ES2231186T3 - Agente inmunoterapeutico especifico para organo, tejido y celula para infecciones virales cronicas, asi como enfermedades inflamatorias, degenerativas y proliferativas, especialmente del higado, asi como cancer basado en virus parapox recombinante. - Google Patents

Abstract

Uso de virus parapox recombinante con propiedades de direccionamiento para la preparación de medicamentos. La presente invención se refiere a la preparación y al uso de virus parapox recombinante para la inmunoterapia dirigida a la diana específica para órgano, tejido y/o célula de infecciones virales, así como de enfermedades inflamatorias, degenerativas, proliferativas, especialmente del hígado y cáncer. La invención concierne además al uso de virus parapox recombinantes con propiedades de direccionamiento para la preparación de medicamentos. Fue objetivo de la invención, producir la actividad inmunológica del virus parapox dirigida a la diana. El objetivo se consigue mediante el acoplamiento o la introducción de péptidos extraños o proteínas adecuados al o en el virus con la capacidad para la interacción con moléculas receptoras específicas de órgano, tejido y/o célula.

Description

Agente inmunoterapéutico específico para órgano, tejido y célula para infecciones virales crónicas, así como enfermedades inflamatorias, degenerativas y proliferativas especialmente del hígado así como cáncer basado en virus parapox recombinante.

La presente invención se refiere a la preparación y al uso de virus parapox recombinante para la inmunoterapia dirigida a la diana específica para órgano, tejido y/o célula de infecciones virales, así como de enfermedades inflamatorias, degenerativas, proliferativas, especialmente del hígado y cáncer. La invención concierne además al uso de virus parapox recombinantes con propiedades de direccionamiento para la preparación de medicamentos.

En el ámbito de uso de los virus parapox anteriormente mencionados se encuentran también enfermedades de la piel y sus síntomas derivados, de los órganos internos, del sistema nervioso central y sus síntomas derivados incluidos del ojo, así como el cáncer, en el hombre y animales.

Es conocido que las infecciones virales latentes y crónicamente persistentes se pueden activar o reactivar mediante una inmunosupresión, o invertir, porque el sistema inmunológico reprime la enfermedad aguda, que puede ser causada por un virus que es latente (por ejemplo, una infección de virus del herpes latente en supresión inmunológica: vesículas de labios con estrés o toma de cortisona). Se conoce además que las infecciones virales crónicamente persistentes y latentes son tratables difícilmente o casi nada con las sustancias antivirales habituales basadas en compuestos de bajo peso molecular.

Un motivo de esto puede ser la actividad enzimática viral fallida en tales infecciones (por ejemplo, la falta de una actividad de la polimerasa viral, que debe proporcionar en primer lugar un inhibidor nucleosídico en el ácido nucleico viral, con lo que esto, por ejemplo, puede llevar a una interrupción de las cadenas en el ADN viral; por ejemplo, la falta de una actividad de la timidinquinasa viral que, por ejemplo, deba fosforilar en primer lugar un compuesto antiviral, con lo que este puede llegar a estar activo) o bien el reconocimiento fallido de células infectadas o antígenos virales por parte del sistema inmunológico del huésped.

Se conoce igualmente que en las infecciones virales persistentes crónicas una superinfección con otro virus puede llevar a efectos antivirales orientados contra el virus crónicamente persistente. 1) La dependencia de este efecto de las interferonas (v.a. IFN-\gamma) y TFN-\alpha que se podrían segregar de las células T, células asesinas naturales y macrófagos, podría mostrarse por parte de los autores.

Los resultados de estos autores confirmaban otro estudio previo, en el que se mostraba que las células T citotóxicas restringidas de clase I podrían inhibir la expresión génica del HBV hepatocelular en ratones transgénicos con HBV, de modo que este proceso trascurrió sin destrucción de las células del hígado y de modo que el proceso se provocaba mediante TNF-\alpha e IFN-\gamma ^{2)}.

En la práctica veterinaria se usa terapéuticamente, meta- y profilácticamente desde hace mucho tiempo un producto para la inducción de la "inmunidad paraespecífica", un denominado inductor de parainmunicidad. Este inductor de parainmunicidad se compone, por ejemplo, de virus parapox ovis químicamente inactivado. Un producto preparado basado en este virus (virus parapox ovis, cepa D 1701) es el BAYPAMUN® (documento DE 3504940).

