JP7277516B2

JP7277516B2 - 組換えボルデテラ株

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Publication number: JP7277516B2
Application number: JP2021116104A
Authority: JP
Inventors: カミーユロクト; ナタリーミエルカレック; ハナカモウン
Original assignee: インセルム（インスティテュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカル）; アンスティテュパストゥールドゥリール; ユニベルシテドリール
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2023-05-19
Anticipated expiration: 2033-10-17
Also published as: JP2019088303A; EP2909229A1; AU2013333928A1; HK1213926A1; EP3459966B1; EP2722338A1; SG10201706392YA; US20150210978A1; WO2014060514A1; CN104936976A; US9528086B2; CN110923181A; AU2013333928B2; DK3459966T3; EP3459966A1; DK2909229T3; JP6473086B2; SG11201502010TA; CA2887055C; JP6914976B2

Description

発明の領域：
本発明は、異種タンパク質を発現する新規の遺伝学的に弱毒化された百日咳菌（Bordetella pertussis）株、およびワクチンとしての、即ち、粘膜免疫感作のためのそれらの使用に関する。

本発明は、さらに、ボルデテラ（Bordetella）株の免疫原性を増加させる方法に関する。

発明の背景：
ワクチンの経鼻送達のような粘膜免疫感作は、古典的な非経口予防接種と比べて多数の利点を有する。それらは、針を使用せず、混入の傾向がより低く、訓練された医療従事者または診療補助者への依存がより少なく、全身免疫および粘膜免疫の両方を誘導することができ、おそらく粘膜感染に対する防御のためにより適切である。

しかしながら、大部分の抗原は、経鼻的に与えられた時、不十分な免疫原であり、強力な粘膜アジュバントの添加を必要とする。最も強力な粘膜アジュバントのうちの一つは、コレラ毒素または密接に関連している大腸菌（Escherichia coli）易熱性毒素およびそれらの解毒型誘導体である。残念ながら、このアジュバントの経鼻ワクチン製剤への添加は、ベル麻痺と関連付けられており（Mutsch et al.,2004）、従って、ヒトにおいては使用され得ない。

本発明者らは、百日咳に対する弱毒生経鼻ワクチン候補を最近開発し（Mielcarek et al.,2006）、それは、ファーストインマン第I相安全性試験を既に成功裡に完了した（Thorstensson et al.、準備中）。この候補ワクチンの概念は、エアロゾル曝露を介した百日咳菌による自然感染が、極めて若い幼児においてすら強力な全身性のB細胞応答およびT細胞応答を誘導することができ（Mascart et al.,2003）、さらに、粘膜免疫も誘導することができるという所見に基づいていた。さらに、非ヒト霊長類における以前の研究は、「百日咳に対する最終的な防御は、おそらく生百日咳菌接種後に最も良く起こる」という結論に至っている（Huang et al.,1962）。

百日咳菌の病原性の分子機序（Locht et al.,2001）の知識に基づき、百日咳菌株を弱毒化し、百日咳毒素を遺伝学的に不活化し、皮膚壊死毒素遺伝子を欠失させ、百日咳菌のampG遺伝子を大腸菌ampGに交換し、それによって、気管細胞毒素の産生を消失させることによって構築した。前臨床モデルにおいて、BPZE1と命名されたこのワクチン候補は、優れた安全性を示し（Mielcarek et al.,2006,2010；Skerry et al.,2009；Kavanagh et al.,2010；Li et al.,2010）、単回経鼻投与によって、迅速で、強力で、持続性の免疫を誘導した（Feunou et al.,2010）。

さらに、驚くべきことに、BPZE1株は、マウスへ経鼻投与された時、気道のアレルギー状態および炎症状態、即ち、喘息に対して、さらに、局所アレルギーに対しても、防御応答を誘発し得ることが明らかとなった。

Reveneauらは、毒素産生が欠損しており、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と防御破傷風毒素断片C（TTFC）とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、成熟FHAを産生しない、遺伝学的に弱毒化されたボルデテラ株を開示している。

Coppensらは、毒素産生が欠損しており、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と髄膜炎菌（N.meningitis）のTbpBとを含むハイブリッドタンパク質を発現し、成熟FHAを産生しない、遺伝学的に弱毒化されたボルデテラ株を開示している。

Alonsoらは、毒素産生が欠損しており、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と無莢膜型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）のHtrAタンパク質とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、成熟FHAを産生しない、遺伝学的に弱毒化されたボルデテラ株を開示している。

US 6 841 358は、毒素産生が欠損しており、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片とマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）のSm28 GSTのモデルペプチドとを含むハイブリッドタンパク質を発現し、成熟FHAの産生が欠損している、遺伝学的に弱毒化されたボルデテラ株を開示している。

しかしながら、fhaB遺伝子は、免疫原性を増加させる目的のために欠失させられたのではなく、欠失は、異種抗原の産生のための担体として使用された株の同時発生的な内因性の特色に過ぎなかった。

その後、BPZE1は、数種の異なる病原体に対して同時に防御することができる多価経鼻ワクチンを開発するための異種防御抗原の発現のためのベクターとして見なされてきた。エンテロウイルス71由来の中和ペプチドSP70は、繊維状赤血球凝集素（FHA）とのハイブリッドタンパク質として、FHAの分泌機構を使用して、BPZE1によって表面に露出させられ、分泌された（Ho et al.,2008）。同様に、BPZE1によってA型インフルエンザ（influenza A）ウイルス由来の基質タンパク質2の外部ドメインを分泌させ露出させるためにも、FHA機構が使用された（Li et al.,2011）。組換えBPZE1誘導体の投与によって、異種抗原に対する全身性および局所性のIgG応答およびIgA応答を誘発することができたが、パッセンジャー抗原に対する免疫応答は、通常、高々中程度のものであった。

BPZE1構築物によって入手される不十分な免疫原性の問題を解決することを試みる中で、天然に存在するFHAタンパク質をコードするネイティブfhaB遺伝子を欠失させるかまたは他の何らかの方法で不活化した時、免疫原性が大いに増加し得ることが、驚くべきことに、本発明者らによって発見された。

さらに、このようにして入手された株は、喘息およびアレルギー性疾患に対する活性によって証拠付けられるような、百日咳菌のネイティブ弱毒株の抗炎症特性にも関わらず、実質的に増加した免疫原性を示した。従って、本発明は、安全であり、かつ上気道または下気道の感染の原因となる病原体を含む、全身感染または粘膜感染の原因となる病原体に存在する抗原に対して強力な免疫応答を誘発することができる、粘膜適用のためのワクチンのための問題を解決する。

本発明は、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、FHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、遺伝学的に弱毒化された組換え百日咳菌株を提供する。

本発明は、粘膜感染、即ち、上気道または下気道の感染の原因となる病原体に対する免疫応答を誘発することを目的とした、上記定義の百日咳菌株を含む、粘膜感染性疾患の処置のための弱毒生ワクチンをさらに提供する。

本発明は、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、FHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含む融合タンパク質を発現し、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、遺伝学的に弱毒化された組換え百日咳菌株を、適切な媒体内に含むワクチンの有効量を、哺乳動物へ投与する工程を含む、哺乳動物における感染性疾患の予防の方法にも関する。

もう一つの局面において、本発明は、本発明の組成物またはワクチンを使用して、粘膜、即ち、下気道もしくは上気道を感染させる病原体による感染に対して哺乳動物を防御し、かつ／または哺乳動物においてそのような病原体に対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。

さらにもう一つの局面において、本発明は、組換え弱毒百日咳菌株を哺乳動物へ投与する工程を含む、哺乳動物において粘膜向性を有する病原体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。本法において、変異型百日咳菌株は、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、免疫応答が求められる病原体のFHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含む融合タンパク質を発現し、組換え株において、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子は不活化されている。

もう一つの局面において、組換え株は、さらに、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子に加えて、欠失または変異させられた皮膚壊死毒素（dnt）遺伝子を含む。いくつかのそのような局面において、野生型ボルデテラ株ampG遺伝子は、大腸菌ampG遺伝子のような他のグラム陰性菌のampG遺伝子に置換される。

