CN109402061B - 一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及其制备方法和应用。本发明保护一种重组多能干细胞，其制备方法包括如下步骤：将多能干细胞的基因组进行如下两个突变：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子。本发明还保护用所述重组多能干细胞制备获得的重组间充质干细胞。本发明还保护重组细胞在制备产品中的应用；所述产品为用于细胞移植治疗的产品。本发明同时解决了细胞移植治疗中有效性与安全性两大关键和瓶颈性难题，对于细胞移植治疗领域具有重大的应用推广价值。

Description

一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及 其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

细胞移植治疗是近年来再生医学领域最具前景和潜力的发展方向，是将特定细胞移植入体内病灶部位，促进组织再生达到治愈疾病的方法。干细胞由于具有自我更新能力和多能性，既可以通过细胞增殖维持自身数目稳定，也可以分化为其他细胞用于组织修复，成为细胞治疗中的首选材料。尽管细胞移植治疗已经在诸如骨髓干细胞移植治疗白血病等方面表达出极佳的治疗效果，但其更广泛的应用仍面临许多问题的挑战。目前，限制细胞移植治疗的主要因素集中在有效性和安全性两方面。

细胞移植治疗的有效性主要体现在移植物移植前的质量及进入体内后能否存活整合并发挥再生功能。一方面，移植物在体外培养过程中存在一定的“寿命”，具体表现为持续受到复制压力影响，有限的连续传代后迅速进入细胞老化(cellular senescence)状态，停止增殖且失去功能，进而影响分化能力，影响治疗效果。另一方面，细胞移植的部位普遍位于疾病或衰老的组织微环境中，其中的炎性因子、有害代谢产物等会损害外源移植物。以上两方面都会导致细胞发生严重的功能性衰退，导致移植效率低下。细胞移植治疗的安全性主要集中在长期移植后的致瘤风险。细胞移植物在病体中持续受到压力胁迫，基因组可能变得极不稳定，若在癌基因或抑癌基因上发生突变，可能演变为癌症，形成安全隐患。

如何通过特定的干预手段提高细胞移植治疗的效率，尽可能的降低致瘤风险一直以来都是再生医学能够广泛应用的决定性问题。然而，迄今为止尚未发展出简单有效的方法克服这一技术瓶颈。当前提高细胞移植效果的尝试主要集中在改善移植部位微环境和增强移植物“抗逆”特性两方面。许多研究通过在不利细胞发挥正常功能的病体微环境中补充外源“营养及保护因子”的方式来改善移植效果，但该方法仅能在短期内改善移植环境，移植复发等不良预后问题突出。与此相比，通过特定方法改善移植物的“内因”，即增强移植材料自身固有的抵抗逆境能力来实现移植效果的改善是更为直接和长效的手段。目前已有少数研究表明可以利用慢病毒或逆转录病毒载体导入抗逆相关蛋白，调控细胞内特定的信号通路或基因表达，增强细胞对逆境的抵抗，进而实现细胞移植治疗效果的提升。尽管一系列临床前研究证明了提高细胞固有抗逆特性的可行性，但整合型病毒载体介导的基因调控必然存在基因组的随机整合，基因突变风险加大，安全性堪忧，这大大削弱了其在临床上的应用价值。

基因靶向编辑技术的发展极大的推动了细胞移植治疗的进步。这一技术使得人们可以精确的编辑基因组上的遗传密码，目前已有大量利用基因靶向编辑技术矫正疾病细胞致病突变的案例被报道。恢复正常功能的基因矫正细胞经体外扩增可以用于自体移植，是细胞移植治疗中绝佳的材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及其制备方法和应用。

本发明保护一种重组间充质干细胞(FOXO3基因增强型的间充质干细胞，FOXO3^{2SA /2SA}MSC细胞)，其基因组中具有编码序列表的序列2所示蛋白质的基因。所述重组间充质干细胞基因组中不具有编码序列表的序列4所示蛋白质的基因。所述重组间充质干细胞具体可为发明内容的下述方法制备得到的重组间充质干细胞。

本发明还保护一种重组多能干细胞(FOXO3基因增强型的多能干细胞；FOXO3^{2SA/ 2SA}hESC细胞)，其基因组中具有编码序列表的序列2所示蛋白质的基因。所述重组多能干细胞基因组中不具有编码序列表的序列4所示蛋白质的基因。所述重组多能干细胞具体可为发明内容的下述方法制备得到的重组多能干细胞。

本发明还保护重组细胞在制备产品中的应用；所述产品为用于细胞移植治疗的产品；所述重组细胞为所述重组间充质干细胞或所述重组多能干细胞。所述治疗具体可为免疫缺陷疾病的治疗。所述治疗具体可为免疫缺陷者疾病的治疗。所述治疗具体可为后肢缺血的治疗。所述治疗具体可为免疫缺陷者的后肢缺血的治疗。所述重组细胞在细胞移植治疗中作为移植细胞。

本发明还保护一种制备重组多能干细胞的方法，包括如下步骤：将多能干细胞的基因组进行如下两个突变(且均为基因纯合型突变)，得到重组多能干细胞：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子。

将多能干细胞的基因组进行如下两个突变(且均为基因纯合型突变)，得到重组多能干细胞：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子(tcc)突变为了编码丙氨酸的密码子(gcc)，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子(tct)突变为了编码丙氨酸的密码子(gct)。

所述多能干细胞为人胚胎干细胞。所述多能干细胞为商业化的人胚胎干细胞系。所述人胚胎干细胞为H9细胞系。

所述FOXO3蛋白具体可如序列表的序列4所示。

本发明还保护一种制备重组间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

(1)将多能干细胞的基因组进行如下两个突变(且均为基因纯合型突变)，得到重组多能干细胞：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子；

(2)用步骤(1)得到的重组多能干细胞制备获得重组间充质干细胞。

将多能干细胞的基因组进行如下两个突变(且均为基因纯合型突变)，得到重组多能干细胞：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子(tcc)突变为了编码丙氨酸的密码子(gcc)，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子(tct)突变为了编码丙氨酸的密码子(gct)。

用重组多能干细胞制备获得重组间充质干细胞的方法，具体包括如下步骤：。

(1)将重组多能干细胞进行拟胚体分化，得到拟胚体；

(2)将步骤(1)获得的拟胚体进行培养，至纤维状细胞出现；

(3)完成步骤(2)后，收集细胞，传代并培养；

(4)完成步骤(3)后，分选CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞，即为重组间充质干细胞。

以上任一所述方法制备得到的重组多能干细胞或以上任一所述方法制备得到的重组间充质干细胞均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种蛋白质，如序列表的序列2所示。

本发明还保护一种DNA分子，如序列表的序列3所示。

本发明提供的人间充质干细胞突变体，能够抵抗逆境及细胞衰老，具有更佳的组织修复功能以及抵抗恶性成瘤转化的能力。本发明同时解决了细胞移植治疗中有效性与安全性两大关键和瓶颈性难题，对于细胞移植治疗领域具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为实施例1中的形态鉴定结果。

图2为实施例1中多能干性基因的表达水平检测的结果。

图3为实施例2中FOXO3转录活性的结果。

图4为实施例2中核内定位的结果。

图5为实施例2中外源刺激下的细胞活力的结果。

图6为实施例2中生长能力测定的结果。

图7为实施例2中SA--Gal染色的结果。

图8为实施例2中有害代谢物含量检测的结果。

图9为实施例2中增殖能力检测的结果。

图10为实施例2中细胞核结构完整性检测的结果。

图11为实施例2中的流程示意图。

图12为实施例2中非锚定依赖生长能力的结果。

图13为实施例3中将细胞移植到小鼠的胫骨前肌的结果。

图14为实施例3中将细胞移植到后肢缺血的免疫缺陷小鼠肌肉的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，细胞培养环境均为37℃、5％CO₂。

btu为bgal-transducing units的缩写。参见文献“An HSV amplicon-basedhelper system for helper-dependent adenoviral vectors.Shuji Kubo,etal.BBRC.2003.307(4):826-830。”

辅助腺病毒载体pAMHDAdGT8-4(Addgene#26421)，简称pAMHDAdGT8-4载体：Addgene，货号26421，https://www.addgene.org/26421/。

转染人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞，简称116细胞。参考文献：Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.PalmerD.and Ng P.Molecular Therapy.2003.8(5):846-52.。

