RU2692628C1 - Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека - Google Patents
Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2692628C1 RU2692628C1 RU2018124583A RU2018124583A RU2692628C1 RU 2692628 C1 RU2692628 C1 RU 2692628C1 RU 2018124583 A RU2018124583 A RU 2018124583A RU 2018124583 A RU2018124583 A RU 2018124583A RU 2692628 C1 RU2692628 C1 RU 2692628C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- recombinant
- dgf
- gene
- virus
- Prior art date
Links
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 14
- 241000702620 H-1 parvovirus Species 0.000 title abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 6
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 abstract description 28
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 abstract description 28
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 abstract description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 4
- 208000034712 Rickettsia Infections Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010061495 Rickettsiosis Diseases 0.000 abstract 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 12
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 101150004676 VGF gene Proteins 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 6
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101710094856 Apoptin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710114676 E1B 55 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 2
- 101150076998 ICP34.5 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 (2-methoxy-4-nitro) 5-sulfo-phenyl Chemical group 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101710150820 Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100195053 Human herpesvirus 1 (strain 17) RIR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N Valacyclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCOC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C=N2 HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001348 anti-glioma Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000030173 low grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000000316 virotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к рекомбинантному штамму вируса осповакцины (ВОВ), продуцирующему апоптоз-индуцирующий онкотоксический белок NS1 парвовируса крыс Н-1 и обладающему онколитической активностью в отношении глиобластомы человека. Штамм VV-NS1-dGF депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-803. рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF получен на основе штамма Л-ИВП вируса осповакцины, содержащего делецию фрагмента гена вирусного ростового фактора, в район которой встроен синтетический ген NS1 парвовируса крыс Н-1. Ген NS1 экспрессируется под контролем ранне-позднего синтетического промотора PE/L ВОВ с образованием белка с молекулярной массой 100 кДа. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для разработки лекарственных средств нового поколения для борьбы с онкологическими заболеваниями. 6 ил., 5 пр.
Description
Изобретение относится к рекомбинантному штамму вируса осповакцины, продуцирующему белок NS1 парвовируса крыс Н-1, обладающему противоопухолевой активностью, и может быть использовано в биотехнологии, в частности, в генетической инженерии для разработки лекарственных средств нового поколения для борьбы с онкологическими заболеваниями, в частности с опухолями головного мозга человека.
Глиобластома - самая агрессивная первичная опухоль головного мозга человека с крайне неблагоприятным прогнозом. Средний безрецидивный период у больных глиобластомой составляет 6 мес., а средняя продолжительность жизни не превышает 9-12 мес. [1]. Несмотря на внедрение множества новых методов лечения, за последние 30 лет средняя продолжительность жизни больных увеличилась всего лишь на 2-3 мес. [2,3].
Лечение глиом представляет особую сложность. В настоящее время общепринятой в большинстве случаев является тактика комбинированного лечения, включающего хирургическую резекцию и последующую химио- и радиотерапию [4]. Основным ограничением в нейрохирургии глиом является недостаточная визуализация границ опухоли вследствие ее инфильтративного роста и расположения в функционально значимых областях головного мозга. Прогрессирование заболевания и неизбежный рецидив после проведенного лечения обусловлены, по-видимому, уцелевшими стволовыми клетками глиомы (СКГ), обладающими повышенной инвазивностью и устойчивостью к радио- и химиотерапевтическим воздействиям [1, 5].
Таким образом, существующие методы лечения глиом малоэффективны. В связи с этим актуальны работы по разработке улучшенных методов лечения. Применение онколитических вирусов (ОВ) является одним из перспективных инновационных подходов к терапии опухолей, в частности, к терапии глиом [5].
Терапия с применением онколитических вирусов обеспечивает избирательный лизис опухолевых клеток, а также высвобождение опухолеассоциированных антигенов и презентацию их иммунной системе хозяина. Малая вероятность формирования внутренней резистентности в опухолевых клетках к ОВ и отсутствие значительных побочных эффектов даже при высоких дозах системного введения, делает ОВ особо привлекательными для генно-инженерной разработки улучшенных вариантов с высокой терапевтической активностью для лечения онкологических больных [2,6]. Ряд онколитических вирусов в настоящее время уже проходят клинические испытания за рубежом в качестве новых противоопухолевых средств для лечения глиом.
На основе вируса кори был создан рекомбинантный онколитический штамм MV-CEA, который экспрессирует раково-эмбриональный антиген (CEA) - секретируемый белок, по уровню которого в сыворотке больного можно оценивать активность вируса в организме [7]. Вирус хорошо реплицировался и вызывал апоптоз при заражении различных культур клеток глиобластом человека. При испытании in vivo на модели глиобластомы человека U87, культивируемой на бестимусных мышах, вирус оказывал выраженное терапевтическое действие в отношении как подкожных, так и внутричерепных опухолей [7]. Вирус MV-CEA не обладал токсичностью при внутричерепном введении мышам и макакам-резус [7]. В октябре 2006 г.началась первая фаза клинических испытаний штамма MV-CEA на больных глиобластомой, итоговые результаты этих испытаний планируется опубликовать летом 2018 года. (https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00390299).
На основе онколитического герпесвируса был сконструирован штамм HSV1716, в котором делетирован ген ICP34.5, являющийся фактором нейровирулентности вируса. В доклинических исследованиях этот штамм селективно реплицировался в клетках глиом, а в нормальных клетках его репликация была блокирована. Штамм HSV1716 прошел три клинических испытания первой фазы среди пациентов с рецидивирующей глиомой. Испытания показали отсутствие токсичности и латентной герпесвирусной инфекции, а также замедление или прекращение прогрессии опухоли и увеличение продолжительности жизни у некоторых пациентов [8].