他の局面において、ptx遺伝子の変異は、基質結合に関与するアミノ酸および／または触媒作用に関与するアミノ酸の置換を含む。いくつかのそのような局面において、基質結合に関与するアミノ酸の置換はR9Kを含み、触媒作用に関与するアミノ酸の置換はE129Gを含む。いくつかの局面において、百日咳菌株は三重変異株を含む。いくつかのそのような局面において、ボルデテラ株は、アクセッション番号CNCM 1-3585によって同定されるBPZE1株である。

他の局面において、方法は、哺乳動物における粘膜感染の防止または処置をさらに含む。いくつかの局面において、百日咳菌株は粘膜感染の前に投与される。いくつかのそのような局面において、百日咳菌株は、粘膜感染の約6週間以上前に投与される。他のそのような局面において、百日咳菌株は、粘膜感染の約12週間以上前に投与される。いくつかの局面において、粘膜感染の原因となる病原体は、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、または肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）である。

他のいくつかの局面において、株は、粘膜感染に対する防御免疫を必要とする哺乳動物へ投与される。いくつかの局面において、哺乳動物はヒトである。

さらにもう一つの局面において、本発明は、ボルデテラ組換えベクターに基づくワクチンを投与する工程を含む、哺乳動物において病原体に対する免疫応答を増強する方法を提供する。本法において、ボルデテラは、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、免疫応答が求められる病原体の異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含む融合タンパク質を発現し、組換え株において、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子は不活化されている。

ボルデテラ株は、好ましくは、百日咳菌株であるが、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchispetica）またはパラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）のような他のボルデテラ種であってもよい。

ボルデテラ株は、BPZE1についての上記の特色を有利に含み、上記のような病原体に対する薬学的ワクチンまたは動物用ワクチンとして投与され得る。
[本発明1001]
変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、FHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、遺伝学的に弱毒化された百日咳菌（Bordetella pertussis）株。
[本発明1002]
ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している、本発明1001の百日咳菌株。
[本発明1003]
FHAタンパク質のN末端断片が、FhaBタンパク質前駆体の最初のアミノ酸から出発して、1～862位、好ましくは、1～330位のアミノ酸を含む、本発明1001または1002の百日咳菌株。
[本発明1004]
毒素をコードする遺伝子が、酵素的に不活性であるが免疫学的特性は保持しているタンパク質をもたらす少なくとも1個の変異を含む、本発明1001～1003のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1005]
ampG遺伝子が、5％未満の残存TCT活性をもたらす異種ampG遺伝子に置換されている、本発明1001～1004のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1006]
異種ampG遺伝子が大腸菌（E.coli）由来である、本発明1005の百日咳菌株。
[本発明1007]
百日咳菌皮膚壊死毒素（Dnt）をコードする遺伝子が変異または欠失している、本発明1001～1006のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1008]
アクセッション番号CNCM 1-3585によって同定されるBPZE1である、本発明1001～1007のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1009]
異種タンパク質が、上気道または下気道の感染の原因となる病原体によって発現されるタンパク質の少なくとも1個のエピトープを含む、本発明1001～1008のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1010]
ハイブリッドタンパク質が、A型インフルエンザウイルスの基質タンパク質の細胞外ドメイン（Me2）に融合したFHAのN末端断片を含む、本発明1001～1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1011]
ハイブリッドタンパク質が、A型インフルエンザウイルスの基質タンパク質の細胞外ドメイン（Me2）の3コピーに融合したFHAタンパク質のN末端断片を含む、本発明1001～1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1012]
ハイブリッドタンパク質が、呼吸器合胞体ウイルス（SRV）のGタンパク質の少なくとも1個の抗原性断片に融合したFHAタンパク質のN末端断片を含む、本発明1001～1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1013]
ハイブリッドタンパク質が、肺炎球菌（S.pneumoniae）のPcsBタンパク質の抗原性断片に融合したFHAタンパク質のN末端断片を含む、本発明1001～1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1014]
本発明1001～1013のいずれかにおいて定義される百日咳菌株を含む、粘膜感染性疾患または全身感染性疾患の処置のための弱毒生ワクチン。
[本発明1015]
粘膜感染性疾患または全身感染性疾患の原因となる病原体によって発現される異種タンパク質に対する免疫応答を誘発するための、本発明1001～1014のいずれかの百日咳菌株を含む、粘膜感染性疾患または全身感染性疾患の処置のための弱毒生ワクチン。
[本発明1016]
鼻腔内にまたは吸入によって投与される、本発明1014または1001の弱毒生ワクチン。
[本発明1017]
ボルデテラ組換えベクターに基づくワクチンを哺乳動物へ投与する工程を含む、哺乳動物において病原体に対する免疫応答を増強する方法であって、該ボルデテラが、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、免疫応答が求められる病原体の異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含む融合タンパク質を発現し、組換え株において、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、方法。
[本発明1018]
ボルデテラ株が、百日咳菌株、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）株、またはボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchispetica）株である、本発明1017の方法。

示されたBPZE1誘導体の投与後の血清抗M2e IgG応答。BALB/cマウスを、10⁷CFUの示された株によって、4週間隔で2回、i.n.免疫感作した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）による予防注射を受けたマウスが、陰性対照として役立った。最後の免疫感作の2週間後、血清を収集し、M2eに対する血清IgG応答をELISAによって測定した。示されたBPZE1誘導体の投与後の血清抗G_RSV IgG応答。BALB/cマウスを、10⁷CFUの示された株によって、4週間隔で2回、i.n.免疫感作した。リン酸緩衝生理食塩水による予防注射を受けたマウス（未感作）が、陰性対照として役立った。最後の免疫感作の2週間後、血清を収集し、G_RSVに対する血清IgG応答をELISAによって測定した。示されたBPZE1誘導体の投与後の血清抗PcsB IgG応答。BALB/cマウスを、10⁷CFUの示された株によって、4週間隔で2回、i.n.免疫感作した。最後の免疫感作の2週間後、血清を収集し、PcsBに対する血清IgG応答をELISAによって測定した。

発明の詳細な説明：
定義：
本明細書の全体にわたって、いくつかの用語が利用され、以下のパラグラフにおいて定義される。

本明細書において使用されるように、「PTX」という略語は、分泌型ADPリボシル化毒素である百日咳毒素をさす。PTXは、（S1～S5と命名された）5種の異なるサブユニットから構成され、各複合体が、S4の2コピーおよびその他のサブユニットの1コピーを含有している。サブユニットはA-B構造で配置されている。A成分は、酵素的に活性であり、S1サブユニットによって形成されており、B成分は、受容体結合部分であり、サブユニットS2～S5から構成されている。

本明細書において使用されるように、「DNT」という略語は、皮内注射された時に、マウスおよびその他の実験動物において限局性の病変を誘導することができる易熱性毒素である百日咳菌皮膚壊死毒素をさす。

本明細書において使用されるように、「TCT」という略語は、ボルデテラによって合成される病原性因子である気管細胞毒素をさす。TCTは、ペプチドグリカン断片であり、インターロイキン1産生および一酸化窒素合成酵素を誘導する能力を有する。それは、線毛の静止を引き起こす能力を有し、呼吸上皮細胞に対して致死効果を有している。

本明細書において使用されるように、「融合タンパク質」または「ハイブリッドタンパク質」という用語は、FHAのN末端部分からなる第1のタンパク質と、それと連結された第2のタンパク質とを含むタンパク質をさす。第2のタンパク質は、FHAとは異なるボルデテラのタンパク質、または、好ましくは、異なる種、即ち、粘膜感染もしくは全身感染の原因となるウイルス、真菌、もしくは細菌に由来するタンパク質、またはボルデテラもしくは粘膜感染もしくは全身感染の原因となる種に対する免疫応答を誘発することができるそのようなタンパク質の断片を含む。

「弱毒」という用語は、免疫応答を刺激し、防御免疫を作出することができるが、一般に、疾病を引き起こさない、弱められた、病原性が低下した百日咳菌株をさす。

本発明の方法を使用した「処置（Treating）」または「処置（treatment）」には、本明細書に記載される疾患、状態、または障害に関連した疾患または障害の増加したリスクを有している可能性があるが、未だ症状を経験せず示していない対象において、症状の開始を防止すること、疾患または障害の症状を阻害すること（その発症を遅くするかまたは阻止すること）、疾患の症状または副作用からの軽減を提供すること（対症療法を含む）、および疾患の症状を軽減すること（退行を引き起こすこと）が含まれる。処置は、（疾患の開始を防止するかもしくは遅らせるための、またはその臨床症状もしくは不顕性の症状の顕在化を防止するための）予防的なものであってもよいし、または疾患もしくは状態の顕在化の後の症状の治療的な抑制もしくは緩和であってもよい。

