FR2690459A1 - Plasmide de B. bronchiseptica, dérivés de ce plasmide et leur utilisation en tant que vecteurs pour la transformation de cellules hôtes. - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend: - soit un fragment d'ADN ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de réplication de cet acide nucléique lorsque ce dernier est introduit dans un hôte cellulaire possédant les éléments nécessaires pour assurer cette réplication, - soit un fragment d'ADN codant pour le polypeptide Mob ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de mobilisation dudit acide nucléique assurant le transfert de ce dernier entre hôtes cellulaires.

Description

PLASMIDE DE B.bronchiseptica, DERIVES DE
CE PLASHIDE ET LEUR UTILISATION EN TANT
QUE VECTEURS POUR LA TRANSFORMATION DE
CELLULES HOTES.

La présente invention a pour objet un- plasmide issu de B.bronchiseptica, ainsi que les dérivés de ce plasmide, et leurs utilisations, notamment pour la transformation de cellules hotes dans le cadre de procédés d'obtention de polypeptides déterminés.

Les plasmides bactériens sont des molécules d'ADN extra-chromosomiques qui se répliquent de façon autonome dans un hôte cellulaire. Leur taille varie d'une ou plusieurs centaines de kilobases (kb), et leur nombre de copies varie d'une à plusieurs centaines par cellule. Les gènes de virulence importants des bactéries pathogènes sont souvent portés par des plasmides (Brubaker, 1985). Certains plasmides peuvent également porter des gènes de résistance contre des agents bactéricides tels que les antibiotiques et les métaux lourds (Cohen et Miller, 1970). Toutefois, beaucoup de plasmides sont cryptiques et contiennent seulement des gènes essentiels pour la réplication du plasmide et parfois pour le transfert par conjugaison de ce plasmide.En raison de leur petite taille, les plasmides cryptiques ont été largement utilisés entant que vecteurs de clonage, et représentent des modèles intéressants pour l'étude moléculaire de la réplication et du transfert d'ADN.

Le genre Bordetella est composé de quatre espèces différentes qui sont tous des pathogènes de l'appareil respiratoire supérieur des animaux homéothermes (Pittman, 1984). Bordetella pertussis est l'agent causal de la coqueluche humaine (Bordet et Gengou, 1906), Bordetella parapertussis est à l'origine d'une infection plus bénigne chez l'homme (Linnemann et
Perry, 1977), Bordetella bronchiseptica est responsable de la rhinite atrophique infectieuse des porcs et de la toux des chiens (Goodnow, 1980) et Bordetella avium est responsable du rhume chez la dinde (Simmons, 1984).

Bien que les gènes codant pour les facteurs de virulence de Bordetella soient localisés sur le chromosome bactérien (Charles et al, 1989; Glaser et al, 1988; Locht et al, 1986; Stibitz et al, 1988), des plasmides naturels ont déjà été observés dans des souches virulentes de B.bronchiseptica et B.avium.

Certains de ces plasmides appartiennent aux groupes
IncP-1 ou IncQ, et leur présence a été associée à la résistance à de nombreux antibiotiques ou métaux lourds. Leur taille est relativement grande et ils pourraient être transférés à Escherichia coli par conjugaison (Graham et Abruzzo, 1983; Hedges et al, 1974, Jackwood et al, 1987; Lax et Walker, 1986,
Shimizu et al, 1981; Terakado et al, 1973, Terakao et
Mitsuhashi, 1974). Les plasmides du groupe IncP-l et
IncQ sont connus pour leur large spectre d'hôtes et ont été développés en tant que vecteurs de clonage à large spectre d'hâtes (Schmidhauser et al, 1988). De tels vecteurs facilitent fortement les études génétiques réalisées sur un grand nombre de bactéries Gramnégatives, dont Bordetella Spp.La plupart des plasmides utilisés jusqu'à maintenant dans le genre
Bordetella appartiennent au groupe à large spectre d'hôtes Incp-l, par exemple pLAFRI (Antoine et Locht, 1990; Weiss et Falkow, 1982). Toutefois, ces vecteurs présentent l'inconvénient d'être relativement grands et de se répliquer avec un faible nombre de copies.

Ainsi la présente invention a notamment pour but de fournir des plasmides qui soient de petite taille et capables de transformer un grand nombre d'hâtes cellulaires.

L'invention vise également l'utilisation de ces plasmides dans des procédés de production de polypeptides déterminés par transformation de cellules hôtes appropriées.

La description qui suit de la présente invention fait appel aux figures suivantes: - Figure 1: représentation de la séquence nucléotidique complète du plasmide pBBR1 de la présente invention, - figure 2: représentation de la carte de restriction du plasmide pBBRl, - Figure 3: alignement de la séquence d'ADN du site RSA de pBBRl avec les séquences de ce site provenant d'autres plasmides d'organismes Gram-positifs, - Figure 4: représentation de l'homologie entre la partie amino-terminale de la protéine codée par ORF1 de pBBR1 et des protéines codées par d'autres plasmides, - Figure 5: représentation schématique des différentes régions d'homologie entre ORF1 et MobA de RSF1010, et des protéines Pre et Mob représentées sur la figure 4, - Figure 6: représentation de l'homologie entre la partie carboxy-terminale de la protéine codée par ORF1 de pBBRl et la protéine MobA de RSF1010, - Figure 7 : analyse Southern Blot de 1'ADN total de plusieurs souches B. Bronchiseptica en utilisant pBBRlCM comme sonde.

L'ADN total a été extrait de B. pertussis Tohama I (ligne 2), B. bronchiseptica souche 7668 (ligne 3), S87 (ligne 4), 7-8 (ligne 5), NL1018 (ligne 6), NL1016 (ligne 7), NL1013 (ligne 8) ou NL1011 (ligne 9) et digéré avec PvuII. La ligne 1 contient pBBRlCM purifié digéré avec PvuII, qui génère deux fragments d'ADN, respectivement de 2,3 kb et 1,7 kb. Après électrophorèse et transfert sur nitrocellulose, le filtre a été testé avec pBBRlCM selon la technique décrite plus loin.

- Figure 8 : hybridation spécifique d'ADN double brin et simple brin. L'ADN dénaturé (A) et non dénaturé (B) a été soit traité avec la nucléase SI (lignes 2, 4 et 6) soit non traité (lignes 1, 3 et 5) avant le transfert sur nitrocellulose et l'hybridation avec pBBRlCM. Les lignes 1 et 2 contenaient 1'ADN de
M13mpl8CM, les lignes 3 et 4 contenaient 1'ADN de pBBRlCM et les lignes 5 et 6 contenaient 1'ADN de pBR328.

La présente invention a pour objet tout acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend: - soit un fragment d'ADN délimité par les nucléotides situés aux positions 1793 et 2452 de la figure 1, et codant pour le polypeptide Rep dont la séquence en acides aminés est représentée sous ce fragment d'ADN sur la figure 1, ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de réplication de cet acide nucléique lorsque ce dernier est introduit dans un hôte cellulaire possédant les éléments nécessaires pour assurer cette réplication, - soit un fragment d'ADN constitué de la succession d'une part du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 2500 et 2687, et, d'autre part, du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 1 et 799 de la figure 1, et codant pour le polypeptide Mob dont la séquence en acides aminés est représentée sous ce fragment d'ADN sur la figure 1, ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de mobilisation dudit acide nucléique assurant le transfert de ce dernier entre hôtes cellulaires.

L'invention vise aussi des acides nucléiques caractérisés en ce qu'il s'agit des ARN correspondant aux ADN ci-dessus décrits.

L'invention a plus spécifiquement pour objet tout acide nucléique comprenant à la fois un fragment d'ADN codant pour le polypeptide Rep sus-mentionné, ou toute partie de ce fragment d'ADN telle que définie cidessus, et un fragment d'ADN codant pour le polypeptide
Mob sus-mentionné, ou toute partie de ce dernier fragment d'ADN telle que définie ci-dessus.

Tout acide nucléique codant pour un polypeptide
Pre ou Mob tels que définis ci-dessus, et dont la séquence nucléotidique diffère, en fonction de la dégénérescence du code génétique, de celles des acides nucléiques sus-mentionnés, entre dans le cadre de la présente invention.

L'invention vise également tout acide nucléique monobrin caractérisé en ce qu'il comprend l'une ou l'autre des deux séquences nucléotidiques complémentaires constituant les fragments d'ADN double-brins décrits ci-dessus, ou tout acide nucléique susceptible de s'hybrider dans les conditions décrites ci-après avec l'acide nucléique sus-mentionné.

L'invention a également pour objet tout plasmide caractérisé en ce que son ADN bicaténaire circulaire comprend un acide nucléique selon l'invention tel que défini ci-dessus.

Un plasmide préféré selon l'invention (plasmide pBBRl) est plus particulièrement caractérisé par 1'ADN bicaténaire circulaire représenté sur la figure 1.