El virus inactivado induce en el animal una protección inespecífica frente a infecciones con los agentes infecciosos más distintos. Se acepta que esta protección se proporciona por medio de distintos mecanismos del sistema defensivo propio del organismo.

Con este fin se considera: inducción de interferón, activación de las células asesinas naturales, inducción de "actividad de estimulación de colonias" (CSA), así como estimulación de la proliferación de linfocitos. Las investigaciones previas en cuanto a mecanismos de acción mostraron la estimulación de interleucina 2 e interferón-\gamma ^{3)}.

Se conoce igualmente que los virus parapox se pueden proveer como vectores con genes de otros agentes infecciosos, para poder expresar las proteínas correspondientes y así producir una protección inmunológica profiláctica (vacunación) frente a los agentes infecciosos ^{4)}.

Se conoce además que los denominados virus "pseudotipo" recombinantes no pueden infectar originalmente las células, tejidos, órganos o huéspedes diana infectables ^{5)}.

En base a tales conocimientos ya se discutió el uso orientado a diana de los vectores terapéuticos de genes ^{6)}.

En la farmacología se hace uso de moléculas naturales y sintéticas como, por ejemplo, de la asialofetuína o poli-L-lisina, para hacer accesibles selectivamente para una terapia con estas moléculas determinados órganos -en el caso de los ejemplos aquí mencionados el hígado- en base a la actividad metabólica con receptores específicos de órganos -en el caso de los ejemplos aquí mencionados del receptor de la asialoglicoproteína del hígado-^{7)}.

A partir de este antecedente se presenta, por tanto, el objetivo de mejorar más partiendo de esto la utilidad terapéutica de la extraordinaria actividad inmunogénica del virus parapox ovis, de modo que se pueda articular la inmunogenicidad paraespecífica generalizada descrita anteriormente del virus parapox dirigida al (sistema)-órgano enfermo y al agente infeccioso de la enfermedad.

Se esperaría de una focalización tal un cuadro de efectos secundarios y un efecto terapéutico más fuerte y persistente en el lugar de actividad.

Por tanto, fue objetivo de la invención, producir la actividad inmunológica del virus parapox dirigida a la diana. El objetivo se consigue mediante el acoplamiento o la introducción de péptidos extraños o proteínas adecuados al o en el virus con la capacidad para la interacción con moléculas receptoras específicas de órgano, tejido y/o célula.

Así se consiguió una focalización fuerte de la reacción inmunológica. Por tanto es posible por vez primera, con ayuda de virus parapox ovis concentrar la capacidad compleja del sistema inmunológico en el lugar de necesidad.

Las ventajas resultantes de esto consisten en la especificidad por el tejido, órgano o célula con el refuerzo simultáneo de la actividad inmunológica en el lugar de necesidad y en la reducción de los efectos secundarios.

Debido a que con los procedimientos/productos conocidos hasta la fecha en la aplicación sistémica se han de recibir por un lado efectos secundarios indeseables de tipo genérico y/o por otro lado sólo se consigue una concentración insuficiente de la sustancia activa en el lugar de acción, se puede conseguir con la nueva calidad de virus parapox ovis sintetizada en esta invención terapias más selectivas y efectivas.

Para la preparación del virus parapox ovis recombinante para la terapia inmunológica específica del órgano, tejido y/o célula dirigida a diana se puede usar proteínas/péptidos virales conocidos, que pueden estar tanto no modificados como también modificados, alargados o recortados. Se ha demostrado como especialmente adecuado a este respecto, por ejemplo, la proteína de envoltura grande del virus de la hepatitis B humano (HBV) para el acceso al hígado.

Además se pueden usar proteínas/péptidos no virales, especialmente la asialoglicoproteína, para la terapia dirigida a diana del hígado.

También es posible el uso de nuevas proteínas/péptidos sintéticos cuyas secuencias se pueden identificar ^{8)} por medio de técnicas comunes para el especialista en la técnica, por ejemplo, a partir de bibliotecas de fagos.