「防御」および「防止」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、病原性の病原体による感染が妨害されることを意味する。

「免疫原性組成物」または「組成物」という用語は、組成物が免疫応答を誘導することができ、従って、免疫原性であることを意味する。「免疫応答」という用語は、免疫系の反応を意味する。これらの反応には、抗原に応答した生物の免疫系の活性の改変が含まれ、例えば、抗体産生、細胞性免疫の誘導、補体活性化、免疫寛容の発達、免疫記憶の発達、または自然免疫活性化が含まれ得る。

本明細書において使用されるように、「疾患」という用語は、当技術分野において一般に公知であり理解されている意味を有し、宿主個体の機能または健康の異常な状態を含む。医療従事者による特定の疾患の診断は、直接検査および／または1種以上の診断テストの結果の考察によってなされ得る。

「経鼻投与」という用語は、鼻腔の呼吸上皮に接触するよう、活性成分を対象の鼻孔へ推進するかまたは他の何らかの方法で導入する投与の形態をさす。経鼻投与は、中央の鼻中隔と各主鼻孔の側壁との間の鼻腔の一番上に位置する嗅上皮との接触も含み得る。嗅上皮の周囲の直近の鼻腔の領域には、気流がない。従って、嗅上皮からの相当の吸収を達成するためには、典型的には、特殊な方法を利用しなければならない。

「エアロゾル」という用語は、圧力下の噴霧ガスによって治療薬適用の部位へ運搬される極めて微細な液滴または固形粒子をさすものとして、従来の意味で使用される。本発明の薬学的エアロゾルは、液状担体と噴霧剤との混合物に溶解していてもよいし、懸濁していてもよいし、または乳化していてもよい治療活性化合物を含有している。エアロゾルは、溶液、懸濁物、エマルション、粉末、または半固形の調製物の形態をとり得る。本発明のエアロゾルは、対象の気道を介して、微細な固形粒子としてまたは液体ミストとして投与するためのものである。炭化水素またはその他の適切なガスを含むが、これらに限定されない、様々な型の噴霧剤を利用することができる。本発明のエアロゾルは、ガス内に実質的に均一なサイズの極めて微細な液体粒子を生成する噴霧器によって送達されてもよい。好ましくは、活性化合物を含有している液体は、噴霧器から患者の気道へ気流によって運搬され得る液滴として分配される。

「哺乳動物」という用語は、本明細書において使用されるように、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタを含むが、これらに限定されない。

「治療的に有効な量」という用語は、疾患の症状を寛解させるのに有効な量である。予防も治療と見なされ得るため、治療的に有効な量は「予防的に有効な量」であり得る。

本明細書において使用されるように、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」という用語、またはそれらの他の変形は、非排他的な包含をカバーするためのものである。例えば、要素のリストを含む過程、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的にはリストされていない、またはそのような過程もしくは方法に固有の他の要素を含むことができる。さらに、反対のことが明示されない限り、「または」とは、排他的な「または」ではなく、包括的な「または」をさす。例えば、条件AまたはBとは、以下のいずれか一つによって満たされる：Aが真実であり（または存在し）、かつBが誤りである（または存在しない）、Aが誤りであり（または存在せず）、かつBが真実である（または存在する）、AおよびBの両方が真実である（または存在する）。

「約」とは、本明細書において使用されるように、量、時間的な期間等のような測定可能な値をさす時、指定された値からの+/-20％または+/-10％、より好ましくは+/-5％、さらに好ましくは+/-1％、さらに好ましくは+/-0.1％の変動を包含することを意味するが、それは、そのような変動が開示された方法を実施するのに適切であるためである。

「対象」とは、ヒトを意味する。典型的には、対象は、新生児、幼児、または成人である。

本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物系に限定されず、当然、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、具体的な局面を記載するためのものに過ぎず、限定するためのものではないことも理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈によってそうでないことが明白に示されない限り、複数の指示物が含まれる。従って、例えば、「ワクチン」との言及には、2種以上のワクチンの組み合わせが含まれ、他も同様である。

本発明者らは、異種抗原を細菌表面および細胞外環境へ運搬するためにFHAのN末端ドメインを使用し、最初のFHAをコードする遺伝子を排除することによって、百日咳菌のための最適化された異種発現系を生成した。3種の異なるモデル（A型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、および肺炎球菌）を使用することによって、本発明は、従来の系と比べた免疫原性の強力な改善の証明を提供する。

本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘発するための免疫原性組成物またはワクチンとして使用され得る組換え弱毒百日咳菌株を提供する。

第1の局面によると、本発明は、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、FHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、遺伝学的に弱毒化された百日咳菌株を提供する。好ましくは、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子は、部分的にまたは完全に不活化されている。

好ましくは、FHAタンパク質のN末端断片は、Lambert-Busine et al.(1998)によって定義されるようなFhaBタンパク質前駆体の最初のアミノ酸から出発して、1～862位、より好ましくは、1～330位のアミノ酸を含む。

気管細胞毒素（TCT）、活性百日咳毒素（PTX）、および皮膚壊死毒素（DNT）が欠損している弱毒生百日咳菌ワクチンは、WO2007/104451およびMielcarek et al.(2006)に記載されている。

百日咳菌ampG遺伝子は大腸菌ampGに置換され得る。得られた株は、1％未満の残存TCT活性を発現した。極めて少量のペプチドグリカン断片を培地へ放出するグラム陰性菌に由来する異種ampG遺伝子が、本発明において使用され得る。適切な異種ampG遺伝子の例には、大腸菌、サルモネラ（Salmonella）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、シュードモナス（Pseudomonas）、モラクセラ（Moraxella）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）、レジオネラ（Legionella）に由来するampG遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

PTXは、百日咳菌感染の全身効果を担う主要な病原性因子であり、S1と呼ばれる酵素活性モエティと、標的細胞受容体との結合を担うモエティとから構成される。それは、主要な防御抗原のうちの一つでもある。天然ptx遺伝子は、非酵素活性毒素をコードする変異バージョンに置換され得る。これは、それぞれ、基質結合および触媒作用に関与する2個の重要残基であるS1のArg-9をLysに、Glu-129をGlyに置換することによって、達成され得る。まずptxオペロンを欠失させ、次いで、変異バージョンを挿入するため、対立遺伝子交換を使用することができる。

百日咳菌培養上清における関連毒素の存在は、イムノブロット分析によって検出され得る。

米国特許第6,713,072号に記載されたもののようなその他の変異、および毒素活性を検出不可能なレベルにまで低下させることができる公知のまたはその他の変異も、作成され得る。

dnt遺伝子を除去するためにも、対立遺伝子交換を使用することができる。百日咳菌の病原性におけるDNTの役割は確実ではないが、それは、密接に関連している種B.ブロンキセプチカにおいて重要な毒素として同定されており、微量の注射で致死活性を示す。

TCTは、感染宿主の気管において線毛細胞の破壊の原因となり、従って、咳症候群に関与し得る。TCTは、グラム陰性菌の細胞壁のペプチドグリカンの分解産物であり、一般に、AmpGトランスポータータンパク質によって、サイトゾルへ取り込まれ、細胞壁生合成において再利用される。百日咳菌AmpGは、ペプチドグリカン分解産物の取り込みにおいて非効率的である。

好ましい態様において、弱毒生百日咳菌ワクチンは、番号CNCM I-3585の下で、2006年3月9日に、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,F-75724 Paris Cedex 15,FRANCE）に寄託されたBPZE1株である。

一つの局面において、組換えボルデテラ株は、変異型ptx遺伝子、欠失または変異させられたdnt遺伝子、および異種ampG遺伝子を含有している。異種ampG遺伝子産物は、産生される気管細胞毒の量を強く低下させることができる。変異させられる出発株は、百日咳菌、ボルデテラ・パラパータシス、およびボルデテラ・ブロンキセプチカを含む任意のボルデテラ株であり得る。一つの局面において、変異型ボルデテラ株を入手するために使用される出発株は、百日咳菌である。もう一つの局面において、株は三重変異ボルデテラ株である。もう一つの局面において、ボルデテラ株は、アクセッション番号CNCM 1-3585によって同定される。もう一つの局面において、ボルデテラ株は、アクセッション番号V09/009169によって同定される。