Другой штамм герпесвируса G207 несет как делецию обеих копий гена ICP34.5, так и инактивирующую инсерцию репортерного гена LacZ в области гена ICP6, кодирующего рибонуклеотид-редуктазу. Удаление этих трех генов еще более повышает аттенуацию вируса в отношении нормальных клеток и дополнительно усиливает его онкоселективность по сравнению со штаммом HSV1716. Штамм G207 прошел клинические испытания фазы 1а и 1b в группе пациентов с рецидивирующей глиобластомой. Препарат не оказывал токсического эффекта. У восьми больных из 21 был отмечен положительный ответ на терапию, у одного пациента продолжительность жизни после терапии составила 5,5 лет [1,9].
Среди онколитических аденовирусов, клинические испытания на пациентах с глиобластомами прошел пока только один рекомбинантный штамм dl1520, также известный как ONYX-015, способный избирательно реплицироваться в опухолевых клетках. Селективный онколитический эффект этого штамма достигается за счет делеции гена, кодирующего белок Е1В-55K и подавляющего активность опухолевого супрессора р53, что, в свою очередь, препятствует запуску апоптоза в зараженной клетке до окончания вирусного цикла. В случае делеции гена Е1В-55K репликация вируса будет успешной только в тех клетках, где р53 дефектен или отсутствует [10]. В первой фазе клинических испытаний штамма ONYX-015 участвовали 24 больных глиобластомой, дефектной по статусу р53. Результаты проведенных клинических испытаний показали, что препарат не вызывал серьезных побочных явлений. У одного больного прекратился рост опухоли, еще у одного замедлилась скорость роста опухоли, трое оставались живыми в течение более 19 мес. [11]. В настоящее время препарат HI01 (Oncorine) на основе штамма d1l520 (прототип ONYX-015) получил лицензию на применение в Китае. Хотя изначально этот препарат предназначался для лечения глиом, наибольшую эффективность он продемонстрировал при терапии злокачественных опухолей головы и шеи.
С использованием вышеперечисленных препаратов у большинства пациентов отчетливой положительной динамики не наблюдалось, однако, вместе с тем сообщается об отдельных случаях клинического улучшения после терапии ОВ. Такие результаты могут быть связаны с тем, что для I/II фазы клинических испытаний отбираются пациенты с 3-4 стадией онкологического заболевания при условии неэффективности для этих пациентов всех использованных ранее традиционных методов лечения опухоли (хирургического, химиотерапевтического и лучевого лечения). Также применяются довольно консервативные режимы терапии и невысокие дозы вируса.
Наиболее успешным в применении против глиобластом стал препарат ParvOryx, созданный на основе парвовируса HI [12,13]. В 2011 году в Германии были начаты I-II фазы клинических испытаний ParvOryx, которые показали его безопасность и признаки иммуногенной активности в отношении опухолей в группе пациентов с мультиформной рецидивирующей глиобластомой [14]. По результатам доклинических испытаний этого препарата до 80% животных с глиомой С6 после локального, системного или интраназального лечения препаратом ParvOryx полностью выздоравливали [13]. При комбинировании ParvOryx с предварительной радиотерапией цитотоксическое действие вирусного препарата еще более возрастало [15]. Таким образом, данный вирусный препарат на сегодняшний день можно считать одним из наиболее перспективных для лечения глиом.
Однако онколитический потенциал парвовируса является недостаточным для лизиса плотной массы солидной опухоли, а маленький размер его генома (5 тыс. п.н.) ограничивает возможности генно-инженерной модификации по усилению противоопухолевой активности препаратов на его основе. Мы в своей работе решили объединить онколитический потенциал парвовируса Н-1 и вируса осповакцины в отношении глиом. Вирус осповакцины (ВОВ), как онколитический агент, обладает целым рядом преимуществ относительно других вирусов, на основе которых были созданы противоглиомные препараты. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях «вирусных фабриках», не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. ВОВ обладает высоким литическим потенциалом для раковых клеток, хорошо передается от клетки к клетке через непосредственные мембранные контакты, что особенно важно для плотно агрегированных солидных опухолей [16]. ВОВ способен системно распространяться по организму, что обеспечивает его эффективную доставку к отдаленным опухолям и метастазам [17]. Исследование известных к настоящему времени штаммов ВОВ на способность реплицироваться в нормальных и опухолевых клетках показало, что уровень репликации всех штаммов в опухолевых клетках выше, чем в нормальных [18]. Для еще большего усиления селективных свойств в отношении опухолевых клеток, используют аттенуированные штаммы ВОВ [19]. Аттенуация может быть достигнута удалением одного или нескольких генов факторов вирулентности VACV, в частности, гена вирусного ростового фактора (virus growth factor, VGF). Ген VGF кодирует секретируемый белок, который стимулирует метаболическую активность, рост и деление окружающих неинфицированных клеток, обеспечивая эффективное распространение инфекции. Таким образом, делеция гена VGF обеспечит как аттенуацию вируса, так и его онкоселективность, поскольку экспрессия этого гена несущественна для репликации вируса в быстро делящихся клетках раковой опухоли.