辅助腺病毒AdHPBGF35，简称病毒AdHPBGF35。参考文献：Genome Size andStructure Determine Efficiency of Postinternalization Steps and Gene Transferof Capsid-Modified Adenovirus Vectors in a Cell-Type-Specific Manner.DmitryM.Shayakhmetov,et al.,Journal of Virology.2004.78(18):10009-10022.。参考文献：Yang J,Li J,Suzuki K,et al.Genetic enhancement in cultured human adult stemcells conferred by a single nucleotide recoding[J].Cell Research,2017,27(9):1178-1181.。

人胚胎干细胞H9细胞系，简称H9细胞，WiCell公司产品，货号WA09(H9)-DL-7。

逆转录病毒载体及包装质粒均为Addgene产品：pBABE-neo-hTERT(#1774)，pBABE-zeo-large T genomic(#1778)，pBABE-puro-HRAS V12(#1768)，gag/pol(#14887)，VSV-G(#8454)。

P53敲低的慢病毒载体质粒PLVTHM-shP53，参考文献：Yang J,Li J,Suzuki K,etal.Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by asingle nucleotide recoding[J].Cell Research,2017,27(9):1178-1181.；即文献中“For generating lentiviral vectors encoding shRNA targeting P53,shRNA oligos13,18were cloned into the pLVTHM/GFP vector(12247,Addgene)pre-cleaved by ClaIand MluI”。

间充质干细胞培养基(hMSC培养基)：由MEM培养基(Invitrogen，12571071)、胎牛血清(Invitrogen，10091148)、青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)和重组人成纤维细胞生长因子(JPC，bFGF)组成；MEM培养基和胎牛血清的体积配比为90:10；培养基中，青霉素/链霉素的浓度为1g/100ml；培养基中，重组人成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml。

间充质干细胞分化培养基：由MEM培养基(Invitrogen，12571071)、胎牛血清(Invitrogen，10091148)、青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)、重组人成纤维细胞生长因子(JPC，bFGF)和TGF-β(Humanzyme，HZ1131)组成；MEM培养基和胎牛血清的体积配比为90:10；培养基中，青霉素/链霉素的浓度为1g/100ml；培养基中，重组人成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml；培养基中，TGF-β的浓度为5ng/ml。

如无特殊说明，实施例中的超高速离心参数均为19200rpm、2.5小时。

实施例1、FOXO3增强型多能干细胞的制备

一、构建重组质粒

将序列表的序列1所示的DNA分子插入pAMHDAdGT8-4载体的SalI和SpeI酶切位点之间，得到重组质粒。

二、制备重组腺病毒

1、取步骤一得到的重组质粒，用PI-SceI进行酶切，得到线性化质粒。

2、将步骤1得到的线性化质粒和病毒AdHPBGF35共同导入116细胞，进行重组腺病毒包装，然后通过超高速离心，获得重组腺病毒颗粒。

3、重组腺病毒颗粒感染目的细胞

用步骤2得到的重组腺病毒颗粒感染H9细胞(1×10⁷个细胞：15btu病毒)，感染后第2-4天，加入G418(25～400g/ml，invitrogen公司产品)进行阳性筛选，感染后第10-13天，加入4μM Ganciclovir(GANC,invitrogen公司产品)进行阴性筛选，筛选掉没有正确整合的细胞，最后对存活下来的细胞进行测序鉴定(PCR引物为FOXO3^2SA/2SAseqF：GATTTACTATATCATCTGGGTGCTC和FOXO3^2SA/2SAseqR：TCCAGCAGGTCGTCCA，测序引物为GATTTACTATATCATCTGGGTGCTC)，得到FOXO3等位基因上位点正确编辑的细胞，向细胞中瞬时转入质粒pCAG-Flpo-2A-puro以实现G418抗性基因的去除，得到FOXO3^2SA/+hESC细胞。

4、用步骤2得到的重组腺病毒颗粒感染FOXO3^2SA/+hESC细胞(1×10⁷个细胞：15btu病毒)，感染后第2-4天，加入G418(25～400g/ml，invitrogen公司产品)进行阳性筛选，感染后第10-13天，加入4μM Ganciclovir(GANC,invitrogen公司产品)进行阴性筛选，筛选掉没有正确整合的细胞，最后对存活下来的细胞进行测序鉴定(PCR引物为FOXO3^2SA/2SAseqF：GATTTACTATATCATCTGGGTGCTC和FOXO3^2SA/2SAseqR：TCCAGCAGGTCGTCCA，测序引物为GATTTACTATATCATCTGGGTGCTC)，得到FOXO3等位基因上位点正确编辑的细胞，向细胞中瞬时转入质粒pCAG-Flpo-2A-puro以实现G418抗性基因的去除，得到FOXO3^2SA/2SA hESC细胞。FOXO3^2SA/2SA hESC细胞即FOXO3增强型多能干细胞。

全基因组测序结果表明，与H9细胞相比，FOXO3^2SA/2SA hESC细胞的差异仅在于基因组中发生了两个突变(且均为基因纯合型突变)：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子(tcc)突变为了编码丙氨酸的密码子(gcc)，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子(tct)突变为了编码丙氨酸的密码子(gct)。突变后基因编码的蛋白质如序列表的序列2所示，其编码框如序列表的序列3所示。

H9细胞中，FOXO3蛋白如序列表的序列4所示，其编码框如序列表的序列5所示。

二、FOXO3增强型多能干细胞的鉴定

H9细胞用FOXO3^+/+hESC表示。FOXO3增强型多能干细胞用FOXO3^2SA/2SAhESC表示。

1、形态鉴定

形态鉴定结果见图1。与H9细胞一样，FOXO3增强型多能干细胞依然具有在体内分化为内中外三胚层细胞的能力。

2、多能干性基因的表达水平检测

对细胞中多能干性基因(OCT4、SOX2、NANOG)表达的蛋白质的水平进行免疫荧光检测。用于免疫荧光鉴定的抗体如下：anti-NANOG(Abcam,ab21624)、anti-OCT4(Santa Cruz，sc5279)、anti-SOX2(Santa cruz，sc17320)。

结果见图2。H9细胞和FOXO3增强型多能干细胞均正常表达多能干性基因(OCT4、SOX2、NANOG)。

实施例2、FOXO3增强型间充质干细胞的制备及其功能检测

一、FOXO3增强型间充质干细胞的制备

1、将实施例1获得的FOXO3^2SA/2SA hESC细胞进行拟胚体分化，得到拟胚体(EB)。

2、将步骤1获得的拟胚体接种于基质胶(matrigel)包被的6孔板中进行培养(采用间充质干细胞分化培养基)，至纤维状细胞出现(约2周)。

3、完成步骤2后，收集细胞，进行胰酶消化，然后接种至新的间充质干细胞分化培养基，培养2周。

4、完成步骤3后，采用流式细胞术分选CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞，即为FOXO3增强型间充质干细胞，又称FOXO3^2SA/2SA MSC细胞。

二、对照间充质干细胞的制备

用H9细胞代替FOXO3^2SA/2SA hESC细胞，按照步骤一进行，得到对照间充质干细胞，又称FOXO3^+/+MSC细胞。

三、表型鉴定及功能检测

1、表型鉴定

荧光素FITC标记的抗人细胞表面识别分子CD90抗体，BD Biosciences，货号：555595。荧光素PE标记的抗人细胞表面识别分子CD73抗体，BD Biosciences，货号：550257。荧光素APC标记的抗人细胞表面识别分子CD105抗体，BD Biosciences，货号：17-1057-42。荧光素APC标记同型对照抗体，BD Biosciences，货号：555751。荧光素PE标记同型对照抗体，BD Biosciences，货号：555749。荧光素FITC标记同型对照抗体，BD Biosciences，货号：555742。

对细胞表面标记物进行检测。FOXO3^2SA/2SA MSC细胞和FOXO3^+/+MSC细胞均能够表达MSC特异的表面标记物CD73、CD90和CD105，而不表达无关的CD34、CD43和CD45。

2、FOXO3增强型间充质干细胞中抗逆基因FOXO3的主动激活

(1)FOXO3转录活性

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞和FOXO3^+/+MSC细胞为供试细胞。

FHRE-Luc质粒为市售的FOXO3转录活性报告质粒(Addgene，#1789)。

记载Renilla载体的参考文献：Wang S,Hu B,Ding Z,et al.ATF6safeguardsorganelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells[J].Cell Discov,2018,4(1).。