本発明は、上記の変異体のみに限定されない。アデニル酸シクラーゼ（AC）欠損変異体、リポ多糖（LPS）欠損変異体、繊維状赤血球凝集素（FHA）、およびbvgによって制御される成分のいずれかのようなその他の付加的な変異が企図され得る。

有利には、ボルデテラ株は、不活性毒素を産生するかまたは毒素を全く産生しないよう、毒素をコードする遺伝子の少なくとも部分的な排除もしくは欠失、または変異によって、毒素の産生が欠損している。そのような遺伝子は、具体的には、百日咳毒素またはそのような毒素との構造上もしくは機能上の類似性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり得る。それは、ボルデテラ株によって発現される溶血素／アデニル酸シクラーゼ毒素もしくは皮膚壊死毒素、または構造上もしくは機能上の類似性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ボルデテラ株は、これらの毒素のうちの1種以上の産生が欠損していてよい。

ハイブリッドタンパク質は、タンパク質FHAの一部と、関心対象のタンパク質の少なくとも一部とを含む。この特定のタンパク質は、National Collection of Microorganism Cultures of Institut Pasteur（28,Rue du Docteur Roux,F-75724,Paris,Cedex 15,France）に1996年10月8日に番号I-1770の下で寄託された株BPNXのような百日咳菌種の株、またはアクセッション番号CNCM 1-3585によって同定される百日咳菌株、またはアクセッション番号V09/009169によって同定される百日咳菌株によって発現され得る。

ハイブリッドタンパク質は、具体的には、2006年3月9日にブダペスト条約の下でCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM）（Paris,France）に寄託され番号CNCM 1-3585を割り当てられた変異型BPZE1株によって発現され得る。

本発明による株は、ハイブリッドタンパク質を発現する病原性株のゲノムからの毒素の遺伝子の排除によって、または部分的な欠失によって、または不活性毒素を産生するような変異によって入手され得る。排除は、当業者に公知の方法によって、具体的には、病原性株を動員株（mobilizing strain）と交配し、次いで、株によって適応するマーカーを通して、毒素遺伝子を失った細胞を選択することによって実施され得る。病原性株の毒素を発現する能力のそのような損失は、病原性株と動員株のプラスミドとの間の相同組換えの二重イベントに起因する。当業者は、弱毒株の入手のため、Antoine and Locht(1990)によって記載された方法を参照することができる。

そのようにして選択された毒素産生欠損株の特徴は、様々な技術、具体的には、ウエスタンブロッティングによってチェックされ得る。

ハイブリッドタンパク質を発現する非病原性株は、当業者に公知の技術によって入手され得、具体的には、その内容が参照によって本発明に含まれる上述のフランス特許出願FR-94 04 661に記載されるように入手され得る。一方では異種ペプチドをコードする配列、他方ではFHAの一部をコードする配列を含む組換えDNAは、当業者に公知の方法を通して、具体的には、フランス特許出願FR-94 04 661の実施例Vに記載されるように入手される。この例は、マンソン住血吸虫の28kDaのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（Sm28GST）の領域190～211の、短縮型FHAタンパク質との融合をもたらす。ハイブリッドタンパク質をコードする組換えDNAが選択され、その配列が当業者に公知の方法によってチェックされ、次いで、ボルデテラ細胞へ移入される。

当業者は、本発明の実施のため、これらの技術に関する一般的なマニュアル、具体的には、以下のマニュアルを参照することができる：Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning:Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor N.Y.,USAまたはその最新改訂版のうちの一つ。

その配列がハイブリッドタンパク質に含まれる異種タンパク質は、任意の抗原性タンパク質配列、具体的には、ボルデテラ、連鎖球菌（Streptococcus）、赤痢菌（Shigella）、ナイセリア（Neisseria）、ヘモフィルス（Haemophilus）、モラクセラ、ビブリオ（Vibrio）、エシェリキア（Escherichia）、ボレリア（Borrellia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）の抗原、ジフテリア、破傷風、もしくはコレラの毒素もしくはトキソイド、インフルエンザ、RSV、B型肝炎、C型肝炎、ポリオウイルス、ライノウイルス、もしくはHIVを含むウイルス抗原、またはマラリア原虫（Plasmodium）、住血吸虫（Schistosoma）、もしくはトキソプラズマ（Toxoplama）のもののような寄生虫抗原であり得る。それには、粘膜感染時または全身感染時に病原体によって発現され得るタンパク質のエピトープも含まれ得る。

有利には、異種タンパク質は、A型インフルエンザウイルスのM2基質タンパク質の全部または一部である。

本発明の好ましい態様において、異種タンパク質は、M2タンパク質の細胞外ドメインである。

もう一つの態様において、異種タンパク質は、RSVのGタンパク質の全部または一部、即ち、B細胞エピトープおよびT細胞エピトープの両方を含有しているアミノ酸残基170～197に及ぶ部分である（Yusibov et al.,2005；Varga et al.,2000）。

さらにもう一つの態様において、異種タンパク質は、肺炎球菌の広範に交差反応性のワクチン抗原、PcsBタンパク質の全部または一部である（Giefing et al.,2008）。

本発明の変異型ボルデテラ株の構築は、株のボルデテラampG遺伝子を異種ampG遺伝子に置換することから開始することができる。当技術分野において公知の任意の異種ampG遺伝子が、本発明において使用され得る。これらの例には、各世代に極めて少量のペプチドグリカン断片を培地へ放出する全てのグラム陰性菌が含まれ得る。グラム陰性菌の例には、大腸菌、サルモネラ、腸内細菌科、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ステノトロホモナス、レジオネラ等が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、ボルデテラampG遺伝子を異種ampG遺伝子に置換することによって、得られた株において産生される気管細胞毒（TCT）の量は、1％未満の残存TCT活性を発現する。もう一つの局面において、得られた株によって発現されるTCT毒素の量は、約0.6％～1％の残存TCT活性または約0.4％～3％の残存TCT活性または約0.3％～5％の残存TCT活性である。

PTXは、百日咳菌感染の全身効果を担う主要な病原性因子であると共に、主要な防御抗原のうちの一つである。その特性のため、酵素活性モエティS1が非酵素活性サブユニットに置換されるよう、天然ptx遺伝子を変異バージョンに置換することができるが、百日咳毒素の免疫原性の特性は影響を受けない。これは、配列の9位のアルギニン（Arg）をリジン（Lys）に置換（R9K）することによって達成され得る。さらに、129位のグルタミン酸（Glu）をグリシン（Gly）に置換（E129G）することができる。これらのアミノ酸位置は、それぞれ、基質結合および触媒作用に関与している。他の局面において、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第6,713,072号に記載されたもの、および毒素活性を低下させることができる公知のまたはその他の変異のような、その他の変異も作成することができる。一つの局面において、まずptxオペロンを欠失させ、次いで、変異バージョンを挿入するため、対立遺伝子交換を使用することができる。

本発明のもう一つの局面において、対立遺伝子交換を使用して、ボルデテラ株からdnt遺伝子を除去することができる。完全除去の他に、点変異によっても酵素活性を阻害することができる。DNTは、N末端領域の受容体結合ドメインおよびC末端部分の触媒ドメインによって構成されているため、Cys-1305をAla-1305に置換するdnt遺伝子における点変異は、DNTの酵素活性を阻害する（Kashimoto et al.,1999）。

ハイブリッドタンパク質をコードするトランスジーンは、当技術分野において周知の手法を使用することによって、遺伝配列またはプラスミドの挿入によって、上記定義の変異型株へ挿入され得る。

有利には、異種タンパク質またはそのエピトープ断片をコードする遺伝子は、FHAのN末端部分のコード配列へ単一または複数のコピーとして融合される。

トランスジーンは、有利には、dnt遺伝子の欠失のため、Mielcarek et al.(2006)によって記載されたようなdnt遺伝子の上流領域および下流領域を含有しているプラスミドを使用して、対立遺伝子交換によって、百日咳菌のdnt遺伝子座へ挿入される。