Adicionalmente a los péptidos o proteínas mencionados se pueden seleccionar, por ejemplo, epítopos inmunomoduladores del virus de la hepatitis B u otros virus, o clonar antígenos asociados a tumores en el virus parapox.

Por tanto se introduce una propiedad inmunoestimuladora fuerte, específica frente a los agentes infecciosos o al tumor en el virus parapox.

La identificación de los epítopos adecuados tiene lugar con técnicas comunes para el especialista en la técnica conocidas como, por ejemplo, la citometría de flujo ^{9)}.

La preparación y caracterización de nuevos virus recombinantes con las propiedades descritas se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como se indica a continuación.

En la preparación de un virus recombinante, al que le faltan secuencias, no son necesarios sus productos génicos o partes de estos para la actividad inmunomodulatoria o para la replicación del virus.

Un ejemplo para la clonación del virus parapox ovis recombinante viene de la construcción de los casetes de selección dobles, que expresan un gen marcador, por ejemplo, el gen LacZ con control del gen Vaccinia 11K o de otra secuencia adecuada y otro gen marcador de selección, por ejemplo, el gen gpt (codificado para la enzima xantin-guanin-fosforibosil-transferasa, XGPRT) con control del promotor adecuado correspondiente. La deleción de las secuencias virales se puede llevar a cabo entonces, por ejemplo, como se describe a continuación:

Se usan como puntos de partida los lugares de corte de restricción singulares en una zona no esencial del virus parapox ovis tanto para la replicación viral como para la actividad inmunomodulatoria, un gen de proteína de envoltura adecuado, otro gen que codifica para una proteína de estructura (en lo sucesivo denominado gen adecuado) u otro gen, por ejemplo, el gen VEGF, para efectuar una deleción bidireccional de secuencias mediante acción de la endonucleasa Ba131.

A tal efecto, por ejemplo, el plásmido correspondiente, un gen de proteína de estructura adecuado, que contiene la secuencia de ácido nucleico de virus parapox ovis, se abre en el gen VEGF con un enzima de restricción adecuado e incuba desde ahora el plásmido linealizado con Ba131. Los plásmidos de deleción adecuados se completan y acto seguido los oligonucleótidos complementarios, que dan lugar a nuevos lugares de corte singulares, por ejemplo, SmaI, SaII y lugares de corte de restricción EcoRV, se ligan a los productos BaI 31 provistos con extremos lisos.

Tras la transformación de bacterias el ADN plásmido se puede aislar y escindir con un enzima, que no contiene en la secuencia del fragmento de ADN de virus parapox ovis correspondiente lugar de reconocimiento alguno. Tras la inserción del casete de selección LacZ/gpt recortado con el enzima de restricción correspondiente en los lugares de deleción en el gen adecuado se puede determinar el tamaño exacto de las deleciones producidas en cada ADN plásmido recombinante resultante mediante secuenciación.

El virus, al que le falta entonces el producto génico correspondiente o una parte del mismo, se puede preparar por ejemplo como sigue:

células adecuadas lavadas confluentes como, por ejemplo, células de riñón bovino, se infectan con una dosis de infección de multiplicidad de infección de aproximadamente 0,1 (moi). Tras aproximadamente dos horas se transfectan las células infectadas con un plásmido de deleción preparado como se describió anteriormente (por ejemplo, 10 \mug), por ejemplo, con uso de sistemas de transfección comunes para el especialista en la técnica y que se adquieren comercialmente. A continuación se incuban estos cultivos celulares con un medio de selección adecuado (por ejemplo, con medio HAT [hipoxantina-aminopterina-timidina], MPA [ácido micofenólico] durante 3 a 6 días a aproximadamente 37ºC y en atmósfera de aproximadamente el 5% en CO_{2} hasta que sea visible un efecto citopático (cpe) o formación de placa. Luego se lisan las células, se prepara una secuencia de dilución a partir del lisado celular y se lleva a cabo un ensayo de placa sobre las células adecuadas. Para el ensayo de placas se añade una mezcla de medio de agarosa que puede contener, por ejemplo, aproximadamente 0,3 mg/ml de Bluo-Gal (GIFCO) para identificar las placas azules que, por ejemplo, contienen virus recombinantes resistentes a MPA, que expresan LacZ. Los virus recombinantes así obtenidos se usan para infección de células adecuadas como, por ejemplo, células de riñón bovino, y sometidos al menos a otras dos valoraciones de placa hasta la mayor homogeneidad posible presentan lo más favorablemente > 99,9% de población de virus recombinante.