采用Lipofectamine 3000试剂盒(Invitrogen)向供试细胞中共转染FHRE-Luc质粒和Renilla载体(2×10⁵个细胞：0.2μg：FHRE-Luc载体：0.2μg：Renilla载体)，培养48小时，然后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(威格拉斯，T002)裂解细胞，通过生物发光法检测细胞内FOXO3转录活性。

结果见图3。图3中，左侧柱形对应FOXO3^+/+MSC细胞，右侧柱形对应FOXO3^2SA/2SA MSC细胞。结果表明，FOXO3^2SA/2SA MSC细胞中FOXO3转录活性明显高于FOXO3^+/+MSC细胞。

(2)核内定位

抗人FOXA2抗体，Cell Signaling Technology，货号：8186S。抗人Lamin B1抗体，Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-6217。

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞和FOXO3^+/+MSC细胞为供试细胞。

取供试细胞，使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天，P0028)分别提取胞质及核质组分蛋白，然后取等量蛋白分别进行Western blot(以胞质标记物β-tubulin和核质标记物Lamin B1为参照)，分别检测胞质及核质中FOXO3蛋白含量。

结果见图4。FOXO3^2SA/2SA MSC中FOXO3蛋白发生明显入核，具体表现为FOXO3^2SA/2SAMSC细胞核质中的FOXO3蛋白高于FOXO3^+/+MSC细胞，FOXO3^2SA/2SA MSC细胞胞质中的FOXO3蛋白略低于FOXO3^+/+MSC细胞。

3、抗逆抗细胞衰老特性

(1)外源刺激下的高细胞活力

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞和FOXO3^+/+MSC细胞为供试细胞。

具体步骤如下：将供试细胞铺于6孔板上，使用500μM过氧化氢刺激供试细胞24小时，刺激结束后采用Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒(威格拉斯，A002)试剂盒细胞的凋亡情况。设置不进行过氧化氢刺激的平行对照。

结果见图5。在过氧化氢刺激下，FOXO3^2SA/2SA MSC细胞均具有更强的细胞活力。

(2)生长能力测定

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞和FOXO3^+/+MSC细胞为供试细胞。

利用细胞计数统计连续传代培养的供试细胞的生长能力。

结果见图6。FOXO3^2SA/2SA MSC细胞倍增速率明显高于FOXO3^+/+MSC细胞，表现出明显的抵抗细胞衰老的能力。

(3)SA--Gal染色

β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-beta-Gal(senescence-associatedbeta-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞的传代细胞和FOXO3^+/+MSC细胞的传代细胞为供试细胞。

早代细胞为传至第3代的细胞。晚代细胞为传至第9代的细胞。

对供试细胞进行SA--Gal染色，然后拍照并统计SA--Gal阳性细胞比例。

结果见图7。图7中，左侧为晚代细胞染色后的照片，右侧为早代细胞和晚代细胞中染色阳性细胞的比率。FOXO3^+/+MSC细胞的晚代细胞大量显示蓝色，而FOXO3^2SA/2SA MSC细胞的晚代细胞基本不显示蓝色。可见，FOXO3^2SA/2SA MSC细胞的衰老进程延缓。

(4)有害代谢物含量检测

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞传至第7代的细胞和FOXO3^+/+MSC细胞传至第7代的细胞为供试细胞。

供试细胞与氧自由基探针H2DCFDA(Invitrogen，货号：C6827；工作浓度为1M)共同孵育30分钟，利用流式细胞仪检测H2DCFDA强度(体现细胞内活性氧含量)。

结果见图8。FOXO3^2SA/2SA MSC细胞传至第7代的细胞中积累更少的活性氧，表明FOXO3^2SA/2SA MSC细胞传至第7代的细胞能够更有效的清除此有害代谢物。

(5)增殖能力检测

抗人Ki 67抗体，Vector Laboratories，货号：VP-RM04。

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞的传代细胞和FOXO3^+/+MSC细胞的传代细胞为供试细胞。

早代细胞为传至第3代的细胞。晚代细胞为传至第7代的细胞。

通过免疫荧光染色法检测供试细胞中与增殖活力相关的Ki67表达。

结果见图9。FOXO3^2SA/2SA MSC细胞的晚代细胞中具有更高的Ki67阳性细胞率。

(6)细胞核结构完整性检测

抗人LAP2抗体，BD Biosciences，货号：611000。

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞传至第7代的细胞和FOXO3^+/+MSC细胞传至第7代的细胞为供试细胞。

通过免疫荧光染色法检测供试细胞中核膜蛋白Lamin B1和LAP2的表达。

结果见图10。与FOXO3^+/+MSC细胞传至第7代的细胞相比，FOXO3^2SA/2SA MSC细胞传至第7代的细胞中核膜异常的细胞(箭头所指的即为核膜异常细胞，核膜蛋白染色后不可见明显的核膜轮廓)数目明显减少，表明FOXO3^2SA/2SA MSC细胞传至第7代的细胞具有更完整的细胞核结构。

4、抵抗恶性转化的特性

(1)FOXO3^2SA/2SATMSC细胞和FOXO3^+/+TMSC细胞的制备

分别以FOXO3^2SA/2SA MSC细胞和FOXO3^+/+MSC细胞为供试细胞。

流程示意图如图11所示，MSC的恶性转化包括端粒延长、抑癌基因缺失和致癌基因突变三方面，该过程通过感染3种逆转录病毒和1种慢病毒实现。慢病毒可同时表达绿色荧光GFP蛋白，同时实现细胞的可视标记。利用体外恶性转化系统，向供试细胞中转入致瘤因子，将非瘤的MSC转化为瘤化的MSC(transformed MSC，TMSC)。

①将质粒pBABE-neo-hTERT、质粒gag/pol和质粒VSV-G各10μg共转染1×10⁷个293T细胞，收集培养上清，并通过超高速离心获得逆转录病毒颗粒(逆转录病毒颗粒甲)。将质粒pBABE-zeo-large T genomic、质粒gag/pol和质粒VSV-G各10μg共转染1×10⁷个293T细胞，收集培养上清，并通过超高速离心获得逆转录病毒颗粒(逆转录病毒颗粒乙)。将质粒pBABE-puro-HRAS V12、质粒gag/pol和质粒VSV-G各10μg共转染1×10⁷个293T细胞，收集培养上清，并通过超高速离心获得逆转录病毒颗粒(逆转录病毒颗粒丙)。

②将15μg质粒PLVTHM-shP53、10μg质粒psPAX和5μg质粒pMD.2G共转染1×10⁷个293T细胞，收集培养上清，并通过超高速离心获得慢病毒颗粒。

③在供试细胞中依次感染逆转录病毒颗粒甲(采用G418筛选)、逆转录病毒颗粒乙(采用zeocin筛选)和逆转录病毒颗粒丙(采用puromycin筛选)，获得三种病毒均整合的细胞；然后在细胞中感染慢病毒颗粒。

FOXO3^2SA/2SA MSC细胞进行上述步骤得到FOXO3^2SA/2SATMSC细胞。

FOXO3^+/+MSC细胞进行上述步骤得到FOXO3^+/+TMSC细胞。

(2)非锚定依赖生长能力

肿瘤细胞在无法粘附的琼脂上能够长成克隆，而非瘤细胞则不可，因此非锚定依赖的生长能力与肿瘤细胞形成实体肿瘤密切相关。

分别以FOXO3^2SA/2SATMSC细胞和FOXO3^+/+TMSC细胞为供试细胞。

将供试细胞与溶解状态的琼脂糖(0.35％)混合均匀，迅速铺于细胞培养皿中，待琼脂糖凝固后覆盖TMSC培养基培养，观察非锚定依赖生长能力。

照片和相对克隆大小见图12。FOXO3^2SA/2SA TMSC细胞的非锚定依赖生长能力较FOXO3^+/+TMSC细胞大大减弱。

(3)体内成瘤能力

分别以FOXO3^2SA/2SATMSC细胞和FOXO3^+/+TMSC细胞为供试细胞。

将供试细胞(3×10⁶个细胞)移植入裸鼠(品系：Balb/C nude mice)后肢近关节处(注射细胞悬液至后肢近关节处的肌肉中)，移植2-3月后，后肢出现明显肿物隆起，处死小鼠，切下后肢使用天平称重。

计算相对质量(相对质量＝移植FOXO3^+/+TMSC的后肢质量/移植FOXO3^2SA/2SA TMSC的后肢质量)。相对质量为2.73±0.22。移植FOXO3^+/+TMSC的后肢质量显著大于移植FOXO3^2SA/2SA TMSC的后肢质量。