Le plasmide pBBR1 sus-mentionné est davantage caractérisé: - en ce qu'il est présent dans des souches de
B.bronchiseptica, notamment dans la souche S87, - en ce qu'il comprend les éléments nécessaires pour assurer sa réplication chez de nombreux hôtes cellulaires Gram-négatifs, notamment chez E.coli et B. pertussis, - en ce qu'il est mobilisable mais n'est pas un plasmide conjugatif, - en ce qu'il est compatible avec d'autres plasmides eux-mêmes susceptibles de se répliquer dans un grand nombre de cellules hôtes différentes, notamment avec les plasmides des groupes IncP, IncQ et IncW, - en ce qu'il n'est pas un élément transposable, - en ce qu'il est susceptible de se répliquer dans répliqué en environ 30 à 40 copies par cellule hôte transformée.

L'invention a également pour objet tout plasmide tel que décrit ci-dessus et caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique hétérologue vis à vis de 1'ADN dudit plasmide.

Avantageusement la séquence nucléotidique hétérologue sus-mentionnée est insérée dans 1'ADN du plasmide, au niveau d'un site non essentiel pour sa réplication et, le cas échéant, non essentiel pour sa mobilisation.

A ce titre, l'invention concerne tout plasmide tel que décrit ci-dessus, dans le génome duquel un ou plusieurs sites de restriction ont été insérés. De tels plasmides (pBBR1CM181 et pBBRlCM191) sont décrits plus en détail dans la suite de ce texte.

L'invention vise également tout plasmide tel que décrit ci-dessus et caractérisé en ce que la séquence nucléotidique hétérologue sus-mentionnée comprend un acide nucléique codant pour un polypeptide déterminé susceptible d'être produit par un hôte cellulaire après transformation de ce dernier avec ledit plasmide, cette séquence nucléotidique comprenant également les éléments nécessaires pour promouvoir et contrôler l'expression de l'acide nucléique codant sus-mentionné dans un hôte cellulaire, et plus particulièrement un promoteur reconnu par les polymêrases de l'hâte cellulaire, notamment un promoteur inductible, situé en amont dudit acide nucléique codant, et sous le contrôle duquel la transcription dudit acide nucléique est susceptible d'être effectuée, le cas échéant une séquence signal codant pour un peptide signal située en amont dudit acide nucléique codant et en aval du promoteur, ainsi qu'une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription située en aval dudit acide nucléique codant.

L'invention concerne également tout hôte cellulaire transformé par un plasmide tel que décrit ci-dessus. A titre d'exemples d'hâtes cellulaires susceptibles d'être transformés par un plasmide selon l'invention, on peut citer les grams négatives tels que les souches résistantes aux antibiotiques d'E.coli,
B.pertussis, B.bronchiseptica, V. cholerae, P.putida, et R. meliloti.

Avantageusement les hôtes cellulaires transformés selon l'invention comprennent les éléments de régulation permettant l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide déterminé tel que défini ci-dessus.

A ce titre, l'invention vise plus particulièrement la souche de E.coli MM 294 transformée à l'aide du plasmide pBBRlKAN, à savoir le plasmide pBBRl représenté sur les figures 1 et 2 et comportant, inséré au niveau de son site PvuI, le gène de résistance à la kanamycine Tn903, (OKA, A. et al. J. Mol. Biol. 147:217 (1981)) cette souche de E.coli ayant été déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur le 8 octobre 1991 sous le numéro I-1152. Un autre plasmide contenu dans la même souche de E.coli MM294, pBBRlCM a été déposé à la CNCM sous le n" I-1151 le 8 Octobre 1991.Ce plasmide pBBRlCM correspond au plasmide pBBR1 représenté sur les figures 1 et 2 dans lequel le gène de résistance au chloramphénicol du plasmide pBR328 (à savoir le fragment HhaI décrit par Soberon et al, 1980) a été inséré au niveau du site PvuI.

L'invention a également pour objet des amorces d'ADN (ou d'ARN) utilisables pour la synthèse des acides nucléiques selon l'invention par la technique d'amplification en chaîne de 1'ADN, ci-après désignée par technique PCR (Polymerase Chain Reaction). Cette technique est plus particulièrement décrite dans les brevets américains N" 4, 683, 202 et n"4, 683, 195, ainsi que dans le brevet européen n" 200.362. Les amorces selon l'invention sont avantageusement constituées d'environ 10 à 40 nucléotides correspondant aux extrémités 3' et 5' de l'un ou l'autre des deux brins constituant les fragments d'ADN sus-mentionnés.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un plasmide tel que défini ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention d'un polypeptide déterminé codé par une séquence nucléotidique hétérologue telle que décrite ci-dessus.

A ce titre l'invention concerne plus particulièrement un procédé d'obtention d'un polypeptide déterminé, ce procédé comprenant notamment la succession d'étapes suivantes: - la mise en culture d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, dans un milieu de culture approprié, - la récupération du polypeptide déterminé produit par ledit hôte cellulaire, soit directement à partir du susdit milieu de culture, lorsque la séquence codant pour ledit polypeptide est précédée d'une séquence signal et que l'hâte cellulaire est capable de secréter le polypeptide dans le milieu de culture (notamment dans le cas des cellules eucaryotes et des levures), soit après lyse de l'hâte cellulaire (notamment dans le cas des bactéries), - le cas échéant, la purification du polypeptide déterminé récupéré à l'étape précédente.

L'invention a également pour objet les polypeptides codés par le plasmide pBBR1 représenté sur la figure 1.

A ce titre l'invention concerne le polypeptide Rep caractérisé par la séquence en acides aminés représentée sous le fragment d'ADN délimité par les nucléotides situés aux positions 1793 et 2452 de la figure 1, ou toute partie de ce polypeptide susceptible de jouer un rôle dans le mécanisme de réplication dudit acide nucléique lorsque ce dernier est introduit dans un hôte cellulaire possédant les éléments nécessaires pour assurer cette réplication.

L'invention concerne également le polypeptide Mob caractérisé par la séquence en acides aminés représentée sous le fragment d'ADN constitué de la succession d'une part du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 2500 et 2687, et, d'autre part, du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 1 et 799 de la figure 1, ou toute partie de ce polypeptide susceptible de jouer un role dans le mécanisme de mobilisation dudit acide nucléique assurant le transfert entre hôtes cellulaires de ce dernier sous forme monocaténaire.

L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention et de la caractérisation d'un plasmide selon l'invention, à savoir le plasmide pBBR1.

I. METHODES EXPERIMENTALES 1. Souches bactériennes, plasmides et milieux de
culture
B.pertussis Tohama I provient de Smith Kline
Biologicals (Rixensart, Belgique). B.pertussis BPRA a été décrit précédemment dans l'article d'Antoine et
Locht, 1990. Les souches B.bronchiseptica 899L et 7668 (Marchitto et al., 1987) proviennent de NIH (Rocky
Mountain Laboratories, Hamilton, Mt. USA). Les souches
B.bronchiseptica NL1012, NL1013, NL1014, NL1015,
NL1016, NL1017, NL1018, NL1019, NL1020, NL1021, CAT, 7-8,- et S87 proviennent de Norden Laboratories, Ne.,
USA. E.coli TG1 tA(lac-pro) supE thi hsdE5/F' tra D36 pro A+B+lacIqlacZEM15] est commercialisé par Amersham
Corp. (Amersham, UK).E.coli SM10 (Simon et al., 1983) provient de la Food and Drug Administration (Bethesda,
Md., USA). Pseudomonas putida 2257 et Rhizobium meliloti 2011 proviennent de la production de culture de micro-organismes LMG de Gent, Belgique. La souche
Vibrio cholerae 569B provient de Harvard medical School (Boston, Mass., USA) et a été décrite par Mekalanos et al PNAS 1982, 79:151-155.

Les plasmides RSF1010 (Gerry et al., 1974,) RK2 (Ingram et al;, 1973), pSa (Watanabe et al., 1968), pGV1106 (De Wilde et al., 1978), and pBR328 (Soberon et al., 1980) ont été obtenus chez Smith Kline-Biologicals (Rixensart, Belgique), et pLAFRIl (Friedman et al., 1982) provient de Harvard Medical School (Boston,
Mass., USA). Les plasmides pBBR1, pBBRlCM, et pBBRlKAN sont décrits ci-après.

Les souches E.coli et V.cholerae ont été cultivées dans un milieu LB ou dans un milieu minimum (Maniatis et al., 1982). Les souches E.coli résistantes aux antibiotiques ont été sélectionnées avec 100pg/ml d'ampicilline, 30pg/ml de chloramphénicol, 25pg/ml de kanamycine, 20pg/ml de streptomycine, ou 15pg/ml de tetracycline.Les souches B.pertussis et
B.bronchiseptica ont été cultivées sur de l'agar Bordet
Gengou (BG) (Bordet et Gengou, 1906), ou sur un milieu modifié de Stainer Scholte (SS) contenant lg/l de 2,6 O-dimethyl-B-cyclodextrine (Imaizumi et al., 1983) et les . antibiotiques aux concentrations suivantes: chloramphénicol, 30pg/ml; streptomycine, 100pg/ml. BG agar contient 36g/l d'agar (Difco Laboratories,
Detroit, Mich.), 1 % de glycerol, et 20 % de sang défibriné de mouton. P.putida et R.meliloti ont été cultivées dans les milieux L-broth et YMB respectivement (Schmidhauser et Helinski, 1985). Les colonies résistantes aux antibiotiques ont été sélectionnées avec 50pg/ml de kanamycine.