Размер генома ВОВ позволяет встраивать до 25000 пар оснований чужеродной ДНК, не нарушая инфекционности вируса. Способность нести большое количество введенных инородных генов (трансгенов) используют для того, чтобы усилить онколитические свойства поксвирусов.
Перспективным трансгеном для усиления онколитической активности аттенуированных штаммов ВОВ в отношении глиом является неструктурный белок NS1 парвовируса крыс Н-1. При доклиническом исследовании ParvOryx было показано, что главным фактором, ответственным за онколитическую и цитотоксическую активность парвовирусов, является именно белок NS1, который способен специфически запускать апоптоз в раковых клетках человека. Опухолевые клетки мозга оказались особенно уязвимы к прямому цитотоксическому действию NS1 [14].
Наиболее близким аналогом (прототипом) представленного изобретения является рекомбинантный штамм BOB VVdGF-ApoS24/2 со встройкой синтетического гена апоптина вируса лейкоза кур, который способен индуцировать апоптоз широкого спектра раковых и трансформированных клеток. Рекомбинантный штамм VVdGF-ApoS24/2 имеет значимо большую цитотоксическую активность для ряда раковых клеток по сравнению с исходным родительским штаммом (Патент РФ №2492238) [20]. Однако наибольшую эффективность штамм VVdGF-ApoS24/2 проявил в отношении эпидермоидной карциномы кожи человека.
Техническим результатом заявляемого изобретения является рекомбинантный штамм BOB VV-NS1-dGF со встройкой синтетического гена NS1 парвовируса Н-1, обладающий специфической онколитической активностью в отношении глиобластом человека.
Указанный технический результат достигается конструированием рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF на основе российского штамма Л-ИВП ВОВ, содержащего делецию фрагмента гена вирусного ростового фактора (VGF) между позициями 7770 и 8071 п.н. (GenBank Асе. KP233807.1), в район которой встроен синтетически полученный трансген NS1, структура которого соответствует позициям 264 - 2280 п.н. генома парвовируса Н-1 (GenBank Асс. Х01457.1) с добавлением на С-конце белка последовательности, кодирующей эпитоп FLAG с мотивом DYKDDDDK, для иммунодетекции белка; трансген NS1 экспрессируется под контролем синтетического промотора PE/L ВОВ и продуцирует рекомбинантный белок NS1 с молекулярной массой 100 кДа; штамм VV-NS1-dGF обладает высокой онколитической активностью в отношении клеток глиобластомы человека и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-808.
Штамм VV-NS1-dGF образуется за счет одиночного кроссинговера между ДНК штамма Л-ИВП и плазмидной ДНК pGEM-Puro-NS1-Flag (фиг. 1) в цитоплазме клеток CV-1, последующей селекции полученной нестабильной конструкции с добавлением в культуральную среду пуромицина за счет наличия в ней гена устойчивости к этому антибиотику (Pat) [21] и внутримолекулярной рекомбинации после снятия селективных условий (фиг. 3). Последовательность гена NS1 парвовируса Н-1 с дополнительным фрагментом, кодирующим эпитоп FLAG, и фланкирующими сайтами рестрикции ApaI и NotI была синтезирована коммерчески. Далее эта последовательность по сайтам рестрикции ApaI и NotI была клонирована в плазмиду pGEM-Puro-UN-DS [21] под контроль ранне-позднего синтетического промотора PE/L ВОВ с получением плазмиды pGEM-Puro-DS-NS1-Flag. Эта плазмида использована для встройки гена NS1 и одновременной делеции гена VGF штамма Л-ИВП ВОВ.
Встройка в качестве трансгена гена NS1 в район делеции гена VGF способствует как дополнительной аттенуации (ослаблению) вируса в отношении нормальных клеток, так и усилению его литической (цитотоксической) активности в отношении клеток опухолей головного мозга.
Штамм VV-NS1-dGF характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя ВОВ, но в отличие от исходного штамма Л-ИВП имеет фенотип VGF-NS1+. Показано, что при заражении клеток глиобластомы U87MG штамм VV-NS1-dGF продуцирует белок NS1 парвовируса Н-1 с молекулярной массой 100 кДа, детектируемый в иммуноблоте по наличию эпитопа FLAG.
Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF имеет длину около 200000 п.н. Наличие в его геноме целевой вставки длиной 2058 п.н подтверждено с помощью метода ПНР (фиг. 3), экспрессия гена NS1 подтверждена Western blot анализом лизатов клеток U87MG, инфицированных рекомбинантным штаммом VV-NS1-dGF (фиг. 4). Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF со встройкой гена NS1 имеет значимо (Р<0.05) большую цитотоксическую активность в отношении клеток глиобластомы человека U87MG по сравнению с аналогичным образом аттенуированным рекомбинантом VVdGF2/6 с делецией гена VGF, но не содержащим встройку трансгена NS1 [21]. Рекомбинантный штамм VVdGF2/6 является более адекватным контролем для оценки вклада трансгена NS1 в онколитическую активность рекомбинанта VV-NS1-dGF, чем родительский не аттенуированный штамм Л-ИВП. ЦТД50 рекомбинантных штаммов VV-NS1-dGF и VVdGF2/6 составляет 0,082 и 0,3 БОЕ/клетку, соответственно.
