (New York City Board of Health) del virus de la vacuna como el virus parental para esta vacuna recombinante. La recombinación in vivo entre el vector plasm�dico y el ADN v�rico dio como resultado la formación de un virus recombinante en el que la secuencia del gen TK del virus de la vacuna se interrumpió por el gen de MUC-1, bajo la dirección transcripcional del promotor 40K, y el gen lacZ, bajo el control del promotor C1, como se ilustra en la Figura 2.
Para identificar y aislar virus recombinantes que contienen las secuencias de lacZ y de MUC-1, se us� un ensayo cromog�nico para !-galactosidasa. Este método aprovecha la capacidad del virus de la vacuna para formar placas distintas cuando se hace crecer en monocapas celulares permisivas. Después de la recombinación in vivo, las células se infectaron con virus de la progenie hasta que fueron visibles placas distintas, en cuyo momento a las placas se les superpuso un sustrato cromog�nico para !-galactosidasa (Bluo-Gal™). Las placas v�ricas que expresan lacZ aparecen azul frente a un fondo claro. Las placas positivas se recogieron de la monocapa celular, y su progenie se propagó adicionalmente. Rondas repetidas de aislamiento de placas y recolocaci�n en presencia de Bluo-Gal dieron como resultado la purificación del recombinante deseado, que entonces se amplificó y se sometió a análisis de expresión gen�mica y proteica.
La estirpe de célula hospedante usada para la preparación del virus recombinante rV-MUC-1 fue la estirpe celular de ri��n de mono verde africano CV-1, obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC # CCL 70). Se establecieron bancos de células maestras y de trabajo (MCB y WCB) y se caracterizaron según las recomendaciones de Puntos a Considerar. Todos los datos apoyaron la seguridad de la estirpe celular para uso en la producción de la vacuna (BB-MF 6587, Volumen 1, p. 40-49 y Amendment # 2).
rV-MUC-1 se fabricó mediante inyección de células d�rmicas de embrión de pollo (CED) primarias, obtenidas de pollos libres de pat�genos específicos, con el virus recombinante. Las células CED se sembraron en botellas giratorias y se infectaron con el lote de virus maestro. Al final del período de infección, las células se cosecharon y las muestras se retiraron para el ensayo en el proceso. Las células se lisaron entonces congelando y descongelando para liberar el virus. El lisado celular se aclar� mediante centrifugaci�n a baja velocidad, y el virus se purificó mediante centrifugaci�n a través de una almohadilla de sacarosa al 36%. El virus a granel purificado se almacen� a 70�C o menos, hasta que se determin� el título. El virus a granel purificado se descongel� entonces, y la concentración se ajust� en consecuencia. El producto se suministr� as�pticamente en viales estériles y se almacen� a -70�C o menos.
El ensayo en el proceso y del producto final de rV-MUC-1 se llev� a cabo según 21 CFR Parte 610 y las recomendaciones de Puntos a Considerar. El producto a granel bruto se analizó para determinar la presencia de diversos contaminantes, incluyendo bacterias y hongos, micoplasma, M. tuberculosis, y virus inesperados. El ensayo in vitro para virus inesperados requirió un tratamiento especializado (dilución y neutralización) del material de ensayo a fin de eliminar la interferencia por el producto del virus de la vacuna. El recipiente final se ensay� para determinar la esterilidad, identidad (análisis de expresión gen�mica y proteica), potencia (titulación de virus), seguridad general, aspecto, y pureza. El ensayo de seguridad general se llev� a cabo usando una dilución 1:10 del material del recipiente final, nuevamente para eliminar la interferencia por el producto del virus de la vacuna. La caracterización adicional del producto incluyó la cuantificación de ADN s�rico y celular presente en el producto final, y la evaluación de la estabilidad de la vacuna.
El ensayo de seguridad precl�nica de rV-MUC-1 comprendió la evaluación de la neurovirulencia, que se evalu� mediante un ensayo de LD50 intracraneal estándar en ratones destetados. Los resultados indicaron que el producto fue menos neurovirulento que la vacuna de la viruela Dryvax autorizada, y apoyaron la seguridad de esta vacuna para la administración humana.
EJEMPLO 2: rV-CEA(6D)/TRICOM
rV-CEA(6D)/TRICOM consiste en un virus de la vacuna recombinante vivo que coexpresa una forma modificada de ant�geno carcinoembri�nico (CEA), ant�geno 3 asociado a la función leucocitaria (LFA-3), molécula 1 de adhesión intracelular (ICAM-1), y B7.1. CEA es una proteína oncofetal que est� sobreexpresada en carcinomas colorrectal, gástrico, pancreático, de mama, y de células pulmonares no pequeñas humanos. LFA-3, ICAM-1, y B7.1 son moléculas coestimulantes expresadas en células que presentan ant�geno que son requeridas para la activación eficaz de células T.
En resumen, el virus parental usado para la generación de esta vacuna fue un aislado en placas a partir del lote de siembra del virus usado por Wyeth para producir la vacuna de la viruela Dryvax� autorizada. Como se muestra en la Figura 4, rV-CEA(6D)/TRICOM se construyó vía recombinación homóloga in vivo entre el ADN del virus de la vacuna parental y un vector plasm�dico, pT8016 (véase la Figura 3), que contiene los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. El vector plasm�dico también posee el gen lacZ de E. coli, que se insert� simultáneamente en el genoma recombinante con los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Se us� un ensayo cromog�nico para !galactosidasa, codificada por el gen lacZ, para seleccionar el candidato de vacuna final, que se verificó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica. El virus recombinante se us� entonces para generar un lote de virus maestro, que se caracterizó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica y mediante ensayo para determinar la potencia, esterilidad, micoplasma, y actividad de la transcriptasa inversa. Todos los resultados de los ensayos apoyaron la identidad y seguridad del virus recombinante para uso en la producción de la vacuna.
El vector plasm�dico (pT8016) usado para la inserción de los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1 en el genoma del virus de la vacuna parental mediante recombinación in vivo se ilustran en la Figura 3. Este vector contiene los siguientes elementos: (1) un origen procariota de replicaci�n para permitir la amplificación del vector en un hospedante bacteriano; (2) el gen que codifica resistencia al antibiótico ampicilina, para permitir la selección de células hospedantes procariotas que contienen el pl�smido; (3) secuencias de ADN homólogas a la región Hind III J del genoma del virus de la vacuna, que dirigen la inserción de secuencias extra�as en esta región vía recombinación homóloga; (4) un gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 40K del virus de la vacuna enlazado al gen de CEA(6D); (5) un segundo gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 30K del virus de la vacuna enlazado al gen de LFA-3; (6) un tercer gen quimérico que comprende el promotor transcripcional I3 del virus de la vacuna enlazado al gen de ICAM-1; (7) un cuarto gen quimérico que comprende el promotor transcripcional sE/L enlazado al gen de B7.1; (8) un quinto gen quimérico que comprende el promotor transcripcional C1 de la viruela aviar enlazado al gen lacZ de E. coli.
El esqueleto plasm�dico de pT8016, que incluye el origen bacteriano de replicaci�n y el gen de resistencia a ampicilina, deriv� del vector plasm�dico pUC8 mediante supresión de un fragmento Hae II de 442 pares de bases (pb) que contiene los poliligadores de pUC8 y el gen lacZ. Un ligador que contiene un único sitio Hind III se insert� en el sitio único Nde I en este vector para facilitar la clonaci�n adicional. Las secuencias Hind III J del virus de la vacuna y las secuencias del promotor del virus de la vacuna se aislaron a partir de ADN gen�mico preparado a partir de la cepa WR del virus de la vacuna (Panicali et al., J. Virol. 37:1000-10 (1981)) o a partir de TBC-Wy. Las secuencias procedentes de la región Hind III J, que flanquean los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, B7.1 y lacZ, incluyen un fragmento Dra I-EcoR I de 508 pb en dirección 5’ de la secuencia de 40K-CEA(6D), y un fragmento EcoR I-Dra I de 633 pb en dirección 3’ de la secuencia C1-lacZ. El elemento promotor 40K se aisl� como un fragmento Dra I -FnuD II de 161 pb a partir de la región Hind III H20 de la cepa WR del virus de la vacuna. El elemento promotor 30K (M2L) se aisl� como un fragmento Sal I-Rsa I de 415 pb a partir de la región Hind III M del genoma del virus de la vacuna (Goebel et al., Virology 179:247-66 (1990)). El elemento promotor I3 se aisl� mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia de 201 pb inmediatamente en 5’ del cod�n de iniciación de la traducción del gen I3 (Schmitt et al., J. Virol. 62:1889-97)). El promotor sE/L se aisl� como un fragmento Hind III-Sal I de 60 pb a partir de pJS-8, un derivado de pSC65 (Chakrabarti et al., BioTechniques 23:1094-97 (1997). El elemento promotor C1 se aisl� como un fragmento Sau3A I de 240 pb a partir del virus de la viruela aviar (Jenkins et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 7:991-9 (1991)). El gen lacZ de E. coli se aisl� como un fragmento BamH I de 3100 pb a partir de pDP500 (Panicali et al., Gene 47:193-9 (1986)).
