DE69534289T2

DE69534289T2 - Rekombinante Pockenviren mit fremden Polynukleotiden in wichtigen Regionen

Info

Publication number: DE69534289T2
Application number: DE69534289T
Authority: DE
Inventors: Falko-Günter Falkner; Georg Holzer; Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter Healthcare SA
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2015-04-29
Also published as: EP0758397A1; JP3911010B2; ES2243937T3; ATA75295A; AT405292B; US5770212A; AU694519B2; JPH09512707A; EP0758397B1; CA2188447C; DK0758397T3; WO1995030018A2; AU2523095A; US5766882A; WO1995030018A3; DE69534289D1; ATE298370T1; CA2188447A1

Description

Rekombinante Poxviren (Pockenviren) wurden als Vektoren für die Expression von Fremdgenen aus einer Vielzahl von Quellen verwendet, wie z.B. Tieren, Pflanzen, Protozoen, Pilzen, Bakterien und Viren. Zusätzlich können rekombinante Poxviren verwendet werden, um chimäre Gene und Gene von synthetischem Ursprung zu exprimieren. Typischerweise sind chimäre Gene und synthetische Gene DNA-Sequenzen, die von natürlich auftretenden Sequenzen abgeleitet sind oder darauf basieren. Zum Beispiel können cDNA-Sequenzen, erzeugt von RNA-Transkripten, einschließlich denjenigen von Retroviren, mit rekombinanten Poxvirusvektoren exprimiert werden.
Poxvirusvektoren in der vorliegenden Verwendung enthalten Fremd-DNA, inseriert in genomische Bereiche, die für die Lebensfähigkeit des Virus nicht essenziell sind. Diese Poxviren, die Fremdgene exprimieren, werden in der Regel durch Insertion der Fremdsequenzen durch homologe Rekombination in genomische Bereiche konstruiert, die für das Wachstum des Virus in Zellkultur nicht essenziell sind. Siehe Panicali und Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 4927–31 (1982); Mackett et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 7415–19 (1982). Vorzugsweise können rekombinante Poxviren durch direktes molekulares Klonieren konstruiert werden. Siehe EP 0 561 034 ; Scheiflinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89: 9977–81 (1992); Merchlinsky und Moss, Virol. 190: 522–26 (1992). Viren mit in nicht-essenzielle Bereiche inserierter Fremd-DNA können autonom in ihrem Wirtsorganismus wachsen und so gegenüber ihren jeweiligen Wirten infektiös verbleiben.
Die Abwesenheit der Produkte der nicht-essenziellen Bereiche beeinflusst die Lebensfähigkeit des rekombinanten Poxvirus nicht übermäßig. Im Fall von Vaccinia, der häufig als prototypischer Poxvirus betrachtet wird, ist einer der nicht-essenziellen Hauptbereiche für die Insertion das Thymidinkinase-Gen. Wenn ein Fremdgen in das Vaccinia-Thymidinkinasegen inseriert wird, geht das Produkt des Gens für das Virus verloren. Nichtsdestotrotz ist rekombinantes Vaccinia immer noch lebensfähig. Andere Poxviren sind auch gegenüber ähnlichen Manipulationen in anderen, nicht-essenziellen Bereichen zugänglich. Rekombinantes Avipoxvirus, wie z.B. Geflügelpoxvirus wurde z.B. entwickelt, worin Fremd-DNA in nicht-essenzielle Bereiche inseriert wurde.
Rekombinantes Vacciniavirus kann als Lebendvaccin verwendet werden, in Expressionssystemen von großem Umfang und für eine Vielzahl anderer Zwecke. Siehe Miner & Hruby, TIBTECH 8: 20–25 (1990). Die Verwendung dieser rekombinanten Viren für eine Expression von Proteinen im großen Umfang stellt jedoch signifikante Risiken dar, da die Viren eine infektiöse Fähigkeit beibehalten. Dementsprechend sind kostenaufwendige Vorsichtsmaßnahmen und umfangreiche Prozeduren nötig, wenn rekombinantes Vaccinia behandelt wird. Eine thermische Inaktivierung aller Medien, Flüssigkeiten und des kontaminierten Laboratoriums ist z.B. nötig, wie auch ein spezielles Training für das Personal, das mit dem Virus arbeitet. Etliche Ansätze wurden in die Betrachtung einbezogen, um den Bedarf an diesen aufwendigen Sicherheitsmaßnahmen zu minimieren. Zum Beispiel wurden hoch attenuierte Vacciniastämme entwickelt. Diese hoch attenuierten Stämme haben eine begrenzte Infektionsfähigkeit. Dementsprechend wurde eine Produktion von Proteinen mit diesen hoch attenuierten Stämmen versucht. Unglücklicherweise haben hoch attenuierte Virusstämme ein langsames und begrenztes Wachstum, was sie häufig für eine Proteinproduktion in großem Umfang schlecht geeignet erscheinen läßt.
Zusätzlich zu den hoch attenuierten Poxviren sind beeinträchtigte Stämme anderer Viren bekannt. Zum Beispiel können beeinträchtigte Retroviren in Helferzellinien gezüchtet werden, die zu einem Komplementieren des beeinträchtigten Virus in der Lage sind. Siehe Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION (Stockton Press, 1990) bei 33–39; Mann et al., Cell 33: 153–59 (1983). Retroviren sind jedoch kleine, RNA-haltige Viren, die sich durch Integration in das Genom der Wirtszelle vervielfältigen, was diese Viren für ihre Verwendung als Expressionsvektoren oder Vaccine ungeeignet macht.
Beeinträchtigte Adenoviren, die in komplementierenden Zellen gezüchtet werden, wurden als Vaccine verwendet, wie beschrieben von Eloit et al., J. Gen. Virol. 71: 2425–31 (1990). Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Viren, die anders als Vacciniavirus sich im Kern der infizierten Zellen replizieren und einen engen Wirtsbereich haben. Zusätzlich wurde auch von einem Wachstum der beeinträchtigten Herpes-Viren in Helferzellen berichtet. Siehe PCT-Veröffentlichungen WO 94/03595, WO 94/21807 und WO 92/05263. Herpes-Virus repliziert sich auch im Kern infizierter Zellen. Nackte Herpes-DNA, wie Adenovirus-DNA, ist infektiös. Dementsprechend funktionieren die Promotoren dieser Viren in der Regel in der Wirtszelle.
Anders als Poxviren sind Herpes- und Adenoviren Kernviren. Defekte Viren jedoch, abgeleitet von den Kernviren haben ein Potenzial einer Ret tung der defekten Bereiche von der Wirtszelle über homologe Rekombination. Solche Rekombinationsereignisse sind nicht wünschenswert und gefährlich, da das beeinträchtigte Virus potenziell in den Wildtyp-Zustand zurückkehren kann, was zu einer erhöhten Infektionsfähigkeit und Virulenz führt, wie auch zum Verlust des inserierten Fremdgens.
Aufgrund eines Bedarfs an sichereren rekombinanten Expressionssystemen und Vaccinen sind erfinderische Ansätze für eine gentechnologische Bearbeitung der fundamental unterschiedlichen rekombinanten Poxviren nötig. Der hier beschriebene Ansatz beinhaltet eine Insertion eines Fremdgens in einen essenziellen Bereich des Poxvirus.
Es ist so eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinante Poxviren bereitzustellen, die Fremd-Polynukleotide exprimieren können, wie genomische DNA und cDNA.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinante Poxviren bereitzustellen, die defekt sind, da ihnen eine Funktion fehlt, die von einer essenziellen Region des Poxvirusgenoms verliehen wird.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, defekte Poxviren bereitzustellen, die Fremd-Polynukleotide besitzen, inseriert in essenzielle Bereiche des Poxvirusgenoms.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, defekte Poxviren bereitzustellen, bei denen der gesamte oder ein Teil eines essenziellen Bereichs deletiert ist.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, defekte Poxviren bereitzustellen, die als Vaccine verwendet werden können.
Indem diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung erreicht wurden, werden gemäß einem Aspekt der Erfindung defekte Poxviren bereitgestellt, denen eine Funktion fehlt, die von einem essenziellen Bereich des Elternpoxvirus bereitgestellt wird, wobei das defekte Poxvirus ein Fremd-Polynukleotid unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors umfasst. Das heißt, das defekte Poxvirus stammt von einem Elternpoxvirus ab, jedoch fehlt eine Funktion, die normalerweise im Elternpoxvirus vorliegt.
Der Promotor sollte mit den Enzymen des defekten Poxvirus oder des infizierten Wirts operabel sein. Solche Promotoren beinhalten Poxvirus-Promotoren und synthetische Promotoren, basierend auf Poxvirus-Promotoren. Das Fremd-Polynukleotid kann in den essenziellen Bereich inseriert werden oder den gesamten essenziellen Bereich ersetzen oder einen Teil davon.
Zusätzlich kann ein Marker den essenziellen Bereich vor der Insertion des Fremd-Polynukleotids in das Virus substituieren. Das Fremd-Polynukleo tid kann dann in den Marker inseriert werden oder ihn ersetzen. Vorzugsweise ist das Elternpoxvirus Vacciniavirus und die zu verlierenden essenziellen Funktionen werden durch die offenen Leserahmen I7L, F18R, F13L, D13L, D6R, A8L, H4L, J1R, J3R, A1OL und A3L oder offene Leserahmen kodiert, die ein 14 Kilodalton Hüllprotein oder ein 25 Kilodalton Strukturprotein kodieren.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Proteins bereitgestellt, umfassend den Schritt der Bereitstellung eines defekten Poxvirus, dem eine Funktion fehlt, verliehen durch einen essenziellen Bereich des Elternpoxvirus wobei das defekte Poxvirus ein Fremd-Polynukleotid umfasst, kodierend das zu erzeugende Protein und wobei das Polynukleotid sich unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors befindet. Der Promotor sollte mit dem defekten Poxvirus oder infizierten Wirt operabel sein, wobei solche Promotoren Poxvirus-Promotoren beinhalten. Das Polynukleotid kann in den essenziellen Bereich des Elternpoxvirus inseriert werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann ein Marker, wie z.B. ein gpt-Gen, die gesamte essenzielle Region oder einen Teil davon ersetzen und das Polynukleotid kann wiederum in den Marker inseriert sein und den gesamten Marker ersetzen oder einen Teil davon. Der Verlust der Markerfunktion wird dann anzeigen, dass das Polynukleotid in das defekte Poxvirus platziert wurde.
Gemäß noch einem weiteren anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Vaccine bereitgestellt, umfassend defekte Poxviren. Diese defekten Poxviren umfassen Polynukleotide, die Antigene gegen Pathogene kodieren. Die Poxviren für die Vaccine der vorliegenden Erfindung können auf dieselbe oder ähnliche Weise wie die anderen defekten Poxviren der vorliegenden Erfindung konstruiert werden.
Diese und andere Aspekte der Erfindung, wie hier offenbart, werden dem Fachmann im Hinblick auf die hier enthaltene Offenbarung deutlich werden.
1 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pRSET-I7L.
2 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pSV-I7L-EDH.