Противоопухолевая активность рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF in vivo на модели nude мышей с подкожными ксенографтами клеток глиобластомы человека U87MG оказалась также выше по сравнению со штаммом VVdGF2/6, не содержащим встройку NS1. Однократное введение в район опухоли рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF приводит к значимому уменьшению размеров ксенографтов (фиг. 7). Нужно отметить, что никакого токсического эффекта при введении иммунодефицитным мышам высоких доз рекомбинантных штаммов VV-NS1-dGF и VVdGF2/6 (107 БОЕ/мышь) выявлено не было, что свидетельствует об аттенуации штаммов. При этом дополнительное введение трансгена NS1 усиливает адресную литическую активность вируса в отношении клеток глиобластомы человека.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:
Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность синтетического гена NS1 с заложенными по краям последовательности сайтами рестрикции ApaI и NotI (подчеркнуты и выделены цветом).
Фиг. 2. Физическая и генетическая карта плазмиды pGEM-Puro-DS-NS1-Flag. L-flank - фрагмент генома ВОВ штамма Л-ИВП длиной 939 п.н., расположенный слева от гена VGF; R-flank - фрагмент генома ВОВ длиной 980 п.н., расположенный справа от гена вирусного ростового фактора; Р7.5К (36 п.н.) и PE/L (42 п.н.) - синтетические ранний и ранне-поздний промоторы ВОВ [22]; NS1- синтетический ген NS1 парвовируса Н-1 с заложенными по краям последовательности сайтами рестрикции ApaI и NotI, размер 2058 п.н; Pat - ген пуромицин N-ацетилтрансферазы, определяющий устойчивость к пуромицину; APr - ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину; ORI - область начала репликации.
Фиг. 3. Схема конструирования рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF ВОВ методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к пуромицину (Pat). L-flank и R-flank -фрагменты генома ВОВ, штамм Л-ИВП, фланкирующие ген VGF слева и справа соответственно (как на фиг. 2); NS1 - ген NS1 парвовируса Н-1 (как на фиг. 2); Р7.5К и PE/L - синтетические промоторы ВОВ (как на фиг. 2);
Фиг. 4. Структура рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF. А - схема генома с указанием позиций праймеров (подписи как на фиг. 3). Б - результаты ГЩР-анализа рекомбинантов с использованием пары праймеров Up35×Apa-L22.
Мв - контроли молекулярных весов; 1 - исходный штамм Л-ИВП (583 п.н.); 2 - рекомбинант VV-NS1-dGF (2456 п.н.). В - Вестерн-блот анализ с использованием коммерческих антител на эпитоп FLAG, введенный в С-конец рекомбинантного белка NS1, а также с антителами к структурному белку P-actin в качестве контроля, где: 1 - лизат клеток U87G, инфицированных VV-NS1-dGF; 2 - лизат клеток U87G, инфицированных Л-ИВП.
В качестве специфических антител использовали ANTI-FLAG BioM2 (Sigma-Aldrich, США). В качестве вторичных антител - антимышиные IgG (целая молекула), конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma-Aldrich, США). В качестве субстрата использовали BCIP (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate) и NBT (Nitro Blue tetrazolium).
Фиг. 5. Онколитическая активность рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF в клетках глиобластомы человека в сравнении с аналогичным рекомбинантом VVdGF2/6, не содержащим встройки NS1. Клетки выращивали в 96-ти луночных планшетах, инфицировали 10-кратными разведениями вируса в диапазоне доз 0,001-10 БОЕ на клетку и рассчитывали 50%-ную цитотоксическую дозу для каждого вируса (ЦТД50) в фотометрическом тесте с использованием субстрата для митохондриальных дегидрогеназ 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ).
Фиг. 6. Ингибирование роста ксенографтов глиобластомы человека U87MG рекомбинантным штаммом VV-NS1-dGF и штаммом сравнения VVdGF2/6. Стрелкой указана точка введения вируса и начала измерения (1 сутки). Дни наблюдения на оси абсцисс указывают период, прошедший после начала «лечения» (введение вируса). Различия между всеми группами достоверны на 23 сутки эксперимента на уровне значимости Р<0,05.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pGEM-Puro-NS1-Flag.
Плазмида pGEM-Puro-NS1-Flag была получена на основе pGEM-Puro-UN-DS [21]. Ген NS1 парвовируса Н-1 получен синтетическим путем в соответствии со структурой, представленной в GenBank под номером Х01457.1, позиции нуклеотидов 264-2280 (DNA2.0, США). К С-концу гена NS1 была добавлена последовательность, кодирующая эпитоп FLAG с мотивом DYKDDDDK, для иммунодетекции синтезируемого NS1 с помощью коммерческих антител. Также по краям последовательности гена NS1 были заложены сайты рестрикции ApaI и NotI (фиг. 1).. Конструирование целевой плазмиды заключалось в лигировании фрагмента NS1/NotI-ApaI в векторную плазмиду pGEM-Puro-UN-DS/NotI-ApaI.
Полученная рекомбинантная плазмида pGEM-Puro-NS1-Flag (фиг. 2) была наработана в препаративных количествах из 1000 мл среды Лурия-Бертани и выделена с использованием набора лабораторных реагентов для выделения плазмидной ДНК, очищенной от эндотоксинов «EndoFree Plasmid Maxi Kit» (Qiagen). Данная плазмида использована для встройки трансгена NS1 в район делеции гена VGF в геноме ВОВ.
Пример 2. Трансфекция клеток CV-1 рекомбинантной плазмидой pGEM-Puro-NS1-Flag и получение рекомбинантного штамма BOB VV-NS1-dGF.
Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF получен в результате однократного кроссинговера между геномной ДНК штамма Л-ИВП ВОВ и гомологичной последовательностью одного из фланков VGF-гена плазмидной ДНК pGEM-Puro-NS1-Flag (пример - R-flank на фиг. 3). В результате кроссинговера образуется нестабильная вирусная конструкция, которая, за счет встройки гена Pat, обладает устойчивостью к пуромицину. Количество образующихся рекомбинантов невелико, однако уже через три селективных пассажа с добавлением в культуральную среду пуромицина вирусная популяция практически полностью состоит из рекомбинантных вариантов. После снятия селективных условий за счет внутримолекулярной рекомбинации по гомологичным участкам плазмидной и вирусной ДНК происходит расщеплнние нестабильной конструкции на исходный вариант с геномом штамма Л-ИВП и искомый вариант VV-NS1-dGF (фиг. 3).
Для получения рекомбинантного штамма вируса VV-NS1-dGF использовали реагент для трансфекции Lipofectamine™ LTX и реагент Plus (Invitrogen). Трансфекцию проводили на 90%-ном монослое клеток CV-1, выращенном в шестилуночных планшетах (Greiner). Клетки инфицировали вирусом осповакцины с множественностью 0,05 БОЕ/клетка и через 1 час инкубации при 37°С добавляли смесь плазмидной ДНК (5 мгк)+липофектамин (20 мкл)+Реагент Plus в соответствии с рекомендацией производителя в 1 мл среды Opti-MEM (Invitrogen). Через 1 час инкубации при 37°С в лунки добавляли 2 мл среды Opti-MEM и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 24-36 часов до развития цитопатического действия (ЦПД). Материал трижды замораживали-оттаивали и обрабатывали ультразвуком для получения гомогенной вирусной суспензии. Далее проводили селекцию рекомбинантов путем трехкратного пассирования на монослое клеток CV-1 с добавлением пуромицина (Sigma) в концентрации 10 мкг/мл среды DMEM (Invitrogen). Вирус клонировали методом бляшек под твердым агаровым покрытием и анализировали на наличие встройки гена NS1 методом ГЩР с использованием праймеров Up35 5'-GTAAGCAAAGAATATAAGAATGAAGCGGTAATGAT-3' и Apa-L22 5'-CGAGCACAATACCGGGAGATGG-3' (позиции праймеров указаны на фиг. 4А). Вирусную ДНК для проведения ГЩР выделяли с использованием наборов «РИБО-сорб» (ЗАО «Интерлабсервис»). Размер амплифицированного фрагмента ДНК исходного ВОВ составлял 583 п.н. (фиг. 4), а рекомбинантного вируса со встройкой гена NS1 - 2456 п.н. (фиг. 4Б). Отобранный рекомбинантный вариант VV-NS1-dGF дважды реклонировали, чтобы избежать следовых примесей исходного вируса, нарабатывали на монослое клеток CV-1 и очищали центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (25-40%). Титр вируса определяли методом бляшек на монослое клеток CV-1, окрашенном фиксирующим раствором кристаллического фиолетового (2 г/л кристаллический фиолетовый, 50 мл/л формальдегид, 100 мл/л этанол, вода). Очищенный рекомбинантный штамм BOB VV-NS1-dGF с титром 109 БОЕ/мл хранится в расфасованном виде при -80°С и используется для проведения дальнейших исследований.
Пример 3. Оценка экспрессии гена NS1 рекомбинантным штаммом ВОВ VV-NS1-dGF.
Экспрессию трансгена NS1 в составе рекомбинантов анализировали методом Вестерн-блот с использованием коммерческих антител на эпитоп FLAG, введенный в С-конец рекомбинантного белка (фиг. 1). Размер транскрипта, включающего последовательность гена NS1 и эпитопа FLAG, составляет 2163 п.н. Расчетная молекулярная масса полипептида составляет 75-80 кДа. По данным литературы в инфицированных парвовирусом Н-1 клетках регистрируется две формы белка NS1 - с молекулярной массой 84 кДа и 100 кДа [24]. Увеличение молекулярной массы обуславливается разной степенью фосфорилирования белка. Форма NS1 с молекулярной массой 100 кДа является наиболее полной его модификацией, необходимой для выполнения множественных функций этого белка, включая онкотоксические функции.
Вестерн - блот анализ проводили следующим образом. Монослой клеток U87G (90% поверхности), выращенный в культуральном матрасе объемом 650 мл (Greiner), инфицировали рекомбинантным штаммом ВОВ VV-NS1-dGF с множественностью 1 БОЕ/кл. Инкубировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5% CO2 в среде ДМЕМ с 2% фетальной бычьей сыворотки, затем среду удаляли, клетки разрушали лизирующим буфером (50 мМ Трис-HCl рН 7.5, 150 мМ NaCl, 1% Triton Х-100, 5 мМ MgCl2, смесь ингибиторов протеаз (proteases inhibitor cocktail)) в объеме 7 мл. Проводили три раунда замораживания-оттаивания и обработку ультразвуком (3 раза по 20 с при 200-300 Вт с охлаждением (10 с) после каждой обработки), центрифугировали (14000 об/мин, 30 мин, 4°С). Супернатант анализировали методом электрофореза с последующим переносом белков на мембрану (Вестерн-блот) с использованием в качестве первичных антител ANTI-FLAG BioM2 (Sigma-Aldrich, США), а в качестве вторичных - антимышиные IgG (целая молекула), конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma-Aldrich, США). Электрофоретическое разделение белков проводили в камере «BioRad» в 5% концентрирующем и 12% разделяющем акриламидном геле при V=100. Перенос белков с геля осуществляли в камере Mini Trans-Blot cell «BioRad» на мембрану Immun-BlotTMPVDF Membrane for Protein Blotting 0,2 μm при V=100 1 час 20 минут.Затем мембрану промывали буфером для переноса и помещали в блокирующий раствор - TBS рН 7,4 с 5% молоком (Skim Milk Powder, Biochemika, Fluka) на 1 час при комнатной температуре (КТ) на качалке. Отмывали мембрану 3 раза по 5 минут TBS рН 7,4 на качалке и инкубировали 16 часов, при +4°С с первичными антителами в рабочей концентрации 0,2 мкг/мл, в TBS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока. После связывания с первичными антителами мембраны отмывали 3 раза по 5 минут TBS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке, затем проводили связывание со вторичными антителами в рабочем разведении 1:5000 в TBS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока в течение 1 часа при КТ на качалке. После связывания с коньюгатом отмывали 3 раза по 5 минут TBS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке. В качестве субстрата использовали BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) и NBT (Nitro Blue tetrazolium). Останавливали реакцию промыванием мембраны в дистиллированной воде.