FOXO3^+/+TMSC能够长出骨肉瘤状肿瘤，而FOXO3^2SA/2SA TMSC则彻底丧失了形成肿瘤的能力。

本实施例的结果表明，FOXO3增强型间充质干细胞中FOXO3得到主动激活，在体内体外均表现出抗逆、抗细胞衰老和抵抗恶性转化的特性。

实施例3、FOXO3增强型间充质干细胞在细胞移植治疗中的应用

供试细胞：实施例2制备的FOXO3^2SA/2SA MSC细胞或FOXO3^+/+MSC细胞。

过表达荧光素酶luciferase的慢病毒载体，简称luc慢病毒载体。参考文献：SIRT6safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivatingNRF2.Pan et.al,.Cell research.(2016)26:190-205；即文献中的“luciferase(Control)-expressed vector”。

慢病毒包装质粒psPAX，简称质粒psPAX，Adgene，货号12260。慢病毒包装质粒pMD2.G，简称质粒pMD2.G，Adgene，货号12259。293T细胞(人胚胎肾细胞)：ATCC，CRL-3216。

本实施例将供试细胞用于细胞移植治疗。

一、制备荧光素酶标记的供试细胞。

1、使用Lipofectamine 3000试剂盒(Invitrogen)将15μg luc慢病毒载体、10μg质粒psPAX和5μg质粒pMD.2G共转染至1×10⁷个293T细胞中，培养48小时，然后收集上清液。

2、取步骤1得到的上清液，4℃、19200rpm离心2.5小时，弃上清，用hMSC培养基悬浮沉淀，得到病毒液。

3、用步骤2得到的病毒液感染供试细胞(4×10⁵个细胞：MOI＝3btu/cell)，使用hMSC培养基培养3天，收集细胞，进行胰酶消化，然后接种至新的hMSC培养基并培养3天，得到荧光素酶标记的供试细胞。

二、将细胞移植到小鼠的胫骨前肌

将1×10⁶个荧光素酶标记的供试细胞注射到CD-1裸小鼠的左、右腿的胫骨前肌中，7天后利用动物活体成像仪检测腿部存留的MSC。

结果见图13，FOXO3^2SA/2SA MSC细胞较FOXO3^+/+MSC细胞能够存留更久。

三、将细胞移植到后肢缺血的免疫缺陷小鼠肌肉

首先使用7.0号的不可吸收手术线将免疫缺陷小鼠(BALB/c Nude小鼠)右后腿的动脉结扎，随后立即将3×10⁶个供试细胞注射到右后腿结扎部位的肌肉中，利用激光多普勒血流仪检测移植后第0、4、8、12、16天小鼠后肢血流的恢复情况。设置用PBS缓冲液代替供试细胞注射的对照处理。

每种处理设置5只小鼠，结果取平均值。

结果见图13。较注射PBS缓冲液或移植FOXO3^+/+MSC相比，移植FOXO3^2SA/2SA MSC能够更快的恢复受损后肢的血流，表明FOXO3^2SA/2SA MSC参与了损伤后血管的再生和修复。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种可以延缓细胞衰老及抵抗恶性转化的人间充质干细胞及其制备方法和应

用

<130> GNCYX181812

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26011

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tgctccaccg agtagcacac accctatcag tttgcccttc tttccatctc ttattctaga 60