3 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pCR-I7Lf-ZG.
4 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pRSET-A8L-3'/2.
5 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pSV-A8L-EDH.
6 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pCR-A8Lf-ZG.
7 zeigt schematisch die Konstruktion der Plasmide pRSET-D6R und pRSET-D6R-3'.
8 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pSV-D6R-EDH.
9 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pCR-D6Rf-ZG.
10 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pRSET-J1R.
11 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pSV-J1R-EDH.
12 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pCR-J1R-ZG.
13 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pSV-H4L-EDH.
14 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pCR-H4Lf-ZG.
15 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pHS-I7L.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt die Verwendung defekter Poxviren für die Erzeugung von Proteinen. Ein "defektes Poxvirus" gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Poxvirus, dem eine Funktion fehlt, die von einem essenziellen Bereich des Elternpoxvirus verliehen wird, auf dem das defekte Poxvirus basiert; in der Konsequenz ist das defekte Poxvirus ohne Komplementierung der verlorenen Funktion durch eine andere Quelle nicht lebensfähig oder infektionsfähig. Ein "essenzieller Bereich" ist ein Bereich des Poxvirus-Genoms, der für die Lebensfähigkeit oder Infektionsfähigkeit des Elternpoxvirus benötigt wird. Die Bezeichnung "Komplementierung" bedeutet eine Wiederherstellung einer verlorenen Funktion durch eine andere Quelle, wie z.B. die Wirtszelle. So ist ein defektes Poxvirus eine nicht lebensfähige oder nicht-infektiöse Form eines Elternpoxvirus und kann in Gegenwart der Komplementierung lebensfähig oder infektiös werden.
Ein Elternpoxvirus kann ein natürlich auftretendes Poxvirus oder ein davon abstammendes Poxvirus sein.
Ein defektes Virus basiert auf (ist abgeleitet von) Elternpoxviren, wie natürlich auftretenden Poxviren oder Poxviren, abgeleitet von natürlich auftretenden Poxviren. Diese abgeleiteten Poxviren zur Verwendung als Elternpoxviren können durch Techniken, wie Gentechnologie, über regionspezifische und ortsspezifische Mutagenese, in-vivo-Rekombination, Passage des Virus durch Wirtszellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Mutagenen und jede Kombination der obigen erhalten werden. Ein defektes Poxvirus kann auf irgendeiner Art von Poxvirus basieren, worin ein Defekt in einen essenziellen Bereich eingeführt werden kann.
Das defekte Poxvirus kann in einem Expressionssystem für Proteine verwendet werden. Die durch die defekten Poxviren der vorliegenden Erfindung erzeugten Proteine werden durch Fremd-Polynukleotide kodiert, wie Gene oder cDNA-Versionen von RNA-Transkripten. Die Bezeichnung "Fremd-Poly nukleotid" betrifft ein Polynukleotid, das normalerweise im Elternpoxvirus nicht vorliegt, auf dem das defekte Poxvirus basiert oder es handelt sich um ein Polynukleotid, das an einer anderen Stelle oder Form vorliegt, als derjenigen, die im Elternpoxvirus angetroffen wird, auf dem das defekte Poxvirus basiert. Die Fremd-Polynukleotide können von einer Vielzahl von Quellen abstammen, wie Tieren, Pflanzen, Protozoen, Pilzen, Bakterien und Viren.
Ein defektes Poxvirus der vorliegenden Erfindung kann einen Promotor beinhalten, der mit dem defekten Poxvirus oder dem Wirt operabel ist, der durch das defekte Poxvirus infiziert ist, um die Transkription des Fremd-Polynukleotids mit dem defekten Poxvirus zu kontrollieren. Ein "Promotor" beschreibt eine Nukleotidsequenz, die die Transkription initiieren oder steuern kann. Jeder Promotor, der mit dem defekten Poxvirus oder in dem infizierten Wirt operabel ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. "Operabel" bedeutet eine Erkennungsfähigkeit oder Lesefähigkeit des Promotors durch Transkriptionsenzyme. Typischerweise sind die Promotoren Poxvirus-Promotoren oder synthetische Promotoren, basierend auf Promotoren von Poxvirus-Ursprung.
Ein defektes Virus kann mindestens ein Fremd-Polynukleotid aufweisen, inseriert in einen essenziellen Bereich des Poxvirus. Ein Promotor kann an das Fremd-Polynukleotid gebunden sein, so dass der Promotor zusammen mit dem Polynukleotid inseriert wird, damit der Promotor eine Transkriptionskontrolle über das Polynukleotid ausübt. Alternativ kann der Promotor zur Kontrolle der Transkription des Fremd-Polynukleotids bereits in dem defekten Poxvirus in einer Stelle vorliegen, die es dem Promotor ermöglicht, die Transkription des Fremd-Polynukleotids zu kontrollieren.
Der essenzielle Bereich kann aus dem Genom des defekten Virus völlig deletiert sein, so dass keine homologe Rekombination zwischen dem Genom der komplementierenden Quelle und dem defekten Virus möglich ist. Ein defektes Virus mit einer solchen Deletion kann nur in Gegenwart der komplementierenden Quelle wachsen, wie z.B. einer Helferzellinie, die die Funktion des essenziellen Bereichs in trans bereitstellt. Reine Stämme des defekten Virus können in der Helferzellinie gezüchtet werden, während Wachstum und Vervielfältigung in normalen Zellen und Organismen unmöglich bleibt. Der Wirtsbereich dieser Art Virus kann auf Helferzellinien begrenzt werden, die spezifisch so gentechnologisch bearbeitet sind, dass sie den Defekt des defekten Virus komplementieren. Ein Markergen kann verwendet werden, um einen essenziellen Bereich in dem defekten Poxvirus zu ersetzen. Das Fremd-Poly nukleotid kann dann in den Marker inseriert werden oder den gesamten Marker oder einen Teil davon durch homologe Rekombination ersetzen. Dieser Ansatz stellt ein Selektionssystem für Poxviren bereit, enthaltend Inserts von Interesse.
Die vorliegende Erfindung ist für mehr als eine Expression von Proteinen in großen Umfang nützlich. Die defekten Poxviren der Erfindung können auch für Impfzwecke verwendet werden. Wenn z.B. ein geeignetes essenzielles Gen inaktiviert wird, behalten die defekten Viren immer noch ihre Fähigkeit, in die Zellen einzudringen und einen abortiven Lebenszyklus zu beginnen. Ein solches Gen würde eins sein, das spät im Lebenszyklus benötigt wird und daher wäre das Virus immer noch in der Lage, seine DNA zu replizieren, eventuell unreife Teilchen zu bilden und die genomische Information zu exprimieren, die das Fremd-Polynukleotid beinhaltet. In diesem Hinblick könnten diese defekten Viren die Wirkung von "Tot-Lebend-Vaccinen" ausüben. Taylor und Paoletti, Vaccine 6: 466–68 (1988). Ein defektes Poxvirus, das als Vaccin verwendet wird, würde ein DNA-Polynukleotid umfassen, das ein Antigen kodiert. Antigene sind Moleküle, die ein Organismus als fremd erkennt. Diese Antigene können eine immunologische Reaktion von dem gegenüber dem Antigen ausgesetzten Organismus induzieren. Antigene beinhalten Proteine von bakteriellem, viralem, Pilz- und Protozoen-Ursprung. Ein bevorzugter parentaler Vaccinia-Stamm für die Konstruktion von defekten Viren, die als Vaccine verwendet werden sollen, wären die Vaccinstämme, wie die von dem New York City Department of Health Laboratories strain (ATCCVR-325).
Die defekten Poxviren der vorliegenden Erfindung können in Wirtszellen gezüchtet werden, die die verlorene essenzielle Funktion des defekten Virus komplementieren. Typischerweise stammen diese Wirtszellen von Zellinien ab, die spezifisch gentechnologisch manipuliert sind, so dass sie die verlorene Funktion komplementieren. Typischerweise wird die Wirtszelle dieselbe oder eine ähnliche essenzielle Poxvirus-Region aufweisen, inseriert in die Wirtszelle, in derartiger Weise, dass der essenzielle Bereich durch die Wirtszelle exprimiert wird oder der essenzielle Bereich ist in der Zelle nach Infektion der Wirtszelle induzierbar.
Essenzielle Genprodukte, die als komplementierende Mittel geeignet sind, beinhalten im allgemeinen Genprodukte, die spät im Lebenszyklus des Poxvirus benötigt werden. Illustrativ für solche Genprodukte sind diejenigen, die an der Morphogenese oder an anderen Post-Replikationsereignissen beteiligt sind, wie auch Enzyme und regulatorische Proteine.
Ein essenzielles Genprodukt, das ein geeignetes komplementierendes Mittel ist, ist das 47-kDa-Protein (das "I7-Protein"), kodiert durch den offenen Leserahmen ("orf") I7L, von dem angenommen wird, dass es an der viralen Genomorganisation beteiligt ist. Kane und Shuman, J. Virol. 67: 2689–98 (1993). Das I7-Protein wird mit dem Viruskern verkapselt.
Eine temperaturempfindliche (ts) Mutation existiert, die als tsl6 bekannt ist. Condit et al., Virol. 128: 429–43 (1983). Das I7-Gen erfüllt daher eine klassische Anforderung an ein essenzielles Gen, nämlich die Existenz einer konditional lethalen Mutante (Temperaturempfindlichkeit).
Unter den essenziellen Genprodukten, die geeignete komplementierende Mittel im gegenwärtigen Kontext sind, befindet sich das 65 kDa-Protein, kodiert durch den D13L orf. Dieses Protein wird spät in der Infektion exprimiert. Wenn die Expression verhindert wird, ist die Replikation nicht betroffen, während die virale Morphogenese auf einer frühen Stufe blockiert wird. Siehe Zhang und Moss, Virol. 187: 643–53 (1992). Andere essenzielle Genprodukte, die als komplementierende Mittel geeignet sind, sind das Vaccinia 14 kDa Hüllprotein, Lai et al., J. Biol. Chem. 265: 22174–80 (1990); das Vaccinia 25 kDa Hauptstruktur-Protein, Weir und Moss, J. Virol. 56: 534–40 (1985) und andere Strukturproteine, wie P4a und P4b.
Ein anderes essenzielles Genprodukt, das als komplementierendes Mittel verwendet werden kann, ist das 11 kDa-Phosphoprotein, Wittek et al., J. Virol. 49: 371–78 (1984), kodiert durch den F18R orf vom WR Wildtyp-Virus (bekannt als "F17R" des Kopenhagen-Stamms von Vaccinia). Siehe Goebel et al., Virol. 179: 247–66 (1990). Das durch den F18R orf kodierte 11 kDa-Phosphoprotein ist ein essenzielles Gen, das für eine korrekte Virion-Anordnung nötig ist. Siehe Zhang und Moss, J. Virol. 65: 6101–10 (1991). Konditional lethale Vacciniamutanten in den F18R und F17R orfs bilden unreife Partikel, mit abweichenden inneren Strukturen unter bestimmten Bedingungen. F18R überlappt jedoch mit dem orf A und wäre daher in der Regel nicht ein essenzieller Bereich der ersten Wahl. Goebel et al., supra.