Результаты эксперимента представлены на фиг. 4 В, из которого следует, что в лизатах клеток, инфицированных штаммом VV-NS1-dGF выявляется белок с молекулярной массой 100 кДа, который позитивно реагирует с антителами к эпитопу FLAG (фиг. 4 В, дорожка 1). В лизатах клеток, инфицированных исходным штаммом Л-ИВП специфический белок не выявляется (фиг. 4 В, дорожка 2). Таким образом, сконструированный нами рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF экспрессируют белок NS1 в форме, наиболее близкой к его природной полноразмерной модификации.
Пример 4. Оценка онколитической активности рекомбинантного штамма BOB VV-NS1-dGF в отношении клеток глиобластомы человека.
Исследование онколитической активности рекомбинантного варианта VV-NS1-dGF in vitro в отношении клеток глиобластомы человека U87MG проводили микрометодом на 96-луночных культуральных планшетах (Greiner) с использованием субстрата для митохондриальных дегидрогеназ 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ) (Sigma). В качестве отрицательного контроля использовали рекомбинантный штамм VVdGF2/6, с делецией гена VGF, но не содержащий встройку трансгена NS1 [21]. Рекомбинантный штамм VVdGF2/6 является более адекватным контролем для оценки онколитической активности рекомбинанта VV-NS1-dGF, чем родительский неаттенуированный штамм Л-ИВП. Онколитическую активность вирусов выражали как ЦТД50 - эффективная концентрация вируса, выраженная в количестве бляшкообразующих единиц на клетку (БОЕ/кл.), необходимая для гибели 50% клеток. Для определения ЦТД50 в лунки планшета с 50%-ным монослоем клеток вносили десятикратные разведения вирусной суспензии с множественностью инфекции от 10 до 0,001 БОЕ/кл. (multiplicity of infection, MOI) в 100 мкл среды 199 (Биолот) с добавлением 2% фетальной сыворотки коров (HyClone). Планшеты помещали в термостат при температуре 37°С, 5% СО2, влажности 85% и инкубировали 72 часа. После инкубации в каждую тестируемую лунку добавляли по 50 мкл реагента ХТТ и феназин-метасульфата (PMS) (Sigma), который получали добавлением к рабочему раствору с содержанием ХТТ 1 мг/мл раствора PMS 1,25 мМ из расчета: на каждый 1 мл ХТТ - 20 мкл PMS. Планшет инкубировали еще 3 часа и определяли оптическую плотность ОП490/620 на планшетном спектрофотометре SpectraCount (Packard). Строили график зависимости ОП от MOI и определяли ЦТД50 - концентрацию вируса, при которой величина ОП490/620, измеренная в зараженных лунках, составляет 50% от величины ОП490/620, измеренной в лунках с незараженной культурой. Сравнивали ЦТД50 рекомбинантного штамма BOB VV-NS1-dGF с ЦТД50 контрольного штамма W-dGF2/6 (фиг. 5). ЦТД50 рекомбинантного штамма VV-NS1-dGF (0,082 БОЕ/кл.) значимо ниже ЦТД50 контрольного штамма VVdGF2/6 (0,3 БОЕ/кл.) (Р<0,05), что свидетельствует об усилении онколитической активности вируса в результате встройки трансгена NS1 в отношении клеток глиобластомы человека.
Пример 5. Оценка онколитической активности патентуемого штамма BOB VV-NS1-dGF и рекомбинанта сравнения VVdGF2/6 in vivo на ксенографтах глиобластомы человека U87MG, привитых подкожно мышам линии nude.