Las secuencias de CEA se aislaron a partir de un clon de ADNc humano procedente de una librería de ADNc de célula de carcinoma de colon construida en el National Cancer Institute (Kaufman et al., Int. J. Cancer 48:900-7 (1991)). El gen de CEA se alter� entonces mediante mutag�nesis in vitro para expresar proteína de longitud completa que contiene un ep�topo modificado. Esta mutación cambi� el amino�cido codificado en la posición 609 (en el que los amino�cidos se numeran comenzando en la primera metionina, incluyendo la secuencia líder) de asparagina a ácido asp�rtico. El gen modificado, denominado CEA(6D), se dise�� para potenciar la inmunogenicidad de CEA. El gen de CEA(6D) estaba contenido en un fragmento de 2109 pb que incluye toda la secuencia codificante para CEA y ninguna región no traducida de 5’ � 3’. El gen que codifica LFA-3 se aisl� en el National Cancer Institute mediante amplificación por PCR de Human Spleen Quick-Clone cDNA (Clontech Inc.) usando la secuencia publicada (Wallner et al., J. Exp. Med. 166:923-32 (1987)). El gen estaba contenido en un fragmento de 759 pb que incluye toda la secuencia codificante para LFA-3, 2 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 4 nucleótidos de la región no traducida de 3’. El gen que codifica ICAM-1 se aisl� en el National Cancer Institute mediante amplificación por PCR de ADNc transcrito de forma inversa a partir de ARN procedente de una estirpe de célula B transformada con el virus de Epstein-Barr derivada de un hombre sano, usando la secuencia publicada (Staunton et al., Cell 52:925-33 (1988)). El gen estaba contenido en un fragmento de 1721 pb que incluye toda la secuencia codificante para ICAM-1, 29 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 93 nucleótidos de la región no traducida de 3’. El gen que codifica B7.1 se aisl� en el National Cancer Institute mediante amplificación por PCR de ADNc derivado de ARN procedente de la estirpe celular Raji humana (ATCC # CCL 86), usando la secuencia publicada (Chen et al., Cell 71:1093-1102 (1992)). El gen estaba contenido en un fragmento de 1180 pb que incluye toda la secuencia codificante para B7.1, 22 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 291 nucleótidos de la región no traducida de 3’.
La estructura del vector de transferencia plasm�dico se verificó mediante digestión con endonucleasas de restricción. Además, los productos de la digestión se sometieron a análisis de transferencia Southern usando sondas marcadas que corresponden a los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1 y a las secuencias de Hind III J del virus de la vacuna. Los fragmentos de ADN visualizados mediante estos métodos fueron de los tamaños predichos, y la presencia de los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1 se demostr� inequívocamente, confirmando as� la estructura predicha del pl�smido.
Un aislado purificado en placa procedente de la cepa Wyeth (New York City Board of Health) del virus de la vacuna se us� como el virus parental para esta vacuna recombinante. La recombinación in vivo entre el vector plasm�dico y el ADN v�rico dio como resultado la formación de un virus recombinante en el que el gen de timidina cinasa estaba interrumpido por el gen de CEA(6D), bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna, el gen de LFA-3, bajo el control transcripcional del promotor 30K del virus de la vacuna, el gen de ICAM-1, bajo el control transcripcional del promotor I3 del virus de la vacuna, el gen de B7.1, bajo el control transcripcional del promotor sE/L, y el gen lacZ, bajo el control del promotor C1, como se ilustra en la Figura 4.
Para identificar y aislar virus recombinantes que contienen las secuencias de lacZ, CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1, se us� el método de !-galactosidasa cromog�nico (Bluo-Gal™) descrito en el Ejemplo 1, anteriormente.
Como se describe con detalle anteriormente en el Ejemplo 1, la estirpe celular hospedante usada para la preparación del virus recombinante rV-CEA(6D)/TRICOM fue la estirpe celular de ri��n de mono verde africano CV
1.
rV-CEA(6D)/TRICOM se fabricó, incluyendo el ensayo de seguridad de producto final y en proceso, mediante infección de células d�rmicas de embrión de pollo (CED) primarias con el virus recombinante, como se describe con detalle en el Ejemplo 1.
EJEMPLO 3: rF-CEA(6D)/TRICOM
rF-CEA(6D)/TRICOM consiste en un virus de la viruela aviar recombinante vivo que coexpresa una forma modificada de ant�geno carcinoembri�nico (CEA), ant�geno 3 asociado a la función leucocitaria (LFA-3), molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1), y B7.1. CEA es una proteína oncofetal que est� sobreexpresada en carcinomas de pulmón, colorrectal, gástrico, pancreático, de mama y de células no microc�ticas, humanos. LFA-3, ICAM-1, y B7.1 son moléculas coestimulantes expresadas en células que presentan ant�geno que son necesarias para la activación eficiente de células T.
En resumen, el virus parental usado para la generación de esta vacuna fue purificado en placa a partir de una cepa de FPV del virus de la vacuna adaptada a cultivo tisular. rF-CEA(6D)/TRICOM se construyó vía recombinación homóloga in vivo entre el ADN de la viruela aviar parental y un vector plasm�dico que contiene los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. El vector plasm�dico también posee el gen de lacZ de E. coli, que se insert� simultáneamente en el genoma recombinante con los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1. Se us� un ensayo cromog�nico para !-galactosidasa, codificada por el gen lacZ, para seleccionar el candidato de vacuna final, que se verificó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica. El virus recombinante se us� entonces para generar un lote de virus maestro, que se caracterizó mediante análisis de expresión gen�mica y proteica y mediante ensayo para determinar la potencia, esterilidad, micoplasma, y actividad de transcriptasa inversa. Todos los resultados del ensayo han apoyado la identidad y seguridad del virus recombinante para uso en la producción de la vacuna.
La generación de los virus de viruela aviar recombinantes se logra vía recombinación homóloga in vivo entre ADN de la viruela aviar y un vector plasm�dico que posee las secuencias heter�logas a insertar. El vector plasm�dico contiene uno o más genes quiméricos, comprendiendo cada uno un promotor poxv�rico ligado a una secuencia que codifica proteína, flanqueado por secuencias v�ricas de una región no esencial del genoma del virus de la viruela aviar. El pl�smido se transfecta en células infectadas con el virus de la viruela aviar parental, y la recombinación entre secuencias de la viruela aviar en el pl�smido y el ADN correspondiente en el genoma v�rico da como resultado la inserción en el genoma v�rico de los genes quiméricos en el pl�smido.
El vector plasm�dico (pT2187) usado para la inserción de los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1 en el genoma del virus de la viruela aviar parental mediante recombinación in vivo se ilustra en la Figura 5. Este vector contiene los siguientes elementos: (1) un origen procariota de replicaci�n para permitir la amplificación del vector en un hospedante bacteriano; (2) el gen que codifica resistencia al antibiótico ampicilina, para permitir la selección de células hospedantes procariotas que contienen el pl�smido; (3) secuencias de ADN homólogas a la región de BamH I J del genoma de la viruela aviar, que dirigen la inserción de secuencias extra�as en esta región vía recombinación homóloga; (4) un gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 40K del virus de la vacuna ligado al gen de CEA(6D); (5) un segundo gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 30K del virus de la vacuna ligado al gen de LFA-3; (6) un tercer gen quimérico que comprende el promotor transcripcional I3 del virus de la vacuna ligado al gen de ICAM-1; (7) un cuarto gen quimérico que comprende el promotor transcripcional sE/L ligado al gen de B7.1; (8) un quinto gen quimérico que comprende el promotor transcripcional C1 de viruela aviar ligado al gen de lacZ de E. coli.