Es können auch Enzyme und regulatorische Proteine als komplementierende Mittel verwendet werden, da diese Proteine nur in katalytischen Mengen vorliegen müssen, die einfach durch die komplementierende Zellinie zur Verfügung gestellt werden können. Die Untereinheiten des Vacciniavirusfrühen Transkriptionsfaktors ("VETF") sind in diesem Hinblick geeignet. Der VETF ist für die Initiation der Transkription von "frühen" Vacciniagenen essenziell. Eine Vaccinia-RNA-Polymerase, der VETF fehlt, ist nicht in der Lage, doppelsträngige DNA-Matrizen in vitro zu transkribieren. Siehe Broy les et al., J. Biol. Chem. 263: 10754–60 (1988). Der Faktor ist ein Heterodimer mit einem 77 kDa Polypeptid und einem 82 kDa Polypeptid, die jeweils durch den D6R und A8L-Gen-orf des Vaccinia-WR-Genoms kodiert werden. Siehe Gershon und Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 4401–05 (1990).
VETF-Proteine werden später in der Infektion exprimiert und in die wachsenden Viruspartikel verpackt. Ein defektes Virus, dem das D6R oder A8L-Gen fehlt, isoliert von VETF exprimierenden Zellen, sollte daher in der Lage sein, einen zusätzlichen vollständigen Lebenszyklus in einer nicht-komplementierenden Zellinie ohne weitere Begrenzungen der Proteinsynthese durchzuführen. Die Proteinsynthese ist eine essenzielle Anforderung zur Verwendung solcher defekter Viren als "Tot-Lebend-Vaccine".
Tod-Lebend-Vaccine beinhalten Avipoxviren, die Fremdgene exprimieren, die verwendet werden, um Säugerwirte zu immunisieren. In dem Säugerwirt vervielfältigen sich die Viren nicht, sondern durchlaufen statt dessen einen abortiven Lebenszyklus. Nichtsdestotrotz stimuliert diese Art von Vaccinen die Immunreaktion bestimmter T-Zellen. Siehe Taylor und Paoletti, supra. Ein defektes Virus, dem VETF fehlt, ist wünschenswert, da es in der Lage sein sollte, einen zusätzlichen Lebenszyklus in Wildtyp-Wirten durchzuführen im Vergleich zu Viren, die nur zur Durchführung eines abortiven Lebenszyklus in der Lage sind, was eine größere Antigenproduktion ermöglicht.
Ein weiterer viraler Faktor, der für eine Komplementierung geeignet ist, ist das RNA-Polymerase assoziierte Protein RAP 94 oder der frühe Transkriptions-Spezifitätsfaktor. RAP94 wird durch den orf H4L kodiert, Ahn und Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci: USA 89: 3536–40 (1992) und es handelt sich um eine Untereinheit der viralen DNA-abhängigen RNA-Polymerase, die disassoziiert werden kann. Die Untereinheit verleiht die Promotorspezifität an den RNA-Polymerase-Komplex für die Initiation der Transkription von Genen der frühen Stufe. Als komplementierendes Mittel erfüllt es dieselben Anforderungen wie die VETF-Untereinheiten. RAP 94 wird spät in der Infektion synthetisiert und in den wachsenden Virus verpackt, um in der folgenden Runde der Infektion eine frühe Transkription zu vermitteln. Daher sollten phänotypisch intakte Viruspartikel, denen das H4L-Gen fehlt, in der Lage sein, eine zusätzliche Infektionsrunde in einem nicht-komplementierenden Wirt ohne weitere Begrenzungen der Proteinsynthese durchzuführen. Die Existenz lethaler Mutanten, Condit und Motytzca, Virol. 113: 224–41 (1981) bestätigt, dass H4L ein essenzielles Gen ist. Das Protein wird in dem Virion in submolaren Mengen im Vergleich mit anderen Komponenten des RNA-Poly merase-Komplexes angetroffen. Ahn und Moss supra. Dementsprechend sollten niedrige Expressionsniveaus von RAP94 in der komplementierenden Zellinie das Wachstum des defekten Virus nicht beeinflussen.
Ein anderes Gen, das für eine Komplementierung des defekten Virus verwendet werden kann, ist das J1R-Gen, das für das Viruswachstum in Zellkultur essenziell ist. Obwohl das Genprodukt davon bis jetzt noch nicht identifiziert wurde, ist dieser orf aufgrund seiner Stellung, benachbart zum Thymidinkinase-Gen auf dem Vacciniavirus-Genom, von beträchtlichem Interesse. Die Deletion einer Sequenz, die den orf J1R beinhaltet und zumindest von Teilen des benachbarten Thymidinkinase-Gens(J2R) führt zu einem Virus, das von einer komplementierenden Zellinie abhängig ist und das gleichzeitig durch negative Selektion auf tk-negativen Zellen, wie LM(TK-)-Zellen oder tk-negativen Verozellen selektierbar ist. Reine Stammhaltungen des defekten Virus werden schnell unter Verwendung dieses zusätzlichen Selektionsverfahrens erhalten.
Das J3R-Gen ist im selben Hinblick wie der J1R orf von Interesse. Die negative Selektion auf tk-negativen Zellen kann aufgrund einer simultanen Deletion des J3R orf und des benachbarten J2R orf (Thymidinkinase) durchgeführt werden. Das J3R-Gen kodiert eine Poly(A)polymerase-Untereinheit (VP39), die für die Bildung der 5'-Kappen-Struktur der mRNA benötigt wird und die Bildung von langen Poly(A)-Schwänzen stimuliert. Gershon et al., Cell 66: 1269–78 (1991); Schnierle et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 2897–01 (1991).
Defekte Poxviren der vorliegenden Erfindung können mit vielen derselben Verfahren erzeugt werden, die verwendet werden, um rekombinante Viren mit Inserts in nicht-essenziellen Bereichen zu konstruieren. Zum Beispiel kann eine in-vivo-Rekombination über homologe flankierende Regionen verwendet werden. Siehe Panicali und Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 4927–31 (1982); Mackett et al., loc. cit. 79: 7415–19 (1982). Ein alternatives Verfahren zur Erzeugung defekter Poxviren ist das direkte molekulare Klonieren und heterologe Verpacken. Siehe EP 0 561 034 ; Scheiflinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 9977–81 (1992); Merchlinsky und Moss, Virol. 190: 522–26 (1992).
Beispiel 1:
Konstruktion eines defekten Vacciniavirus, dem das I7L-Protein fehlt ("d-I7L-ZG") und einer komplementierenden Zellinie, basierend auf Vero-Zellen ("V-I7L")
Konstruktion der komplementierenden Zellinie V-I7L
Der erste Schritt bei der Konstruktion der Helferzellinie war die Klonierung des I7L-orf, durch konventionelle, PCR-vermittelte Methoden, in ein E. coli-Expressionsplasmid und in ein eukaryontisches Expressionsplasmid. Die Expression des I7L-orf in E. coli ermöglicht eine schnelle Produktion des Proteins für die Immunisierung von Kaninchen, um Anti-I7L-Protein-Antikörper zu erhalten, die später zur Identifizierung des I7L-Proteins in permanenten Zellinien verwendet werden können.
Zu diesem Zweck wurde der I7L-orf durch PCR amplifiziert und dann in das Plasmid pCRII (Invitrogen, Inc.) kloniert. Die Primer oI7-1 (5'-AGT ACT CCA TGG AAA GAT ATA CAG ATT TAG-3') (SEQ ID NO: 1) und oI7-2 (5'-ATC CCG GGT TTT AGA GAC TTT GAA GCT ACT-3') (SEQ ID NO: 2) wurden verwendet, um das I7L-Gen als 1,3 kb-Fragment zu amplifizieren. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCRII inseriert, was zu pCR-I7L führte. Das Plasmid pCR-I7L war die Quelle des NcoI-HindIII-Genfragments, das später durch forciertes Klonieren in das Plasmid pRSET-B (InVitrogen, Inc.) inseriert wurde, was pRSET-I7L ergab (1). Das Plasmid pRSET-I7L erlaubte eine Überexpression des I7L-orf, der stromabwärts vom T7-Promotor angeordnet war. Die Expression unter der T7-Promotorkontrolle benötigte eine T7 RNA-Polymerase, die durch Infektion von Plasmid tragenden E. coli durch den Bacteriophagen M13mp18/T7 bereitgestellt wurde.
Das I7L-Protein wurde in JM109 E. coli-Zellen, infiziert mit M13mp18/T7 überexprimiert, die außerdem das Plasmid pRSET-I7L beherbergten. Die Induktion des lac-Promotors treibt die Expression der T7-Polymerase in Bacteriophagen M13mp18/T7 mit Isopropylthiogalactosid ("IPTG") an. Das in diesem speziellen Beispiel verwendete E. coli-Expressionssystem wurde von InVitrogen, Inc. (USA) erhalten und beinhaltet die Elternplasmide pRSET A, pRSET B und pRSET C und den auf M13-basierenden Helferphagen M13mp18/T7. Andere geeignete Expressionssysteme können auch mit der gegenwärtigen Erfindung verwendet werden.
Folgend auf die Expression wurden bakterielle Lysate hergestellt und einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Die Bande, die das I7L-Protein enthielt wurde nachgewiesen, aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert. Kaninchen wurden mit dem elektroeluierten Material und kom plettem Freund's Adjuvans (30 mg Protein pro Dosis, i.m.) immunisiert. Nach einem Monat wurden die Tiere mit derselben Dosis inkomplettem Freund's Adjuvans Antigen ausgesetzt und die Entwicklung der Antikörper durch Western-Blots überwacht.
Die Western-Blots können im wesentlichen wie von Towbin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 76: 4350–54 (1979) beschrieben, durchgeführt werden. Der erste Antikörper ist ein Kaninchen-anti-I7L-Antikörper (siehe oben), verwendet in 1:100-Verdünnung. Der zweite Antikörper ist ein Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (BioRad, Inc.), verwendet in einer 1:1.000-Verdünnung. Die Reagenzien (BCIP und NBT) und die Färbeprotokolle stammen von Promega, Inc.
Ein NcoI-SmaI-Genfragment des Plasmids pCR-I7L ist Teil des Expressionsplasmids pSV-I7L-EDH. Siehe 2. Das Plasmid pEDH1 (2) umfasst die "EDH-Gen-Kassette", beinhaltend eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle, die Dihydrofolatreduktase- ("dhfr") und Hygromycin ("hph") -Gene als EcoRV-SalI-Fragment. Dieses Plasmid pEDH1 stammt von dem Plasmid pB4/EDHPro (Herlitschka, Doktorarbeit) ab, worin vier zusätzliche Restriktionsstellen (SalI, ClaI, SwaI und DraI) stromabwärts von der "EDH-Gen-Kassette" zwischen den Stellen SpeI und NotI inseriert wurden. Die "EDH-Gen-Kassette" von pEDH1 wurde als EcoRV-SalI-Fragment zwischen den einzigartigen Restriktionsstellen SmaI und SalI des Plasmids pSV-I7L inseriert. Diese Konstruktion ergab das Plasmid pSV-I7L-EDH.