2. Méthodologie ADN
Les enzymes de restriction, T4 DNA ligase, T4 DNA polymérase et autres enzymes modifiant 1'ADN sont celles commercialisées par Pharmacia-LKB (Uppsala,
Suède), Boehringer (Mannheim, Allemagne), New England
Biolabs (Berverly, Mass., USA), Bethesda Research
Laboratories (Gaithersburg, Md., USA), Amersham Corp.

(Aylesbury, UK), et utilisées selon les recommandations des fabricants. Toutes les autres manipulations d'ADN ont été réalisées dans des conditions standards telles que décrites par Maniatis et al. (1982). L'analyse par immunotransfert selon la technique de Southern et l'hybridation des colonies ont été réalisées avec des sondes d'ADN non radioactives marquées avec du digoxigenine-dUTP et le développement a été effectué suivant les instructions du fabricant (Boehringer (Mannheim, Allemagne), kit n" 1093 657). L'ADN total a été isolé à partir des souches B.pertussis et
B.bronchiseptica selon la méthode décrite par Hull et al., (1981).

3. Conjugaison bactérienne
La conjugaison entre E.coli SM10 fraîchement cultivé contenant des plasmides dérivés de pBBRl et des cellules fraîchement cultivées de NalRSmR B.pertussis
BPRA, or B.bronchiseptica S87 a été réalisée de la manière décrite dans l'article d'Antoine et Locht, 1990. La conjugaison entre E.coli SM10 contenant des plasmides dérivés de pBBRl et V.cholerae a été réalisée de manière identique, à l'exception du fait que 1'ex-conjugant V.cholerae a été sélectionné sur le milieu LB contenant de la streptomycine et du chloramphénicol aux concentrations indiquées ci-dessus.

4. Electrotransformation
L'électrotransformation de P.putida et R.meliloti a été réalisée de la manière suivante. Les cellules provenant de 200 ml d'une culture à 0.5-0.7 unités O.D.

ont été récoltées par centrifugation et lavées deux fois avec du saccharose 300 mM. Les cellules ont ensuite été resuspendues dans 10 ml de saccharose 300 mM, 15 % de glycerol, et conservées à -20 C dans des aliquots de 500p1. 150p1 de suspension cellulaire ont ensuite été mélangés avec lpg d'ADN dans une cuvette de 0,2 cm et incubés dans de la glace pendant 20 minutes, avant d'appliquer une pulsation de 2.500 V, 25pu, 400n (constante de temps d'approximativement neuf msec) avec l'appareil Gene Pulser équipé du Pulse
Controller (BioRad).Après électroporation, les cellules ont été immédiatement diluées dans 2 ml du milieu de culture approprié et incubée pendant 3 h à 32"C avant de les déposer sur un milieu sélectif solide.

5. Procédures analytiques
Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) utilisant 12,5 % de gel, a été réalisée selon la technique décrite dans l'article de Laemmli, 1970. Des analyses par immunotransfert (Western blot) utilisant aussi bien des anticorps monoclonaux que polyclonaux ont été réalisées selon la méthode décrite dans l'article de Burnette, 1981.

L'anticorps monoclonal PllB10 dirigé contre la sousunité S2 de PTX a été décrit par Frank et Parker (Frank et Parker, 1984) et l'anticorps polyclonal dirigé contre FHA (Delisse-Gathoye et al., 1990) provient de
Smith Kline-Biologicals (Rixensart, Belgique).

6. Détermination du nombre de copies de plasmides
Le nombre de copies de plasmides dérivées de pBBR1 a été estimé par mesure d'activité enzymatique exprimé par une enzyme codée par le plasmide. Le gène reporteur utilisé correspond au gène CAT. On a comparé le nombre de copies de pBR328 avec le pBBRlCM 10 ml, en utilisant la méthode ELISA afin de mesurer le niveau de chloramphénicol acetyl transferase (CAT) dans les lysats de E.coli. E.coli MM294 (pBR328) et MM294 (pBBRlCM) ont chacun été cultivés en phase mid-log dans 100 ml de LB contenant 30pg/ml de chloramphénicol. Des cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation et resuspendues dans 10 ml 0,25 M Tris.HCl (pH 7.5), et lysées par sonication. Le lysat a été fractionné par centrifugation à 13.000 g pendant 20 minutes.La fraction surnageante a ensuite été chauffée à 65oC pendant 10 minutes, clarifiée par centrifugation et conservée par -20 C. La quantification de CAT dans les extraits bruts de cellules a ensuite été réalisée en utilisant le kit CAT-ELISA (5 Prime - > 3 Prime, Inc.

West Chester, Pa., USA) selon les instructions du fabricant.

Les nombres de copies de plasmides ont également été estimés par la méthode d'Ivanov et Bachvarov (1987). Cette méthode comprend le marquage in vivo de l'ADN total avec [3H]thymidine (Amersham Corp., UK), séparation de l'ADN en fractions d'ADN chromosomal et d'ADN plasmidique par la méthode de l'ébullition, et quantification de l'ADN dans les deux fractions. Le nombre de copies de plasmides (N) a été calculé par la formule N=(Gh.Rî)/ (Gp.R2) dans laquelle Gh représente la taille génomique de la souche bactérienne, Gp représente la taille du plasmide, R1 représente la radioactivité (cpm) de la fraction plasmidique, et R2 représente la radioactivité de la fraction d'ADN chromosomique.

7. Séquençage de l'ADN
La séquence nucléotique de pBBR1 a été déterminée par séquençage des deux brins en utilisant la méthode de terminaison de chaine dideoxy. Le séquençage a été réalisé en utilisant un séquenceur automatique d'ADN (Applied Biosystem, Foster City, Ca) et soit le kit de séquençage utilisant l'amorce colorante Taq (Applied
Biosystem, numéro de reference 401119) soit le kit de séquençage Taq Dye Deoxy (TM) Terminator (Applied
Biosystem, numéro de référence 401150) suivant les instructions du fabricant. Des fragments d'ADN ont été sous-clonés dans Ml3mpl8 puis transformés dans E.coli TG1. L'ADN monobrin purifié a ensuite été séquencé en utilisant l'amorce universelle fluorescente.La séquence d'autres régions a été déterminée en utilisant l'ADN plasmidique double brin et de nombreuses amorces oligonucléotidiques synthétiques hybridant à des régions internes du plasmide.

8. Analyse par ordinateur
Les analyses des séquences d'ADN et des protéines ont été réalisées en utilisant les programmes DNA
Strider (Marck, 1988) DNASTAR (DNASTAR, Inc. UK), ou
GCG (University of Wisconsin Genetics Computer Group;
Devereux et al;, 1984). Les recherches dans des bases de données ont été réalisées avec le programme FastA du groupe GCG. Le programme CODONPREFERENCE a été utilisé à l'aide de la table d'usage des codons de B.pertussis récemment publié (Wada et al., 1991).

9. Détection de 1'ADN plasmidique monobrin
La méthode utilisée pour la détection de l'ADN plasmidique monobrin par hybridation selon Southern a été décrite par te Riele et al. (1986). Les échantillons d'ADN extraits au phénol à partir d'E.coli ont été soit traités avec de la nucléase S1, soit laissés non traités préalablement avant l'électrophorèse sur gel d'agarose. 1'ADN est ensuite soit dénaturé ou non avant transfert sur nitrocellulose et hybridation avec une sonde pBBRlCM non radioactive telle que décrite ci-dessus.

II. RESULTATS 1. Caractérisation de plusieurs souches de
B.bronchiseptica
L'ADN total de chaque souche de B.bronchiseptica (mentionné au tableau I), ainsi que de la souche de B.pertussis Tohama I, a été digéré avec Hindîli ou
EcoRI.

L'ADN a pu être digéré par EcoRI mais est résistant à la digestion par HindIII. La résistance de 1'ADN de B.pertussis à la digestion HindIII a déjà été préalablement observée (Weiss et Falkow, 1982) et peut être attribuée à un système de modification-restriction de B.pertussis (Greenaway, 1980) spécifique pour les sites HindIII . Comme il est indiqué sur le tableau I, un tel système semble être une caractéristique générale de l'espèce Bordetella, et pourrait faire l'objet d'un critère supplémentaire d'identification des Bordetella.

L'étude de la présence éventuelle du gène ptx a été réalisée par hybridation selon la technique de
Southern en utilisant un fragment EcoRI de 4,5 kb contenant le gène ptx entier (Locht et al., 1986). Il a été précédemment démontré que la plupart des souches
B.bronchiseptica et B.parapertussis contiennent une copie silencieuse du gène ptx dans leur chromosome (Arico et Rappuoli, 1987; Marchitto et al., 1987).

Toutes les souches analysées portent le gène ptx, à l'exception des souches S87, 899L et 7668. Les deux dernières souches ont été incluses en tant que contrôles négatifs puisqu'il a été précédemment démontré et qu'elles ne possèdent pas le gène ptx (Marchitto et al., 1987).