本発明の組換えボルデテラ株は、粘膜感染の処置または防止のための免疫原性組成物において使用され得る。そのような免疫原性組成物は、哺乳動物において免疫応答、抗体応答およびまたはT細胞応答のいずれかを起こすのに有用である。例えば、T細胞応答または抗体応答は、インフルエンザ、RSV、肺炎球菌、もしくはその他の感染に対して、またはそれらの結果／疾患／症状に対して哺乳動物を防御するようなものであり得る。

本発明の変異型ボルデテラ株は、ワクチンまたは免疫原性組成物において使用され得る。一つの局面において、株は経鼻投与のために使用される。

本発明の組成物は、アジュバントを含む他の免疫制御剤と共へ投与されてもよいが、アジュバントの添加は好ましくない。

さらにもう一つの局面において、本発明は、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素（FHA）のN末端断片と、FHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている組換え百日咳菌株を投与する工程を含む、哺乳動物において粘膜向性を有する病原体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。

一つの局面において、組換え株は、変異型百日咳毒素（ptx）遺伝子、欠失または変異させられた皮膚壊死（dnt）遺伝子、および異種ampG遺伝子を含む。いくつかのそのような局面において、野生型ボルデテラ株ampG遺伝子は、大腸菌ampG遺伝子のような、他のグラム陰性菌のampG遺伝子に置換される。

他の局面において、ptx遺伝子の変異は、基質結合に関与するアミノ酸および／または触媒作用に関与するアミノ酸の置換を含む。いくつかのそのような局面において、基質結合に関与するアミノ酸の置換はR9Kを含み、触媒作用に関与するアミノ酸の置換はE129Gを含む。いくつかの局面において、ボルデテラ株は三重変異株を含む。いくつかのそのような局面において、ボルデテラ株は、アクセッション番号CNCM 1-3585によって同定されるBPZE1株である。

他の局面において、方法は、哺乳動物における粘膜感染の防止または処置をさらに含む。いくつかの局面において、ボルデテラ株は粘膜感染の前に投与される。いくつかのそのような局面において、ボルデテラ株は、粘膜感染の約6週間以上前に投与される。他のそのような局面において、ボルデテラ株は、粘膜感染の約12週間以上前に投与される。いくつかの局面において、粘膜感染の原因となる病原体は、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、または肺炎球菌である。

他のいくつかの局面において、株は、粘膜感染または全身感染に対する防御免疫を必要とする哺乳動物へ投与される。いくつかの局面において、哺乳動物はヒトである。

粘膜感染または全身感染に関連する疾患の処置または防止のための方法は、治療的に有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。本発明の組成物は、薬学的組成物へ製剤化され得る。これらの組成物は、株のうちの1種以上に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知のその他の材料を含むことができる。そのような材料は、典型的には、無毒であるべきであり、典型的には、活性成分の効力に干渉するべきでない。

組成物は、典型的には、粘膜免疫を誘発するために使用され得る。他の局面において、各投薬量における細菌の数は、哺乳動物において有効な免疫応答を達成するために調整される。各投薬量における細菌の数またはcfuは、約1、10、100、1000、10000、100000、1000000、5^*10⁶、10⁷、10⁸、もしくはそれ以上、またはそれらの各投薬量の間の任意の投薬量であり得る。

本発明のワクチンの製剤化は、当技術分野において認識されている方法を使用して達成され得る。対象へ投与される本発明のワクチンの量および投与の計画は、アジュバント（存在する場合）、特定の対象の年齢、性別、体重、種、および状態、ならびに投与経路のような因子を考慮に入れて、薬学および獣医学の分野における当業者に周知の標準的な技術に従って決定され得る。ワクチンの投与は、通常、単回投与である。あるいは、本発明のワクチンを初回投与（初回予防接種）した後、そのワクチンによる少なくとも1回のリコール（後続投与）を行う。

典型的には、経鼻投与または吸入によってワクチンを投与することができる。この型の投与は、コストが低く、本発明の弱毒生百日咳菌ワクチンによる気道におけるコロニー形成を可能にする。経鼻投与は、液体溶液、懸濁物、エマルションの形態の弱毒生百日咳菌ワクチンによって達成され得る。溶液および懸濁物は、点滴薬として投与される。溶液は、鼻スプレーボトルまたは鼻吸入器から、微細なミストとして投与されてもよい。ゲルは、1回の適用のために必要な投薬量を含有している小さなシリンジへ分配される。吸入は、溶液、懸濁物、および粉末の形態の弱毒生百日咳菌ワクチンによって達成され得；これらの製剤は、エアロゾル、液滴、または乾燥粉末吸入器を介して投与される。粉末は、注入器（insufflators）またはパッファー（puffers）によって投与され得る。

鼻腔内経路は、既に大量生産されている比較的単純な装置によって容易なアクセスを提供するため、利用可能な様々な粘膜送達オプションのうち、最も実用的なものである。従って、本発明の組成物は、好ましくは、鼻スプレー、点鼻薬、ゲル、または粉末のような鼻腔内投与のために適応しかつ／またはパッケージングされる。

送達の経路に関わらず、本発明の組成物は、好ましくは、単位用量形態でパッケージングされる。有効な用量はルーチンに確立され得る。注射または鼻腔内使用のための組成物の典型的なヒト用量は、0.1～1.0mlの体積を有し、例えば、各鼻孔に1回、2×500μlがスプレーされる。

本発明の組成物は、好ましくは、例えば、pH6～pH8、一般には、およそpH7に緩衝される。

以下の図面および実施例によって本発明をさらに例示する。しかしながら、これらの実施例および図面は、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。

材料および方法
細菌株および培養条件。この研究のために使用された百日咳菌株は、表1にリストされる。1％グリセロール、20％脱線維素ヒツジ血液、および100μg/mlストレプトマイシン（Sigma Chemical Co.,St Louis,Mo.）が補足されたボルデー・ジャング（Bordet-Gengou）寒天（Difco,Detroit,Mich.）上で、37℃で72時間、それらを培養した。1g/リットルのヘプタキス(2,6-ジ-o-メチル)βシクロデキストリン（Sigma）を含有しているステイナー・ショルテ（Stainer-Scholte）培地（Stainer and Scholte,1970）において、以前に記載されたように（Menozzi et al.,1991）、百日咳菌の液体培養物をインキュベートした。

プラスミドおよび組換えBPZE1株の構築。ここに記載された異なるBPZE1誘導体は、全て、BPZE1におけるdnt遺伝子の欠失のための、（Mielcarek et al.2006）によって記載されたような、dnt遺伝子の上流領域および下流領域を含有しているpJQmp200rpsL12（Quandt & Hynes,1993）に由来するプラスミドを使用して、対立遺伝子交換によって挿入されたトランスジーンを、BPZE1のdnt遺伝子座に含有していた。

pXR1の構築
まず、pJQdntUPLOと命名されたこのプラスミド（Mielcarek et al.,2006）の骨格のXbaI部位を、製造業者の説明書に従って、プライマー

およびQuickChangeII（登録商標）XL（Stratagen）を使用することによって、TCTAGA（SEQ ID NO:1）からTCCAGA（SEQ ID NO:2）へ変化させた。pXR1と命名された得られたプラスミドのdnt上流領域およびdnt下流領域を配列決定した。（百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,839位に相当する）dnt下流領域内の1個の変異G→Aが認められた。

pXR1-Fha44の構築
fhaB遺伝子の5'部分をコードする合成遺伝子を、Eurogentec（Liege,Belgium）から購入した。fha44cと命名されたこの遺伝子は、4個のサイレント変化（G354C、C864G、G2,331C、およびA2,556G）、配列

を有する27bpマルチクローニング部位、ならびに2個のTGA終止コドンを除き、FHAの前駆体であるFhaBのアミノ酸1～861をコードする2,583bp（ヌクレオチド253～2,835位、GenBank M60351.1）を含有している。この配列は、pUC57-Fha44_cと命名されたプラスミドに提供されていた。このプラスミドを、XhoIおよびXbaIによって消化し、fha44cに相当する断片を、XhoI/XbaIによって消化されたpXR1へ挿入した。従って、得られたプラスミドpXR1-Fha44は、dnt遺伝子のATG開始コドンの上流の813bp領域（百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,646,310～3,647,122位）、27bpマルチクローニング部位に融合した担体タンパク質Fha44をコードする領域を含有し、その後に、2個のTGA終止コドン、dnt遺伝子のTGA終止コドンの下流の83pb領域（百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,479～3,651,564位）、XbaI制限部位、およびpXR1の712pb dnt下流領域（pXR1に存在した百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,839位に相当するG→A変異を除き、百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,565～3,652,276位の配列と同一）を含有していた。予想外の変異の欠如を確認するため、プラスミドを配列決定した。