El esqueleto plasm�dico, que incluye el origen bacteriano de replicaci�n y el gen de resistencia a ampicilina, deriv�
del vector plasm�dico pUC8 mediante supresión de un fragmento de Hae II de 442 pares de bases (pb) que contiene los poliligadores de pUC8 y el gen lacZ. Un ligador que contiene un único sitio de BamH I se insert� en el sitio único de Nde I en este vector para facilitar la clonaci�n adicional. Las secuencias de BamH I J de la viruela aviar (Jenkins et al., 1991) se aislaron a partir de ADN gen�mico preparado a partir de la cepa de la vacuna POXVAC-TC (Schering Corporation) del virus de la viruela aviar. Las secuencias de la región de BamH I J que flanquean los genes CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, B7.1 y lacZ incluyen un fragmento de BamH I-Bgl II de 850 pb en dirección 5’ de la secuencia de 40K-CEA(6D), y un fragmento de Bgl II-Xba I de 750 pb en dirección 3’ de la secuencia de C1-lacZ. El elemento del promotor 40K se aisl� como un fragmento de Dra I-FnuD II de 161 pb a partir de la región de región Hind III H (Rosel et al., 1986) de la cepa WR del virus de la vacuna (Panicali et al., 1981). El elemento del promotor 30K (M2L) se aisl� como un fragmento de Sal I-Rsa I de 415 pb de la región de Hind III M del genoma del virus de la vacuna (Goebel et al., 1990). El elemento del promotor I3 se aisl� mediante amplificación con reacción de cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia de 201 pb inmediatamente 5’ al cod�n de iniciación de la traducción del gen I3 (Schmitt et al., J. Virol. 62:1889-97 (1988)). El promotor sE/L se aisl� como un fragmento de Hind III-Sal I de 60 pb a partir de pJS-8, un derivado de pSC65 (Chakrabarti et al., 1997). El elemento del promotor C1 se aisl� como un fragmento de Sau3A I de 240 pb a partir del virus de la viruela aviar (Jenkins et al., 1991). El gen lacZ de E. coli se aisl� como un fragmento de BamH I de 3100 pb a partir de pDP500 (Panicali et al., 1986).
Las secuencias de CEA se aislaron a partir de un clon de ADNc humano procedente de una librería de ADNc de células de carcinoma de colon construida en el National Cancer Institute (Kaufman et al., 1991). El gen de CEA se alter� entonces mediante mutag�nesis in vitro para expresar proteína de longitud completa que contiene un ep�topo modificado. Esta mutación cambi� el amino�cido codificado en la posición 609 de asparagina a ácido asp�rtico (en el que los amino�cidos se numeran comenzando en la primera metionina, incluyendo la secuencia líder). El gen modificado, denominado CEA(6D), se dise�� para potenciar la inmunogenicidad de CEA. El gen de CEA(6D) estaba contenido en un fragmento de 2109 pb que incluye toda la secuencia codificante para CEA y ninguna de las regiones no traducidas de 5’ � 3’. El gen que codifica LFA-3 se aisl� en el National Cancer Institute mediante amplificación por PCR de Human Spleen Quick-Clone cDNA (Clontech Inc.) usando la secuencia publicada (Wallner et al., 1987). El gen estaba contenido en un fragmento de 759 pb que incluye toda la secuencia codificante para LFA-3, 2 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 4 nucleótidos de la región no traducida de 3’. El gen que codifica ICAM1 se aisl� en el National Cancer Institute mediante amplificación por PCR de ADNc transcrito de forma inversa a partir de ARN procedente de una estirpe de célula B transformada con el virus de Epstein-Barr derivada de un hombre sano, usando la secuencia publicada (Staunton et al., 1988). El gen estaba contenido en un fragmento de 1721 pb que incluye toda la secuencia codificante para ICAM-1, 29 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 93 nucleótidos de la región no traducida de 3’. El gen que codifica B7.1 se aisl� en el National Cancer Institute mediante amplificación por PCR de ADNc derivado de ARN procedente de la estirpe celular Raji humana (ATCC # CCL 86), usando la secuencia publicada (Chen et al., 1992). El gen estaba contenido en un fragmento de 1180 pb, que incluye toda la secuencia codificante para B7.1, 22 nucleótidos de la región no traducida de 5’, y 291 nucleótidos de la región no traducida de 3’.
La estructura del vector de transferencia plasm�dico se verificó mediante digestión con endonucleasas de restricción. Además, los productos de la digestión se sometieron a análisis de transferencia Southern usando sondas marcadas que corresponden a los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1 y a las secuencias de BamH I J de la viruela aviar. Los fragmentos de ADN visualizados mediante estos métodos fueron de los tamaños predichos, y la presencia de los genes de CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1 se demostr� inequívocamente, confirmando as� la estructura predicha del pl�smido.
Se us� un aislado purificado en placas a partir de la cepa de la vacuna POXVAC-TC del virus de la viruela aviar como el virus parental para esta vacuna recombinante. La recombinación in vivo entre el vector plasm�dico y el ADN v�rico dio como resultado la formación de un virus recombinante en el que el gen de CEA(6D), bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna, el gen de LFA-3, bajo el control transcripcional del promotor 30K del virus de la vacuna, el gen de ICAM-1, bajo el control transcripcional del promotor I3 del virus de la vacuna, el gen de B7.1, bajo el control transcripcional del promotor sE/L, y el gen lacZ, bajo el control del promotor C1, se insertaron en la región de BamH I J del genoma del virus de la viruela aviar, como se ilustra en la Figura 6.
Para identificar y aislar virus recombinantes que contienen las secuencias de lacZ, CEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1, se us� el método de !-galactosidasa cromog�nico (Bluo-Gal™) descrito en el Ejemplo 1, anteriormente.
Como se describe con detalle anteriormente en el Ejemplo 1, la estirpe celular hospedante usada para la preparación del virus recombinante rF-CEA(6D)/TRICOM fue la estirpe celular de ri��n de mono verde africano CV
1.
rF-CEA(6D)/TRICOM se fabricó, incluyendo el ensayo de seguridad de producto final y en proceso, mediante infección de células d�rmicas de embrión de pollo (CED) primarias con el virus recombinante, como se describe con detalle en el Ejemplo 1.
EJEMPLO 4: PANVAC™-F
PANVAC-F consiste en el virus de la viruela aviar recombinante vivo que coexpresa una forma modificada (flotante)
de MUC-1, MUC-1(6), una forma modificada (flotante) de ant�geno carcinoembri�nico, wCEA(6D), ant�geno 3 asociado a la función leucocitaria (LFA-3), molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1), y B7.1. La secuencia nucleot�dica de MUC-1 flotante usada en PANVAC-F, también conocida como wMUC-1(6), se muestra en la Figura 7 como SEC ID NO:1; la secuencia de amino�cidos correspondiente de wMUC-1(6) se muestra en la Figura 8 como SEC ID NO:2. La secuencia nucleot�dica de CEA flotante usado en PANVAC-F, también conocido como wCEA(6D), se muestra en la Figura 9 como SEC ID NO:3; la secuencia de amino�cidos correspondiente de wCEA(6D) se muestra en la Figura 10 como SEC ID NO:4.
La generación de virus de viruela aviar recombinantes se logra vía recombinación homóloga in vivo entre ADN de viruela aviar y un vector plasm�dico que posee las secuencias heter�logas a insertar. Como se describe anteriormente, el vector plasm�dico contiene uno o más genes quiméricos, comprendiendo cada uno un promotor poxv�rico enlazado a una secuencia codificante de proteína, flanqueada por secuencias v�ricas de una región no esencial del genoma del virus de la viruela aviar. El pl�smido se transfecta en células infectadas con el virus de la viruela aviar parental, y la recombinación entre las secuencias de la viruela aviar en el pl�smido y el ADN correspondiente en el genoma v�rico da como resultado la inserción en el genoma v�rico de los genes quiméricos en el pl�smido.
Para la generación de la vacuna recombinante PANVAC-F, se usaron dos vectores plasm�dicos. El primer pl�smido, denominado pT1154, dirige la inserción de las secuencias codificantes de wCEA(6D) y wMUC-1(6) en la región FP 14 del genoma del virus de la viruela aviar. El segundo pl�smido, denominado pT8150, dirige la inserción de las secuencias codificantes de LFA-3, ICAM-1, y B7.1 (colectivamente conocidas como TRICOM) en la región de BamH I J del genoma del virus de la viruela aviar. El gen de wCEA(6D) est� bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna. El gen de wMUC-1(6) est� bajo el control transcripcional del promotor temprano/tardío sintético (sE/L). El gen de LFA-3 est� bajo el control transcripcional del promotor 30K del virus de la vacuna, el gen de ICAM-1 est� bajo el control transcripcional del promotor I3 del virus de la vacuna, y el gen de B7.1 est� bajo el control transcripcional del promotor temprano/tardío sintético (sE/L). Además, pT1154 contiene el gen de lacZ de E. coli, bajo el control del promotor 40K del virus de la vacuna, que se incluye como una identificación para la progenie recombinante, y pT8150 contiene el gen GUS, bajo el control del promotor 7.5, para uso en la identificación de la progenie recombinante.