gaccttaaag cctacttgtt ggtatatatt ttcaggtttt tggaaattgg gctgtttaat 120

tgaagttaat accagtgatg agacttttca acctgagaac aacctagatg ctacttcaca 180

ttttgcagtg gaagcttact tccatcttca ctcatgtagg acattctttg gtctcaatgt 240

tttatcacat ctcatgttaa agtataattc aggtctattt tgtggctcct gcccccttcc 300

cattaattca atggttaaac agatacaatt ttttgacccc ctactatgta ccaggccctc 360

tgccgggtgc taaagctata gtaaaacatg gtatctggtt taaagagcca gactgcaccc 420

tgcattttat ctttgctatt agtgtgctaa tccagacatt ggtactaatg ttctctttct 480

gggtggtggg ttacacctca aggccaggtg gtgtgagtct gtctctgctc tgttgacact 540

taggagctga ttggattcag gtgtggcact gtgcctcttt ggtcctcagg gtctgcgact 600

gtgaagttgg ggctgcctgt ttcatagaaa gagggtttcc tggccctctc catgttcccc 660

agctattgct atttttactg agcttcctgc cctggttgct tgtcatatgt catgaaagtg 720

atgctaaatt cttggatgtg ctcctgagtt ctggatgcat gtttcctatg cccttttatt 780

cgatttccac acacagtaag ttttcaaact ggaaaaaggt gcagccttat tttgtttaag 840

ctaagtgaat attaataata aaactatttc tgttccactt catggctttt ataacttcat 900

gcctgttaac tctttgaggc aaccattttg tgtggctaat ttgagcatgg tcttaaaaga 960

gaatttcagt agcatgtgtt tgctgagcac cttgtgggaa ggggaaacag attcaataac 1020

atcacaggag aagcttggag aaagacaaca ggggcatcca aatgctgcag ctttaaccta 1080

ctttctggga ctgtcatctc gctgactgca cgcctttaga tgcttcttcc tcagtctatg 1140

gggagaggga cctggggcta gaaataggag agtttgtggg gaggggcagg atgctgcagg 1200

gagtgggtgt gggcagaggt tgcaagactg ccagggttct ctgtgtgccg gaagtgcagg 1260

tttggctgtg aggaatggaa tgttctctct tgccctccaa gagcacaaac agctgtggaa 1320

gagcttgaaa agaagattac taaaagaaaa aataataata attaatatga aaataaaatc 1380

caccctagaa aacccaacag aaccgtgtgt ggagtatagt ggtagtcatc tttttcatgc 1440

tatttaagag aactttcttc ctatctagga tttctttttc agttgagggc aggataaatt 1500

gtgtacccag ccctttctcc ccttgggaaa gcctcatatg tctcattttg tttggataga 1560

aaattgattc attattctga tgaccagatg atgattttat tctttttatg agggaccaga 1620

acctgtcgct tgcttgctgc ttgaaaactt aaatgttagt ttccaaaggc catctctgtg 1680

ggtagagggt tatcgtcagc agtttaacgg gaaatcttgt ttctaactgg aaatttaatt 1740

attcagccaa gttcccaaca atgtttactt tagagcatcg tctttttttt tttttttaag 1800

tcccttaatg gtttaaactt ttaagcttta ggcaagagta gagtggagct agatttacat 1860

atcaggttgt ttgtgcaatc ttttacatga aagtttatgt tttcttctca atctgaaaat 1920

tggttttggc cattatagct ggtattatat atgacgtaat aactctctct gatctcagat 1980

acatttttat gctgtcatac tttctgcacc tgcttttgaa caacatctta gtcccaaagt 2040

agataaaatc tagcagaagg gagtaggcag ctaaaaacta gattctagca atatctaagg 2100

aaattacaag gatcagttag tgttccattc cttccttctt tggctatatc aattcctagt 2160

tttgtgaaag tccacatgcc ttctttctgt ccatgcctgt gcatgctggg tggagaagca 2220

tcacagagca gaatgaggtg actgtcccca aggcagggta aggtcaagga tctttcccct 2280

cacctcatga ttttcaaaag aaaagcagat ctggacctca gttacctaaa ataaaataaa 2340

attaccctag ctcttattct gcacataaaa tcacagcttt aatctctcat cccagttctc 2400

acctttatct tctcaatgat ggaaacttgg acttaaagga agttactgtg ctatgttacc 2460

agatctaagg agactgggaa tcattagatt ggaatcagat cctcagtcaa tggaaatata 2520

aggaggaaag accattggtt cttggcccta attgcacatt agaataatct ggggagctgt 2580

aaaaatgtac ctatatccag gccttacccc atctattgaa tcaaaacctc tgagactggg 2640

atgtgagtgt ttaaagtctc cccaggtgat tctaataggc ggggtgaaga actactactg 2700

aagggaaatt gagggcctct tccagagaat tgcctttgaa agatcctgtc attatacacc 2760

gaaggcgccc acccgggcct gctcctgaag ctagctgttt gcagtgctct cctgtggcac 2820

gcagacctct gggtctccct gtgaattggg gttccattgg gctgttcaaa aaacctttgt 2880

catctgtggt tcagcagacg cgtatgttag aattcaggca tttggcaacc tcattctgaa 2940

ttgtcagtac ccacaagtca agcagtgaga cccacttgaa atgctggtcc tgtacacaaa 3000

gtgggtgagc actgtattga aagacagtcc tttccagtgc tttcccctga aattccttgt 3060

aaggaccagg agacgcctgc agtcggcctg gtgggaagta gtgggcctgg ctttggagtt 3120

aaccataact cattttgctg ctccagacag tcctcctccc accccacccc accccacctc 3180

aaaaaaaaaa agagagagga gggggttgtc tttaaagaaa aaaaaaaagc aggggctttt 3240

aagagttaaa ttacacaact cgctttttat ttttaaagtg agcagatttc ttgttgtcgt 3300

tgctgagaaa gataaattga taccacatgt tgcttccaga caaaaacctc tctgtgttcc 3360

aggggaagca catgcagctg gtgtctgggt gagtggacag tctccacaag gtaaacatgg 3420

tttggaaggg ctgaagcgga cgtagggtac aaaatttaag aaattaccag ttacttctga 3480

ctggcacggc acctctgaaa tactttttta aagtttgaaa tcctttcctg gaaggggccg 3540

ccctggaacc ttttggctta aagtatatga tgctcggaaa acagtaagtt aacatttatg 3600

atgtcactgc ttccgtgtgg gatctaacag ttgttgggag ctgcttttgt acttggcact 3660

tcactgagta gtttgcatgc agagctttat ttaatcttcc caaagagcca agagatagtc 3720

aaagaatgtt tttatcctgc ctgtgggaat tatccccttt gtaaattatt ggtggaatac 3780

ttttcatttc aggaagcttc tctctcacac ctaatctgat ctgtttgggg tccatgtgtc 3840

ttcacaacca gttagcatgt atgtagagat catggatact ttagtattag caataattgt 3900

atcttgcaat agaaaacggt cttcattata acaagaaaaa taattgccag attctgctag 3960

gtgcagtcat ctttatgctg atttattcaa ggtggaccaa acaaaggaat ctctaggcag 4020

caggactgtg aaatgtgaat tccatcatgc tgcctccttc acacacctat tgcacctgcc 4080

tcctggaagg gttatgccac tgattgccag ttctgtaact gattaactac acctaacggg 4140

tttctgcccc agtgcagggc ttccttcagt gtaaattgtt ttgtaaaaga gaagatggac 4200

ataaaaatga aataaagagt attcttacca ctgcactctc tttagacaca ttgtgataga 4260

ggtgttttaa gggttcttta aacctttcgg cccacgttgg ggacaagctg gtacatttgt 4320

ccctgaagct gaagtttttt cctagagatc tttctttctt gtaatttcat caaaatcttg 4380

atttctaagt actgaattta aatcacatga ttttgggttt gggggtcata gtagcttctt 4440

agcttcttta gtgagtaact gtgacaattg cctgagctct agcagtaggt gtcttggtta 4500

ttacgtacct tactatctta gccttaagga aggcacatcc ctagttcttc agccagttac 4560

cattggcctg cctcaaaggg tatagcaaaa tgtgtattta gatgtgatta gaaaaatcat 4620

tctcgttctg tcaagccagt ccttttttat cttcagctcc caatcccaaa actaatgtaa 4680

aatgttagaa atttagacta tttggtaagg tgacatacga attagtgaaa aatcatagaa 4740

tatttgtaat gatagttttc ctgggattga ggtggcagga gggacatttg aaatattaca 4800

gaaattgtat caccattaat ttttgatacc agggaagaag tggggaaaca ttggagttct 4860

ggtattttat ctggcatcta tttatttacc tttcctgctt taccaacatt taagtagaga 4920

agttagtaca gttgagcctt gaacaatgta ggtttgaatt gcacaggtcc acttacatag 4980

agctcttttt caaccaaaca cagcattccc aggatgtgaa acccccctct gggcctgggg 5040

gagttggctc ttacatgtga gtttcttctg cggggctgac tgtggagtgg agtatgcaca 5100

ggtttagtta tatgcagatg gtcctggaac cagtcccctg cgtataacaa ggattaacta 5160

taatcagaat catgacctgt gaggaaaaca gaatgtattt ctggcatctg attttgaggg 5220

gtaactgggc gtttgaactg gaaatggaca gatgagccat atttgttggc ctttgtcaat 5280

gccctacctt cagattatgg attttgtcaa tggaaggctg gccaccctgt atgaatagaa 5340

ggctgctgag attggggact gtgagaatga tggtggcaca gtttttgttt gtgttgactt 5400

agtaatgtaa ctggaaaaac ctgtctgaac tttctgtagg taataggctc cagggaatgc 5460

attctgccac taagaaacct ctaaactgag agtcaagcaa agattggcca ttgaagctaa 5520

tcatctattt aataagttgg gctttgtttc agaatctaag agtagttaat attgggggtg 5580

ggagggttgt ggttttttgt gtgttttttt gagacggaat ctcactctgt catccaggct 5640

ggagtgcagt ggagatgggg tttcgccacg ttggccagcg tggtctcaaa ctcctgatct 5700

caggtgatct atccccgctt ggcctcccaa agtgctaaga ttacaggtgt gagccaccgt 5760

gcctggccaa cattggtttg tatggtatcc actgtcctct ttagaatgaa tgtgatcatg 5820

gccactttac taaagaaaga caagtaagtc ctatagaata agctcatact ttgaggtttc 5880

ctcttctgaa agactttttt ttgtttgctt tttggggttt ttgtgttttt ttgtttgttt 5940

gttttttgag atagggctgt gctctgtcgc ccaggctgga gtgcagtgat gaaatcacag 6000

ctcactgcag cctcagcctc ccaggcacaa gtgatcctcc cacctcagcc tccccagtag 6060

ctgtgactat aggtacatgc caccacacct agctaatttt tgtatttttt gtagagacag 6120

ggttttgcca tgttgcccag gctggtcttg aactcctgag ctcaagcgat ccgtctgcct 6180

cagtgtccca aagtactgga attataggcg tcaggcactg tgcctggctc agactttgtt 6240

tttaaaatct taaaaaaaaa ttttttttta ggaagggccc accaaatacc cgtaactatt 6300

tcataaacaa attaaaatag taagattgtg cttttatatt cctattcttt cttaaatgtg 6360

aaatgattct ttagataatc tgtttaactg ttagcccaag tagattaaat ggtgacttct 6420

gcataatttg gtaagaggcc tatatgaaag gttgtagaaa aagcagtgca ttggagttta 6480

ggaaacccag tgtcagtttt ggctcttgtg aacagtagct gtgggacctt gcattaagtt 6540