Fha44-M2eを発現するBPZE1誘導体の構築
M2eペプチドの3コピーをコードする配列を、M2eの3タンデムコピーのコード情報を含有しているpGA4-3M2e（Geneart AG）から、PCRによって増幅した。pGA4-3M2eにおける各M2eコピーは、

によって分離されており、M2eにおける17位および19位のシステインコドンはセリンに置換されていた。オリゴヌクレオチド

をプライマーとして使用した。次いで、増幅されたDNA断片を、pCRII-TOPO（Invitrogen）へ挿入し、DNA配列決定によって立証した。MluI/NdeI消化の後に入手された273bp断片を、pXR1-Fha44のMluI/NdeI部位へクローニングして、pHKG3を得た。このプラスミドを、望まれない改変の欠如を立証するために配列決定し、形質転換によって大腸菌SM10（Simon et al.,1983）へ導入し、得られた組換え大腸菌SM10菌を、BPZE1とコンジュゲートした。記載されたように（Stibitz,1994）、2つの連続の相同組換えイベントを選択した。次いで、ハイブリッド遺伝子がdnt遺伝子座へ正確に挿入されたクローンを同定するため、組換え株をPCRによって分析した。組換えBPZE1株をBPZM2eと命名した。

FHA欠損組換え株であるBPZEM2e-ΔFhaを構築するため、FHAをコードする遺伝子を、以前に記載されたように（Antoine et al.,2000）、組込みベクターpFUS2を使用して、BPZM2eにおいて不活化した。

Fha44-G_RSVを発現するBPZE1誘導体の構築
RSV株A2（GenBank AAC55969.1）の糖タンパク質のアミノ酸170～197をコードするオリゴヌクレオチドを、百日咳菌コドン使用頻度に従って合成した。それは、以下の配列を有していた：

。

それは、100nMのオーバーラップするオリゴヌクレオチド

を鋳型として使用し、400nMオリゴヌクレオチド

をプライマーとして使用して、PCRによって作製された。

次いで、得られた96bp断片を、pCRII-TOPO（Invitrogen）へ挿入して、pCRII-TOPO-G_RSVBamHIを得、予想外の変異の欠如を確認するために配列決定した。次いで、pCRII-TOPO-G_RSVBamHIを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド

をプライマーとして使用して、PCRによって、RSV G配列を増幅した。次いで、得られた96bp断片を、pCRII-TOPOへ挿入して、pCRII-TOPO-G_RSVMluIを得、予想外の変異の欠如を確認するために配列決定した。pCRII-TOPO-G_RSVMluIをMluIによって消化し、MluIによって消化されたpXR1-Fha44へRSV G配列を挿入して、pXR1-Fha44/G_RSVを得た。このプラスミドを、インサートの適切な方向および望まれない改変の欠如を立証するために配列決定し、次いで、形質転換によって大腸菌SM10（Simon et al.,1983）へ導入し、得られた組換え大腸菌SM10菌をBPZE1とコンジュゲートした。記載されたように（Stibitz,1994）、2つの連続の相同組換えイベントを選択した。次いで、ハイブリッド遺伝子がdnt遺伝子座へ正確に挿入されたクローンを同定するため、組換え株をPCRによって分析した。組換えBPZE1株をBPZG_RSVと命名した。

FHA欠損組換え株であるBPZG_RSV-ΔFhaを構築するため、FHAをコードする遺伝子を、以前に記載されたような（Antoine et al.,2000）組込みベクターpFUS2を使用して、BPZG_RSVにおいて不活化した。

Fha44-PcsBを発現するBPZE1誘導体の構築
PcsBの成熟型（アミノ酸残基28～残基278）のコード配列を、肺炎球菌血清型1（臨床分離株E1586）からの染色体DNAを鋳型として使用し、合成オリゴヌクレオチド

をプライマーとして使用して、PCRによって増幅した。肺炎球菌を煮沸し、10μMのオリゴヌクレオチドをPCR混合物へ添加した。得られた750bp断片を、pCRII-TOPOへ挿入して、pCRII-TOPO-PcsBを得、次いで、配列決定した。pCRII-TOPO-PcsBをMluIおよびNdeIによって消化し、PscB配列に相当する断片を、MluI/ NdeIによって消化されたpXR1-Fha44へ挿入して、pXR1-Fha44-PcsBを得た。配列決定の後、このプラスミドを、形質転換によって、大腸菌SM10（Simon et al.,1983）へ導入し、得られた組換え大腸菌SM10菌を、BPZE1とコンジュゲートした。記載されたように（Stibitz,1994）、2つの連続の相同組換えイベントを選択した。次いで、ハイブリッド遺伝子がdnt遺伝子座へ正確に挿入されたクローンを同定するため、組換え株をPCRによって分析した。組換えBPZE1株をBPZPcsBと命名した。

FHA欠損組換え株であるBPZPcsB-ΔFhaを構築するため、FHAをコードする遺伝子を、以前に記載されたような（Antoine et al.,2000）組込みベクターpFUS2を使用して、BPZM2eにおいて不活化した。

組換えキメラタンパク質のタンパク質分析および免疫検出。Fha44-3M2eキメラタンパク質、Fha44-G_RSVキメラタンパク質、およびFha44-PcsBキメラタンパク質の検出のため、100μg/mlストレプトマイシンが補足された10mlのステイナー・ショルテ培地において、48時間、組換え株を培養した。次いで、細胞を4,000×gで15分間遠心分離した。400μlの上清を収集し、細胞を400μlのPBSに再懸濁させた。200μlの3×Laemmli（1970）ローディング緩衝液を上清および細胞懸濁物に添加した。次いで、混合物を95℃に10分間加熱した。細菌懸濁物を27ゲージ針へ10回通すことによって、染色体DNAを剪断した。その後、95℃に15分間加熱した。10μlの各試料を、イムノブロット分析またはクーマシーブルー染色のため、10％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法ゲル（SDS-PAGE）にロードした。非組換えBPZE1上清および／または全細胞溶解物を、陰性対照として使用した。

電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜上に電気的に転写し、0.1％トゥイーン20および1％ウシ血清アルブミンを含有しているPBSにおいてマウス抗M2e抗体（Neirynck et al.,1999）または抗G_RSV抗体（Mekseepralard et al.,2006）と共にインキュベートした。1:4,000に希釈されたアルカリホスファターゼ-ヤギ抗マウスモノクローナル抗体コンジュゲート（Promega）を、アルカリホスファターゼ基質（ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート試薬；Promega）の添加によるタンパク質の発色検出のために使用した。反応バンドのサイズを、All Blue protein Marker（Biorad）の泳動距離から決定した。

マウスにおけるコロニー形成および免疫原性。BALB/cマウスをCharles River（l'Abresle,France）から入手し、Institut Pasteur de Lilleの動物施設において特定病原体除去条件下で維持した。肺におけるコロニー形成のため、以前に記載されたように（Mielcarek et al.,2006）、6週齢BALB/cマウスを、麻酔カクテル（ケタミン＋アトロピン＋バリウム）の腹腔内（i.p.）注射によって軽く鎮静させ、10⁶または10⁷コロニー形成単位（CFU）のBPZE1または組換え株を含有している20μlのPBSによって鼻腔内（i.n.）免疫感作した。記載されたように（Mielcarek et al.,2006）、i.n.投与後の示された時点でマウスを屠殺し、肺を採集し、PBSで均質化し、段階希釈してBG-血液寒天へ播種し、3～4日間の37℃でのインキュベーションの後にCFUを計数した。

免疫感作研究のため、6週齢BALB/cマウスの群を、10⁷CFUのBPZE1または組換え株を含有している20μlのPBSによってi.n.免疫感作し、次いで、4週間隔で同量の細菌によって追加刺激した。