Como el virus parental para esta vacuna recombinante, se us� un aislado purificado en placa procedente de la cepa de la vacuna POXVAC-TC del virus de la viruela aviar. La recombinación in vivo entre los vectores plasm�dicos y el ADN v�rico dio como resultado la formación de un virus recombinante en el que las secuencias de pT1154 se insertaron en FP 14, y las secuencias de pT8150 se insertaron en la región de BamHI J, como se ilustra en la Figura
11.
PANVAC-F se ha usado conjuntamente con PANVAC-V en un ensayo cl�nico continuado para el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma metast�sico (Etapa IV) del páncreas. Los resultados y la descripción posterior de este ensayo se describen más abajo en el Ejemplo 11.
EJEMPLO 5: PANVAC™-V
PANVAC-V consiste en un virus de la vacuna recombinante que coexpresa una forma modificada (flotante) de MUC1, wMUC-1(6), una forma modificada (flotante) de ant�geno carcinoembriog�nico, wCEA(6D), ant�geno 3 asociado con la función leucocitaria (LFA-3), molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1), y B7.1. La secuencia nucleot�dica de MUC-1 flotante usada en PANVAC-V, también conocida como wMUC-1(6), se muestra en la Figura 7 como SEC ID NO:1. La secuencia de CEA flotante usada en PANVAC-V, también conocida como wCEA(6D), se muestra en la Figura 9 como SEC ID NO:3.
Para la generación de la vacuna recombinante PANVAC-V, se us� un nuevo procedimiento desarrollado que dio como resultado el aislamiento de un virus recombinante que contiene los genes extraños deseados, pero que no contiene genes que codifican marcadores seleccionables. Este procedimiento aprovecha la ventaja de la inestabilidad genética de secuencias duplicadas dentro del genoma poxv�rico, dando como resultado la supresión de secuencias nucleot�dicas situadas entre las secuencias duplicadas. Usando este procedimiento, los virus recombinantes contienen inicialmente el gen lacZ de E. coli junto con los genes extraños de interés. Estos virus recombinantes se identifican y purifican usando una identificación colorim�trica para el producto g�nico de lacZ. Durante la propagación subsiguiente de los virus recombinantes, la recombinación intramolecular entre secuencias duplicadas que flanquean el gen lacZ da como resultado la supresión de este gen, dejando un virus recombinante que contiene sólo los genes de interés.
Un derivado de la cepa de Wyeth (New York City Board of Health) del virus de la vacuna se us� como el virus parental para esta vacuna recombinante, denominada TBC-vTRICOM. Este virus parental, denominado TBCvTRICOM, contiene las secuencias codificantes de LFA-3, ICAM-1, y B7.1 insertadas en la región de Hind III F del genoma del virus de la vacuna. La Figura 14 muestra la derivación de TBC-vTRICOM. En primer lugar, la vacuna de Wyeth se purificó en placa por Flow Laboratories, y después se expandió en células CV-1, para crear TBC-Wy. A continuación, el pl�smido pT1068 se insert� usando células CV-1, para suprimir F13L (37K), creando TBCWy-Delta37. Entonces se insertaron LFA-3, ICAM-1, B7.1 y F13L en este virus usando el pl�smido pT5132 en células
CED, creando TBC-vTRICOM.
Un vector plasm�dico denominado pT1153, que dirige la inserción de las secuencias codificantes de CEA y MUC-1 modificadas en la región de Hind III J del genoma del virus TBC-vTRICOM, se us� para generar la vacuna recombinante PANVAC-V. El gen de CEA modificado, denominado wCEA(6D), est� bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna, y el gen de MUC-1 modificado, denominado wMUC-1(6), est� bajo el control transcripcional del promotor temprano/tardío sintético (sE/L). El pl�smido también contiene una porción de la región de Hind III J del virus de la vacuna, que codifica el gen de timidina cinasa (TK). Además, el gen de lacZ de E. coli, bajo el control del promotor 40K del virus de la vacuna, est� incluido como una identificación transitoria para la progenie recombinante. La recombinación entre el vector plasm�dico y el ADN v�rico dio como resultado la formación de un virus recombinante en el que el gen de wCEA(6D), bajo el control transcripcional del promotor 40K del virus de la vacuna, el gen de wMUC-1(6), bajo el control transcripcional del promotor de sE/L, y el gen lacZ, bajo el control del promotor 40K se insert� en la región de Hind III J del genoma del virus de la vacuna, como se ilustra en la Figura
12.
El gen lacZ est� flanqueado por secuencias repetidas para la selección transitoria de lacZ. La secuencia repetida consiste en todo el promotor 40K del virus de la vacuna de 161 pb, descrito anteriormente.
Las secuencias de CEA se aislaron de un clon de ADNc procedente de una librería de ADNc de células de carcinoma de colon construida en el National Cancer Institute (Kaufman et al., Int. J. Cancer 48:900-7 (1991)). El gen de CEA se alter� entonces mediante mutag�nesis in vitro para expresar proteína de longitud completa que contiene un ep�topo modificado. Esta mutación cambi� el amino�cido codificado en la posición 609 de asparagina a ácido asp�rtico (en el que los amino�cidos se numeran comenzando en la primera metionina, incluyendo la secuencia líder). El gen modificado, denominado CEA(6D), se dise�� para potenciar la inmunogenicidad de CEA.
El vector plasm�dico (pT1153) usado para la inserción de las secuencias codificantes de CEA y MUC-1 modificadas en el genoma del virus de la vacuna parental TBC-vTRICOM se ilustra en la Figura 13. Este vector contiene los siguientes elementos: (1) un origen procariota de replicaci�n para permitir la amplificación del vector en un hospedante bacteriano; (2) el gen que codifica resistencia al antibiótico ampicilina, para permitir la selección de células hospedantes procariotas que contienen el pl�smido; (3) secuencias de ADN homólogas a la región de Hind III J del genoma del virus de la vacuna, que dirige la inserción de secuencias extra�as en esta región vía recombinación homóloga; (4) un gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 40K del virus de la vacuna enlazado al gen lacZ; (5) un segundo gen quimérico que comprende el promotor transcripcional 40K enlazado al gen de wCEA(6D); (6) un tercer gen quimérico que comprende el promotor transcripcional sE/L enlazado al gen de wMUC-1(6).
El esqueleto plasm�dico, que incluye el origen bacteriano de replicaci�n y el gen de resistencia a ampicilina, denominado pAG3, deriv� del vector plasm�dico pUC8 (Vieira, Gene 19:259-268(1982)) mediante supresión de un fragmento de Hae II de 442 pares de bases (pb) que contiene los poliligadores de pUC8 y el gen lacZ. Un ligador que contiene un único sitio de Hind III se insert� en el sitio único Nde I en este vector para facilitar la clonaci�n adicional. Las secuencias de Hind III J del virus de la vacuna y las secuencias del promotor del virus de la vacuna se aislaron de ADN gen�mico preparado a partir de la cepa WR (Panicali, J. Virol. 37:1000-1010(1981)) o a partir de TBC-Wy. Las secuencias procedentes de la región de Hind III J que flanquean los genes de lacZ, CEA y MUC-1 comprenden un fragmento de Dra I-EcoR I de 508 pb en dirección 5’ de la secuencia de 40K-lacZ, y un fragmento de EcoR I-Dra I de 633 pb en dirección 3’ de la secuencia de sE/L-MUC-1. El elemento del promotor 40K se aisl� como un fragmento de Dra I-FnuD II de161 pb a partir de la región de Hind III H del virus de la vacuna (Rosel, 60:436-449 (1986)). El promotor sE/L se aisl� como un fragmento de Hind III-Sal I de 60 pb a partir de pJS-8, un derivado de pSC65 (Chakrabarti, BioTechniques 23:1094-1097(1997)). El gen lacZ de E. coli se aisl� como un fragmento de BamH I de 3100 pb a partir de pDP500 (Panicali, 47:193-199 (1986)).
El ensayo cromog�nico para !-galactosidasa se us� para identificar y aislar virus recombinantes que contienen las secuencias de lacZ, CEA y MUC-1, como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
El gen lacZ de E. coli insertado estaba flanqueado por secuencias poxv�ricas duplicadas. La recombinación intramolecular entre estas secuencias dio como resultado la supresión del gen lacZ. Los virus recombinantes de los que se suprimió el gen lacZ dieron lugar a placas incoloras, que se seleccionaron y se purificaron en placa. El poxvirus recombinante purificado final contenía sólo los genes deseados que codifican las proteínas CEA, MUC-1, LFA-3, ICAM-1 y B7.1 y ningún gen marcador (lacZ). Los recombinantes positivos se amplificaron en células CED para producir un lote de siembra. El lote de siembra se sometió entonces a titulación, ensayo de esterilidad, y análisis de expresión gen�mica y proteica.