En la preparación de un virus recombinante, que contiene las secuencias, son necesarios sus productos génicos o partes de estos para un direccionamiento específico para órgano, tejido o célula.

Para la preparación del virus recombinante con secuencias de direccionamiento se procede de forma análoga. Como virus de partida se usa un virus modificado como se describió anteriormente. De forma alternativa puede tener lugar la inclusión de la secuencia de direccionamiento en un virus no modificado genéticamente, si la replicación del virus y/o la actividad inmuno-modulatoria no se ven influidas de forma negativa. En lugar del plásmido, que contiene las secuencias delecionadas o recortadas de virus parapox ovis, se usa un plásmido correspondiente que contiene una secuencia de ADN no modificada o modificada de forma adecuada, que codifica una proteína o péptido, que hace posible un direccionamiento específico para órgano, tejido y/o célula del virus recombinante en forma no inactivada o en forma inactivada. Esto puede ser para el caso, por ejemplo, de que el virus recombinante se transportase al hígado, por ejemplo, la secuencia para la proteína de envoltura grande del virus de la hepatitis B del hombre u otra secuencia adecuada. Si la incorporación de la secuencia de direccionamiento se efectúa en un gen que no codifica para una proteína estructural, entonces la secuencia de direccionamiento se puede acoplar con los núcleos de membrana correspondientes para hacer posible una incorporación en la envoltura del virus.

La elección del marcador de selección en la preparación ha de cumplir que no interfiera o sólo en modo y forma conocida con los marcadores de selección ya disponibles.

De forma análoga se puede incorporar adicionalmente secuencias que codifican para epítopos inmunológicamente activos. Tales epítopos se seleccionar con los procedimientos conocidos por el especialista en la técnica ^{9)}.

Comprobación de las propiedades de direccionamiento del virus recombinante

Las nuevas propiedades del virus recombinante se demuestran por un lado en estos virus por medio de los procedimientos adecuados conocidos por el especialista en la técnica como, por ejemplo, el uso de marcadores de selección y/o la comprobación de la nueva proteína/péptido tiene lugar mediante Western-Blot. Por otro lado puede tener lugar una comprobación funcional. Esto se realiza en células diana del direccionamiento. En el caso de un direccionamiento al hígado con un virus recombinante, que puede contener asialoglicoproteína o partes correspondientes de la misma, se demuestra esta comprobación funcional mediante unión de virus recombinantes en células, que expresan el receptor de la asialoglicoproteína. Estas pueden ser células del hígado humano o células del hepatoma (por ejemplo, HepG2), en las cuales se pueden llevar a cabo estudios de unión competitiva con asialoglicoproteína y virus recombinantes.

Para los controles tienen lugar estos estudios también en células, que no expresan el receptor de la asialoglicoproteína, por ejemplo fibroblastos. Las propiedades de direccionamiento se encuentran disponibles tanto en virus recombinantes inactivados como también en no inactivados. Para una terapia se usan, sin embargo, sólo aquellos virus recombinantes, en los que se podrían comprobar las propiedades de direccionamiento correspondiente a los lugares diana terapéuticos.

Comprobación de las propiedades inmunomoduladoras

La comprobación de las propiedades inmunomoduladoras del virus recombinante puede tener lugar de forma experimental, por ejemplo, en ratones. A tal efecto se inyecta a ratones, por ejemplo, ratones Balb/c, el virus recombinante en forma inactivada o no inactivada, por ejemplo, en una cavidad corporal, por ejemplo, por vía intraperitoneal o subcutánea, intramuscular o intravenosa. Según un cronograma que se va a fijar, por ejemplo, 6, 12, 24 horas tras al aplicación, los animales se sacrifican, y se extraen los órganos y/o células, por ejemplo células, que se consiguen mediante lavado peritoneal. De los órganos/células se aísla el material genético como, por ejemplo, el ARN, y se determina la expresión de la citoquina mediante procedimientos adecuados como, por ejemplo, mediante PCR semi-cuantitativa o cuantitativa.