В работе использовали самок nude мышей в возрасте 6-8 нед, весом 18-20 г.Для формирования опухолей мышам вводили суспензию клеток U87MG. С этой целью суспензию клеток U87MG (1,0×10 клеток/мл) в 0,9% NaCl смешивали с Matrigel (BD Bioscience, США) в соотношении 2:1 и 100 мкл этой суспензии вводили подкожно в правый бочок мыши ближе к бедру. Время формирования опухолей (ксенографтов) составляло 20 дней, после которых в эксперимент было отобрано 15 мышей с опухолями объемом 80-120 мм3. Мышей разделили на три равные группы (n=5). Первым двум группам вводили рекомбинантные штаммы VV-NS1-dGF и VVdGF2/6 в область опухоли в дозе 107 БОЕ/мышь в 100 мкл стерильного 0,9%-го NaCl. Мышам третьей контрольной группы аналогично вводили 100 мкл 0,9%-го NaCl. Мониторинг состояния мышей осуществляли 2 раза в неделю, объем опухоли рассчитывали по формуле L×W2×0,5 [23]. Общий период наблюдения после введения вируса составил 24 дня. В течение эксперимента размеры ксенографтов у мышей контрольной группы, не подвергавшейся виротерапии, постепенно увеличивались, достигая в среднем 170 мкл к концу эксперимента (фиг. 6). Однократное введение в район опухоли рекомбинантного штамма VVdGF2/6 приводит к полному торможению роста ксенографтов. Введение же штамма VV-NS1-dGF в той же самой дозе приводит не только к торможению роста, но и к значимому уменьшению размеров ксенографтов (Р<0,05) (фиг. 6).
Таким образом, выше изложенные результаты (примеры 1-5) подтверждают достижение заявляемого технического результата, а именно, создан рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий синтетический ген NS1 парвовируса Н-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека.
Источники научно-технической и патентной информации
1. Губанова Н.В. и др. Онколитические вирусы в терапии глиом // Молекулярная Биология. - 2012. - №. 46. - С. 874-886.
2. Wollmann G., Ozduman К., van den Pol A.N. Oncolytic Virus Therapy for Glioblastoma Multiforme // Cancer J. - 2012. - Vol. 18. - No. 1. - P. 69-81.
3. Liu C. et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma // Cell. 2011. - Vol. 146. - No. 2. - P. 209-221.
4. Mirimanoff R.O. et al. Radiotherapy and temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: Recursive partitioning analysis of the EORTC 26981/22981-NCIC CE3 phase III randomized trial // J. Clin. Oncol. - 2006. - Vol. 24. - No. 16. - P. 2563-2569.
5. Баклаушев В.П. и др. Онколитические вирусы в лечении низкодифференцированных глиом // Клиническая практика. - 2015. - №. 2. - С. 46-59.
6. Cheema Т.A. et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2013. - Vol. 110. - No. 29. - P. 12006-12011.
7. Phuong L.K. et al. Use of a vaccine strain of measles virus genetically engineered to produce carcinoembryonic antigen as a novel therapeutic agent against glioblastoma multiforme // Cancer Res. - 2003. - Vol. 63. - No. 10. - P. 2462-2469.
8. Rampling R. et al. Toxicity evaluation of replication-competent herpes simplex virus (ICP 34.5 null mutant 1716) in patients with recurrent malignant glioma // Gene Ther. - 2000. - Vol. 7. - No. 10. - P. 859-866.
9. Markert J.M. et al. Phase lb trial of mutant herpes simplex virus G207 inoculated pre- and post-tumor resection for recurrent GBM // Mol. Ther. - 2009. - Vol. 17. - No. l. - P. 199-207.
10. Bischoff J.R. et al. An Adenovirus Mutant That Replicates Selectively in p53-Deficient Human Tumor Cells // Science. - 1996. - Vol. 274. - No. 5286. - P. 373-376.
11. Chiocca E.A. et al. A phase I open-label, dose-escalation, multi-institutional trial of injection with an E1B-attenuated adenovirus, ONYX-015, into the peritumoral region of recurrent malignant gliomas, in the adjuvant setting // Mol. Ther. - 2004. - Vol. 10. - No. 5. - P. 958-966.
12. Geletneky K. et al. Phase I/IIa study of intratumoral/intracerebral or intravenous/intracerebral administration of Parvovirus H-1 (ParvOryx) in patients with progressive primary or recurrent glioblastoma multiforme: ParvOryx01 protocol //BMC Cancer. - 2012. - Vol. 12. - doi: 10.1186/1471-2407-12-99.
13. Rommelaere J. et al. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics // Cytokine Growth Factor Rev. Elsevier Ltd. - 2010. - Vol. 21. - No. 2-3. - P. 185-195.
14. Geletneky K. et al. Oncolytic H-l Parvovirus Shows Safety and Signs of Immunogenic Activity in a First Phase I/IIa Glioblastoma Trial // Mol. Ther. - 2017. - Vol. 25. - No. 12. - P. 2620-2634.
15. Geletneky K. et al. Improved killing of human high-grade glioma cells by combining ionizing radiation with oncolytic parvovirus H-l infection // J. Biomed. Biotechnol. - 2010. - Vol. 2010. - doi: l0.1155/2010/350748.
16. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. Fields Virology, 5th Edition // Fields Virology. - 2007. - Vol. 2. - No. 1. 3177 p.
17. Breitbach С J. et al. Intravenous delivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans // Nature. - 2011. - Vol. 477. - No. 7362. - P. 99-104.
18. Thorne S.H. et al. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963 // J. Clin. Invest. - 2007. - Vol.117. - No. 11. - P. 3350-3358.
19. McCart J.A., Bartlett D.L., Moss B. Combined Growth Factor-deleted And Thymidine Kinase-deleted Vaccinia Virus Vector // US 20070154458 A1. опубл. 2007.
20. Чумаков П.М. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-Puro-DS-Apo, содержащая синтетический ген апоптина, фланкированный последовательностями генома вируса осповакцины из района C10L-C12L, и рекомбинантный штамм VVdGF-ApoS24/2 вируса осповакцины, продуцирующий апоптин. // Патент РФ №2492238 Опубликован 10.09.2013. -Бюл.. №25. (прототип).