Das Plasmid pSV-I7L wurde erhalten durch Insertion des 1,3 kb NcoI-SmaI-Fragments von pCR-I7L zwischen die BbsI-SmaI-Stellen des Plasmids pSV-Bbs. Das Plasmid pSV-Bbs ist ein Derivat des Plasmids pSVβ (Clontech, Inc. USA), dem das β-Galactosidase-Gen fehlt, das jedoch eine einzigartige BbsI-Stelle enthält. Die BbsI-Stelle wird durch einen Linker eingeführt, beinhaltend die Oligonukleotide oBbs-1 (5'-CTA GGC TTT TGC AAA AAG CTC CTC GAC CAT GGT GTC TTC A-3') (SEQ ID NO: 3) und oBbs-2 (5'-AGC TTG AAG ACA CCA TGG TCG AGG AGC TTT TTG CAA AAG C-3') (SEQ ID NO: 4). Der Linker wurde zwischen die AvrII- und HindIII-Stellen des Plasmids pSVβ inseriert. Siehe 2.
In pSV-I7L-EDH wird der I7L-orf durch den SV40 frühen Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker zum Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, beinhaltend die dhfr- und hph-Gene, was ein effizientes Screening und eine Amplifikation der Gene von Interesse in permanenten Zellinien ermöglicht. Herlitschka, S. E. (1994), Doktor-Arbeit, Universität für Bodenkultur, Wien, Österreich. Die Durchführung der gegenwärtigen Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieses Markers begrenzt.
Dieses Plasmid wird in Affen-Nieren-Vero-Zellen (ATCC Nr. CCL 81) transfiziert. Die Vero-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Die Zellen wurden mit dem Plasmid pSV-I7L EDH gemäß Graham und van der Eb, Virol. 52: 456–67 (1973) transfiziert und in selektivem Medium, basierend auf Hygromycin B (DMEM, 10% fötales Rinderserum, 250 mg/ml Hygromycin B) inkubiert. Die Kolonien wurden nach 10 bis 14 Tagen sichtbar. Diese Kolonien wurden expandiert, zweimal subkloniert und dann weiter charakterisiert. Permanente hph-positive Zellinien wurden in Gegenwart von Hygromycin B selektiert. Die Zellinien wurden weiter durch PCR-Analyse im Hinblick auf die Gegenwart des komplementierenden Genkonstrukts (I7L) charakterisiert. Western-Blots werden verwendet, um zu zeigen, dass das Gen von Interesse, das I7L-Protein, exprimiert ist. Die endgültige komplementierende Zellinie wird V-I7L genannt.
Konstruktion des defekten Virus 8-I7L-ZG:
Um das Virus d-I7L-ZG zu konstruieren, dem das I7L-Produkt fehlt, wurde das Plasmid pCR-I7Lf konstruiert, wie in 3 zusammengefasst. Dieses Plasmid basiert auf dem pCRII-Vektor und enthält den I7L-orf, beinhaltend ungefähr 0,5 kb des flankierenden Bereichs auf jeder Seite. Die Primer oI7-3 (5'-AGG AGT TAA TGA GGC CAA TGG A-3') (SEQ ID NO: 5) und oI7-4 (5'-GAC ATA GGT ATA GAA TCC GGA-3') (SEQ ID NO: 6) wurden verwendet, um ein PCR-Produkt mit ungefähr 2,3 kb zu erhalten, das in das pCRII-Plasmid subkloniert wurde, um pCR-I7Lf zu ergeben.
Eine doppelte Genkassette, beinhaltend die E. coli-Gene lacZ und gpt, wurde als SmaI-Fragment von dem Plasmid pLGb ausgeschnitten und in die einzigartige HpaI-Stelle inseriert, lokalisiert innerhalb des I7L-orf, was das pCR-I7L-Gen in dem resultierenden Plasmid pCR-I7Lf-ZG inaktiviert.
Das Plasmid pLGb wurde von p2T erhalten, was auf dem Plasmid p1Ta und pTZ19R (Pharmacia) basiert. Zunächst wurde das große PvuII-Vektorfragment von pTZ19R mit den angeklebten Oligonukleotiden P-1T(1): 5'-AGT TTA AAC GGC GCG CCC GGG CTC GAG AGG CCT CTG CAG ATG CAT CCA TGG GGA TCC GAA TTC 3' (SEQ ID NO: 7) und P-1T(2): 5'-GAA TTC GGA TCC CCA TGG ATG CAT CTG CAG AGG CCT CTC GAG CCC GGG CGC GCC GTT TAA ACT (SEQ ID NO: 8) ligiert. Dies ergab p1Ta, das dann mit EcoRI und BamHI gespalten wurde. Das gespaltene p1Ta wurde dann mit den angehafteten Oligonukleotiden P-2T(1): 5'-GAT CCT ACG TAT CTA GAA TTA ATT AAT GGC CAA TTT AAA TGC CCG GGA-3' (SEQ ID NO: 9) und P-2T(2): 5'-AAT TTC CCG GGC ATT TAA ATT GGC CAT TAA TTA ATT CTA GAT ACG TAG-3' (SEQ ID NO: 10) ligiert. Dies ergab Plasmid p2T, das dann mit SmaI gespalten wurde. Eine doppelte Genkassette, beinhaltend die E. coli-Gene lacZ und gpt wurde als mit HindIII, SalI und Klenow-Polymerase behandeltes Fragment inseriert. Die doppelte Genkassette wird von dem Plasmid pZgpt-a erhalten, das auf dem Plasmid pTNa basiert sowie verwandten Plasmiden.
Für die Konstruktion des d-I7L-ZG-Virus wurde das Plasmid pCR-I7Lf-ZG in den WR-Stamm des Vacciniavirus durch in-vivo-Rekombination in CV-1-Zellen inseriert. Zunächst wurden 5 × 10⁶ CV-1-Zellen mit 0,1 koloniebildenden Einheiten pro Zelle von Vaccinia WR, infiziert, eine Stunde gezüchtet, mit einem Calciumphosphatpräzipitat transfiziert, das 20 μg des Plasmid pCR-I7Lf-ZG beinhaltet und dann 3 Tage gezüchtet. Siehe Graham und van der Eb, supra. Eine virale Rohstammlösung wird hergestellt und für Plaquezellen in Gegenwart von gpt-Selektion verwendet, Falkner und Moss, J. Virol. 62: 1849–54 (1988) sowie Blue-Plaque-Screening, Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. S. 5: 3403–09 (1985).
Das defekte Virus wächst ausschließlich in V-I7L-Zellen und ist gpt- und lacZ-positiv, während das Wildtyp-Virus in beiden Zellinien wächst, jedoch gpt- und lacZ-negativ ist. Die Reinigung wird zehnmal durchgeführt. Die gereinigten defekten Viren werden dann in größerem Umfang gezüchtet und durch Southern-Blot überprüft. Die Abwesenheit von Wildtyp-Virus und Gegenwart der vorhergesagten Banden bestätigt, dass die korrekten defekten Genome gebildet wurden. Plaque-Assays der defekten Viren auf den komplementierenden Zellen und auf Wildtyp-Zellen bestätigen, dass der Wirtsbereich der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie begrenzt ist. Tierstudien bestätigen, dass die defekten Viren nicht pathogen sind.
Beispiel 2:
Konstruktion eines defekten Vacciniavirus, das das HIV env gp160-Gen (d-I7L MN) in der komplementierenden V-I7L-Zellinie exprimiert
Um eine Fremdgen-Expression in dem neuen System zu demonstrieren, wurde das HIV gp160-Gen des HIV MN-Stamms in den essenziellen Bereich I7L inseriert. Zu diesem Zweck wird eine Genkassette von einem SmaI-Fragment des Plasmids pSep-ST2 erhalten. Das Plasmid pSep-ST2 enthält die HIV-1 gp160MN-Sequenzen, kontrolliert durch den starken semi-synthetischen Poxvirus-Promotor Sep und eine Selektionskassette, die das P7,5 gpt-Gen beinhaltet. Siehe Falkner und Moss, J. Virol. 62: 1849–54 (1988).
Um das Plasmid pSep-ST2 zu konstruieren, wurde zunächst das Plasmid pSep(1) konstruiert. Um pSep(1) zu erhalten, wurde der semi-synthetische Poxvirus-Promotor Sep durch Kombination des späten Geflügelpoxvirus-Promotors P2 ( EP 0 538 496 A1 , Dorner et al.) mit einer synthetischen frühen Promotorsequenz konstruiert. Kurz gefasst wurde der HpaI/NcoI-verdaute Vek tor pS2gpt-P2 (europäische Patentanmeldung Nr. 0 561 034 A2) mit den angehafteten Oligonukleotiden P-Sep(3) & P-Sep(4) ligiert. Die Sequenz der Oligonukleotide war P-Sep(3), 5'-CTCGTAAAAA TTGAAAAACT ATTCTAATTT ATTGCACGGT CGCGA-3' (SEQ ID NO: 11) und P-Sep(4), 5'-CATGGTACGT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT AGTTTTTCAA TTTTTACGAG-3' (SEQ ID NO: 12). Das resultierende Plasmid wurde als pSep(1) bezeichnet. Um pSep-ST2 zu erhalten, wurde zunächst ein 2,65 kb StuI/PvuII-Fragment, abgeleitet von dem Plasmid pMNenv2 (beschrieben in EP 0 561 034 A2 ), enthaltend das HIV1-MN env-Gen, mit dem SnaBI-linearisierten Plasmid pSep(1) ligiert. Das resultierende Plasmid, enthaltend das Insert in richtiger Orientierung im Hinblick auf den "Sep-Promotor" wurde pSep-gp160mn genannt. Um eine Punktmutation, lokalisiert innerhalb des gp160-orf zu reparieren, wurde ein 1,9 kb NsiI/SalI-Fragment von pSep-gp160mn durch ein äquivalentes Fragment, abstammend von dem Plasmid pMN-ST2, ersetzt. Das resultierende Plasmid wurde pSep-ST2 genannt. Die Plasmide pMNenv1 und pMN-ST2 wurden von Marvin Reitz (N. C. I. Bethesda, Maryland, USA) bereitgestellt.
Die Kassette von pSep-ST2 enthält das HIV gp160-Gen und das E. coli gpt-Gen und wird in die einzigartige HpaI-Stelle von pCR-I7Lf inseriert, was das Plasmid pCR-I7Lf-MN ergibt. Dieses Plasmid wird in einem in-vivo-Rekombinationsexperiment in CV-1-Zellen verwendet, involvierend WR-Wildtyp-Virus, um einen viralen Rohstamm zu erhalten, der eine Mischung aus dem folgenden ist: (1) defekte Viren, die zwei Cross-Over-Ereignisse durchlaufen haben, um zu einem rekombinanten Virus zu werden; (2) Viren, die nur ein Cross-Over-Ereignis durchlaufen haben und (3) Wildtyp-Helfer-Viren. Eine Gesamterklärung der Cross-Over-Ereignisse ist in Falkner und Moss, J. Virol. 64: 3108–11 (1990) enthalten.