atttaatatc tctcagcctg agtcttctta tataaaatta gggcactgac atactaattc 6600

ttgcaggttt attatgagga ttagagacga tgaatctaaa acactctggc tcagtaactg 6660

acagtgctgt aatctggcag gcactgtcat ccttgcaatt aggggacctg ggtgggtggg 6720

cagtctccat tgtcctttcc cacccgaaca ccctgtggtt atggccctgg atgtgggtgt 6780

tccagcccct ttttaccaca tgcccttgta gaagcttaat atctgtgtcc agattttaac 6840

cctgtgtagc ttttaatttt ataaaactat acgcatacgt tgttggaggt tagaattgtg 6900

atagatggcc atcagaaaat ttatgtgggg cattttgcag ttctataaga tgtttcacac 6960

tttttctcag ttgggttgga attggtgatg ctaaagtaca ttttaaaata ttgttcccta 7020

aatgcttttt aagggggtat agctgaatac ttgactggtc attctagtta attctgtgtg 7080

ttggtgtgat ctccttccag aatctaacgc agagggggct ggacagagtg ggagtactta 7140

gggtaggtgt ccacatttcc atttagcctc gggacctccg tgttttttca cttagaagct 7200

tgagtttgtt tttatttaat atatctagtg acctgaattg tagatccacc tgtacttgcc 7260

tgctttctga acactgcaga gtacatgttg agagcatgct tcatacctat tgcatagaga 7320

aattgtttta ctttttaaag aagtgtacta tccggaccat tagtagagat gccattattc 7380

tttttaaaaa ccgtaaaagg aatcaggata tatagtctcc tgggcaacat ttgccttatc 7440

agatactcag catgttgctt atgttcttct ctcaaacgca gttgtagaaa tgccaactta 7500

tgacccatga ttgctaatgc ttattgccta tcctgaacta caggcccttc ctacatgtga 7560

agcatagtat tttggattat ttactaatgg taaaatcctg ctgacattct gtgtttttaa 7620

aacattctgg gctgggcgtg gtggctcatg cctgtaatcc cagcacttgg gtggggaggc 7680

caaggtgggc agatcacttg atgtcaggag tttgagacca gcctggccaa catagtgaaa 7740

ccctgtctct agttaaaata caaaaattag gccgggcatg gtggctcatg cctgtaatcc 7800

cagcactttg ggaggccgag gcgggtgggt cacgaggtca ggagatcgag accatcctgg 7860

ctaacacgat gtagagacag ggttactacc acacttctct gtcccctgca ctttgcaaca 7920

agtagaaacc cagtctctac taaaaataca aaaaattagc tgggcatggt ggcgggtgcc 7980

tgtagtccta gctactcggg aggctgaggc aggagaatgg cgtgaacctg ggaggcagag 8040

cttgcagtga gccgagatca cgccactgca ctccaacctg ggcaacagag cgagactcta 8100

tctcaaataa aaaaaagaaa atacgaaaat acaaaaatta gccaggtgtg gtggcacgca 8160

cctgtaaccc cagctactcg ggaggctgag gtgggagaat cacttgaacc ctggaggcgg 8220

aggttgcagt gagccgagat caagccattg cactccagcc tgggtgacag agtgggactc 8280

tgtctcgggc ggcgggggga acattctggt agaagcatgt gtttgtatct tctacatgaa 8340

tacagttcgt gattgccaat ttaaacaaat atatatatat gtatatataa cttttaggat 8400

tgtccatatt taatatatgg acagtagcat caggagtatc ttttgtcttt aacgtgcaaa 8460

taaaaactca tctggcctgc aggtactgtt ccggatgtgg agcatacaga ttcatcagct 8520

cctccctttt actgcaggag gcattttaca gattagaatg agcctgctgc aggccatgaa 8580

ctctctccac catggactct gtgttttata atagcaataa gaacaccctg acttcatagc 8640

atgactggct tctgaaatat atcatgtgtc acccttacat catccctgta cagagatggt 8700

ttggatatga ttatagccat aatgaaggtg gggaactgca gttgttgcag acaaattaga 8760

tttgttcagg gtcacatggt tggtcagtgg cagagatagg actgaatctg ggtcatcact 8820

gtcaactggg tgtatttgcc aagccaggag gagaattctt gcaagatgga gttttgaggg 8880

tattttgccc tactttttaa gtaaatattt attttaggat acttttaaat ttacagaaaa 8940

gttgcagaga tagtagagag ttcccataca cccaatatca agtttcccct gtggttaaca 9000

tcttacagta tgtgacattt gtcacaactg atgaatcaat atggatatat tattattaac 9060

ttaagttttt actttcttca gatttctttc attttcactt aatgtttttt tttgttccag 9120

gattccatcc agcataccat attaccttta gccgtcatat ctccttaggc tcttctaggc 9180

tgtgactatt ttgagaagta ctgactaggc attttgtaaa tgtcccttaa ttgaaatgtg 9240

tctgatgtct ttctcatgct tagactgagg ttatgggctt tggaaggcag accacagaag 9300

gtgccattct catcatgtca tatcaagggt acatattatc agctcatctt atccttgtag 9360

atattgaccc cgatcaccta ctgaaatagt gtttgtcagt ttctccactc taaagttgct 9420

cttttccccc cttttcatac tgtactcttt ctaaggaagt tactatgctc agcccacact 9480

aacttgacag gcaagtgtct atataaatta tttgaattct tctgaatggg agacttgcct 9540

acttctctaa tcaacctggc aaatcctgct ctacacttct tatgtctgca agagttacat 9600

ggtaaggtgt aaaatctggc aggatgagat ggagtcatag aaaggttagg taaaaattct 9660

catcggttct tcattcacag aagtagttaa gaaaaggtag acgttgtgcc tctatactag 9720

tggaggaggg gaccatgaga aaataaaata gccctccacc aggtgattaa ttacccttag 9780

agagccgggg aagtttgttg caaagtgcag gggacagagg agtgtggtag taaattccaa 9840

gtgtgaactt caatatgggc aatataatta cagaaaggcc agtaattagg ggcctttcaa 9900

tatgggcaat ataattacag aaaggccagg aatttgagga aaactactat cagtgagctt 9960

atctattccc agcatctctt ggacatgaaa tcatctccct tccccctaga tatgaaaact 10020

gccatttaac atgtcatttt attctcaaag agggtcatgc atatatgtgt ctttttgaat 10080

taggatggat tttttttaac ctttgaaatt gaggcagctt taaaaaatga ggagttggcc 10140

agcacggtgg ctcatgccta taatcctagc actttgggag gccaacgtgg gaggatctct 10200

tgagtccagg agtttgagac cagcctgggt aacgtggaaa accccatctg tacagaagtt 10260

cctattctct agaaagtata ggaacttcgg cccctgcagg tcaattctac cgggtagggg 10320

aggcgctttt cccaaggcag tctggagcat gcgctttagc agccccgctg ggcacttggc 10380

gctacacaag tggcctctgg cctcgcacac attccacatc caccggtagg cgccaaccgg 10440

ctccgttctt tggtggcccc ttcgcgccac cttctactcc tcccctagtc aggaagttcc 10500

cccccgcccc gcagctcgcg tcgtgcagga cgtgacaaat ggaagtagca cgtctcacta 10560

gtctcgtgca gatggacagc accgctgagc aatggaagcg ggtaggcctt tggggcagcg 10620

gccaatagca gctttgctcc ttcgctttct gggctcagag gctgggaagg ggtgggtccg 10680

ggggcgggct caggggcggg ctcaggggcg gggcgggcgc ccgaaggtcc tccggaggcc 10740

cggcattctg cacgcttcaa aagcgcacgt ctgccgcgct gttctcctct tcctcatctc 10800

cgggcctttc gacctgcagc ctgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 10860

ataatacgac aaggtgagga actaaaccat gggatcggcc attgaacaag atggattgca 10920

cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 10980

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 11040

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 11100

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 11160

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 11220

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 11280

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 11340

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 11400

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 11460

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 11520

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 11580

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 11640

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaggggatcg 11700

gcaataaaaa gacagaataa aacgcacggg tgttgggtcg tttgttcgga tcgaagttcc 11760

tattctctag aaagtatagg aacttccata tgtgtacaaa aaatacaaca attaactggg 11820

cttggtggca tgcgcctgta gtcccagtta caggtgcttc aggatcgctt cagcccagga 11880

ggttgaggct gcaccactgc attccagcat gggcagcaga gtgagacctt gtctcaaaaa 11940

aataaaataa aaaatgaatg aggagtctga tttactatat catctgggtg ctcggttttg 12000

gaccattctg gttcatactc tgtattttct tttctccctg cagaactcca tccggcacaa 12060

cctgtcactg catagtcgat tcatgcgggt ccagaatgag ggaactggca agagctcttg 12120

gtggatcatc aaccctgatg gggggaagag cggaaaagcc ccccggcggc gggctgtcgc 12180

catggacaat agcaacaagt ataccaagag ccgtggccgc gcagccaaga agaaggcagc 12240

cctgcagaca gcccccgaat cagctgacga cagtccctcc cagctctcca agtggcctgg 12300

cagccccacg tcacgcagca gtgatgagct ggatgcgtgg acggacttcc gttcacgcac 12360

caatgctaac gccagcacag tcagtggccg cctgtcgccc atcatggcaa gcacagagtt 12420

ggatgaagtc caggacgatg atgcgcctct ctcgcccatg ctctacagca gctcagccag 12480

cctgtcacct tcagtaagca agccgtgcac ggtggaactg ccacggctga ctgatatggc 12540

aggcaccatg aatctgaatg atgggctgac tgaaaacctc atggacgacc tgctggataa 12600

catcacgctc ccgccatccc agccatcgcc cactggggga ctcatgcagc ggagctctag 12660

cttcccgtat accaccaagg gctcgggcct gggctcccca accagctcct ttaacagcac 12720

ggtgttcgga ccttcatctc tgaactccct acgccagtct cccatgcaga ccatccaaga 12780

gaacaagcca gctaccttct cttccatgtc acactatggt aaccagacac tccaggacct 12840

gctcacttcg gactcactta gccacagcga tgtcatgatg acacagtcgg accccttgat 12900

gtctcaggcc agcaccgctg tgtctgccca gaattcccgc cggaacgtga tgcttcgcaa 12960

tgatccgatg atgtcctttg ctgcccagcc taaccaggga agtttggtca atcagaactt 13020

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tcttgctgag ttttttgtat gaccttgtca tatatctagt gtttctcagc catatccatg 19440