EJEMPLO 6: Pan 1-1
En el estudio de Fase I, a los pacientes con cáncer pancreático no extirpable se les administr� una mezcla de rVCEA(6D)/TRICOM™ (véase el Ejemplo 2 anterior) con rV-MUC-1 (véase el Ejemplo 1, anterior), seguido de rF-CEA(6D)/TRICOM (véase el Ejemplo 3, anterior), a dosis que se espera que genere respuestas inmunitarias y clónicas relevantes con toxicidad mínima, basado en estudios previos. En consecuencia, el estudio de Fase 1
suministr� una dosis de “sensibilizaci�n” de 1 x 108 pfu rV-CEA(6D)/TRICOM™ mezclado con 1 x 108 pfu rV-MUC-1 subcut�neamente (SC), seguido 2 semanas más tarde por una dosis de “refuerzo” de 1 x 109 pfu rFCEA(6D)/TRICOM™ administrada SC. Los “refuerzos” de 1 x 109 pfu rF-CEA(6D)/TRICOM™ administrados SC se repitieron a intervalos de dos semanas, durante un total de tres “refuerzos”. Se administr� SC sagramostim humana recombinante (100 ∃g) en el sitio de la inyección de la vacuna como adyuvante, en el momento de cada inmunizaci�n y durante tres días consecutivos después. Los pacientes se observaron en cada visita de vacunación y cuatro semanas tras el “refuerzo” final para determinar el examen físico y la recogida de datos de laboratorio e información de sucesos adversos.
Los resultados del estudio de Fase I de Pan1-1 se describen más abajo en el Ejemplo 11.
EJEMPLO 7: Vacunas adicionales
Usando los procedimientos expuestos en los Ejemplos 1-6, se puede generar un abanico de vectores de vacuna. Los sitios de inserción preferidos para los vectores de la viruela aviar y del virus de la vacuna, incluyendo vectores MVA, se describen anteriormente. Los sitios de inserción de la viruela aviar preferidos son 43K, FP14 y la secuencia única larga (LUS). Los sitios de inserción del virus de la vacuna preferidos son MVA 44/45; MVA 49/50 y MVA 124/125.
Por ejemplo, el vector de vacuna del Ejemplo 2 (rV-CEA(6D)/TRICOM) se puede modificar para excluir el ant�geno CEA, generando as� rV-TRICOM. éste puede incluir secuencias murinas (por ejemplo, rV-TRICOM murina) o secuencias humanas (es decir, rV-TRICOM-humana). De forma similar, en otro ejemplo, el vector de vacuna del Ejemplo 3 (rF-CEA(6D)/TRICOM) se puede modificar para excluir el ant�geno CEA, generando as� rF-TRICOM, que puede tener secuencias humanas o murinas.
En otro ejemplo, el vector del Ejemplo 4 (PANVAC-F) se puede preparar con secuencias murinas as� como con secuencias humanas. Los ant�genos de PANVAC, wMUC-1(6), wCEA(6D), LFA-3, ICAM-1, y B7.1, también se pueden incluir en un vector de MVA en los sitios MVA 44/45, MVA 49/50, y MVA 124/125.
Por ejemplo, un virus de la viruela aviar recombinante denominado rF-MUC-1 contiene el ácido nucleico que codifica el gen de MUC-1 humano, o como alternativa, una o más regiones repetidas del MUC-1 humano como se describe anteriormente (SEC ID NO: 1), bajo el control del promotor 40K, y se ha descrito (Grosenbach, D. W., Barrientos, J. C., Schlom, J. y Hodge, J. W., Cancer Res 61, 4497-505, 2001). El virus de la viruela aviar recombinante que contiene el ácido nucleico que codifica MUC-1 humano y los genes de B7-1, ICAM-1, y LFA-3 murinos se denomina rF-MUC-1-TRICOM, y es el mismo vector que aquel descrito por Grosenbach et al., solo con ant�geno MUC-1 en lugar de ant�geno CEA (Grosenbach, D. W., Barrientos, J. C., Schlom, J. y Hodge, J. W., Cancer Res 61, 4497-505, 2001). El vector de la viruela aviar recombinante denominado rF-OX40L se gener� mediante inserción del gen OX40L murino bajo el control del promotor 40K en el genoma de rF-CEA en el sitio de FP 14 en el genoma. El ADNc de OX40L se amplificó a partir de células B murinas activadas anti-CD40/anti-IgM mediante RT-PCR usando cebadores específicos para los extremos 5’-(dGGTACCGGTACCATGGAAGGGGAAGGGGTTC) (SEC ID NO:5) y 3’-(dCTCGAGCTCGAGTCACAGTGGTACTTGGTTC) (SEC ID NO:6) del marco de lectura abierto. El ADNc se clon� en un vector de transferencia de poxvirus. El análisis de secuencia confirm� que no se introdujeron mutaciones en el proceso de clonaci�n. El virus de la viruela aviar recombinante denominado rF-MUC-1-TRICOM/OX40L se gener� mediante inserción del gen OX40L murino bajo el control del promotor 40K en el genoma de rF-TRICOM en el sitio de FP14 en el genoma. Ambos virus de la viruela aviar recombinantes que expresan OX40L se generaron mediante métodos descritos previamente (Gritz, L., Destree, A., Cormier, N., Day, E., Stallard, V., Caiazzo, T., Mazzara, G. y Panicali, D., J Virol 64, 5948-57, 1990). Estos virus también expresan el gen de MUC-1 humano y el gen de betagalactosidasa bacteriana.
El virus de la viruela aviar recombinante denominado rF-CEA contiene los ácidos nucleicos que codifican el gen de CEA humano, o cualquier repetición antig�nica del mismo como se muestra en SEC ID NO: 2, bajo el control del promotor 40K, y se ha descrito (Grosenbach, D. W., Barrientos, J. C., Schlom, J. y Hodge, J. W., Cancer Res 61, 4497-505, 2001). El virus de la viruela aviar recombinante que contiene el gen de CEA humano y los genes de B7-1, ICAM-1, y LFA-3 murinos se denomina rF-TRICOM a lo largo de este estudio, y se ha descrito (Id.). El virus de la viruela aviar recombinante denominado rF-OX40L se gener� como se describe anteriormente. El virus de la viruela aviar recombinante denominado rF-CEA-TRICOM/OX40L se gener� mediante inserción del gen de OX40L murino bajo el control del promotor 40K en el genoma de rF-TRICOM en el sitio de FP14 en el genoma. Ambos virus de la viruela aviar recombinante que expresan OX40L se generaron mediante métodos previamente descritos (Gritz, L., Destree, A., Cormier, N., Day, E., Stallard, V., Caiazzo, T., Mazzara, G. y Panicali, D., J Virol 64, 5948-57, 1990). Estos virus también expresan el gen de CEA humano y el gen de !-galactosidasa bacteriana.
EJEMPLO 8: Respuesta inmunitaria a TAAs expresados mediante poxvirus recombinantes en un modelo murino
Para evaluar respuestas inmunitarias frente a poxvirus recombinantes que expresan CEA o MUC-1, se inmunizaron ratones con virus recombinantes que expresan estos ant�genos solos o en combinación con homólogos murinos de B7.1 o de las tres moléculas coestimulantes que comprenden TRICOM murino (muB7.1, muTRICOM™,
respectivamente). El uso de moléculas coestimulantes murinas en estos estudios permitió la evaluación del efecto de la coestimulaci�n en el desarrollo de respuestas de células T.
En un experimento, se evalu� el efecto de muB7.1 sobre respuestas inmunitarias provocadas por MUC-1 expresado por el virus de la vacuna. Un grupo de ratones C57BL/6 se vacun� con una mezcla de rV-MUC-1 y virus de la vacuna no recombinante (107 pfu de cada virus) en los días 0, 14, y 28. El segundo grupo de ratones se vacun� con una mezcla de rVMUC-1 y rV-muB7.1 (107 pfu de cada virus) en el día 0, y después con una mezcla de rV-MUC-1 y virus de la vacuna no recombinante (107 pfu de cada virus) en los días 14 y 28. Los ratones se eutanasiaron en el día 35, y la actividad de células T citot�xicas se evalu� en un ensayo de liberación de indio estándar. CTL específico de MUC-1 se detect� en ambos grupos; sin embargo, el porcentaje de lisis específica fue aproximadamente 1,5 veces mayor en ratones que recibieron la mezcla de rV-MUC-1/rV-muB7.1. (Akagi et al., J Immunother. 20:38-47 (1997)).