Para una terapia se usan luego aquellos virus recombinantes de cuyas propiedades inmunomoduladoras (inducción de una respuesta inmune Th1) se espera que den un efecto terapéutico.

Con la motivación de la relación conocida de influencia de una respuesta inmune Th1 sobre infecciones de virus latentes y crónicamente persistentes ^{10, 11)} y de las propiedades inmunomoduladoras del virus parapox ovis recombinante similares o mejoradas en comparación con el virus parapox ovis no recombinado es posible el uso de virus parapox ovis recombinante específico para órgano, tejido y/o célula como monoterapia o en combinación con compuestos biológicamente activos (por ejemplo, antivirales), de bajo peso molecular, o proteínas biológicamente activas en humanos y animales y de uso terapéutico para la terapia antiviral de infecciones predominantemente crónicas con el virus de la hepatitis B; son de mencionar otras infecciones virales de órganos internos, sobre todo del hígado, en donde por ejemplo el virus de la hepatitis C (HCV), o todos los demás agentes infecciosos del grupo de los virus que provocan la hepatitis ^{12)}, infecciones, también en compañía de otras enfermedades, con los distintos tipos de virus simple del herpes (HSV); los distintos tipos del virus del papiloma humano (HPV); el virus de inmunodeficiencia humana (HIV); el citomegaliecirus humano (HCMV); así como las correspondientes enfermedades víricas en animales.

Además se pueden llevar a cabo con el virus parapox recombinante en base al mecanismo de acción mostrado especialmente los siguientes tratamientos profilácticos o terapéuticos prometedores:

Impedir las recurrencias en infecciones por virus del herpes, metafiláxis, es decir, impedir el establecimiento de infecciones virales (por ejemplo, por HIV), si se trata directamente tras la exposición con el agente ^{13)}. El tratamiento de cáncer es igualmente posible en base al mecanismo de acción ^{14, 15)}. También en estas indicaciones mencionadas es posible el uso de virus parapox ovis recombinantes específicos para órgano, tejido y/o célula como monoterapia o en combinación razonable con compuestos biológicamente activos de bajo peso molecular.

Es igualmente posible el tratamiento de enfermedades inflamatorias y no inflamatorias degenerativas y proliferativas del hígado como, por ejemplo, la cirrosis hepática y/o la fibrosis hepática con virus parapox ovis recombinante. También es posible en estas indicaciones mencionadas el uso de virus parapox ovis recombinante específico para órgano, tejido y/o célula como monoterapia o en combinación razonable con compuestos biológicamente activos de bajo peso molecular.

En correspondencia al planteamiento clínico (por ejemplo, enfermedad por virus de la hepatitis B crónica del hombre) se prepara el virus recombinante para la terapia específica para órgano, tejido y/o célula.

Se procede de forma que los genes, que no son necesarios para una inducción de una respuesta inmune mediada por la célula, son delecionados o mutados. En estos genes o recortes de genes libres se usan luego las secuencias génicas que codifican para epítopos (péptidos/proteínas), que garantizan una interacción específica con uno o más receptores sobre las células diana de tejidos o células diana de órganos. De forma alternativa se puede usar las secuencias de genes que codifican para epítopos correspondientes en virus parapox no modificados genéticamente, si la replicación del virus, la maduración del virus y/o las propiedades inmunomodulantes no se ven influenciadas de forma negativa.

De forma adicional se puede reforzar específicamente por medio de epítopos inmunológicamente activos adecuados (por ejemplo, epítopos del HBV), la respuesta inmune mediada por las células frente a un agente infeccioso.

Para esto se dota el virus parapox ovis recombinante de integración/unión específica para órgano y/o célula adicionalmente con epítopos de potenciación de la respuesta inmune, direccionados contra uno o varios agentes infecciosos y se usa en la indicación respectiva (por ejemplo, contra uno o más de las enfermedades víricas anteriormente mencionadas como, por ejemplo, la enfermedad de la hepatitis B crónica del hombre). De forma alternativa las secuencias de genes que codifican los epítopos correspondientes se pueden usar en virus parapox no modificados genéticamente, si la replicación de virus, la maduración de virus y/o las propiedades inmunomodulantes no se ven influenciadas de forma negativa.