Diese Mischung aus Viren wird in der komplementierenden Zelle plaquegereinigt, überprüft im Hinblick auf Reinheit, wie beschrieben in Beispiel 1, außer, dass die Plaque-Assays nur auf einer gpt-Selektion basieren. Das resultierende Virus wird als d-I7L-MN bezeichnet und für die Expression von rekombinantem gp160 in V-I7L-Zellen verwendet. Das Virus d-I7L-MN wird in Kombination mit der komplementierenden Zellinie zur Expression von gp160 verwendet. V-I7L-Zellen werden mit 0,1 KBE d-I7L-MN infiziert und drei Tage gezüchtet. Das rekombinante Protein wird durch Western-Blots unter Verwendung eines anti-gp41 monoklonalen Antikörpers in einem Verfahren gemäß Towbin et al., supra, nachgewiesen. Tierexperimente in Mäusen werden durchgeführt um zu demonstrieren, dass d-I7L-MN nicht pathogen ist, jedoch immer noch eine Immunreaktion auslösen kann.
Beispiel 3:
Konstruktion eines defekten Vacciniavirus, dem die große Untereinheit des frühen Transkriptionsfaktors (d-A8L-ZG) fehlt und einer komplementierenden Zellinie für die Propagation des Virus
Konstruktion einer Helferzellinie, basierend auf Vero-Zellen (V-A8L):
Der VETF-Faktor ist ein Heterodimer, umfassend ein 77 kD-Polypeptid und ein 82 kD-Polypeptid, die jeweils von den D6R und A8L orfs des Vaccinia-WR-Genoms kodiert werden. Gershon und Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 4401–05 (1990). Die VETF-Proteine werden spät in der Infektion exprimiert und in die wachsenden Viruspartikel verpackt. Ein defektes Virus, dem VETF fehlt, ist wünschenswert, da es in der Lage sein sollte, einen zusätzlichen Lebenszyklus in Wildtyp-Wirten im Vergleich mit Viren durchzuführen, die nur abortive Lebenszyklen durchführen können.
Die D6R-Untereinheit enthält eine mögliche ATP-Bindungsstelle und es hat sich erwiesen, dass sie an die frühe Promotor-DNA-Sequenz bindet. Siehe Broyles und Li, J. Virol 67: 5677–80 (1993). Temperaturempfindliche Mutationen wurden auf das D6R-Gen kartiert. Der A8L-orf wurde gewählt, um unerwünschte Protein-DNA Wechselwirkungen in der komplementierenden Zellinie zu vermeiden.
Der erste Schritt bei der Konstruktion der Helferzellinie war die Klonierung des A8L-orfs durch PCR-vermittelte Techniken in ein E. coli-Expressionsplasmid und ein eukaryontisches Expressionsplasmid. Die Expression des orf in E. coli ermöglichte eine schnelle Produktion des Proteins für die Immunisierung von Kaninchen, um Anti-VETF große Untereinheit-Antikörper zu erhalten, die darauffolgend zur Identifizierung des Proteins in den permanenten Zellinien verwendet wurden.
Zu diesem Zweck wurde der A8L-orf durch PCR amplifiziert und in das Plasmid pCRII kloniert. Die Primer oA8-9t (5'-AAA CTG CAG GAT GCG ATA TAT AGT AAG TCC GCA AAT GGT ATT A-3') (SEQ ID NO: 13) und oA8-2t (5'-AGG AAT TCA GGC CTG TTT AAT TAA TTT GTG CTC TTC-3') (SEQ ID NO: 14) wurden verwendet, um das A8L-Gen als 2,1 kb-Fragment zu amplifizieren. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCRII (InVitrogen Inc.) inseriert, was zu pCR-A8Lt führte.
Das Plasmid pCR-A8Lt ist die Quelle eines 0,9 kb BamHI-EcoRI-Genfragments. Die BamHI-Stelle (die in dem A8L-Gen vorliegt) und die EcoRI-Stelle (eingeführt durch die multiple Klonierungsstelle von pCRII) wurden gespalten, um das Fragment zu erhalten, das durch forciertes Klonieren in das Plasmid pRSET-B (InVitrogen, Inc.) inseriert wurde, was zu dem Plasmid pRSET-A8L-3'/2 führte. Siehe 4. Das Plasmid enthält ein Fusionsgen, kodierend den C'-terminalen Bereich der VETF großen Untereinheit mit einem N'-terminalen 6-Histidin-tag. Das verkürzte A8L-Protein wurde in E. coli-Zellen (Stamm JM109), die das Plasmid pRSET-A8L-3'/2 beherbergten, überexprimiert.
Die Bakterien wurden danach durch den Helferphagen M13mp18/T7 in Gegenwart von IPTG infiziert, das den lac-Promotor induziert, der die Expression von T7-Polymerase im Bacteriophagen M13mp18/T7 antreibt. Das rekombinante verkürzte A8L-Protein, beinhaltend das his-tag, wurde aus bakteriellen Lysaten durch Affinitätschromatographie auf Nickel-NTA-Säulen gereinigt, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Diagen, Inc.). Das gereinigte Material, emulgiert in komplettem Freund's Adjuvans, wurde verwendet, um Kaninchen zu immunisieren (80 mg Protein pro Dosis, s.c. und i.m.). Nach einem Monat wurden die Tiere mit derselben Dosis Antigen ausgesetzt und die Entwicklung von Antikörpern wurde durch Western-Blots überwacht.
Um die Kaninchen-Antiseren zu charakterisieren, wurden die A8L-Proteine in bakteriellen Lysaten durch Western-Blots nachgewiesen. Die Western-Blots wurden im wesentlichen wie von Towbin et al., supra beschrieben, durchgeführt. Der erste Antikörper war ein Kaninchen-anti-A8L-Protein-Antikörper, verwendet in 1:100-Verdünnung. Der zweite Antikörper war ein Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (BioRad, Inc.), verwendet in 1:1.000-Verdünnung. Die Reagenzien (BCIP und NBT) und Färbeprotokolle waren von Promega, Inc.
Um das Expressionsplasmid pSV-A8L-EDH zu erhalten, wurde das A8L-Gen auf dem Plasmid pCR-A8Lt als 2,1 kb PstI-StuI-Genfragment isoliert. Die PstI- und StuI-Stellen wurden durch die PCR-Primer oA8-9t bzw. oA8-2t eingeführt. Dieses Fragment und ein EcoRV-ClaI-Genfragment von dem Plasmid pEDH1, umfassend die "EDH-Genkassette", wurden in den PstI-ClaI geschnittenen Expressionsvektor pSVMCS#51 ligiert, der von pSVβ (Clontech, Inc.) abstammte, durch Substitution des β-Galactosidase-Gens durch eine multiple Klonierungsstelle ("msc"), beinhaltend die Restriktionsstellen ApaI, AvrI-II, SpeI, HindIII, PstI, SalI, XbaI, SmaI, EcoRI und ClaI. Zu diesem Zweck wurde der Vektor pCMVβ mit NotI geschnitten und wieder ligiert, was zu dem Plasmid pCMV führte. Dieses Plasmid wurde mit SalI und HindIII geschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und religiert, was zu einem intermediären Plasmid führte. Dieses Plasmid wurde mit XhoI geschnitten und ein doppelsträngiger Linker, kodierend für die Restriktionsstellen ApaI, AvrIII, SpeI, HindIII, PstI, SalL, XbaI, SmaI, EcoRI und ClaI wurde inseriert, was zu dem Plasmid pSVMCS#51 führte. Siehe 5.
In dem Plasmid pSV-A8L-EDH wird der A8L-orf durch den SV40 frühen Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker zum Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, beinhaltend das dhfr-Gen und das hph-Gen, wie beschrieben in Beispiel 1.
Das Plasmid pSV-A8L-EDH wurde in Affen-Mieren-Vero-Zellen (ATCC Nr. CCL 81) in einem Verfahren gemäß Graham & van der Eb, supra transfiziert und in einem Selektionsmedium (DMEM, 10%iges fötales Rinderserum, 250 μg/ml Hygromycin) inkubiert und weiter wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Permanente Hygromycin-Phosphotransferase-positive Zellinien wurden in Gegenwart des Antibiotikums Hygromycin B selektiert. Nach fünf Passagen wurde die Integration der Fremd-DMA durch PCR unter Verwendung von Primern demonstriert, die für das 0,5 kb-Segment des A8L-Gens spezifisch waren.
Es werdem Western-Blots verwendet um zu bestimmen, ob das Gen von Interesse, die VETF große Untereinheit, exprimiert wird. Die Zellinien, die die höchsten Niveaus der VETF großen Untereinheit exprimieren, werden weiter durch PCR-Analyse charakterisiert und als komplementierende Zellinie verwendet und V-A8L genannt.
Konstruktion des defekten Virus d-A8L-ZG:
Um das Virus d-A8L-ZG zu konstruieren, wurde das Plasmid pCR-A8Lf-ZG kloniert, wie schematisch in 6 dargestellt. Bereiche (mit Größen zwischen 0,5 kb und 0,7 kb), die den A8L-orf an beiden Seiten flankierten, wurden durch PCR amplifiziert und in das Plasmid pCRII subkloniert, um pCR-A8L-fl bzw. pCR-A8L-fr zu erhalten.
Die PCR-Primer für die Amplifikation des A8L 5'-flankierenden Bereiches waren oA8-8 (5'-AGC GCC GCT ACT AGC ACT CC-3') (SEQ ID NO: 15) und oA8-5 (5'-GAA CGT TAA CAT TTA TAT CGT GGG GTA AAG TGA AAA TC-3') (SEQ ID NO: 16). Die Primer für den A8L 3'-flankierenden Bereich waren oA8-4 (5'-TTG GAG AAC TTG ATA CGC CG-3') (SEQ ID NO: 17) und oA8-6 (5'-CAT ATG CAA TTG TAA ATT AAA CAA CTA AAT CTG TAA ATA AAT A-3') (SEQ ID NO: 18). Der A8L 5'-flankierende Bereich als 0,7 kb NotI-SpeI-Fragment von pCR-A8L-f1 wurde zwischen die Stellen NotI und XbaI direkt stromaufwärts von dem A8L 3'-flankierenden Bereich in pCR-A8L-fr ligiert, was das Plasmid pCR-A8L-flanks ergab.
Um die weiteren Klonierungsprozeduren zu erleichtern, wurde ein synthetischer Linker, enthaltend die seltenen Restriktionsstellen SmaI, NotI, SfiI und RsrII, zwischen die A8L-flankierenden Bereiche in pCR-A8L-flanks ligiert. Die für die Konstruktion des Linkers verwendeten Oligonukleotide waren oA8-11 (5'-AAC GGT CCG GCC CGG GCG GCC GCC-3') (SEQ ID NO: 19) und oA8-12 (5'-AAT TGG CGG CCG CCC GGG CCG GAC CGT T-3') (SEQ ID NO: 20). Das Plasmid pCR-A8L-flanks wurde danach mit MunI und HpaI (beide Stellen werden durch die PCR-Primer oA8-5 bzw. oA8-6 eingeführt) linearisiert. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pdA8L, wurde mit einer 3,9 kb SmaI Doppel-Genkassette von dem Plasmid pLGb, beschrieben in Beispiel 1, ligiert, um pCR-R8Lf-ZG zu ergeben. Bei diesem Konstrukt ist der A8L-orf vollständig deletiert, um die Rettung des defekten Virus durch die komplementierende Zellinie über homologe Rekombination zu verhindern.