Otro experimento compar� los efectos de muB7.1 y muTRICOM™ sobre respuestas inmunitarias provocadas por CEA expresado por el virus de la vacuna. En este estudio, ratones transg�nicos para CEA C57BL/6, que expresan CEA humano con una distribución tisular similar a la de seres humanos, se vacunaron con uno de tres inmun�genos:
(1) rV-CEA; (2) rV-CEA mezclado con rV-muB7.1; o (3) rV-CEA/muTRICOM. Todos los animales se sacrificaron en el día 22, y se midieron las respuestas linfoproliferativas específicas de CEA. Los ratones inmunizados con rV-CEA/muTRICOM™ tuvieron respuestas dos veces mayores que aquellos vacunados con rV-CEA + rV-muB7.1, y respuestas cuatro veces mayores que aquellos vacunados con rV-CEA sola. Un número de estudios adicionales evalu� las respuestas inmunitarias a CEA expresado por poxvirus en ratones. (Hodge et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1228-39 (2000); Hodge et al., Cancer Research 59: 5800-07 (1999)).
EJEMPLO 9: Actividad antitumoral de vacunas que expresan moléculas coestimulantes en modelos murinos
Los modelos murinos permiten no sólo la medida de las respuestas inmunitarias provocadas por vacunas del cáncer, sino también la evaluación de efectos antitumorales profilácticos o terapéuticos estimulados por estas vacunas. Por ejemplo, para evaluar la capacidad de vacunas a base de poxvirus para proteger frente a exposiciones tumorales, se inmunizaron ratones mediante escarificaci�n de la cola con una mezcla de rV-CEA y rV-muB7.1. Cuando los ratones inmunizados se expusieron a células MC-38 que expresan CEA, los tumores no se establecieron, indicando que la inmunizaci�n había dado lugar a una protección frente a la exposición tumoral. Esta protección vino acompañada de respuestas de células T específicas de CEA correspondientes (Hodge et al., Cancer Res 55:3598-3603 (1995)). Se dieron a conocer resultados similares después de que los ratones se inmunizaron con un único virus de la vacuna recombinante que expres� tanto CEA como muB7.1 (Kalus, 1999). Subsiguientemente, la mezcla (rV-CEA + rV-muB7.1) se compar� con el constructo de gen dual (rV-CEA/muB7.1) en un modelo de protección frente a tumor. Tanto la mezcla como el recombinante individual provocaron respuestas antitumorales; sin embargo, se necesitaron mayores dosis de los virus mezclados para obtener respuestas inmunitarias comparables a las obtenidas usando el recombinante individual.
La protección exitosa usando muB7.1 conduce a estudios que evalúan combinaciones de moléculas coestimulantes. En otro experimento de exposición a tumor, se vacunaron SC ratones C57BL/6 con rV-CEA o rV-CEA/muTRICOM™, y después se expusieron 100 días más tarde a células de carcinoma de colon MC-38 que expresan CEA. Todos los ratones vacunados con rV-CEA sucumbieron a los tumores, mientras que todos los ratones vacunados con rV-CEA/muTRICOM™ sobrevivieron a la exposición al tumor. Las respuestas de células T también fueron significativamente mayores en animales vacunados con rV-CEA/muTRICOM (Hodge et al., Cancer Research 59: 5800-07 (1999)).
En los estudios de protección frente a tumor descritos previamente, CEA, aunque expresado en una estirpe de célula tumoral murina, represent� un ant�geno extraño en los ratones vacunados. A fin de determinar si se podrían provocar respuestas antitumorales similares en un marco en el que CEA representa un ant�geno “propio”, se realizaron estudios de inmunoterapia tumoral usando ratones transg�nicos para CEA. En un experimento, los animales se inocularon primero con células MC-38 que expresan CEA, después se inmunizaron cuatro días más tarde con rV-CEA, rV-CEA/muB7.1, o rV-CEA/muTRICOM™. Sólo los ratones que recibieron rV-CEA/muTRICOM™ permanecieron libres del tumor. Estos ratones también tuvieron las respuestas de células T específicas de CEA más elevadas (Hodge et al., Cancer Research 59: 5800-07 (1999)).
En un modelo de inmunoterapia más riguroso, ratones transg�nicos para CEA con metástasis de carcinoma hepático positivo a CEA establecido se trataron mediante vacunación semanal durante cuatro semanas con rV-muCEA/TRICOM™ más GM-CSF e IL-2 murinos. De los dieciséis ratones tratados, nueve (56%) permanecieron vivos a lo largo de 25 semanas. Por el contrario, en el grupo de control (que recibió virus de la vacuna no recombinante más citocinas), sólo sobrevivió uno de diecinueve (5%) pasadas 16 semanas (Grosenbach, 2001).
EJEMPLO 10: Expresión de TRICOM™ en células que presentan ant�geno en un modelo murino
Las células dendr�ticas (DCs) son partícipes claves en la activación de linfocitos T tanto CD4+ como CD8+. El grado de activación de las células T parece estar relacionado, al menos en parte, con el nivel de expresión de ciertas moléculas coestimulantes en DCs. Se demostr� que DCs murinas infectadas con rV-muTRICOM o rF-muTRICOM™
potencia significativamente la proliferaci�n de células T sin tratamiento, la proliferaci�n de células T alog�nicas, y la proliferaci�n de células T específicas de p�ptidos in vitro. Además, las DCs pulsadas con p�ptidos infectadas con rV
o rF-muTRICOM™ indujeron mayor actividad de CTL in vivo que lo que lo hicieron las DCs pulsadas con p�ptido no infectadas correspondientes (Hodge et al., J Natl Cancer Inst. 92:1228-1239 (2000)).
Se han obtenido resultados similares usando DCs humanas. El origen y la etapa de madurez de DCs humanas afecta a los niveles de moléculas coestimulantes mostrados por estas células. Zhu y colaboradores han demostrado que varias horas después de la infección con rF-TRICOM™, las DCs humanas hiperexpresan eficientemente las tres moléculas coestimulantes (Zhu, 2001). Además DCs aut�logas pulsadas con p�ptidos, infectadas con rFmuTRICOM™, fueron más potentes a la hora de activar células T in vitro que las DCs pulsadas con p�ptidos sin infectar, según se mide mediante la producción de interfer�n-gamma tras 24 horas de incubaci�n. Estos resultados se obtuvieron usando p�ptidos procedentes de ant�genos v�ricos tanto fuertes como débiles, as� como p�ptidos de ant�genos propios, asociados a tumores (CEA y PSA). La activación de células T potenciada no estuvo acompañada por una mayor apoptosis de células T.
La potencia de otras células que presentan ant�geno (APCs), tales como células progenitoras de médula ósea (BMPCs), también se puede incrementar usando vectores poxv�ricos que expresan TRICOM™ (Rad, 2001). BMPCs murinas infectadas con rV-o rF-muTRICOM™ potencian significativamente la activación de poblaciones de células T CD4+ y CD8+ T tanto nativas como efectoras. Una población de APC genérica, esplenocitos murinos, también se podría hacer más eficiente en la presentación de ant�genos mediante infección con cualquiera de los vectores TRICOM™ (Hodge et al., Vaccine 19:3552-3567 (2001)). Los esplenocitos infectados requieren menos concanavalina A (que actúa como señal 1) para activar células T sin tratamiento. Además, cuando se us� para este ensayo una cantidad constante de concanavalina A, se necesit� un menor número de esplenocitos infectados para la activación de células T. Los esplenocitos infectados con TRICOM™ también indujeron una mayor activación de células T específicas de ant�geno que lo que lo hicieron los esplenocitos sin infectar, aproximándose a niveles logrados con DCs no infectadas según se mide mediante producción de interfer�n-gamma.
EJEMPLO 11: Datos de ensayos cl�nicos
PANVAC-VF se dise�� para estimular el sistema inmunitario para seleccionar como dianas y destruir células cancerosas que expresan dos proteínas (o ant�genos), ant�geno carcinoembri�nico (CEA) y mucina-1 (MUC-1), encontradas en alrededor del 90 por ciento de células de tumor pancreático. Se administraron vacunas de Therion vía inyección subcutánea de una manera de “sensibilizaci�n-refuerzo” empleando el virus de la vacuna como el vector de sensibilizaci�n, seguido de dosis secuenciales con un vector de la viruela aviar, como se describe más abajo. Las vacunas también incorporan TRICOM, diseñado para potenciar y sostener una respuesta inmunitaria dirigida contra células tumorales.