Según cada planteamiento clínico o virus participante etiológicamente se aplica el virus parapox ovis recombinante en forma inactivada o no inactivada sistémicamente (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa) o local (por ejemplo, en el órgano respectivo).

El virus parapox ovis recombinante se presenta a este respecto liofilizado y se suspende directamente antes de la aplicación en un disolvente adecuado o bien se presenta en otra formulación adecuada.

A este respecto pueden ser necesarias varias aplicaciones hasta la infusión continua según cronogramas que correspondan a los requisitos de los planteamientos clínicos.

El uso de virus parapox ovis específicos para órgano, tejido y/o célula puede tener lugar como monoterapia o en combinación con compuestos biológicamente activos, de bajo peso molecular que corresponden a la indicación y/o al planteamiento clínico.

En una combinación con compuestos biológicamente activos de bajo peso molecular la aplicación puede tener lugar de forma simultánea o con espaciamiento temporal. Así es posible, por ejemplo, reducir o evitar en primer lugar con un compuesto de bajo peso molecular (por ejemplo, análogos de nucleoides u otros compuestos) una replicación viral y a continuación provocar un aclaramiento viral con el virus parapox ovis recombinante. En una terapia de combinación tal es posible el uso, por ejemplo, también en infecciones virales agudas.

Ejemplo Para la preparación y ensayo de un mutante de direccionamiento para el mediador de entrada del virus del herpes

La glicoproteína D (gD) del virus del herpes bovino 1 (BHV-1) es responsable en la unión del virus a sus células diana y de la penetración del virus en las células diana, en donde toman parte en esto otras glicoproteínas virales (Liang y col. 1991). Los anticuerpos específicos gD de neutralización ejercen su función de modo que estos en una etapa que sigue a la adsorción del virus, alteran la penetración (Okazaki y col. 1986). La gd sirve por tanto como lugar de unión viral para el mediador de entrada del virus del herpes (HVEM) (Montgomery y col. 1996). Las células, que no poseen este mediador de entrada del virus del herpes, son resistentes frente a una infección con distintos virus del herpes, por ejemplo, virus del herpes humano 1 [HSV-1] o BHV-1, distintas cepas de BHV-1, que expresan fuertemente de formas distintas las gD, las células penetran fuertemente de formas distintas, con lo que existe una correlación positiva respecto al contenido en gK (Fehler, 1991).

El virus parapox ovis recombinante que porta la gD en la superficie, se puede usar para direccionar tales lugares de unión del HVEM sobre las células, que expresan el HVEM (por ejemplo, células MDBK). Estas células se infectan con BHV-1, virus parapox recombinante, el cual exprime la gD o virus parapox de tipo salvaje, de esta forma debería poder medirse el direccionamiento del HVEM en cuanto a la velocidad de penetración. A este respecto se espera que el virus parapox recombinante gD penetre en las células aproximadamente igual de rápido que el BHV-1, en cualquier caso, no obstante, más rápido que el virus parapox ovis de tipo salvaje, que puede infectar igualmente a las células MDBK.

Preparación del mutante LacZ

En el virus parapox ovis (cepa D 1701) se delecionaron casi completamente los genes vegf disponibles por partida doble en el genoma y en estos lugares se insertó respectivamente un casete de expresión lacZ-xgpt de E. coli (Rziha y col. 1999).

Preparación del plásmido de transfección para la recombinación homóloga

El gen de gD se amplificó a partir de BHV-1 incluyendo su secuencia de señal y anclaje de membrana (Tikoo y col. 1990) mediante PCR y se clona el extremo romo en el sitio de EcoRV del vector pDVRcc (Rziha y col. 1999). El grado de coincidencia de la secuencia de la gD en pDVRec con la secuencia original se confirmó mediante secuenciación (MWG Biotech).