Enfin, les différentes souches ont été analysées afin de déterminer la présence éventuelle de production de facteurs de virulence spécifique, la toxine (PTX) et l'hémagglutinine filamenteuse (FHA). Les lysats cellulaires de nombreuses souches dont B.pertussis
Tohama I ont été analysés par technique d'immunodétection (Western-blot) en utilisant des anticorps polyclonaux contre FHA et l'anticorps monoclonal PllB10 contre la sous-unité S2 de PTX. De manière attendue et en accord avec des publications précédentes (Arico et Rappuoli, 1987, Marchitto et al., 1987), aucune des souches B.bronchiseptica ne produit
PTX, tandis que B.pertussis produit et sécrète une toxine réagissant avec PllP10. Par contre, toutes les souches produisent de la FHA, qui réagit avec les anticorps polyclonaux.

2. Présence de plasmides dans B.bronchiseptica
L'isolement de plasmides du groupe IncQ et IncP à partir de B.bronchiseptica a été décrit par Graham et
Abruzzo, 1982, Hedges et al., 1974; Lax and Walker, 1986; Shimizu et al., 1981; Terakado et al., 1973;
Terakado et Mitsuhashi, 1974. La possibilité du fait que les souches de B.bronchiseptica citées au Tableau I portent également de tels plasmides a été étudiée par hybridation de leur ADN total avec le plasmide RSF1010 du groupe IncQ et le plasmide RK2 du groupe IncP utilisés en tant que sondes. La technique d'hybridation des colonies a permis de démontrer que cinq souches (NL1011, NL1018, NL1019, NL1021 et S87) contiennent de l'ADN apparenté à celui de RSF1010.

Lorsque l'ADN total a été digéré avec EcoRI et sondé à l'aide de RSF1010 après transfert sur nitrocellulose selon Southern, il a été déterminé que les cinq souches préalablement identifiées ont des profils d'hybridation identiques.

Bien que les cinq souches contiennent des plasmides s'hybridant avec RSF1010, une bande plasmidique n'a pu être déterminée que dans une seule souche (S87) à l'aide de gradients de chlorure de césium. L'absence d'une seconde bande visible dans le gradient de chlorure de césium pendant la purification de l'ADN des quatre autres souches est problablement due au relativement faible nombre de copies des plasmides du type RSF1010 maintenu dans ces souches sans sélection. La bande plasmidique fortement visible dans le cas de la souche S87 laisse suggérer soit que le plasmide de type RSF1010 dans cette souche présente un grand nombre de copies, ou que un ou plusieurs plasmides puissent être présents dans cette souche.

Par conséquent la fraction plasmidique de la souche S87 a été étudiée plus en détail, et l'ADN a été analysé par restriction après purification par gradient de chlorure de césium. L'analyse de restriction réalisée à l'aide de plusieurs enzymes confirme la présence de deux plasmides, un de 27 à 30-kb, dénommé pBBR2, et un de 2,6-kb dénommé pBBRî. Le plus grand plasmide (pBBR2) s'hybride avec RSF1010. Puisque des petits plasmides cryptiques n'ont jamais été décrits chez Bordetella, pBBR1 a été étudié plus en détail.

3. Transformation de E.coli avec pBBRl
Afin de caractériser plus en détail pBBR1, des essais de transformation de E.coli ont été réalisés, et les transformants possibles ont été sélectionnés sur des milieux contenant des antibiotiques. Aucun transformant n'a pu être sélectionné sur les boîtes LB contenant du chloramphénicol, de la kanamycine, de l'ampicilline, de la streptomycine, ou de la tétracycline après transformation de E.coli MM294 avec pBBRI, indiquant que le plasmide n'est pas capable de se répliquer chez E.coli ou ne contient pas les marqueurs de résistance testés.

Afin de distinguer entre ces deux possibilités, un gène de résistance au chloramphénicol (CMr) a été inséré dans pBBRl. A cet effet, le fragment HhaI pBR328 contenant le gène de résistance au chloramphénicol a été inséré dans le plasmide pBBRI linéarisé avec PvuI ou AvaII. Ces deux sites uniques ont été choisis dans l'espoir de trouver au moins un site localisé dans une région non essentielle pour la réplication du plasmide. Après ligation, les cellules
E.coli MM294 ont été transformées avec les plasmides recombinants. Aucun transformant n'a été obtenu après insertion du gène CMr au niveau du site AvaII de pBBR1.

Par contre l'insertion de ce gène au niveau du site
PvuI permet d'obtenir un plasmide recombinant, dénommé pBBRlCM, qui est capable de transformer E.coli pour le rendre résistant au chloramphénicol, indiquant que pBBR1 est capable de se répliquer chez E.coli, et que le site PvuI est localisé dans une région non essentielle pour la réplication du plasmide dans
E.coli.

4. Transfert de pBBR1 à B.pertussis
Comme pBBR1 est capable de se répliquer chez
E.coli, son transfert à B.pertussis a été testé par conjugaison, cette dernière étant la technique la plus adaptée pour introduire de l'ADN dans cet organisme (Weiss et Falkow, 1982). pBBRlCM a été mobilisé à l'aide de fonctions de transfert de groupe P provenant de vecteurs susceptibles de transformer un nombre important d'hôtes cellulaires. E.coli SM10, qui contient les fonctions de transfert de groupe P de RK2 integrées dans le chomosome (Simon et al., 1983) a été transformé avec pBBRlCM. SM10 (pBBR1CM) a alors été croisé avec B.pertussis Tohama I et les exconjuguants ont été placés sur un milieu d'agar
Bordet-Gengou contenant du chloramphénicol et de la streptomycine. Apres trois jours de culture à 36"C, les colonies hémolytiques de B.pertussis ont été analysées afin d'y détecter l'éventuelle présence d'ADN plasmidique. Les résultats indiquent la présence de pBBRlCM se répliquant sous forme d'un plasmide autonome dans B.pertussis, indiquant que PBBR1CM est capable d'être transmis par conjugaison à B.pertussis lorsque les fonctions de transfert de RK2 sont données en trans.A l'inverse les tentatives de conjugasion utilisant E.coli MM294 sans les fonctions de transfert
RK2 en tant que souche donneuse se sont révélées non fructueuses, ce qui laisse suggérer que pBBRl est un plasmide mobilisable mais n'est pas un plasmide conjugatif.

5. pBBRl est compatible avec d'autres plasmides
susceptibles de transformer un grand nombre de
cellules hôtes
Puisque pBBRl est capable de se répliquer à la fois chez E.coli et chez B.pertussis, il était intéressant d'étudier si ce plasmide appartient à l'un des trois groupes d'incompatibilité IncP, IncQ, ou
IncW, connu pour se répliquer dans l'espèce Bordetella et E.coli (Hedges et al., 1974; Lax et Walker, 1986,
Weiss et Falkow, 1982). Le test d'incompatibilité a été réalisé chez E.coli en transformant des cellules d'E.coli MM294 (pBBRlCM) à l'aide de plasmides de chacun des trois groupes d'incompatibilité et avec pBBR1KAN en tant que contrôle d'incompatibilié.

pBBRlKAN a été construit en insérant le fragment d'ADN
HindII disponible commercialement et contenant le gène de résistance à la kanamycine Tn903 (KANr) (Pharmacia,
Uppsala, Suède) à l'intérieur du site pvuI de pBBR1.

Les cellules compétentes d'E.coli MM294 (pBBRlCM) ont eté transformées avec pLAFRII (IncP), RSF1010 (IncQ), pGV1106 (IncW), ou pBBRlKAN et étalées sur les plaques LB contenant l'antibiotique contre lequel est codée la résistance par le plasmide introduit. Les transformants obtenus ont ensuite été transférés en parallèle sur des boîtes LB contenant du chloramphénicol ou l'antibiotique du plasmide introduit. Les résultats présentés sur le tableau II indiquent que pBBRlCM est compatible avec les plasmides des groupes IncP, IncQ et IncW car les cellules contiennent les deux marqueurs de résistance de pBBRlCM et celui du plasmide introduit.

Les résultats montrent également que pBBRlCM est plûtot stable en l'absence de sélection par un antibiotique puisque les cellules MM294 (pBBRlCM) étalées sur l'agar LB sans antibiotiques, ont toutes retenu le plasmide. Une mini-préparation de la fraction d'ADN plasmidique de ces transformants confirme la présence de pBBRlCM et du plasmide introduit dans la même cellule. Le test d'incompatibilité montre que pBBR1KAN a remplacé pBBRlCM comme l'on pouvait s'y attendre dans le cas de deux plasmides incompatibles.

Lorsque les cellules de B.bronchiseptica S87 ont été conjugées avec E. coli SM10 (pBBRlCM) et étalées sur agar SS contenant du chloramphénicol et de la streptomycine afin de sélectionner les cellules E.coli, il a été trouvé que les ex-conjuguants contiennent pBBRlCM mais pas pBBR1, ce qui laisse suggérer que
B.bronchiseptica S87 pBBRlCM est incompatible avec pBBR1.