Se han llevado a cabo dos estudios cl�nicos de fase I de etiqueta abierta: PAN 1-1 y TBC-PAN-002, cada uno con el objetivo primario de la seguridad. En resumen, los estudios enrolaron un total de 22 pacientes con cáncer pancreático avanzado (Etapa III o IV), 20 de los cuales tuvieron enfermedad metast�sica (Etapa IV); todos ellos recibieron quimioterapia previa. Basándose en un repaso de los estudios de Fase III múltiples que implican otras sustancias quimioterap�uticas, la supervivencia global mediana esperada de esta población de pacientes es aproximadamente 3 meses.
PAN 1-1
PAN 1-1 fue un estudio de etiqueta abierta para evaluar la seguridad y tolerabilidad de rV-CEA(6D)/TRICOM mezclado con rV-MUC-1 seguido de rF-CEA(6D)/TRICOM en combinación con sagramostim en el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma del páncreas. La población de estudio incluyó pacientes % 18 años de edad que habían confirmado histol�gicamente adenocarcinoma del páncreas, cuya enfermedad no era extirpable quirúrgicamente en opinión del investigador, y que habían tenido un estado de comportamiento ECOG de & 2.
Los pacientes recibieron una dosis de sensibilizaci�n de 1 x 108 pfu rV-CEA(6D)/TRICOM mezclado con 1 x 108 pfu rV-MUC-1 SC en el Día 0, seguido de una dosis de refuerzo de 1 x 109 pfu rF-CEA(6D)/TRICOM SC en los Días 14, 28, y 42. Se administr� sagramostim (100 ∃g) SC en el sitio de inyección en el día de cada administración de la vacuna y durante tres días consecutivos después. A discreción del investigador, a los pacientes se les dej� continuar en una fase de tratamiento de extensión tras el Día 70. Tres pacientes entraron en la fase de extensión; el estudio se termin� el 11 de diciembre de 2003, tras la retirada del paciente final.
Los parámetros de seguridad evaluados durante el transcurso de este estudio incluyeron historial m�dico, signos vitales, examen físico, ensayos de laboratorio (hematología, química, y urin�lisis), ECGs, estado de comportamiento ECOG, y documentación de medicaciones concomitantes.
Doce pacientes se enrolaron en el estudio y recibieron la vacunación de sensibilizaci�n. Dos de estos doce pacientes fueron sustitutos de pacientes que se retiraron prematuramente del estudio por razones distintas de toxicidad. Nueve pacientes completaron el curso completo del tratamiento por protocolo (una inyección de sensibilizaci�n y tres inyecciones de refuerzo). Cinco pacientes completaron la visita de seguimiento final (Día 70: 28
d�as después de la última dosis). De este modo, de las 40 vacunaciones planificadas originales (diez pacientes; cuatro vacunaciones cada uno), se administraron 42 vacunaciones a los 12 pacientes enrolados en este estudio. Tres de estos pacientes entraron en la fase de extensión y recibieron mensualmente vacunaciones durante un período adicional de cinco meses. De este modo, para los tres pacientes enrolados en la fase de extensión, cada uno recibió un total de nueve vacunaciones durante un período de aproximadamente siete meses (Fase Central más Fase de Extensión).
Bas�ndose en los datos disponibles, rV-CEA(6D)/TRICOM, rV-MUC-1, y rF-CEA(6D)/TRICOM en combinación con sagramostim se toleraron bien. No hubo toxicidades limitantes de la dosis (DLTs) o sucesos adversos serios relacionados de forma causal con el régimen de tratamiento, y los pacientes no se retiraron debido a DLT, suceso relacionado con la inoculación, u otro suceso adverso relacionado con el tratamiento. Las reacciones adversas relacionadas causalmente con el régimen de tratamiento se limitaron a sucesos de grado 1 y 2, asociados con reacciones de sitio de inyección cut�neas locales y sucesos sist�micos de fatiga, escalofríos y fiebre.
Como se señala anteriormente, al final de la Fase de Tratamiento Central de 70 Días, tres pacientes entraron en la Fase de Extensión del Estudio. Estos tres pacientes recibieron cinco refuerzos adicionales de rF-CEA(6D)/TRICOM, y se retiraron subsiguientemente del estudio debido a la progresión de la enfermedad. Ninguno de los pacientes permaneció en el estudio. Se dieron a conocer veintiún AEs, posible o definitivamente relacionado con la vacuna, en los tres pacientes durante el período de cinco meses de la Fase de Extensión. Todos los AEs relacionados con la vacuna [rF-CEA(6D)/TRICOM] tuvieron gravedad de grado 1. El AE más habitual fue eritema de grado 1 en el sitio de inyección tras los refuerzos mensuales. Estos datos, aunque en un número pequeño de pacientes, sugiere que los refuerzos mensuales continuados con vacunas a base de viruela aviar son bien tolerados durante más de 6 meses.
Todos los pacientes enrolados en el Estudio PAN 1-1 continúan estando seguidos para determinar datos de supervivencia. Ocho de los 12 pacientes enrolados en el Estudio PAN 1-1 murieron. La supervivencia global (OS) mediana es de 7,9 meses. Es de señalar que todos estos pacientes tuvieron enfermedad metast�sica en la línea base, y todos fracasaron en la quimioterapia de primera línea. Basándose en los datos de control hist�ricos, la OS mediana esperada en esta población de pacientes es aproximadamente 3-4 meses (Heinemann, Semin Oncol. diciembre de 2002; 29(6 Supl. 20):9-16). Aunque el tamaño de la muestra es pequeño y el análisis est� limitado por comparación con datos de control hist�ricos, estos datos son alentadores.
TBC-PAN-002
El Protocolo de Ensayo Cl�nico TBC-PAN-002 fue un estudio de etiqueta abierta de Fase I para evaluar la seguridad y tolerabilidad de PANVAC-VF en combinación con sagramostim en el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma del páncreas. La población del estudio incluye pacientes % 18 años de edad que han confirmado histol�gicamente adenocarcinoma del páncreas, cuya enfermedad no es extirpable quirúrgicamente en la opinión del investigador, y que tienen un Estado de Comportamiento Karnofsky de % 80. Los pacientes del estudio deben haber también recibido virus de la vacuna previa (inmunizaci�n contra la viruela) y se espera que vivan al menos 4 meses.
Para TBC-PAN-002, los pacientes recibieron una dosis de “sensibilizaci�n” de 2 x 108 pfu PANVAC-V SC en el Día 0, seguido de una dosis de “refuerzo” de 1 x 109 pfu PANVAC-F SC en los Días 14, 28, y 42. Sagramostim (100 ∃g) se da SC en el sitio de inyección en el día de la administración de cada vacuna y durante tres días consecutivos después.
Tras el Día 70, a discreción del investigador, se dej� que los pacientes que estaban cl�nicamente estables entrasen en una Fase de Extensión de vacunaciones continuadas. Los pacientes en la Fase de extensión recibieron refuerzos mensuales de PANVACF a 1 x 109 pfu con sagramostim mensualmente hasta la progresión de la enfermedad, según se determine por el investigador. Durante la Fase de Extensión, se continuarán recogiendo datos de seguridad.
Los parámetros de seguridad evaluados durante el transcurso de este estudio incluyen historia m�dica, signos vitales, examen físico, ensayos de laboratorio (hematología, química, uran�lisis), y medicaciones concomitantes. La seguridad se evalúa examinando estos parámetros y tabulando efectos adversos que surgen del tratamiento que se producen entre la línea base y los Días 14, 28, 42 y 70. Además, se recogieron lecturas de ECG en la línea base, Día 28, y Día 70, y se determin� una evaluación del Estado de Comportamiento Karnofsky en la línea base, Día 28 y Día 70. Los resultados de los ensayos de laboratorio fuera del intervalo, u otros sucesos no evaluados como cambios cl�nicamente significativos a partir de la línea base, no se dan a conocer como sucesos adversos.
El AE más habitual (43%) relacionado con las vacunas fue reacción del sitio de inyección en el sitio de administración de la vacuna. Estos AEs fueron todos grado 1 e incluyeron eritema, hinchazón, prurito, ampollas, induraci�n, y dolor. Principalmente, de las diez administraciones del virus de la vacuna (PANVAC-V), hubo tres AEs de grado 1 (ampolla, eritema, y prurito). Es de señalar que todas las vacunaciones en este estudio se administraron subcut�neamente (y lo ser�n en todos los estudios futuros de PANVAC-VF). Estos datos demuestran que el perfil de AE relacionado con la administración subcutánea de la vacuna es significativamente más benigno que el perfil de AE tras la administración intrad�rmica mediante escarificaci�n. La administración intrad�rmica del virus de la vacuna est� asociada clásicamente con la formación de vesículas, pústulas, y cicatrices, todas las cuales pueden contener virus infeccioso. De este modo, aunque los sitios de inyección no se cultivaron en estudio reciente, el perfil de AE tras la vacunación con PANVAC-V sugiere que PANVAC-V no se puede desprender del paciente tras la vacunación. La administración de PANVAC-F estuvo asociada más habitualmente con reacciones del sitio de la inyección. De las 28 vacunaciones de PANVAC-F administradas a los 10 pacientes, 20 estaban asociadas con AEs, y 15 de estas 20 (75%) estaban limitadas a eritema de grado 1.