Transfección

La transfección del mutante lacZ del virus parapox (D1701-RV) tuvo lugar con el plásmido aislado pDVRec/gD y células BKKL3A. En una monocapa de células de 70 a 80% (placa de 6 pocillos: número de células de aproximadamente 4\cdot10^{5} por pocillo) se llevó a cabo la transfección. Como reactivo de transfección sirvió el reactivo de transfección liposomal DOSPER. Las células se infectaron con el mutante lacZ del virus parapox en un MOI de 0,1. Se mezclaron 2 \mug del ADN plásmido en relación de 1:3 y 1:4 con DOSPER y se añadió a las células tras la infección del virus.

Las células mostraron a los 4 a 7 días tras la infección un efecto citopatógeno específico del virus y el virus se renovó mediante congelación y descongelación tres veces.

Limpieza de placas

Las células BKKL3A se infectaron con el virus recombinante diluido (10^{-2} a 10^{-6}) en etapas. Los pocillos en los que se observaban tras unos días aproximadamente de 10 a 30 placas de virus de partida se recubrieron con agarosa-Bluo-Gal 300 \mug/ml (GIBCO). Tras 24 a 48 horas de incubación a 37ºC (CO_{2} al 5%) tuvo lugar el picado de las placas blancas. El material vírico del bloque de agarosa punzonado se hizo eluir durante la noche en un medio y el virus se multiplicó de nuevo (primera limpieza de placa). Tras la primera limpieza de placa se hibridaron los clones en Dot Blot con una sonda de ADN-gD marcada con ^{32}P. La limpieza de los recombinantes positivos tuvo lugar mediante al menos etapas de limpieza de placa de tres veces.

Ensayo de penetración

Se cultivaron células de riñón bovino (MDBK, ATCC nº CCL-22) correspondientemente a las instrucciones de ATCC y se hicieron confluir en el comienzo del experimento. Se preincubaron las células durante 5 minutos a 4ºC. A continuación se succionó el medio y se añadió sobre las células (MOI 0,01) a) BHV-1, b) virus parapox recombinante gD o c) virus parapox ovis de tipo salvaje enfriado previamente (4ºC). Luego se incubaron las células durante 15 minutos a 4ºC, se succionó el medio y se lavaron las células una vez con PBS frío (4ºC). A continuación a esto se incubaron las células de nuevo en medio caliente a 37ºC de nuevo en la incubadora.

Tras 10, 20, 30, 60 y 120 minutos se lavó respectivamente 1 pocillo durante aproximadamente 45 segundos con tampón de citrato, un pocillo de control respectivo con PBS. Con ello se inactivaron los virus que hasta ese momento aún no habían penetrado en las células. Por tanto se obtiene una cinética de penetración. Las células se recubrieron tras los tratamientos ácidos con medio (que contiene metilcelulosa al 0,5%). Tras 3 días se fijaron las células, se colorearon y se valoraron las placas con una escala de 0 a ++++ en un visor de placas.

Resultado

Se muestra que en el BHV-1 y el virus parapox ovis recombinante gD (gDPPVO) ya tras aproximadamente 7 minutos ha penetrado en la membrana citoplasmática más de la mitad de los virus, mientras que el virus parapox ovis de tipo salvaje (wt PPVO) necesita para esto aproximadamente 20 minutos. Estas diferencias son significativas (análisis de varianza con comparación post hoc). Con esto se podría mostrar que a) la expresión de una proteína en la superficie del virus parapox ovis es posible y que b) esta proteína se puede usar para el direccionamiento de los receptores específicos, que se expresan nuevamente sobre células determinadas y/o tejidos determinados.

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21. Rziha H-J, Henkel M, Cottone R, Bauer B, Auge U, götz F, Pfaff E, Büttner M (1999): Generation of recombinant Parapoxviruses: Non-essential genes suitable for foreign gene expresión. Journal of Biotechnology (1.09.99) ?

22. Tikoo S K, Fitzpatrick D R, Babuik I A, Zamb T J (1990): Molecular Cloning, Sequencing, and Expression of functional bovine Herpesvirus 1 Glycoprotein gIV in Transfected Bovine Cells. Journal of Virology, vol. 64, nº 10, 5132-5142.

Claims (2)

1. Uso de virus parapox recombinante con propiedades de direccionamiento para la preparación de medicamentos.

2. Medicamento que contiene virus parapox recombinante con propiedades de direccionamiento.