6. Mise en évidence du fait que pBBR1 n'est pas un
élément transposable
Des séquences d'insertion transposables ont été décrites chez Bordetella (McLafferty et al., 1988; Park et al., 1988; McPheat et al., 1989). Puisque des éléments transposables existent parfois sous forme de mini-cercles libres (Scott et al., 1988), la possibilité que pBBRl puisse être la forme épisomale d'un élément transposable a été étudiée. L'ADN total de nombreuses souches de Bordetella, dont
B.bronchiseptica S87 a été digéré avec PvuII et analysé par la technique de transfert sur nitrocellulose selon
Southern en utilisant pBBRlCM en tant que sonde. Les résultats (Figure 7) montrent que pBBR1 s'hybride uniquement avec un fragment unique de 2,6-kb correspondant à la forme linéaire de pBBRl, de l'ADN total de B.bronchiseptica S87, mais pas avec l'ADN des autres souches de Bordetella.Ce résultat indique que pBBR1 n'existe pas sous une forme intégrée dans le chromosome, éliminant par conséquent l'hypothèse du transposon.

7. Détermination du spectre d'activité bactérien
de pBBRl
Puisque pBBR1 n'appartient pas aux groupes d'incompatibilité à large spectre d'activité IncP,
IncQ, ou IncW, mais est néanmoins capable de se répliquer dans E.coli et Bordetella spp., sa capacité de réplication dans de nombreuses autres bactéries
Gram-négatives a été testée. pBBRlCM a été introduit dans la souche 569B de V.cholerae par conjugaison avec
E.coli SMl0 (pBBRlCM), et les ex-conjuguants ont été sélectionnés sur milieu LB contenant du chloramphénicol et de la streptomycine afin de contre-sélectionner
E.coli. pBBRlKAN a été introduit dans la souche 2011 de R.meliloti et la souche 2257 de P.putida par électrotransformation, et les transformants ont été sélectionnés sur milieu solide contenant de la kanamycine.Les plasmides pBBRlCM ne pouvaient être utilisés pour transformer ces organismes, puisqu'ils étaient déjà résistants à 50pg/ml de chloramphénicol.

L'analyse de restriction a permis de montrer que les souches résistantes aux antibiotiques d'E.coli,
B.pertussis, B.bronchiseptica, V.cholerae, P.putida, et R.meliloti contiennent toutes le plasmide dérivé de pBBR1, ce qui laisse suggérer que pBBR1 peut se répliquer et être maintenu à l'intérieur d'un large spectre d'hôtes cellulaires Gram-négatifs.

8. Nombre de copies de pBBRl dans E.coli et
B.pertussis
Le nombre de copies de pBBRlCM par cellules d'E.coli a été déterminé par comparaison avec d'autres plasmides dont le nombre de copies est connu. Puisque le gène CAT de pBBR328 a été utilisé pour la construction de pBBRlCM, la détermination du niveau de
CAT dans des cellules d'E.coli en phase exponentielle de croissance contenant soit pBBR328 ou pBBRlCM donnera une estimation du nombre de copies de pBBRlCM par rapport à pBBR328. En utilisant le système CAT ELISA, il a été déterminé que pBBRlCM présente un nombre de copies légèrement plus élevé (50 t) que pBBR328 chez
E.coli MM294. Ces résultats sont confirmés par la méthode d'Ivanov et Bachvarov (1987), et indiquent que les plasmides dérivés de pBBR1 sont de l'ordre de 30 à 40 copies par cellules de E.coli.De plus cette méthode appliquée à B.pertussis (pBBRlCM), en utilisant pLAFRII en tant que plasmide de référence, indique également la présence d'environ 30 copies de pBBRlCM par cellule de Bordetella.

9. Analyse de la séquence d'ADN de pBBRl
La séquence d'ADN complète de pBBR1 a été déterminée en séquençant les deux brins, et en utilisant la combinaison du séquençage mono-brin et double-brin après clonage de fragments divers à l'intérieur de dérivés de phages M13 et de dérivés de plasmides pUC respectivement, en utilisant des amorces universelles ainsi que des oligonucléotides synthétiques. Alors qu'environ 70 % du plasmide a pu être séquencé relativement facilement et rapidement, les 30 % restant, de la position 1000 à la position 1600 sur la figure 2, ont eté difficile à obtenir en raison d'événements de recombinaisons fréquents dans les vecteurs pUC ou M13, même à l'intérieur de souches
E.coli recA.

Il a ainsi été trouvé que le contenu G+C de pBBR1 est de l'ordre de 64,6%, en concordance avec le contenu
G+C déterminé pour l'ADN génomique total des organismes
Bordetella (Kersters et al., 1984). La séquence d'ADN, composée de 2687 nucléotides présentee sur la figure 1, a été examinée afin de détecter les phases ouvertes de lecture. Deux phases ouvertes de lecture majeures ont été trouvées, orientées dans des directions opposées, et dénommées ORF1 et ORF2. L'analyse par ordinateur utilisant les programmes CODONPREFERENCE et TESTCODE indiquent que les deux phases ouvertes de lecture ont une forte probabilité de coder pour des protéines.

ORF1 est délimité par le nucléotide situé à la position 799 jusqu'au nucléotide situé à la position 2500, et contient 329 codons. ORF2 est délimité par le nucléotide situé à la position 1793 et par celui situé à la position 2452, et contient 220 codons. Les deux
ORF débutent avec un codon d'initiation ATG situé en aval des séquences homologues aux sites de liaison des ribosomes de E.coli, et des séquences consensus de promoteurs, comme il est indiqué sur la figure 1.

En plus des deux ORF, l'analyse par ordinateur de la séquence d'ADN permet d'observer la présence de trois régions riches en A+T, indiquées sur la figure 2.

La plus grande région riche en A+T contient la séquence consensus du facteur d'intégration dans l'hâte (IHF)
YAANNNNTTGATW (W représente A ou T; Y représente des pyrimidines, N représente tout nucléotide), située entre les nucléotides 1595 et 1607 (Friedman, D.I.

1988). La région riche en A+T située en amont de ORF1 présente une homologie avec les séquences RSA (Gennaro et al;, 1987) de plusieurs plasmides isolés à partir d'organismes Gram-positifs, telles que représentées sur la figure 3. Cette séquence type RSA comprend une repétition inversée comprenant la boîte 10 (-10 box) du promoteur de ORF1 et est localisée à 67 nucléotides du site probable de liaison aux ribosomes en amont de ORFI. La distance entre RSA et le site de liaison aux ribosomes dans pBBR1 est très similaire à celle observée chez les plasmides d'organismes Gram-positifs.

Plusieurs répétitions directes ont également été observées chez pBBR1, dont les plus évidentes sont présentées sur la figure 1. Aucune autre séquence homologue d'ADN a été trouvée entre pBBR1 et les séquences des bases de données EMBL et GenBank, comprenant les séquences d'autres plasmides à large spécificité d'hôtes, confirmant le fait que pBBR1 n'est pas un membre des plasmides du groupe d'incompatibilité connu des bactéries Gram-négatives.

10. Analyse des séquences des protéines de ORF1 et
ORF2
Les séquences des protéines de ORF1 et ORF2 ont été comparées avec les structures primaires des protéines de la bande de données NBRF en utilisant le programme FastA. Alors qu'aucune homologie de séquence significative n'a pu être trouvée entre ORF2 et l'une quelconque des séquences de protéines connues, ORF1 présente une grande similitude avec les protéines Mob et Pre codes par les plasmides des organismes Grampositifs. Les alignements des différentes protéines sont présentés à la figure 4. Cette homologie de séquence se situe au niveau des 186 acides aminés de la partie amino-terminale de la protéine (figure 5) et varie de 31,7% à 42% d'identité. Plus de 10% des résidus amino-acides sont identiques parmi toutes les protéines alignées (figure 4).

La partie carboxy-terminale de ORF1 contient deux régions similaires à la protéine MobA de RSF1010 (figure 6). La région la plus en amont présente 21,3% de résidus identiques à MobA sur une distance de 80 acides aminés, et la région la plus en aval présente 56% d'identite sur une distance de 25 acides aminés.

Les poids moléculaires calculés de ORF1 et ORF2 sont respectivement de 36.685 et 24.409, et leur poids isoelectriques calculés sont respectivement de 10,55 et 6,64. Les charges de ORF1 sont distribuées uniformément sur toute la protéine, alors que ORF2 contient une charge positive nette au niveau de la moitié Nterminale de la molécule, et une charge négative nette au niveau de la partie carboxy-terminale.