Für die Konstruktion des d-A8L-ZG-Virus wurde das Plasmid pCR A8L-ZG in das Vacciniavirus WR inseriert. Das Plasmid pCR-A8Lf-ZG wurde für eine in-vivo-Rekombination in CV-1-Zellen verwendet. Zunächst wurden 5 × 10⁶ CV-1 Zellen mit 0,1 KBE pro Zelle des Vaccinia WR infiziert, 1 Stunde inkubiert, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat transfiziert, gemäß Graham & van der Eb, supra, das 20 μg des Plasmids pCR-A8L-ZG enthielt und 3 Tage gezüchtet.
Dies führte zu einem Rohstamm, enthaltend Wildtyp-Viren (Helfer) und defekte Viren. Um einen reinen Stamm der defekten Viren zu erhalten, wurden Plaque-Assays in V-A8L-Zellen durchgeführt, die in der Lage waren, das defekte Virus zu komplementieren. Der virale Rohstamm wurde hergestellt und verwendet für Plaque-Assays auf V-A8L-Zellen in Gegenwart von gpt-Selektion (Falkner und Moss (1988), supra) und einem Blue-Plaque-Screening (Chakrabarti et al., supra). Die Plaque-Reinigung wird zehnmal wiederholt. Die gereinigten defekten Poxviren werden in großem Umfang gezüchtet und durch Southern-Blot überprüft. Die Abwesenheit von Wildtyp-Virus und Gegenwart der vorhergesagten Banden bestätigt, dass die korrekten defekten Genome gebildet wurden. Plaque-Assays der defekten Viren auf den komplementierenden Zellen und auf Wildtyp-Zellen bestätigen, dass der Wirtsbereich der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie begrenzt ist. Tierstudien bestätigen, dass die defekten Viren nicht pathogen sind.
Beispiel 4:
Konstruktion eines defekten Vacciniavirus, den die kleine Untereinheit des frühen Transkriptionsfaktors (d-D6R-ZG) fehlt und einer komplementierenden Zellinie
Konstruktion einer Helferzellinie, basierend auf Vero-Zellen (V-D6R):
Die kleine Untereinheit des frühen Transkriptionsfaktors VETF ist ein Polypeptid mit einer Größe von 77 kD. Wie in Beispiel 3 beschrieben, enthält VETF eine mögliche ATP-Bindungsstelle und es hat sich erwiesen, dass er an die frühe Promotor-DNA-Sequenz bindet. Broyles und Li, supra. Der D6R-orf wird für eine Komplementierung gewählt, da temperaturempfindliche Mutationen auf dieses Gen kartiert wurden, was ein Element der Definition eines essenziellen Gens ist. Seto et al., Virol. 160: 110–19 (1987).
Die Schritte bei der Konstruktion der Helferzellinie V-D6R sind im wesentlichen identisch zur Konstruktion der Zellinie V-A8L in Beispiel 3. Zunächst wird der D6R-orf in das Plasmid pCRII (InVitrogen, Inc.) durch PCR-vermittelte Techniken kloniert. Das resultierende Plasmid ist die Quelle des D6R-Genfragments für die Konstruktion eines eukaryontischen Expressionsvektors und eines E. coli-Expressionsplasmids. Die Expression des orf in E. coli ermöglicht eine schnelle Produktion des Proteins für eine Immunisierung von Kaninchen, um anti-VETF kleine Untereinheit-Antikörper zu erhalten, die darauffolgend verwendet werden, um das Protein in den permanenten Zellinien zu identifizieren.
Zu diesem Zweck wurde der D6R-orf als 1,9 kb-Fragment durch PCR amplifiziert, unter Verwendung der Primer oD6-1 (5'-CTG CAG AAT GAA TAC CGG AAT TAT AGA TTT-3') (SEQ ID NO: 21) und oD6-2 (5'-CCC GGG TTA TGG AGA AGA TAC CAC GTT-3') (SEQ ID NO: 22) und in pCRII kloniert, was das Plasmid pCR-D6R ergab.
Wie in 7 dargestellt, wurde das E. coli-Expressionsplasmid pRSET-D6R-3' konstruiert durch Ligieren eines 1,6 kb EcoRI-Fragments von pCR-D6R in den Vektor pRSET-B (InVitrogen, Inc.). Das Plasmid pRSET-D6R-3' enthält ein Fusionsgen, kodierend ein N'-terminales 6-Histidin-tag, fusioniert an die VETF kleine Untereinheit, der die ersten 100 Aminosäuren fehlen. Bakterielle Expression, tag-vermittelte Reinigung des rekombinanten Proteins und die Produktion von anti-VETF kleinen Untereinheit-Antikörpern wurden wie in Beispiel 3 durchgeführt. Das Expressionsplasmid pSV-D6R-EDH wurde wie folgt konstruiert: Das 1,9 kb Genfragment D6R-orf wurde von pCR-D6R isoliert, indem das Plasmid mit PstI und SmaI geschnitten wurde und in den Vektor pSVMCS#51 ligiert wurde (Herlitschka, supra) und zwar durch forciertes Klonieren zum Erhalt des Plasmids pSV-D6R. Die Stellen PstI und SmaI wurden durch die PCR-Primer oD6-1 (5'-CTGCAGAATG AATACCGGAA TTATAGATTT-3') (SEQ ID NO: 21) bzw. oD6-2 (5'-CCCGGGTTAT GGAGAAGATA CCACGTT-3') (SEQ ID NO: 22) eingeführt. Die Ligation des EcoRV-ClaI-Genfragments von dem Plasmid pEDH1, umfassend die "EDH-Genkassette" in SmaI-ClaI geschnittenes pSV-D6R ergab das Expressionsplasmid pSV-D6R-EDH. Siehe 8.
In dem Plasmid pSV-D6R-EDH wird der D6R-orf durch den SV40 frühen Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker zum Erhalt der permanenten Zellinien ist ein Fusionsgen mit dem dhfr-Gen und dem hph-Gen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Transfektion und Screeningverfahren für die Konstruktion der komplementierenden Zellinien sind identisch zu denjenigen in Beispiel 3.
Konstruktion des defekten Virus d-D6R-ZG:
Um das Virus d-D6R-ZG zu konstruieren, wurde das Plasmid pCR-D6Rf-ZG kloniert, wie schematisch in 9 dargestellt. Regionen (mit Größen zwischen 0,5 kb und 0,6 kb), flankierend den D6R-orf an beiden Seiten, wurden durch PCR-vermittelte Techniken amplifiziert und in das Plasmid pCRII subkloniert, um pCR-D6R-fl bzw. pCR-D6R-fr zu erhalten. Die PCR-Primer für die Amplifikation des D6R 5'-flankierenden Bereichs sind oD6-3 (5'-TGA GAA GAA TTG CCG TCG-3') (SEQ ID NO: 23) und oD6-5 (5'-GTC GAC GAT ATC TTC TAT AAA TAT ATG AGC-3') (SEQ ID NO: 24). Die Primer für den D6R 3'-flankierenden Bereich sind oD6-4 (5'-TAC AGT ACC CGA ATC TCT AC-3') (SEQ ID NO: 25) und oD6-6 (5'-ACA ATT GGT ATT AAG TAT AAC GAC TCC-3') (SEQ ID NO: 26). Der D6R 5'-flankierende Bereich als 0,6 kb SacI-SpeI-Fragment von pCR-D6R-fl wurde zwischen die Stellen SacI und XbaI direkt stromabwärts zu dem D6R 5'-flankierenden Bereich in pCR-D6R-fl ligiert, was das Plasmid pCR-D6R-flanks ergab. Um die weiteren Klonierungsverfahren zu erleichtern, wurde ein synthetischer Linker, enthaltend die seltenen Restriktionsstellen SmaI, NotI, SfiI und RsrII zwischen die D6R-flankierenden Bereiche in pCR-D6R-flanks ligiert. Die für die Konstruktion des Linkers verwendeten Oligonukleotide sind oA8-11 und oA8-12. Siehe Beispiel 3. Das Plasmid pCR-D6R-flanks wird daher mit SalI linearisiert, mit Klenow-Polymerase behandelt und mit MunI geschnitten (beide Restriktionsstellen werden durch die PCR-Primer oD6-5 bzw. oD6-6 eingeführt). Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pdD6R, wird mit einer 3,9 kb SmaI doppelten Genkassette von dem Plasmid pLGb, beschrieben in Beispiel 1, ligiert, um pCR-D6Rf-ZG zu ergeben. In diesem Konstrukt wird der D6R-orf vollständig deletiert, um die Rettung des defekten Virus durch die komplementierende Zellinie aufgrund homologer Rekombination zu verhindern.
Für die Konstruktion des d-D6R-ZG-Virus wird das Plasmid pCR D6RF-ZG in das Vaccinia-Virus WR inseriert. Das Plasmid pCR-D6Rf-ZG wird für die in-vivo-Rekombination in CV-1-Zellen verwendet. Zunächst werden 5 × 10⁶ CV-1-Zellen mit 0,1 KBE pro Zelle des Vaccinia WR infiziert, es wird 1 Stunde inkubiert, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat (gemäß Graham & van der Eb, supra) transfiziert, enthaltend 20 μg des Plasmids pCR-D6R-ZG und 3 Tage gezüchtet. Dies führt zu einem Rohstamm, enthaltend Wildtyp-Viren (Helfer) und defekte Viren. Um reine Stammlösungen des defekten Virus zu erhalten, werden Plaque-Assays in V-D6R-Zellen durchgeführt, die das defekte Virus komplementieren können. Der virale Rohstamm wird hergestellt und für Plaque-Assays auf V-D6R-Zellen in Gegenwart von gpt-Selektion (Falkner und Moss, supra (1988) und Blue-Plaque-Screening (Chakrabarti et al., supra) verwendet. Die Plaque-Reinigung wird zehnmal wiederholt. Die gereinigten defekten Poxviren werden auf größeren Umfang gezüchtet und durch Southern-Blot überprüft. Die Abwesenheit von Wildtyp-Virus und Gegenwart der vorhergesagten Banden bestätigt, dass die korrekten defekten Genome gebildet wurden. Plaque-Assays der defekten Viren auf den komplementierenden Zellen und auf Wildtyp-Zellen bestätigen, dass der Wirtsbereich der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie begrenzt ist. Tierstudien bestätigen, dass die defekten Viren nicht pathogen sind.