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tactaacagg tcagagttca ggctgaatcc agatgctggt ttcttttaaa agctctgcag 19860

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<210> 2

<211> 673

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ala Glu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Leu Ser Pro Leu Glu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Pro Glu Phe Glu Pro Gln Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr

20 25 30

Trp Pro Leu Gln Arg Pro Glu Leu Gln Ala Ser Pro Ala Lys Pro Ser

35 40 45

Gly Glu Thr Ala Ala Asp Ser Met Ile Pro Glu Glu Glu Asp Asp Glu

50 55 60

Asp Asp Glu Asp Gly Gly Gly Arg Ala Gly Ser Ala Met Ala Ile Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Leu Leu Leu Glu Asp

85 90 95

Ser Ala Arg Val Leu Ala Pro Gly Gly Gln Asp Pro Gly Ser Gly Pro

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Thr Gln Ala Leu Leu Gln

115 120 125

Pro Gln Gln Pro Leu Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gln Pro Arg Lys Cys Ser Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Leu

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Leu Ile Thr Arg Ala Ile Glu Ser Ser Pro Asp Lys

165 170 175

Arg Leu Thr Leu Ser Gln Ile Tyr Glu Trp Met Val Arg Cys Val Pro

180 185 190

Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn

195 200 205

Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser Arg Phe Met Arg Val Gln

210 215 220

Asn Glu Gly Thr Gly Lys Ser Ser Trp Trp Ile Ile Asn Pro Asp Gly

225 230 235 240

Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg Arg Arg Ala Val Ala Met Asp Asn

245 250 255

Ser Asn Lys Tyr Thr Lys Ser Arg Gly Arg Ala Ala Lys Lys Lys Ala

260 265 270

Ala Leu Gln Thr Ala Pro Glu Ser Ala Asp Asp Ser Pro Ser Gln Leu

275 280 285

Ser Lys Trp Pro Gly Ser Pro Thr Ser Arg Ser Ser Asp Glu Leu Asp

290 295 300

Ala Trp Thr Asp Phe Arg Ser Arg Thr Asn Ala Asn Ala Ser Thr Val

305 310 315 320

Ser Gly Arg Leu Ser Pro Ile Met Ala Ser Thr Glu Leu Asp Glu Val

325 330 335

Gln Asp Asp Asp Ala Pro Leu Ser Pro Met Leu Tyr Ser Ser Ser Ala

340 345 350

Ser Leu Ser Pro Ser Val Ser Lys Pro Cys Thr Val Glu Leu Pro Arg

355 360 365

Leu Thr Asp Met Ala Gly Thr Met Asn Leu Asn Asp Gly Leu Thr Glu

370 375 380

Asn Leu Met Asp Asp Leu Leu Asp Asn Ile Thr Leu Pro Pro Ser Gln

385 390 395 400

Pro Ser Pro Thr Gly Gly Leu Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Pro Tyr

405 410 415

Thr Thr Lys Gly Ser Gly Leu Gly Ser Pro Thr Ser Ser Phe Asn Ser

420 425 430

Thr Val Phe Gly Pro Ser Ser Leu Asn Ser Leu Arg Gln Ser Pro Met

435 440 445

Gln Thr Ile Gln Glu Asn Lys Pro Ala Thr Phe Ser Ser Met Ser His

450 455 460

Tyr Gly Asn Gln Thr Leu Gln Asp Leu Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser

465 470 475 480

His Ser Asp Val Met Met Thr Gln Ser Asp Pro Leu Met Ser Gln Ala

485 490 495

Ser Thr Ala Val Ser Ala Gln Asn Ser Arg Arg Asn Val Met Leu Arg

500 505 510

Asn Asp Pro Met Met Ser Phe Ala Ala Gln Pro Asn Gln Gly Ser Leu

515 520 525

Val Asn Gln Asn Leu Leu His His Gln His Gln Thr Gln Gly Ala Leu

530 535 540

Gly Gly Ser Arg Ala Leu Ser Asn Ser Val Ser Asn Met Gly Leu Ser

545 550 555 560

Glu Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys His Gln Gln Gln Ser Pro Val

565 570 575

Ser Gln Ser Met Gln Thr Leu Ser Asp Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu

580 585 590

Tyr Ser Thr Ser Ala Asn Leu Pro Val Met Gly His Glu Lys Phe Pro

595 600 605

Ser Asp Leu Asp Leu Asp Met Phe Asn Gly Ser Leu Glu Cys Asp Met

610 615 620

Glu Ser Ile Ile Arg Ser Glu Leu Met Asp Ala Asp Gly Leu Asp Phe

625 630 635 640

Asn Phe Asp Ser Leu Ile Ser Thr Gln Asn Val Val Gly Leu Asn Val

645 650 655

Gly Asn Phe Thr Gly Ala Lys Gln Ala Ser Ser Gln Ser Trp Val Pro

660 665 670

Gly

<210> 3

<211> 2022

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggcagagg caccggcttc cccggccccg ctctctccgc tcgaagtgga gctggacccg 60

gagttcgagc cccagagccg tccgcgatcc tgtacgtggc ccctgcaaag gccggagctc 120

caagcgagcc ctgccaagcc ctcgggggag acggccgccg actccatgat ccccgaggag 180

gaggacgatg aagacgacga ggacggcggg ggacgggccg gctcggccat ggcgatcggc 240

ggcggcggcg ggagcggcac gctgggctcc gggctgctcc ttgaggactc ggcccgggtg 300

ctggcacccg gagggcaaga ccccgggtct gggccagcca ccgcggcggg cgggctgagc 360

gggggtacac aggcgctgct gcagcctcag caaccgctgc caccgccgca gccgggggcg 420

gctgggggct ccgggcagcc gaggaaatgt tcgtcgcggc ggaacgcctg gggaaacctg 480

tcctacgcgg acctgatcac ccgcgccatc gagagctccc cggacaaacg gctcactctg 540

tcccagatct acgagtggat ggtgcgttgc gtgccctact tcaaggataa gggcgacagc 600

aacagctctg ccggctggaa gaactccatc cggcacaacc tgtcactgca tagtcgattc 660

atgcgggtcc agaatgaggg aactggcaag agctcttggt ggatcatcaa ccctgatggg 720

gggaagagcg gaaaagcccc ccggcggcgg gctgtcgcca tggacaatag caacaagtat 780

accaagagcc gtggccgcgc agccaagaag aaggcagccc tgcagacagc ccccgaatca 840

gctgacgaca gtccctccca gctctccaag tggcctggca gccccacgtc acgcagcagt 900

gatgagctgg atgcgtggac ggacttccgt tcacgcacca atgctaacgc cagcacagtc 960

agtggccgcc tgtcgcccat catggcaagc acagagttgg atgaagtcca ggacgatgat 1020

gcgcctctct cgcccatgct ctacagcagc tcagccagcc tgtcaccttc agtaagcaag 1080

ccgtgcacgg tggaactgcc acggctgact gatatggcag gcaccatgaa tctgaatgat 1140

gggctgactg aaaacctcat ggacgacctg ctggataaca tcacgctccc gccatcccag 1200

ccatcgccca ctgggggact catgcagcgg agctctagct tcccgtatac caccaagggc 1260

tcgggcctgg gctccccaac cagctccttt aacagcacgg tgttcggacc ttcatctctg 1320

aactccctac gccagtctcc catgcagacc atccaagaga acaagccagc taccttctct 1380

tccatgtcac actatggtaa ccagacactc caggacctgc tcacttcgga ctcacttagc 1440

cacagcgatg tcatgatgac acagtcggac cccttgatgt ctcaggccag caccgctgtg 1500

tctgcccaga attcccgccg gaacgtgatg cttcgcaatg atccgatgat gtcctttgct 1560

gcccagccta accagggaag tttggtcaat cagaacttgc tccaccacca gcaccaaacc 1620

cagggcgctc ttggtggcag ccgtgccttg tcgaattctg tcagcaacat gggcttgagt 1680

gagtccagca gccttgggtc agccaaacac cagcagcagt ctcctgtcag ccagtctatg 1740

caaaccctct cggactctct ctcaggctcc tccttgtact caactagtgc aaacctgccc 1800

gtcatgggcc atgagaagtt ccccagcgac ttggacctgg acatgttcaa tgggagcttg 1860

gaatgtgaca tggagtccat tatccgtagt gaactcatgg atgctgatgg gttggatttt 1920

aactttgatt ccctcatctc cacacagaat gttgttggtt tgaacgtggg gaacttcact 1980

ggtgctaagc aggcctcatc tcagagctgg gtgccaggct ga 2022

<210> 4

<211> 673

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ala Glu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Leu Ser Pro Leu Glu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Pro Glu Phe Glu Pro Gln Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr

20 25 30

Trp Pro Leu Gln Arg Pro Glu Leu Gln Ala Ser Pro Ala Lys Pro Ser

35 40 45

Gly Glu Thr Ala Ala Asp Ser Met Ile Pro Glu Glu Glu Asp Asp Glu

50 55 60

Asp Asp Glu Asp Gly Gly Gly Arg Ala Gly Ser Ala Met Ala Ile Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Leu Leu Leu Glu Asp

85 90 95

Ser Ala Arg Val Leu Ala Pro Gly Gly Gln Asp Pro Gly Ser Gly Pro

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Thr Gln Ala Leu Leu Gln

115 120 125

Pro Gln Gln Pro Leu Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gln Pro Arg Lys Cys Ser Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Leu

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Leu Ile Thr Arg Ala Ile Glu Ser Ser Pro Asp Lys

165 170 175

Arg Leu Thr Leu Ser Gln Ile Tyr Glu Trp Met Val Arg Cys Val Pro

180 185 190

Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn

195 200 205

Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser Arg Phe Met Arg Val Gln

210 215 220

Asn Glu Gly Thr Gly Lys Ser Ser Trp Trp Ile Ile Asn Pro Asp Gly

225 230 235 240

Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg Arg Arg Ala Val Ser Met Asp Asn

245 250 255

Ser Asn Lys Tyr Thr Lys Ser Arg Gly Arg Ala Ala Lys Lys Lys Ala

260 265 270

Ala Leu Gln Thr Ala Pro Glu Ser Ala Asp Asp Ser Pro Ser Gln Leu

275 280 285

Ser Lys Trp Pro Gly Ser Pro Thr Ser Arg Ser Ser Asp Glu Leu Asp

290 295 300

Ala Trp Thr Asp Phe Arg Ser Arg Thr Asn Ser Asn Ala Ser Thr Val

305 310 315 320

Ser Gly Arg Leu Ser Pro Ile Met Ala Ser Thr Glu Leu Asp Glu Val

325 330 335

Gln Asp Asp Asp Ala Pro Leu Ser Pro Met Leu Tyr Ser Ser Ser Ala

340 345 350

Ser Leu Ser Pro Ser Val Ser Lys Pro Cys Thr Val Glu Leu Pro Arg

355 360 365

Leu Thr Asp Met Ala Gly Thr Met Asn Leu Asn Asp Gly Leu Thr Glu

370 375 380

Asn Leu Met Asp Asp Leu Leu Asp Asn Ile Thr Leu Pro Pro Ser Gln

385 390 395 400

Pro Ser Pro Thr Gly Gly Leu Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Pro Tyr

405 410 415

Thr Thr Lys Gly Ser Gly Leu Gly Ser Pro Thr Ser Ser Phe Asn Ser

420 425 430

Thr Val Phe Gly Pro Ser Ser Leu Asn Ser Leu Arg Gln Ser Pro Met

435 440 445

Gln Thr Ile Gln Glu Asn Lys Pro Ala Thr Phe Ser Ser Met Ser His

450 455 460

Tyr Gly Asn Gln Thr Leu Gln Asp Leu Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser

465 470 475 480

His Ser Asp Val Met Met Thr Gln Ser Asp Pro Leu Met Ser Gln Ala

485 490 495

Ser Thr Ala Val Ser Ala Gln Asn Ser Arg Arg Asn Val Met Leu Arg

500 505 510

Asn Asp Pro Met Met Ser Phe Ala Ala Gln Pro Asn Gln Gly Ser Leu

515 520 525

Val Asn Gln Asn Leu Leu His His Gln His Gln Thr Gln Gly Ala Leu

530 535 540

Gly Gly Ser Arg Ala Leu Ser Asn Ser Val Ser Asn Met Gly Leu Ser

545 550 555 560

Glu Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys His Gln Gln Gln Ser Pro Val

565 570 575

Ser Gln Ser Met Gln Thr Leu Ser Asp Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu

580 585 590

Tyr Ser Thr Ser Ala Asn Leu Pro Val Met Gly His Glu Lys Phe Pro

595 600 605

Ser Asp Leu Asp Leu Asp Met Phe Asn Gly Ser Leu Glu Cys Asp Met

610 615 620

Glu Ser Ile Ile Arg Ser Glu Leu Met Asp Ala Asp Gly Leu Asp Phe

625 630 635 640

Asn Phe Asp Ser Leu Ile Ser Thr Gln Asn Val Val Gly Leu Asn Val

645 650 655

Gly Asn Phe Thr Gly Ala Lys Gln Ala Ser Ser Gln Ser Trp Val Pro

660 665 670

Gly

<210> 5

<211> 2022

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atggcagagg caccggcttc cccggccccg ctctctccgc tcgaagtgga gctggacccg 60

gagttcgagc cccagagccg tccgcgatcc tgtacgtggc ccctgcaaag gccggagctc 120

caagcgagcc ctgccaagcc ctcgggggag acggccgccg actccatgat ccccgaggag 180

gaggacgatg aagacgacga ggacggcggg ggacgggccg gctcggccat ggcgatcggc 240

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gggaagagcg gaaaagcccc ccggcggcgg gctgtctcca tggacaatag caacaagtat 780

accaagagcc gtggccgcgc agccaagaag aaggcagccc tgcagacagc ccccgaatca 840

gctgacgaca gtccctccca gctctccaag tggcctggca gccccacgtc acgcagcagt 900

gatgagctgg atgcgtggac ggacttccgt tcacgcacca attctaacgc cagcacagtc 960

agtggccgcc tgtcgcccat catggcaagc acagagttgg atgaagtcca ggacgatgat 1020

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ccatcgccca ctgggggact catgcagcgg agctctagct tcccgtatac caccaagggc 1260

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cagggcgctc ttggtggcag ccgtgccttg tcgaattctg tcagcaacat gggcttgagt 1680

gagtccagca gccttgggtc agccaaacac cagcagcagt ctcctgtcag ccagtctatg 1740

caaaccctct cggactctct ctcaggctcc tccttgtact caactagtgc aaacctgccc 1800

gtcatgggcc atgagaagtt ccccagcgac ttggacctgg acatgttcaa tgggagcttg 1860

gaatgtgaca tggagtccat tatccgtagt gaactcatgg atgctgatgg gttggatttt 1920

aactttgatt ccctcatctc cacacagaat gttgttggtt tgaacgtggg gaacttcact 1980

ggtgctaagc aggcctcatc tcagagctgg gtgccaggct ga 2022

Claims (8)

1.一种重组间充质干细胞，其基因组中具有编码序列表的序列2所示蛋白质的基因；所述重组间充质干细胞基因组中不具有编码序列表的序列4所示蛋白质的基因。

2.重组多能干细胞，其基因组中具有编码序列表的序列2所示蛋白质的基因；所述重组多能干细胞基因组中不具有编码序列表的序列4所示蛋白质的基因；所述多能干细胞为H9细胞系。

3.重组细胞在制备产品中的应用；所述产品为用于细胞移植治疗的产品；所述重组细胞为权利要求1所述重组间充质干细胞或权利要求2所述重组多能干细胞。

4.一种制备重组多能干细胞的方法，包括如下步骤：将多能干细胞的基因组进行如下两个突变，得到重组多能干细胞：编码FOXO3蛋白第253位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子，编码FOXO3蛋白第315位氨基酸残基的密码子由编码丝氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子；所述多能干细胞为H9细胞系。

5.一种制备重组间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

（1）按照权利要求4所述方法制备重组多能干细胞；

（2）用步骤（1）得到的重组多能干细胞制备获得重组间充质干细胞。

6.权利要求4所述方法制备得到的重组多能干细胞或权利要求5所述方法制备得到的重组间充质干细胞。

7.一种蛋白质，如序列表的序列2所示。

8.一种DNA分子，如序列表的序列3所示。

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