11. Les rôles fonctionnels de ORF1 et ORF2
Afin d'étudier les rôles fonctionnels des deux ORF de pBBR1, chacun d'eux a été individuellement interrompu par l'insertion d'un gène commercial KANr (Pharmacia, Uppsala, Suède) à l'intérieur de pBBRlCM, soit au niveau du site HgiAI afin d'inactiver ORF1, soit au niveau du site PvuII afin d'inactiver ORF2. De plus, le gène KANr a été inséré à l'intérieur du site
NarI ou du site AvaI localisés dans la région non codante du plasmide. Après ligation, E.coli MM294 a été transformée avec le plasmide recombinant et sélectionnée sur LB + kanamycine. Alors que de nombreuses colonies ont été obtenues après insertion du gène KANr à l'intérieur d'HgiAI ou de NarI aucune colonie n'a été detectée après insertion à l'intérieur du site PvuII.Le site PvuII est localisé entre le promoteur et le site de liasion aux ribosomes probable situé en amont de ORF2. Par conséquent l'inactivation par insertion au niveau de ce site de restriction doit abolir l'expression de ORF2. En accord avec des résultats précédents utilisant le gène d'insertion CMr à l'intérieur du site AvaII (cf. ci-dessus), l'inactivation de ORF2 supprime la réplication de pBBR1 chez E.coli. Afin de déterminer si ORF2 joue un rôle dans la réplication de pBBR1, des expériences de transcomplémentation ont été réalisées. Le fragment
BalI de 1296 pb isolé de pBBRlCM a été souscloné dans le site SmaI de pUC8, de telle façon que ORF2 se trouve sous le contrôle du promoteur lac dans ce plasmide.

L'orientation du fragment souscloné a été déterminée par analyse de restriction. Un candidat appelé pREP1 a été isolé et utilisé dans les expériences de transcomplémentation. E.coli TG1 contenant pREP1 a été transformée avec pBBRlCM possédant une insertion de la cassette KanR au site AvaII dans ORF2. Les cellules transformées ont été étalées sur milieu LB contenant de l'ampicilline, du chloramphénicol, de la kanamycine et de l'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside (0.5 mM) afin de déréprimer le promoteur lac. Les résultats indiquent qu'en présence de pREP1 de nombreuses colonies d'E.coli résistantes aux antibiotiques ont été détectées. Par contre en l'absence de pREP1 aucune colonie résistante n'apparaît.L'analyse de restriction de l'ADN plasmidique isolé des clones transformés et résistants aux antibiotiques a montré la présence à la fois de pREPl et du plasmide dérivé de pBBRlCM. Cette expérience montre que pREP1 est capable d'apporter les fonctions de réplication en trans lorque ORF2 est inactivée dans pBBRlCM. Par conséquent la protéine codée par ORF2 peut être dénommée protéine Rep.

L'inactivation de ORF1 n'interfère pas avec l'habilité du plasmide à se répliquer chez E.coli, et
ORF1 n'est par conséquent pas essentiel pour la réplication de pBBRl. En raison de l'homologie en acides aminés de ORF1 avec la famille des protéines Mob (figures 4 et 6), le rôle de ORF1 dans la conjugaison a été étudié plus en détail. A cet effet, pBBRlCM contenant le gène KANr inséré au niveau du site HgiAI, ou au niveau du site AvaI, a tout d'abord été introduit dans E.coli Si10. Les souches d'E.coli SM10 transformées ont ensuite été conjuguées avec B.pertussis BPRA, et les ex-conjugants ont été sélectionnés sur agar BG contenant de la streptomycine et du chloramphénicol ou de la kanamycine. B. pertussis résistant à la kanamycine et au chloramphénicol et contenant le plasmide recombinant derivé de pBBR1 n'a pu être obtenu qu'après insertion à l'intérieur du site
AvaI. Aucune colonie de B.pertussis n'a été détectée sur BG+kanamycine ou BG+chloramphénicol après insertion à l'intérieur du site HgiAI. Ce résultat indique que l'interruption de ORF1 par insertion à l'intérieur du site HgiAI, supprime la mobilisation de pBBRlCM, alors que l'insertion à l'intérieur du site AvaI dans la région non codante n'altère pas la mobilisation. Il est par conséquent probable que ORF1 code pour une protéine impliquée dans la mobilisation de pBBR1, cette protéine ayant par conséquent été appelée protéine Mob.

12. pBBR1 ne se réplique pas par l'intermédiaire
d'un mécanisme de cercle roulant.

Puisque pBBR1 n'est pas un membre des groupes à large spectre d'hôtes IncQ, IncP et IncW, mais présente une homologie significative avec des séquences de petits plasmides provenant d'organismes Gram-positifs, il a été étudié si pBBRlCM, au même titre que ces derniers, se réplique également par l'intermédiaire d'un mécanisme de type de cercle roulant, générant ainsi des intermédiaires d'ADN monobrin (Gruss et
Ehrlich, 1989). L'ADN monobrin peut être détecté de façon spécifique par hybridation après transfert sur nitrocellulose selon Southern dans des conditions non dénaturantes. Par conséquent des analyses par transfert sur nitrocellulose (Sourthern blot) ont été réalisées dans des conditions dénaturantes ou non dénaturantes, avant ou après traitement des échantillons d'ADN avec la nucléase S1.Des résultats présentés sur la figure 8 comprennent des expériences réalisées avec la forme réplicative de M13mpl8 contenant le gène CMr à l'intérieur du site Smal en tant que contrôle positif d'un mécanisme de réplication de type de cercle roulant (colonnes 1 et 2), pBBRlCM (colonnes 3 et 4), et pBR328 (colonnes 5 et 6) en tant que contrôle négatif d'un plasmide dont le mécanisme de réplication n'implique pas une étape d'ADN monobrin.

Comme il est présenté sur la figure 8B, seulement
M13mpl8CM présente un intermédiaire d'ADN monobrin (figure 8B, colonne 1), qui disparaît après digestion avec la nucléase S1 (figure 8B, colonne 2).

Ni pBBRlCM ni pBBR328 ne semblent accumuler une forme d'ADN monobrin. La figure 8A montre que différentes formes de plasmides peuvent être détectées après transfert sur nitrocellulose selon Southern dans des conditions dénaturantes. L'absence d'un intermédiaire monobrin de pBBRlCM durant la réplication indique que pBBR1 ne se réplique pas par l'intermédiaire d'un mécanisme en cercle roulant.

13. Insertion de sites de restriction dans pBBR1.

La cassette CmR a été introduite dans le site SmaI de pUC18 et de pUC19 (Yanisch, Perron C., Vieira Y., & BR<
Messing Y. Gene, 33:103-119 (1985)). Les dérivés de pUC18 et de pUC19, résistants au chloramphénicol, ont ensuite été digérés par HaeII et les fragments contenant le promoteur lac, les sites de restrictions et la cassette CmR ont été traites à la T4 DNA polymérase et insérés dans pBBR1, digéré par PvuI et traité avec la T4 DNA polymérase. Les dérivés de pBBR1, résistants au chloramphénicol, ont eté analysés par restriction et deux candidats ont été retenus.Ces plasmides recombinants sont appelés pBBRlCM181 et pBBRlCMl91, et contiennent la cassette CmR dans le fragment HaeII provenant respectivement de pUC18 et pUCl9.

Après introduction dans B.pertussis, ces nouveaux plasmides se maintiennent de manière stable et peuvent être utilisés pour le clonage de fragments d'ADN dans de nombreuses bactéries Gram-négatives. Les sites uniques et utiles pour le clonage sont : SacI, KpnI,
BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI et HindIII. Les sites uniques en aval du promoteur lac sont SacI et KpnI pour pBBRlCM181, et BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI et HindIII pour pBBRlCMl91. Ces sites permettent l'insertion d'un fragment d'ADN en vue de l'expression dans les espèces qui reconnaissent les signaux du promoteur lac.

III. Analyse des résultats
Les plasmides de plusieurs souches de B.bronchiseptica ont fait l'objet de précédentes études, et il a été trouvé que certains d'entre eux étaient associés à la résistance à de nombreux antibiotiques ou métaux lourds (Graham A.C. et Abruzzo
G.K., 1982; Hedges R.W. et al, 1974; Jackwood, M.W. et al, 1987, Lax, A.J. et Walker C.A., 1986; Shimizu M., et al, 1981; Terakado, N., et al, 1973; Terakado, N., et Mitsuhashi, S., 1974). Par exemple le plasmide R906 du groupe IncP isole par Terakado et al. (1973) est associé à la résistance à l'ampicilline, la streptomycine, les sulfonamides et les sels de mercure.

D'autres plasmides du groupe IncQ ont été isolés à partir de plusieurs souches de B.bronchiseptica (Lax et
Walker, 1986), et confèrent la résistance à un- ou plusieurs antibiotiques tels que l'ampicilline, la tétracycline et le sulfonamide. Ces plasmides sont proches de RSF1010, voire identiques à ce dernier.

Les 16 souches de B.bronchiseptica étudiées cidessus sont tout d'abord caractérisées par la présence du gène PTX, l'absence de PTX et la production de FHA.

Il a également été déterminé que l'ADN de Bordetella est résistant à la digestion par HindIII. Ceci suggère que ces souches possèdent un système de restrictionmodification liée à HindIII. Un tel système a déjà été décrit pour B.pertussis (Greenaway, 1980), et il semble qu'il existe également chez B.bronchiseptica.

Toutefois, il est intéressant de noter qu'aucun site Hindîli n'a été trouvé jusqu'à present parmi les fragments d'ADN de Bordetella qui ont été séquencés dans plusieurs laboratoires, ainsi que dans la séquence d'ADN de la présente invention (Arico et Rappuoli, 1987; Charles et al. 1989; Delisse-Gathoye et al., 1990; Glaser et al., 1988; Locht et Keith, 1986).