Beispiel 5:
Konstruktion eines defekten Vacciniavirus, dem das J1R-Genprodukt fehlt (d-J1R-ZG) und einer komplementierenden Zellinie
Konstruktion einer Helferzellinie, basierend auf Vero-Zellen (V-J1R):
Der erste Schritt war die Expression des J1R-orf in E. coli (unter Verwendung des InVitrogen pRSET-Vektorsystems). Zunächst wurde das Plasmid pCR-J1R durch Klonieren des J1R-PCR-Produkts konstruiert, erhalten mit den Primern oJ1R-1 (5'-GCCATGGATC ACAACCAGTA TCTCTT-3') (SEQ ID NO: 27) und oJ1R-2 (5'-ACCCGGGTTA ATTAATTATT GTTCACTTTA-3') (SEQ ID NO: 28) in den pCRII-Vektor. Ein NcoI-EcoRI-Fragment wurde dann in pRSET-B inseriert, was den E. coli-Expressionsvektor pRSET-J1R ergab (10). Mit diesem Plasmid wurden große Mengen J1R-Protein erhalten, die bemerkenswerterweise in Kaninchen nicht immunogen waren. Antikörper für die weitere Identifizierung des Proteins in den permanenten Zellinien wurden so gegen ein Konjugat eines synthetischen J1R-Peptids und dem Trägerprotein KLH gezüchtet. Das synthetische Peptid mit der Aminosäuresequenz SLATTAIDPIRYIDP, korrespondierend zu den Aminosäurepositionen 118 bis 132 des J1R-Proteins, wurde an KHL (präaktiviertes KLH von Pierce, USA) gekoppelt. Das gereinigte Konjugat in komplettem Freund's Adjuvans wurde verwendet, um Kaninchen zu immunisieren (100 mg Protein pro Dosis, s.c. und i.m.). Mach einem Monat wurden die Tiere mit derselben Dosis Antigen ausgesetzt und die Entwicklung von Antikörpern wurde durch Western-Blots überwacht.
Die Proteine werden durch die Western-Blots nachgewiesen. Die Western-Blots werden im wesentlichen wie von Towbin et al., supra beschrieben, durchgeführt. Der erste Antikörper ist ein Kaninchen-anti-J1R-Protein-Antikörper, verwendet in 1:100-Verdünnung. Der zweite Antikörper ist ein Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (BioRad, Inc.), verwendet in 1:1.000-Verdünnung. Die Reagenzien (BCIP und NBT) und Färbeprotokolle stammen von Promega, Inc. (USA).
Um das Expressionsplasmid pSV-J1R-EDH (11) für die Transformation in die Vero-Zellen zu erhalten, wurde ein 0,5 kb NcoI-SmaI-Genfragment, kodierend das komplette J1R-Gen, aus dem Plasmid pCR-J1R isoliert. Die NcoI- und SmaI-Stellen wurden durch die PCR-Primer oJ1R-1 bzw. oJ1R-2 (siehe oben) eingeführt. Dieses Fragment wurde in den BbsI geschnittenen Expressionsvektor pSV-Bbs (siehe Beispiel 1) ligiert. Die Insertion eines EcoRV-ClaI-Genfragments von Plasmid pEDH1, umfassend die "EDH-Genkassette" in SmaI-ClaI geschnittenen pSV-J1R ergab pSV-J1R-EDH. Siehe 11. In dem Plasmid pSV-J1R-EDH wurde der J1R-orf durch den SV40 frühen Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker zum Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, beinhaltend das dhfr-Gen und das hph-Gen, wie beschrieben in Beispiel 1.
Das Plasmid pSV-J1R-EDH wurde in Affen-Nieren-Vero-Zellen (ATCC Nr. CCL 81) gemäß einem Verfahren gemäß Graham & van der Eb, supra transfiziert und in Selektivmedium inkubiert (DMEM, 10% fötales Rinderserum, 250 μg/ml Hygromycin) und weiter, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Permanent Hygromycin-Phosphotransferase-positive Zellinien wurden in Gegenwart des Antibiotikums Hygromycin B selektiert. Nach fünf Passagen wurde die Integration der Fremd-DNA durch PCR unter Verwendung von Primern, die für ein 0,5 kb Segment des J1R-Gens spezifisch waren, demonstriert. Western-Blots wurden verwendet um zu bestimmen, ob das Gen von Interesse, das J1R Protein, exprimiert wurde. Die Zellinien, die die höchsten Niveaus des J1R-Proteins exprimierten, werden weiter durch Southern-Blot gekennzeichnet, als komplementierende Zellinie verwendet und V-J1R genannt.
Konstruktion des defekten Virus d-J1R-ZG:
Um das Virus d-J1R-ZG zu konstruieren, wurde das Plasmid pCR-J1Rf-ZG kloniert, wie schematisch in 12 dargestellt. Ein 1,5 kb Genfragment, umfassend den J1R-orf und ungefähr 0,5 kb der flankierenden Sequenzen an beiden Seiten, wurde aus Vacciniavirus (Stamm WR) durch PCR amplifiziert und in das Plasmid pCRII subkloniert, um pCR-J1Rf zu erhalten.
Die PCR-Primer waren oJ1-3 (5'-TCC ACA TCC ATG AGA TTG AAT-3') (SEQ ID NO: 29) und oJ1-4 (5'-CGA TTG ATA CAT ATC ATT ACC-3') (SEQ ID NO: 30). Die Deletion des kompletten J1R-Gens und der ersten 40 Nukleotide des be nachbarten Thymidinkinase-Gens wurde auch durch PCR-vermittelte Techniken durchgeführt. Das vollständige Plasmid pCR-J1Rf, ausschließlich der zu deletierenden Sequenzen, wurde über PCR amplifiziert, was zu einem 6 kb-Produkt führte. Eine Polynukleotid-Kinase-Behandlung und darauffolgende Religierung des PCR-Produkts ergab das Plasmid pCR-J1R-flanks. Die Primer oJ1-5 (5'-AACAATTGCA TCATCTGCGA AGAACATCG-3') (SEQ ID NO: 31) und oJ1-6 (5'-CAGTTAACTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT-3') (SEQ ID NO: 32), die für diese Reaktion verwendet wurden, führen die Restriktionsstellen MunI und HpaI ein. Das Plasmid wurde an diesen Stellen gespalten und der Linker (oA8-11 und OA8-12, wie in Beispiel 3 beschrieben) wurde inseriert, um pdJ1R zu erhalten. Analog zu Beispiel 3 wurde eine lacZ-gpt-Doppelmarker-Kassette in die SmaI-Stelle von pdJ1R ligiert, was zu dem Rekombinationsvektor pCR-J1Rf-ZG führte. (Dieses Plasmid enthält nur 40 Basenpaare des J1R-Gens, am 5'-Terminus, die notwendig sind für die Integrität des benachbarten L5R-orf im defekten Virus.)
Für die Konstruktion des d-J1R-ZG-Virus wurde das Plasmid pCR-J1R-ZG in das Vacciniavirus WR inseriert. Das Plasmid pCR-J1Rf-ZG wurde für eine in-vivo-Rekombination in CV-1-Zellen verwendet. Zunächst wurden 5 × 10⁶ CV-1-Zellen mit 0,1 KBE pro Zeile Vaccinia WR infiziert; 1 Stunde inkubiert, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat (gemäß Graham & van der Eb, supra) transfiziert, enthaltend 20 μg des Plasmid pCR-J1R-ZG und 3 Tage gezüchtet.
Dieses Verfahren führte zu einem Rohstamm, enthaltend Wildtyp (Helfer-Viren) und defekte Viren. Um die reinen Stämme des defekten Virus zu erhalten, wurden Plaque-Assays in den V-J1R-Zellen durchgeführt, die in der Lage sind, das defekte Virus zu komplementieren. Die virale Rohstammlösung wurde hergestellt und für Plaque-Assays auf V-J1R-Zellen in Gegenwart einer gpt-Selektion (Falkner und Moss (1988), supra) und eines Blue-Plaque-Screening (Chakrabarti et al., supra) verwendet, alternierend mit Plaque-Assays auf tk-negativen V-J1R-Zellen in Gegenwart von BUdR (Mackett et al., supra). Die Plaque-Reinigung wird zehnmal wiederholt. Die gereinigten defekten Poxviren werden auf einen größeren Umfang angezüchtet und durch Southern-Blot überprüft. Die Abwesenheit von Wildtyp-Virus und Gegenwart der vorhergesagten Banden bestätigt, dass sich die korrekten defekten Genome gebildet haben. Plaque-Assays der defekten Viren auf dem komplementierenden Zellen und auf Wildtyp-Zellen bestätigen, dass der Wirtsbereich der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie begrenzt ist. Tierstudien bestätigen, dass die defekten Viren nicht pathogen sind.
Beispiel 6:
Konstruktion eines defekten Vacciniavirus, dem das H4L-Genprodukt fehlt (d-H4L-ZG) und einer komplementierenden Zellinie
Der H4L-orf wird für die Komplementierung gewählt, da konditional lethale temperaturempfindliche Mutationen auf dieses Gen kartiert wurden. Seto et al., supra.
Die Schritte bei der Konstruktion der Helferzellinie V-H4L sind im wesentlichen identisch zu der Konstruktion der Zellinie V-A8L bei Beispiel 3. Zunächst wurde der H4L-orf in das Plasmid pCRII (InVitrogen, Inc.) durch PCR-vermittelte Techniken kloniert. Das resultierende Plasmid ist die Quelle des H4L-Genfragments für die Konstruktion des Vero-Zell-Expressionsvektors pSV-H4L-EDH, wie dargestellt in 13. Antikörper zur Identifizierung des H4L-Genprodukts (RAP94) in den permanenten Zellinien werden gegen ein KLH-Konjugat eines synthetischen Peptids gezüchtet. Das Konjugat wurde durch Verbindung des synthetischen Peptids KIYKNSFSEDHNNSLD, korrespondierend zu den Aminosäurepositionen 242 bis 258 im H4L-orf, Kane und Shuman, J. Virol. 66: 5752–62 (1992), an aktiviertes KLH (KLH coupling Kit, Pierce Inc., USA), hergestellt. Dieses Konjugat wurde für die Produktion von Anti-H4L-Antikörpern analog zu Beispiel 5 verwendet.
Für die Konstruktion des Vero-Zell-Expressionsvektors wurde der H4L-orf als 2,4 kb-Fragment durch PCR unter Verwendung der Primer oH4-1 (5'-ACC ATG GAC TCT AAA GAG ACT AT-3') (SEQ ID NO: 33) und oH4-2 (5'-CAA TTG CCC GGG TTA ATT AAT GAA ATT AAT CAT ATA CAA CTC-3') (SEQ ID NO: 34) amplifiziert und in pCRII kloniert, was zu dem Plasmid pCR-H4L führte. Das Expressionsplasmid pSV-H4L-EDH wurde wie folgt konstruiert: Der H4L-orf wurde als 2,4 kb Genfragment aus pCR-H4L isoliert, indem das Plasmid mit NcoI und SmaI geschnitten und in den Vektor pSV-Bbs ligiert wurde (siehe Beispiel 1) und zwar durch forciertes Klonieren, um das Plasmid pSV-H4L zu erhalten. Die Stellen NcoI und SmaI wurden durch die PCR-Primer oH4-1 bzw. oH4-2 eingeführt. Die Ligation eines EcoRV-SalI-Genfragments von dem Plasmid pEDH1, umfassend die "EDH-Genkassette" in SmaI-SalI geschnittenes pSV-H4L ergab das Expressionsplasmid pSV-H4L-EDH. Siehe 13.