La mayoría de los AEs relacionados con la vacuna (63 de 74; 85%) tuvieron una gravedad de grado 1. Hubo diez AEs de grado 2 relacionados con la vacuna (cinco fatigas, tres cefaleas, un vómito, una náusea). Hubo 1 fiebre de grado 3 que fue una toxicidad limitante de la dosis (véase más abajo). Siguiendo las reacciones del sitio de inyección, los AEs más habituales fueron fatiga, anorexia, náusea, vómito, fiebre, cefalea, y mialgia. Es posible que varios de estos AEs puedan reflejar un síndrome relacionado con la vacuna.
Se han dado a conocer veintitrés sucesos adversos graves (SAEs) en cinco pacientes. Todos los SAEs se clasificaron como no relacionados con la vacuna por los investigadores. Tres de los sucesos (disfunción/insuficiencia hepática, progresión de la enfermedad de cáncer pancreático, y recurrencia de neumonía) dieron como resultado la muerte. Un paciente experiment� una DLT de Fiebre de Grado 3, que se resolvió sin secuelas: este paciente recibió la inyección de vacuna de sensibilizaci�n en el Día 0, y vacunaciones de refuerzo en los Días 14 y 28. Sagramostim se administr� por protocolo tras las vacunaciones del Día 0 y Día 14. En la tarde del Día 28, tras la segunda administración de PANVAC-F y una administración de sagramostim, el paciente observ� una temperatura de 104,5�F, que fue una reacción de grado 3 y una DLT, ya que el investigador clasificó este suceso como definitivamente relacionado con la vacuna. El paciente se trat� con 500 mg de acetaminofeno oralmente, y el suceso se resolvió sin secuelas. Este paciente continu� en el Estudio.
Bas�ndose en los datos preliminares, PANVAC-VF en combinación con sagramostim parece ser bien tolerado y de este modo hasta ahora no se han observado sucesos adversos graves, cl�nicamente significativos, causalmente relacionados con el régimen de tratamiento. La OD mediana es 6,3 meses.
TBC-PAN-003
El Protocolo de Ensayo Cl�nico TBC-PAN-003 es un estudio controlado, aleatorizado, de Fase III, para evaluar la seguridad y eficacia de PANVAC-VF en combinación con sargarmostim frente a la mejor quimioterapia de cuidados complementarios o paliativa en pacientes con adenocarcinoma metast�sico (Etapa IV) del páncreas que han fracasado en un régimen de quimioterapia que contiene gemcitabina. El protocolo para el tratamiento de pacientes en este ensayo cl�nico sigue el protocolo para TBC-PAN-002, descrito anteriormente.
LISTADO DE SECUENCIAS ORIGINAL
<110> THERION BIOLOGICS CORPORATION THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES
<120> SISTEMA PARA TRATAR Y PREVENIR CÁNCER DE MAMA
<130> P105991EPPC/DLB
<140> 04810831.0
<141> 2004-11-12
<150> US 60/519,427
<151> 2003-11-12
<160>6
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 1548
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo nucleot�dico sintético
<400> 1 <210>2
<211> 515
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo proteico sintético
<400> 2
<210>3
<211> 2106
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo nucleot�dico sintético
<400> 3
<210>4 5 <211> 372
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: constructo proteico sintético 10 <400> 4
<210>5 <211>31
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético
<400> 5 ggtaccggta ccatggaagg ggaaggggtt c 31
10 <210>6 <211>31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético
<400> 6 ctcgagctcg agtcacagtg gtacttggtt c 31

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunol�gica frente a una célula que expresa un ant�geno asociado con cáncer de mama en un ser humano que tiene cáncer de mama o con riesgo de desarrollar cáncer de mama, que comprende:
    (a)
    un primer vector que contiene uno o más segmentos de ADN que codifican (i) mucina (MUC) o una porción antig�nica de la misma o una versión modificada de la misma, en el que la versión modificada de la misma comprende SEC ID NO: 2, y (ii) ant�geno carcinoembri�nico (CEA) o una porción antig�nica del mismo
    o una versión modificada del mismo, en el que la versión modificada del mismo comprende SEC ID NO: 4, y
    (b)
    al menos un segundo vector que contiene uno o más segmentos de ADN que codifican (i) MUC o una porción antig�nica de la misma o una versión modificada de la misma, en el que la versión modificada de la misma comprende SEC ID NO: 2, y (ii) CEA o una porción antig�nica del mismo o una versión modificada del mismo, en el que la versión modificada del mismo comprende SEC ID NO: 4,
    en el que el segundo vector es para la administración al ser humano a intervalos regulares tras la administración del primer vector.
  2. 2.
    Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunol�gica frente a una célula que expresa un ant�geno asociado con cáncer de mama en un ser humano que tiene cáncer de mama o con riesgo de desarrollar cáncer de mama.
  3. 3.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 1, o el uso de la reivindicación 2, en el que la composición farmacéutica comprende además factor estimulante de colonias de granulocitos-macr�fagos (GM-CSF).
  4. 4.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 1 � 3, o el uso de la reivindicación 2 � 3, en el que la composición farmacéutica comprende además al menos una molécula coestimulante.
  5. 5.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 4, en el que la molécula coestimulante es codificada por al menos uno de los vectores.
  6. 6.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 5, en la que el al menos uno de los vectores que codifican la molécula coestimulante contiene al menos B7.1, LFA-3 e ICAM-1 como genes coestimulantes.
  7. 7.
    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-6, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en la que los vectores primero y segundo son vectores poxv�ricos.
  8. 8.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 7, en la que los vectores primero y segundo se seleccionan del grupo que consiste en: un vector de virus orthopox; un vector de virus avipox; un vector de virus suipox; un vector de virus capropox; un vector de virus leporipox; y un vector de iridovirus, en la que los vectores primero y segundo pueden ser vectores poxv�ricos iguales o diferentes.
  9. 9.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 7, en la que al menos uno de los vectores poxv�ricos es un vector poxv�rico con replicaci�n alterada o que no se replica.
  10. 10.
    La composición farmacéutica o uso de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en la que el primer vector es un vector de virus orthopox, y el segundo vector es un vector de virus avipox.
  11. 11.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 10, en la que el vector orthopox es virus de la vacuna.
  12. 12.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 11, en la que el virus de la vacuna es virus de la vacuna Wyeth o un virus de la vacuna atenuado.
  13. 13.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 12, en la que el virus de la vacuna atenuado es MVA o NYVAC.
  14. 14.
    La composición farmacéutica o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en la que el vector orthopox se administra antes de que se administre el vector avipox.
  15. 15.
    La composición farmacéutica o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en la que el vector orthopox se administra en una a tres administraciones a intervalos establecidos, y el vector avipox se administra en múltiples administraciones a intervalos establecidos.
  16. 16.
    La composición farmacéutica o uso de la reivindicación 15, en la que el intervalo establecido es 20 días a 90 días.
  17. 17.
    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-16, o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-16, en la que la mucina es MUC-1.
  18. 18.
    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-16, o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-16, en la que la versión modificada de mucina es una MUC flotante y contiene cinco a quince repeticiones en t�ndem.
  19. 19.
    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-16, o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-16, en la que la mucina es una MUC-1 flotante o una mini-MUC-1 flotante que tiene seis repeticiones en t�ndem.
  20. 20.
    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-19, o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-19, en la que el uno o más segmentos de ADN comprende SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, o codifica SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 4.
    Figura 1 Mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT2137
    Figura 2 Esquema del vector rV-MUC-1
    Figura 3 Mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT8016
    Figura 4 Generación del virus de la vacuna recombinante rV-CEA(6D)/TRICOM
    Figura 5 Mapa de endonucleasas de restricción del pl�smido pT2187
    Figura 6 Generación del virus de la viruela aviar recombinante rF-CEA(6D)/TRICOM
    FIGURA 7 SECUENCIA DE wMUC-l(6), SEC. ID. NO: 1
    FIGURA 8 SECUENCIA DE AMINO�CIDOS DE wMUC-l(6), SEC. ID. NO: 2
    FIGURA 9 SECUENCIA DE ADN DE wCEA(6D), SEC. ID. NO: 3
    Pl�smidos de PANVAC-F pT1154 y pT8150
    FIGURA 11
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