Puisque 1'ADN de Bordetella séquencé jusqu'à maintenant atteint une longueur totale de plus de 70-kb de fragments discontinus, il est probable que le genre
Bordetella présente la propriété non usuelle de ne pas contenir de site HindIII dans leur génome.

Cinq souches de B.bronchiseptica contiennent de l'ADN plasmidique proche de celui de RSF1010. Une souche présente, en plus du plasmide proche de RSF1010 (désigné par pBBR2), un petit plasmide cryptique dénommé pBBRl, visible dans un gradient de chlorure de césium. L'insertion de gènes de résistance aux antibiotiques permet de démontrer que pBBR1 est capable de se repliquer chez E.coli avec un grand nombre de copies. Il peut également être transmis par conjugaison en utilisant les fonctions de transfert RK2 données en trans. Cette propriété permet de démontrer que pBBR1 est capable de se répliquer et de se maintenir de façon stable chez E.coli, B.bronchiseptica, B.pertussis,
V.cholerae, P.putida, et R.meliloti.

Des tests d'incompatibilité ont permis de demontrer que pBBR1 n'est pas un membre des groupes
IncP, IncQ, et IncW connus pour se répliquer chez l'espèce Bordetella. Ceci a été confirmé par l'absence d'homologie d'ADN entre pBBRl et l'un de ces trois groupes de plasmides. Aucune homologie de séquence n'a également été observée avec les plasmides à large spectre d'hôtes du groupe IncN (Krishan et Iyer, 1988).

Il est par conséquent possible que pBBRl appartienne au groupe IncC, connu également pour son large spectre d'hôtes (Datta et Hedges, 1972). Les plasmides de ce groupe d'incompatibilité ont été beaucoup moins étudiés que ceux appartenant aux autres groupes à large spectre d'hôtes et les séquences des plasmides IncC ne sont pas encore disponibles.

Le mécanisme de réplication de pBBRl n'est pas encore connu, mais ne semble pas requérir une forme intermédiaire monobrin. Par conséquent pBBRl ne se réplique pas par l'intermédiaire d'un mécanisme en cercle tournant, caractéristique des petits plasmides
Gram-positifs (Gruss et Ehrlich, 1989). De plus aucune homologie de séquence n'a été détectée entre pBBRl et les séquences impliquées dans la réplication en cercle tournant, en dépit de la présence significative de séquences similaires aux régions responsables de la mobilisation des plasmides des organismes Grampositifs. pBBR1 semble être le premier plasmide naturel connu jusqu'à ce jour comprenant à la fois un mécanisme de réplication des plasmides d'organismes Gram-négatifs avec un mécanisme de mobilisation des plasmides d'organismes Gram-positifs.

La réplication de pBBRl requiert l'expression de
ORF2, puisque l'inactivation par insertion de ORF2 à deux positions différentes abolit la réplication du plasmide dans E.coli. La protéine codée par ORF2 a par conséquent été appelée protéine "Rep". Rep ne présente pas de similitude significative avec d'autres séquences de protéines connues. Toutefois, sur la base de la distribution de charge, il est probable que se serait une protéine à deux domaines. Le domaine amino-terminal contient une charge postive nette et pourrait par conséquent être le domaine interagissant avec l'ADN plasmidique. Le domaine carboxy-terminal contient une charge négative nette, et des prédictions de structure secondaire suggèrent que cette portion de protéine contient très peu de structures secondaires ordonnées.

En raison de sa charge négative, ce domaine serait écarté de l'ADN pour interagir avec d'autres protéines durant la réplication de plasmides.

Bien que la séquence entière de pBBRl présente un contenu riche en G+C, plusieurs régions ont été identifiées avec un contenu exceptionnellement haut en
A+T. Les origines de réplication des plasmides Gramnégatifs sont habituellement riches en AT et contiennent deux ou plusieurs répétitions directes (Kües et Stahl, 1989). La plus grande zone riche en AT est localisée en amont de OFR2. Cette région riche en
AT contient une séquence identique à la séquence consensus de liaison à l'hâte (IHF), et deux paires différentes de répétitions directes. En se liant à son
ADN cible, IHF peut accroître la liaison ADN, processus important pour l'interaction ADN-proteine durant la réplication (Friedman, D.I. 1988). Il est probable que cette zone est impliquée dans la réplication de pBBRl, notamment par intermédiaire d'une liaison avec Rep.

Puisque pBBRl a pu être transféré avec d'autres bactéries Gram-négatives lorsque les fonctions tra du plasmide IncP RK2 sont disposées en trans, il contient un oriT qui peut être utilisé par les protéines de transfert IncP, à la condition qu'il contienne également un ORF1 fonctionel. L'analyse de la séquence d'ADN indique que pBBRl contient un site RSA (Gennaro et al., 1987) en amont de ORF1, comprenant une répétition inversée et le 'la10 box" du promoteur probable de ORF1. De plus ORF1 présente des homologies de séquence avec la protéine Mob ou la protéine Pre (enzyme de recombinaison de plasmide) impliquée dans la mobilisation des plasmides provenant d'organismes
Gram-positifs via la formation du plasmide RecAindépendant (Gennaro et al., 1987, Priebe et Lacks, 1989).Durant les étapes initiales de la mobilisation, il a été proposé que les protéines interagissent spécifiquement avec le site RSA, et catalysent la coupure des brins d'ADN et parfois la recombinaison avec d'autres plasmides ou le chromosome bactérien avant transfert. Le transfert par conjugaison peut avoir lieu en présence de gènes agissant en trans et fournissant d'autres fonctions tra. L'inactivation de
ORF1 par insertion entraîne la perte du transfert par conjugaison de pBBR1, ce qui confirme que ORF1 code également pour une protéine impliquée dans la mobilisation du plasmide, qui a par conséquent été appelée protéine "Mob". L'homologie entre Mob et les protéines Mob/Pre de bactéries Gram-positives se situe dans la moitié amino-terminale des molécules.Bien que cette homologie soit frappante avec différentes molécules Mob/Pre de plasmides provenant de bactéries
Gram-positives, elle n'est pas limitée aux plasmides
Gram-positifs puisqu'une homologie significative a également été retrouvée avec ORF1 de pZM2, isolé à partir de Zymomonas mobilis (Misawa et Nakamura, 1989).

Toutefois à la différence des protéines Mob/Pre des plasmides des bactéries Gram-positives, ORF1 de pZM2 n'est pas précédé par un RSA et son rôle fonctionnel est inconnu.

La partie carboxy-terminale de la protéine Mob presente deux régions de séquences similaires à la protéine MobA de Rif1010. Puisque le transfert par conjugaison de pBBR1 nécessite, en plus de la protéine
Mob de ORF1, les fonctions tra fournis en trans par
E.coli SM10, il est concevable que le domaine aminoterminal de la protéine Mob de ORF1 interagisse spécifiquement avec le site RSA, alors que le domaine carboxy-terminal homologue de MobA de RSF1010 interagit avec les autres protéines de transfert codées par le chromosome de la souche SM10.

La protéine MobA de RSF1010 est divisée en deux domaines. Le domaine amino-terminal est impliqué dans la mobilisation du plasmide, alors que le domaine carboxy-terminal présente une activité primase (Scholz et al., 1989). La région la plus en amont de ces deux régions homologues est située dans le domaine de MobA RSF1010 qui est impliqué dans la mobilisation, alors que la région la plus en aval de ces régions est localisée dans le domaine primase. En plus de MobA RSF1010, l'hexapeptide AQRQQE a également été trouvé dans la séquence MobL de pTF1, un plasmide mobilisable cryptique isolé à partir de Thiobacillus ferrooxidans (Drolet et al., 1990).

L'analyse de la séquence de pBBR1 indique que ce dernier ne contient pas de gène codant pour la résistance aux antibiotiques ou au métaux lourds. Le plasmide semble coder uniquement pour ses fonctions de réplication et de mobilisation. Deux sites de restriction ont été identifiés (PvuI et AvaI) permettant l'insertion d'ADN etranger sans pour autant affecter les mécanismes de réplication ou de conjugaison. Ces sites peuvent être utilisés pour insérer des sites multiples de clonage afin de transformer pBBRl en un nouveau vecteur de clonage à large spectre d'hôtes.

En conclusion, son large spectre d'hâtes, son grand nombre de copies et sa petite taille font de pBBRl un modèle utile pour 1 l'étude du maintien des réplicons, du spectre d'hôtes, du contrôle de nombre de copies, de la mobilisation, et de l'interaction des protéines codées par l'hâte provenant de différentes espèces bactériennes avec les produits des gènes et ceux codés par le plasmide. Ces propriétés rendent ce plasmide particulièrement intéressant pour le developpement de vecteurs d'expression et de clonage à large spectre d'hâtes pour les bactéries Gramnégatives. Il est particulièrement intéressant à utiliser pour la transformation de B.pertussis et
B.bronchiseptica pour lesquels seuls des vecteurs de grande taille et à faible nombre de copies sont actuellement disponibles, par exemple le pLAFRI.