抗体検出。96穴プレートを、2μg/mlの合成M2eペプチド

、2μg/mlの合成G_RSVペプチド

、または2μg/mlの組換えPcsBによってコーティングし、4℃で一晩インキュベートし、0.05％トゥイーン20を含有しているPBS（PBST）によって洗浄した。その後、プレートを、100μl/ウェルのブロッキング緩衝液（PBST中の2％BSA）によって37℃で1時間ブロッキングした。3回洗浄した後、100μlの段階希釈血清をウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。さらに3回洗浄した後、プレートを、PBSTで1:4000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識抗マウスIgG（Southern Biotech）100μlと共に37℃で1時間インキュベートした。5回洗浄した後、プレートを100μlのHRP基質TMB溶液（Interchim）と共に室温で30分間インキュベートした。50μlの1M H₃PO₄の添加によって反応を中止した。450nmにおける光学濃度（OD）を、Biokinetic reader EL/340 microplateによって測定した。最終力価を、陰性対照血清の2倍を上回る光学濃度読み取り値を有していた最高血清希釈として決定した。

組換えPcsBの作製。PcsB断片を、鋳型としての肺炎球菌血清型1（臨床分離株E1586）からの染色体DNAおよび合成オリゴヌクレオチド

を使用して、PCRによって増幅した。アンプリコンをpCRII-TOPO（Invitrogen,Cergy-Pontoise,France）へ挿入し、配列決定して、pCRII-TOPOPcsBexpを得た。このベクターのNotI/NcoI断片をpET24D+へ挿入して、pET24DPcsBを得た。このプラスミドを、PcsBの作製および精製のため、大腸菌BL21へ導入した。組換え細菌を、カナマイシン（25μg/ml）が補足された液体LBブロスにおいて37℃で培養した。OD600が0.8に達した時、1mMイソプロピル-d-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって、37℃で4時間、発現を誘導した。次いで、誘導された細胞を、4℃での20分間の8,000rpmでの遠心分離によって採集し、1錠/25mlのプロテアーゼ阻害剤［complete（商標）EDTAフリー（Roche Molecular Biochemicals,Meylan,France）］が補足された溶解緩衝液A（PBS、pH7.0；350mM NaCl；10％グリセロール）に懸濁させた。

フレンチプレスに2回通すことによって細胞を破壊した。遠心分離（20分間15,000rpm）によって膜画分を採集した後、細胞溶解物の上清を、0.5ml/分の流速で、ニッケル-NTAアガロース（Qiagen）（Chelating Sepharose,Fast flow,with Ni2+ metal coupled,Amersham-Pharmacia）に通した。ODが基線に達するまで、未結合材料を緩衝液Aによって洗浄した。結合したヒスチジンタグ付きタンパク質の溶出を、50mM、100mM、または200mMイミダゾールを含有している15mlの緩衝液Aによる段階勾配を使用して実施した。溶出液を2ml画分として収集した。次いで、入手された試料を、12％ポリアクリルアミドゲルを使用したSDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって分析し、PcsBタンパク質を含有している画分をプールし、4℃でPBSに対して一晩透析した。製造業者の指示を使用して、BCA試験（Pierce）を使用して、タンパク質濃度を推定した。

結果
1. Fh44-3M2eを産生する組換えBPZE1株（BPZM2e）
Fha44-3M2eを産生する組換えBPZE1株（BPZM2e）の構築
A型インフルエンザウイルスの基質タンパク質M2の細胞外ドメイン（M2e）は、インフルエンザに対するユニバーサル防御抗原として提唱されている（Neirynck et al.,1999；de Filette et al.,2006）。BPZE1においてM2eを発現させるため、本発明者らは担体としてFha44を使用した。Fha44は、FHAの80kDaのN末端断片であり、全長FHAより良好に百日咳菌によって分泌される（Renauld-Mongenie et al.,1996）。

M2eコード配列の3コピーをFha44コード配列に融合させた。対立遺伝子交換によって、構築物をBPZE1染色体のdnt遺伝子座へ挿入し、BPZM2eと命名された組換え株においてトランスジーンをdntプロモーターの調節下に置いた。

BPZE1およびBPZM2eの未濃縮培養上清および全細胞抽出物を、抗M2eモノクローナル抗体を使用したイムノブロット分析によって調査した。Fha44-3M2eキメラタンパク質の予想されるサイズに相当する94kDaバンドが、組換え株の培養上清中に検出された。抗M2e抗体とも反応性の類似したサイズのタンパク質が、全細胞抽出物中にも検出された。この観察は、キメラタンパク質が、組換え株から分泌され、BPZM2eの細菌細胞にも関連していたことを示す。

BPZM2eの肺におけるコロニー形成および免疫原性
まず、ステイナー・ショルテ培地におけるインビトロのBPZM2eの増殖動力学を、親株BPZE1のものと比較した。2つの株の間に統計的な差は存在せず、そのことから、一般的な細菌の適応度がFha44-3M2eの発現によって損なわれないことが示された。

組換え株BPZM2eのマウス気道においてコロニー形成する能力を研究するため、BALB/cマウスを、10⁶CFUのBPZM2eまたは非組換えBPZE1によってi.n.感染させ、コロニー形成プロファイルを比較した。組換え株BPZM2eのコロニー形成プロファイルは、対応する親株BPZE1のものと区別不可能であり、そのことから、Fha44-3M2eの挿入が、マウスの肺においてコロニー形成する細菌の能力を改変しないことが示された。

M2eペプチドに対する抗体応答を、BPZM2eの投与後の異なる時点で、ELISAによって調査した。しかしながら、M2e特異抗体は、いかなる時点でも検出されなかった。次いで、BPZM2e用量を10倍に増加させ、BALB/cマウスを、10⁷CFUのBPZE1または組換えBPZM2eによって、4週間隔で2回、i.n.免疫感作した。最初の免疫感作の2週間後および4週間後、ならびに最後の免疫感作の2週間後に、全身抗M2e IgGを評価するため、血清を収集した。再び、M2eに対する有意な抗体応答は、血清中に検出されなかった。

FHAの変異および新しい組換え株（BPZM2e-ΔFHA）の特徴決定
次いで、fhaBの内部断片を含有しているpFus2誘導体（Antoine et al.,2000）を導入することによって、BPZM2eから、FHAをコードする染色体遺伝子（fhaB）を不活化した。pFus2は百日咳菌において複製し得ないため、相同組換えによってプラスミドをfhaB遺伝子へ組み込み、それによって、この遺伝子を妨害する。100μg/mlストレプトマイシンおよび10μg/mlゲンタマイシンを含有しているBG血液寒天上で、組込み体を選択した。得られた株をBPZM2e-ΔFHAと命名した。

BPZM2e-ΔFHAにおけるFHAの欠如を、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって立証し、培養上清中のFha44-3M2eの存在を、イムノブロット分析によって決定した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色は、変異株の培養上清においても、対照として使用された公知のFHA欠損株であるBPGR4の培養上清においても、FHAに相当する220kDaタンパク質の欠如を示した。未濃縮培養上清のイムノブロット分析は、FHA欠損変異体が少なくともBPZM2e親株と同量のFha44-3M2eを産生することを示した。予想通り、BPZE1の培養上清中には、免疫反応バンドは検出されなかった。

BPZM2e-ΔFHAによるマウスの肺におけるコロニー形成
FHAの欠失後の新しい組換え株のコロニー形成プロファイルを調査するため、BALB/cマウスを、10⁷CFUのBPZM2e-ΔFHAによってi.n.感染させ、肺内の細菌量を28日間追跡した。BPZE1およびBPZM2e-ΔFHAの両方が、肺においてコロニー形成し、類似したレベルでマウスの肺に存続したが、接種後3日目には、BPZE1より有意に少ないBPZM2e-ΔFHAがマウスの肺に検出された。

BPZM2e-ΔFHAの免疫原性
BPZM2e-ΔFHAの免疫原性を、4週間隔での2回のi.n.投与の後に評価した。最後の免疫感作の2週間後に血清を収集し、全身抗M2e抗体応答を分析した。予想通り、BPZM2e-ΔFHAは、M2eに対して高レベルの全身IgGを誘導することが見出されたが、FHAを産生するBPZM2eまたはBPZE1の2回の投与は、有意な抗M2e IgG応答をもたらさなかった（図1）。これらの観察は、FHAの欠如が、組換えBPZE1によるi.n.免疫感作後のM2eに対する免疫応答を強く増加させることを示す。