In dem Plasmid pSV-H4L-EDH wird der H4L-orf durch den SV40 frühen Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker zum Erhalt der permanenten Zellinien ist ein Fusionsgen, beinhaltend das dhfr-Gen und das hph-Gen, wie beschrieben in Beispiel 1. Die Transfektion und die Screening-Verfahren für die Konstruktion der komplementierenden Zellinie wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, außer dass H4L-spezifische Reagenzien verwendet wurden.
Konstruktion des defekten Virus d-H4L-ZG:
Um das Virus d-H4L-ZG zu konstruieren, wurde das Plasmid pCR-H4Lf-ZG, wie in 14 schematisch dargestellt, kloniert. Bereiche (mit Größen zwischen 0,5 kb und 0,6 kb), die den H4L-orf an beiden Seiten flankieren, wurden durch PCR-vermittelte Techniken amplifiziert und in das Plasmid pCRII subkloniert, um pCR-H4L-fl bzw. pCR-H4L-fr zu erhalten.
Die PCR-Primer für die Amplifikation des H4L 5'-flankierenden Bereichs sind oH4-3 (5'-CCT TTA GGT CAG AA GAT CGC-3') (SEQ ID NO: 35) und oH4-5 (5'-GTC GAC AAT TGT TAA AG TAC AAA CAA CTA GGA-3') (SEQ ID NO: 36). Die Primer für den H4L 3'-flankierenden Bereich sind oH4-4 (5'-GCT AAC ATC ATA CCC TCC TG-3') (SEQ ID NO: 37) und oH4-6 (5'-GTC GAC GTT AAC AGA AGC ATT GGA ATA CGC AT-3') (SEQ ID NO: 38). Der H4L 3'-flankierende Bereich wurde als 0,5 kb SalI-SpeI-Fragment von pCR-H4L-fr zwischen die SalI- und XbaI-Stellen direkt stromabwärts zum H4L 5'-flankierenden Bereich in pCR-D6R-fl ligiert, was das Plasmid pCR-H4L-flanks ergab.
Um die weiteren Klonierungsverfahren zu erleichtern, wurde ein synthetischer Linker, enthaltend die seltenen Restriktionsstellen SmaI, NotI, SfiI und RsrII zwischen die H4L-flankierenden Bereiche in pCR-H4L-flanks ligiert. Die für die Konstruktion des Linkers verwendeten Oligonukleotide sind oA8-11 und oA8-12. Das Plasmid pCR-H4L-flanks wurde danach mit MunI und HpaI linearisiert (beide Stellen werden durch die PCR-Primer oH4-5 bzw. oH4-6 eingeführt). Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pdH4L, wurde mit einer 3,9 kb SmaI-Doppel-Genkassette von dem Plasmid pLGb, wie beschrieben in Beispiel 1 ligiert, um pCR-H4Lf-ZG zu ergeben. In diesem Konstrukt ist der H4L-orf vollständig deletiert, um eine Rettung des defekten Virus durch die komplementierende Zellinie aufgrund einer homologen Rekombination zu verhindern.
Die Konstruktion des d-H4L-ZG-Virus durch in-vivo-Rekombination und Plaque-Reinigung wird gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Schema durchgeführt.
Beispiel 7:
Konstruktion einer komplementierenden Zellinie mit Hitzeschock-induzierbarer I7L-Funktion
Die Wirkung des Vaccinia-Wirts-Protein-shut-off variiert von Zelltyp zu Zelltyp, was die Wirksamkeit der Komplementierung beeinflusst und so die Menge von notwendigen Plaque-Reinigungen bestimmt, um reine Stämme von de fektem Virus zu erhalten und die mit den Wirtszellinien erhältlichen Titer. Um die Komplementierung effizienter zu gestalten, wird der essenzielle offene Leserahmen, kodierend die komplementierende Funktion, stromabwärts zum Promotor des 70 kd humanen Hitzeschock-Protein (Hsp70) -Gens (Hunt & Morimoto, supra) kloniert. Die Transkription des Hsp70-Gens wird durch Vaccinia-Infektion induziert und es wurde vorgeschlagen, dass Hsp70 an der Anordnung des Vaccinia-Virions beteiligt ist (Jindal und Young, supra).
Der erste Schritt die ist Klonierung des Hsp70-Promotors durch PCR-Verfahren. Die Oligonukleotide oHS-1, 5'-TACGTATGGA GACCAACACC CTTCC-3' (SEQ ID NO: 39) und oHS-2, 5'-CCATGGATAT CGGGTTCCCT GCTCTCTGTC GG-3' (SEQ ID NO: 40) wurden zusammen mit menschlicher DNA (Clontech, Inc.) als Matrize verwendet, um die menschlichen Hsp70-Promotorsequenzen zu erhalten. Das PCR-Produkt wird in den pCRII-Vektor (InVitrogen, Inc.) kloniert, was das Plasmid pCR Hsp ergibt. Das SnaBI-NcoI-Promotorfragment wird verwendet, um den SV40-Promotor in dem Plasmid pSV-Bbs zu substituieren (siehe Beispiel 1), was nach Entfernung des in diesem Plasmid vorliegenden SV40-Introns zu dem Plasmid pHS führt. Dieser Vektor wird verwendet, um offene Leserahmen, wie z.B. I7L zu inserieren, durch Ligation des NcoI-SmaI-Fragments von pSV-I7L (Beispiel 1) mit pHS, was das Plasmid pHS-I7L ergibt. Siehe 15.
Um die komplementierende Zellinie zu konstruieren, wird das Co-Transformationsverfahren (Wigler, supra) durchgeführt. Ein geeigneter Selektionsmarker, wie z.B. das Neomycin-Resistenzgen, das auf dem Plasmid pSV2-neo vorliegt (Southern, P. J. und Berg, P., J. Mol. Appl. Genet. 1: 327 (1982)) wird zusammen mit dem Plasmid pHS-I7L in einem Transfektionsexperiment in Vero-Zellen verwendet. Die Zellen werden gemäß Graham und van der Eb, supra transfiziert und in einem Selektivmedium einschließlich dem Antibiotikum G418 (DMEM, 10% fötales Rinderserum, 500 μg/ml G-418) inkubiert. Nach 10 bis 14 Tagen werden die Kolonien sichtbar. Diese Kolonien werden expandiert, zweimal subkloniert und dann weiter gekennzeichnet. Die Zellinien werden weiter durch PCR-Analyse im Hinblick auf die Gegenwart des komplementierenden Genkonstrukts charakterisiert. Western-Blots werden verwendet, um zu zeigen, dass das Gen von Interesse, das I7L-Protein, bei Induktion exprimiert wird. Die endgültige komplementierende Zellinie wird VHsp-I7L genannt. Die Zellinie ist, wie in Beispiel 1 beschrieben, gekennzeichnet. Die Konstruktion von defektem Virus d-I7L-ZG/Hsp wird, wie in Beispiel 1 für das Virus d-I7L-ZG beschrieben, durchgeführt, außer dass die Zellinie VHsp-I7L für die Komplementierung verwendet wird und dass nur fünf Runden einer Plaque-Reinigung durchgeführt werden, um das defekte Virus zu erhalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Defekter Pockenvirus, dem eine Eigenschaft fehlt, die ihm durch einen wesentlichen Bereich seines Elternpockenvirus verliehen wird, wobei der wesentliche Bereich ein Bereich des Pockenvirusgenoms ist, der für die Lebensfähigkeit und Infektiosität des Elternpockenvirus erforderlich ist, wobei der defekte Pockenvirus ein fremdes Polynukleotid umfaßt, das unter der transkriptionalen Kontrolle eines Pockenviruspromoters steht.
Defekter Pockenvirus nach Anspruch 1, wobei das fremde Polynukleotid in den wesentlichen Bereich eingeführt wird.
Defekter Pockenvirus nach Anspruch 2, wobei der wesentliche Bereich aus dem defekten Pockenvirus deletiert wurde.
Defekter Pockenvirus nach Anspruch 3, wobei ein Marker den wesentlichen Bereich ersetzt.
Defekter Pockenvirus nach Anspruch 4, wobei das fremde Polynukleotid in diesen Marker eingeführt wird.
Defekter Pockenvirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, wobei der Elternpockenvirus Vaccina ist.
Defekter Pockenvirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, wobei der wesentliche Bereich ein offener Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus I7L, F18R, D13L, D6R, A8L, J1R, J3R, H4L, A10L und A3L, ist.
Defekter Pockenvirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, wobei der wesentliche Bereich ein offener Leserahmen ist, der das 14 kD Hüllprotein oder das 25 kD Strukturprotein kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend den Schritt des Bereitstellens eines defekten Pockenvirus, dem eine Eigenschaft fehlt, die ihm durch einen wesentlichen Bereich seines Elternpockenvirus verliehen wird, wobei der wesentliche Bereich ein Bereich des Pockenvirusgenoms ist, der für die Lebensfähigkeit und Infektiosität des Elternpockenvirus erforderlich ist, wobei der defekte Pockenvirus ein fremdes Polynukleotid umfaßt, das unter der transkriptionalen Kontrolle eines Pockenviruspromoters steht.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Bereitstellens durch Einführen des fremden Polynukleotids in den wesentlichen Bereich des Elternpockenvirus vervollständigt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Bereitstellens durch Austauschen des wesentlichen Bereichs des Elternpockenvirus mit dem fremden Polynukleotid vervollständigt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt des Bereitstellens durch Austauschen des wesentlichen Bereichs des Elternpockenvirus mit einem Marker vervollständigt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polynukleotid in den Marker eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polynukleotid den Marker ersetzt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 14, wobei der Marker gpt ist.
Impfstoff, umfassend einen defekten Pockenvirus, dem eine Eigenschaft fehlt, die ihm durch einen wesentlichen Bereich seines Elternpockenvirus verliehen wird, wobei der wesentliche Bereich ein Bereich des Pockenvirusgenoms ist, der für die Lebensfähigkeit und Infektiosität des Elternpockenvirus erforderlich ist, wobei der defekte Pockenvirus ein fremdes Polynukleotid umfaßt, das unter der transkriptionalen Kontrolle eines Pockenviruspromoters steht.
Impfstoff nach Anspruch 16, wobei der Elternpockenvirus Vaccina ist.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, umfassend den Schritt des Bereitstellens eines defekten Pockenvirus, dem eine Eigenschaft fehlt, die ihm durch einen wesentlichen Bereich seines Elternpockenvirus verliehen wird, wobei der wesentliche Bereich ein Bereich des Pockenvirusgenoms ist, der für die Lebensfähigkeit und Infektiosität des Elternpockenvirus erforderlich ist, wobei der defekte Pockenvirus ein fremdes Polynukleotid umfaßt, das unter der transkriptionalen Kontrolle eines Pockenviruspromoters steht.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß Ansprüchen 16 und 17, wobei der Elternpockenvirus Vaccina ist.
Verwendung eines defekten Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Impfstoffs.