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Tableau I
Caractérisation des différentes souches Bordetella
Souches digestion Plasmide du ptx gène PTX FHA Origine
par HindIII type RSF 1010
B. bronchiseptica NL 1011 - + + - + porc
B. bronchiseptica NL 1012 - - + - + chien (1973)
B. bronchiseptica NL 1013 - - + - + porc
B. bronchiseptica NL 1014 - - + - + cobaye (1986)
B. bronchiseptica NL 1015 - - + - + inconnue
B. bronchiseptica NL 1016 - - + - + inconnue
B. bronchiseptica NL 1017 - - + - + inconnue
B. bronchiseptica NL 1018 - + + - + inconnue
B. bronchiseptica NL 1019 - + + - + inconnue
B. bronchiseptica NL 1020 - - + - + inconnue B. bronchiseptica NL 1011 - + + - + inconnue
B. bronchiseptica CAT - - + - + chat (1985)
B. bronchiseptica 7-8 - - + - + cochon (1979)
B. bronchiseptica S87 - + - - + inconnue (1978)
B. bronchiseptica 899L - - - - + Marchitto et al., 1987
B. bronchiseptica 7668 - - - - + Marchitto et al., 1987
B. pertussis Tohama I - - + + + Antoine and Locht. 1990 Tableau II
Test d'incompatibilité
Plasmide Margueut sur le Fréquence de colonies introduit plasmide introduit résistantes au chloramphénicol pLAFRII Tetracycline 50/50* pGV1106 Kanamycin 48%50
RSF1010 Streptomycin 50/50 pBBRIKAN Kanamycin 5/50 *Nombre de colonies bactériennes qui retiennent le plasmide résident pBBR1CM après introduction du plasmide introduit et sélection avec seulement le marquer d'antibiotique de plasmide introduit.

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend: - soit un fragment d'ADN délimité par les nucléotides situés aux positions 1793 et 2452 de la figure 1, et codant pour le polypeptide Rep dont la séquence en acides aminés est représentée sous ce fragment d'ADN sur la figure 1, ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de réplication de cet acide nucléique lorsque ce dernier est introduit dans un hôte cellulaire possédant les éléments nécessaires pour assurer cette réplication, - soit un fragment d'ADN constitué de la succession d'une part du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 2500 et 2687, et, d'autre part, du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 1 et 799 de la figure 1, et codant pour le polypeptide Mob dont la séquence en acides aminés est représentée sous ce fragment d'ADN sur la figure 1, ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de mobilisation dudit acide nucléique assurant le transfert de ce dernier entre hôtes cellulaires.

2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend à la fois - un fragment d'ADN délimité par les nucléotides situés aux positions 1793 et 2452 de la figure 1, et codant pour le polypeptide Rep dont la séquence en acides aminés est représentée sous ce fragment d'ADN sur la figure 1, ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de réplication de cet acide nucléique lorsque ce dernier est introduit dans un hôte cellulaire possédant les éléments nécessaires pour assurer cette réplication, - et un fragment d'ADN constitué de la succession d'une part du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 2500 et 2687, et, d'autre part, du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 1 et 799 de la figure 1, et codant pour le polypeptide Mob dont la séquence en acides aminés est représentée sous ce fragment d'ADN sur la figure 1, ou toute partie de ce fragment d'ADN susceptible de coder pour un polypeptide impliqué dans le mécanisme de mobilisation dudit acide nucléique assurant le transfert entre hôtes cellulaires de ce dernier sous forme monocaténaire.

3. Acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou la revendication 2, et dont la séquence nucléotidique diffère, en fonction de la dégénérescence du code génétique, de celles des acides nucléiques selon la revendication 1 ou la revendication 2.

4. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une ou l'autre des deux séquences nucléotidiques complémentaires constituant les fragments d'ADN décrits dans l'une des revendications 1 à 3.

5. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il est susceptible de s'hybrider avec un acide nucléique selon la revendication 4.

6. Plasmide caractérisé en ce que son ADN bicaténaire circulaire comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.

7. Plasmide selon la revendication 6 caractérisé en ce que son ADN bicaténaire circulaire est représenté sur la figure 1.

8. Plasmide selon la revendication 7 caractérisé: - en ce qu'il est présent dans des souches de
B.bronchiseptica, notamment dans la souche S87, - en ce qu'il comprend les éléments nécessaires pour assurer sa réplication chez de nombreux hôtes cellulaires Gram-négatifs, notamment chez E.coli et
B.pertussis, - en ce qu'il est mobilisable mais n'est pas un plasmide conjugatif, - en ce qu'il est compatible avec d'autres plasmides eux-mêmes susceptibles de se répliquer dans un grand nombre de cellules hôtes différentes, notamment avec les plasmides des groupes IncP, IncQ et IncW, - en ce qu'il n'est pas un élément transposable, - en ce qu'il est susceptible d'être répliqué en environ 30 à 40 copies par cellule hôte transformée.

9. Plasmide selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique hétérologue vis à vis de 1'ADN dudit plasmide.

10. Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique hétérologue est insérée dans l'ADN du plasmide, au niveau d'un site non essentiel pour sa réplication et, le cas échéant, non essentiel pour sa mobilisation.

11. Plasmide selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique hétérologue comprend un acide nucléique codant pour un polypeptide déterminé susceptible d'être produit par un hôte cellulaire après transformation de ce dernier avec ledit plasmide, cette séquence nucléotidique comprenant également les éléments nécessaires pour promouvoir et contrôler l'expression de l'acide nucléique codant sus-mentionné dans un hôte cellulaire, et plus particulièrement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hâte cellulaire, notamment un promoteur inductible, situé en amont dudit acide nucléique codant, et sous le contrôle duquel la transcription dudit acide nucléique est susceptible d'être effectuée, le cas échéant une séquence signal codant pour un peptide signal située en amont dudit acide nucléique codant et en aval du promoteur, ainsi qu'une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription située en aval dudit acide nucléique codant.

12. Hôte cellulaire transformé par un plasmide selon l'une des revendications 6 à 11.

13. Hôte cellulaire selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments de régulation permettant l'expression d'un acide nucléique codant pour un polypeptide déterminé tel que défini dans la revendication 11.

14. Hôte cellulaire selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche de E.coli MM 294 transformée à l'aide du plasmide pBBRlKAN, à savoir le plasmide tel que défini dans la revendication 7 ou la revendication 8 et comportant, inséré au niveau de son site PvuI, le gène de résistance à la kanamycine Tn903, cette souche de
E.coli ayant été déposée à la Collection Nationale de
Cultures de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut
Pasteur le 8 octobre 1991 sous le numéro I-1152.

15. Hôte cellulaire selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche de E.coli MM 294 transformée à l'aide du plasmide pBBRlCM à savoir le plasmide tel que défini dans la revendication 7 ou la revendication 8 et comportant, inséré au niveau de son site PvuI, le gène de résistance au choramphenicol, cette souche de E.coli ayant été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur le 8 octobre 1991 sous le numéro I-1151.

16. Utilisation d'un plasmide selon l'une des revendications 6 à 11 pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention d'un polypeptide déterminé codé par une séquence nucléotidique hétérologue telle que définie dans la revendication 11.

17. Procédé d'obtention d'un polypeptide déterminé, ce procédé comprenant la succession d'étapes suivantes: - la mise en culture d'un hôte cellulaire selon l'une des revendications 12 à 15, transformé par un vecteur recombinant selon la revendication 11, dans un milieu de culture approprié, - la récupération du polypeptide déterminé produit par ledit hôte cellulaire, soit directement à partir du susdit milieu de culture, lorsque la séquence codant pour ledit polypeptide est précédée d'une séquence signal et que l'hôte cellulaire est capable de secréter le polypeptide dans le milieu de culture (notamment dans le cas des cellules eucaryotes et des levures), soit après lyse de l'hâte cellulaire (notamment dans le cas des bactéries), - le cas échéant, la purification du polypeptide déterminé récupéré à l'étape précédente.

18. Polypeptide Rep codé par l'acide nucléique selon la revendication 1, et caractérisé par la séquence en acides aminés représentée sous le fragment d'ADN délimité par les nucléotides situés aux positions 1793 et 2452 de la figure 1, ou toute partie de ce polypeptide susceptible de jouer un rôle dans le mécanisme de réplication dudit acide nucléique lorsque ce dernier est introduit dans un hôte cellulaire possédant les éléments nécessaires pour assurer cette réplication.

19. Polypeptide Mob codé par l'acide nucléique selon la revendication 1, et caractérisé par la séquence en acides aminés représentée sous le fragment d'ADN constitué de la succession d'une part du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 2500 et 2687, et, d'autre part, du fragment délimité par les nucléotides situés aux positions 1 et 799 de la figure 1, ou toute partie de ce polypeptide susceptible de

Claims (1)

1. jouer un rôle dans le mécanisme de mobilisation dudit acide nucléique assurant le transfert de ce dernier entre hôtes cellulaires.