2. Fha44-G_RSVを産生する組換えBPZE1株（BPZG_RSV）
Fha44-G_RSVを産生する組換えBPZE1株（BPZG_RSV）の構築
アミノ酸残基170～197に及ぶRSVのGタンパク質のペプチド断片は、中和B細胞エピトープ（Power et al.,2001；Yusibov et al.,2005）およびT細胞エピトープ（Varga et al.,2000）を含有していることが示されている。タンパク質のこの領域は、異なるRSV分離物の間でもよく保存されている。上記のインフルエンザウイルスのM2eエピトープと同様に、本発明者らは、BPZE1においてGエピトープを発現させるための担体としてFha44を使用した。

Gエピトープコード配列の単一コピーを、Fha44コード配列と融合させた。対立遺伝子交換によって構築物をBPZE1染色体のdnt遺伝子座へ挿入し、BPZG_RSVと命名された組換え株においてトランスジーンをdntプロモーターの調節下に置いた。

BPZG_RSVの未濃縮培養上清を、抗Gモノクローナル抗体を使用したイムノブロット分析によって調査した。Fha44-G_RSVキメラタンパク質の予想されるサイズに相当するおよそ90kDaのバンドが、組換え株の培養上清中に検出され、そのことから、キメラタンパク質が組換え株から分泌されたことが示された。

BPZG_RSVの肺におけるコロニー形成および免疫原性
組換え株BPZG_RSVのマウス気道においてコロニー形成する能力を研究するため、BALB/cマウスを、10⁶CFUのBPZG_RSVまたは非組換えBPZE1によってi.n.感染させ、コロニー形成プロファイルを比較した。組換え株BPZG_RSVのコロニー形成プロファイルは、対応する親株BPZE1のものと区別不可能であり、そのことから、Fha44-G_RSVの挿入が、マウスの肺においてコロニー形成する能力を改変しないことが示された。

BPZG_RSVの投与後に、Gペプチドに対する抗体応答をELISAによって調査した。しかしながら、G特異抗体は検出されなかった。次いで、BPZG_RSV用量を10倍に増加させ、10⁷CFUのBPZE1または組換えBPZG_RSVによって、4週間隔で2回、BALB/cマウスをi.n.免疫感作した。全身抗G IgG応答を評価するため、最後の免疫感作の2週間後に血清を収集した。再び、Gペプチドに対する有意な抗体応答は、血清中に検出されなかった。

FHAの変異および新しい組換え株（BPZG_RSV-ΔFHA）の特徴決定
次いで、上記のようにpFus2誘導体を導入することによって、FHAをコードする染色体遺伝子（fhaB）をBPZG_RSVから不活化し、BPZG_RSV-ΔFHAにおけるFHAの欠如を、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって立証し、培養上清中のFha44-G_RSVの存在をイムノブロット分析によって決定した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色は、変異株の培養上清におけるFHAに相当する220kDaタンパク質の欠如を示した。未濃縮培養上清のイムノブロット分析は、FHA欠損変異株がBPZG_RSV親株と同量のFha44-G_RSVを産生することを示した。

BPZG_RSV-ΔFHAの免疫原性
BPZG_RSV-ΔFHAの免疫原性を、4週間隔での2回のi.n.投与の後に評価した。最後の免疫感作の2週間後に血清を収集し、全身抗G抗体応答をELISAによって分析した。BPZG_RSV-ΔFHAは、Gエピトープに対する高レベルの全身IgGを誘導することが見出されたが、BPZE1またはFHAを産生するBPZG_RSVの2回の投与は、有意な抗G IgG応答をもたらさなかった（図2）。これらの観察は、M2eと同様に、FHAの欠如が、組換えBPZE1によるi.n.免疫感作の後のGエピトープに対する免疫応答を強く増加させることを示す。

3. Fha44-PcsBを産生する組換えBPZE1株（BPZPcsB）
Fha44-PcsBを産生する組換えBPZE1株（BPZPcsB）の構築
PcsBは、様々な臨床分離物の間で高度に保存されており、致死的な敗血症に対する防御を誘導する肺炎球菌のタンパク質抗原である。それは、敗血症モデルおよび肺炎モデルの両方において、4種の異なる血清型に対して交差防御性であることが示されている（Giefing et al.,2008）。

PcsBの成熟部分（アミノ酸28～278）をコードする遺伝子を、単一コピーとして、Fha44コード配列と融合させた。対立遺伝子交換によって、構築物をBPZE1染色体のdnt遺伝子座へ挿入し、BPZPcsBと命名された組換え株において、トランスジーンをdntプロモーターの調節下に置いた。

BPZPcsBの未濃縮培養上清を、SD-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって調査した。Fha44-PcsBキメラタンパク質に相当する112kDaバンドが、組換え株の未濃縮培養上清中に容易に検出可能であり、そのことから、キメラタンパク質が組換え株から分泌されたことが示された。

BPZPcsBの免疫原性
BALB/Cマウスを、10⁷cfuのBPZPcsBによって、4週間隔で3回、経鼻免疫感作するか、または対照としてのBPZE1を与えた。各免疫感作の2週間後に血清を収集し、PcsBに対する抗体応答をELISAによって調査した。BPZPcsBの用量の増加は、PcsBに対する抗体力価の増加をもたらしたが、抗体力価は、特に、1回目および2回目の免疫感作の後、極めて低いままであった。

FHAの変異および新しい組換え株（BPZPcsB-ΔFHA）の特徴決定
次いで、上記のようなpFus2誘導体を導入することによって、FHAをコードする染色体遺伝子（fhaB）をBPZPcsBから不活化し、BPZPcsB-ΔFHAにFHAが存在せず、Fha44-PcsBが存在することを、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって立証した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色は、変異株の培養上清中に、FHAに相当する220kDaタンパク質が存在せず、Fha44-PcsBに相当するより低いMrのタンパク質が存在することを示した。

BPZPcsB-ΔFHAの免疫原性
BPZPcsB-ΔFHAの免疫原性を、4週間隔での2回のi.n.投与の後に評価した。最後の免疫感作の2週間後に血清を収集し、全身抗PcsB抗体応答を分析した。BPZPcsB-ΔFHAは、FHAを産生するBPZPcsBによって誘導されたものより有意に高い、高レベルのPcsBに対する全身IgGを誘導することが見出された（図3）。これらの観察は、M2eおよびG_RSVと同様に、FHAの欠如が、組換えBPZE1によるi.n.免疫感作後のPcsBに対する免疫応答を有意に増加させることを示している。

本願の全体にわたって、様々な参照によって、本発明が関係する技術分野の現状が記載されている。これらの参照の開示は、参照によって本開示に組み入れられる。

参照

（表１）細菌株

Claims

異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現するボルデテラ（Bordetella）株を作製するための方法であって、
ボルデテラ株において繊維状赤血球凝集素（FHA）をコードする遺伝子を不活性化する工程、
該ボルデテラ株において皮膚壊死毒素（DNT）をコードする遺伝子を欠失させる工程、および
FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子をDNTをコードする欠失された該遺伝子の遺伝子座に挿入する工程
を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および／または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。
異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現するボルデテラ株を作製するための方法であって、欠失された皮膚壊死毒素（dnt）遺伝子を含むボルデテラ株において、FHAをコードする遺伝子を不活性化させる工程、および、欠失された該dnt遺伝子の遺伝子座に、FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および／または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。
ボルデテラ株において異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現させるための方法であって、
ボルデテラ株においてFHAをコードする遺伝子を不活性化する工程、
該ボルデテラ株においてDNTをコードする遺伝子を欠失させる工程、および
FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子をDNTをコードする欠失された該遺伝子の遺伝子座に挿入する工程
を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および／または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。
ボルデテラ株において異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現させるための方法であって、欠失されたdnt遺伝子を含むボルデテラ株において、FHAをコードする遺伝子を不活性化させる工程、および、欠失された該dnt遺伝子の遺伝子座に、FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および／または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。
ボルデテラ株が、百日咳毒素（PTX）活性を欠損している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
ボルデテラ株が、免疫原性であるが、酵素的に不活性である変異型PTXをコードする遺伝子を含む、請求項５に記載の方法。
ボルデテラ株が、ネイティブampG遺伝子を置換する異種ampG遺伝子をコードする遺伝子を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
異種ampG遺伝子が大腸菌（E.coli）由来である、請求項７に記載の方法。