21. Кочнева Г.В. и др. Apoptin enhances the oncolytic activity of vaccinia virus in vitro // Mol. Biol. - 2013. - Vol. 47. - No. 5. - P. 733-742.
22. Merchlinsky M. et al. Construction and characterization of vaccinia direct ligation vectors // Virology. - 1997. - Vol. 238. - No. 2. - P. 444-451.
23. Yu Z. et al. Oncolytic vaccinia therapy of squamous cell carcinoma // Mol. Cancer. - 2009. - Vol.8. - doi: 10.1186/1476-4598-8-45.
24. Rhode S.L., Paradiso P.R. Parvovirus replication in normal and transformed human cells correlates with the nuclear translocation of the early protein NS1. // J. Virol. - 1989. - Vol. 63. - No. 1. - P. 349-355.
Claims (1)
- Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины (ВОВ), депонированный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-803 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018124583A RU2692628C1 (ru) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018124583A RU2692628C1 (ru) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2692628C1 true RU2692628C1 (ru) | 2019-06-25 |
Family
ID=67038188
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018124583A RU2692628C1 (ru) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2692628C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2819082C1 (ru) * | 2023-08-04 | 2024-05-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинантный штамм VV-mNIS-NS1 вируса осповакцины, продуцирующий симпортер йодида натрия мышей mNIS и белок NS1 парвовируса крыс H-1 для тераностики злокачественных опухолей |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017197207A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ohio State Innovation Foundation | Oncolytic viruses comprising esrage and methods of treating cancer |
RU2678003C1 (ru) * | 2017-12-11 | 2019-01-22 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoQ, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при раке яичников |
-
2018
- 2018-07-04 RU RU2018124583A patent/RU2692628C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017197207A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ohio State Innovation Foundation | Oncolytic viruses comprising esrage and methods of treating cancer |
RU2678003C1 (ru) * | 2017-12-11 | 2019-01-22 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинантный онколитический штамм вируса осповакцины Л-ИВП_oncoQ, содержащий гены, кодирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся опухолевыми клетками при раке яичников |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2819082C1 (ru) * | 2023-08-04 | 2024-05-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинантный штамм VV-mNIS-NS1 вируса осповакцины, продуцирующий симпортер йодида натрия мышей mNIS и белок NS1 парвовируса крыс H-1 для тераностики злокачественных опухолей |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7262134B2 (ja) | 腫瘍溶解性hsvベクター | |
JP7326396B2 (ja) | 腫瘍選択的e1aおよびe1b変異体 | |
Guo et al. | The enhanced tumor selectivity of an oncolytic vaccinia lacking the host range and antiapoptosis genes SPI-1 and SPI-2 | |
EP3072966B1 (en) | Mitogen-activated protein kinase-dependent recombinant vaccinia virus (md-rvv) and use thereof | |
KR20070103412A (ko) | 동물 세포에서 다중 내성을 반전시키기 위한 방법 | |
JP2008531739A (ja) | 治療的処置のための粘液腫ウイルスとラパマイシンの組み合わせの使用 | |
US11932879B2 (en) | Mumps virus as a potential oncolytic agent | |
RU2604187C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ VV-GMCSF-Lact ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ ОНКОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ЧЕЛОВЕКА И ОНКОТОКСИЧЕСКИЙ БЕЛОК ЛАКТАПТИН | |
CA2449013C (en) | Viral mutants that selectively replicate in targeted human cancer cells | |
Vliegen et al. | Deletion of the vaccinia virus F13L gene results in a highly attenuated virus that mounts a protective immune response against subsequent vaccinia virus challenge | |
ES2963232T3 (es) | Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende | |
RU2692628C1 (ru) | Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека | |
WO2005014017A1 (ja) | 癌治療用医薬組成物 | |
WO2020011754A1 (en) | Chimeric vaccinia viruses | |
BR112021012630A2 (pt) | Poxvírus modificado, método para produzir o poxvírus modificado e composição | |
ES2617926T3 (es) | Modulación de respuestas inmunitarias por la proteína K4 poxvírica | |
Harrington et al. | Viral Therapy of Cancer | |
RU2492238C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGEM-Puro-DS-Apo, СОДЕРЖАЩАЯ СИНТЕТИЧЕСКИЙ ГЕН АПОПТИНА, ФЛАНКИРОВАННЫЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ ГЕНОМА ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ИЗ РАЙОНА C10L-C12L, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ VVdGF-ApoS24/2 ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АПОПТИН | |
García et al. | Antitumoral activity of oncolytic vaccinia virus expressing the interferon-induced ds-RNA dependent protein kinase PKR | |
TW202413636A (zh) | 嵌合痘病毒 | |
WO2024038175A1 (en) | Chimeric poxviruses | |
EP3669893A1 (en) | Treatment of p53 mutated/modified cancer-forms with parvovirus | |
Meinhardt | Combined application of oncolytic vaccinia and measles vaccine viruses for the treatment of highly resistant human tumor cells | |
Ho | Designing the Next-Generation Oncolytic Vaccinia Virus | |
RU2194755C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAd5-f, НЕСУЩАЯ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА АДЕНОВИРУСА 5 ТИПА С ДЕЛЕЦИЕЙ В ГЕНЕ E1B-55K, И ШТАММ МУТАНТНОГО АДЕНОВИРУСА Ade12, ОБЛАДАЮЩИЙ СЕЛЕКТИВНОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ |