WO2010107192A2

WO2010107192A2 - Ｚｎｆ281을 발현하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법

Info

Publication number: WO2010107192A2
Application number: PCT/KR2010/001338
Authority: WO
Inventors: 강경선; 노경환
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-03
Publication date: 2010-09-23
Also published as: KR100950195B1; CN102395673A; ES2722930T3; WO2010107192A3; JP2012520671A; RU2511417C2; EP2410046B1; AU2010225612B2; JP6038962B2; EP2410046A4; PL2410046T3; RU2011142170A; EP2410046A2; WO2010107159A1; AU2010225612A1; JP2015091254A; US10584312B2; US20120021509A1; JP5995720B2; MY160164A

Abstract

본 발명은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기 내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법, 본 발명에 의해 분리된 제대혈 유래 만능 줄기세포, 상기 제대혈 유래 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 줄기세포 배양용 배지, 이 배지에서 줄기세포를 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법 및 줄기세포를 구 배양 (sphere culture) 또는 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 줄기성 (stemness) 증가방법에 관한 것이다.

Description

ＺＮＦ281을 발현하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법

줄기 세포들은 자기 재생 (self-renewing), 분화, 영구성 (immortal) 등의 특징을 가지고 있으며, 이러한 독특한 성질을 이용하여 재생의학의 관점에서 다양한 퇴행성 질병의 치료를 위한 해결방법으로 제시될 뿐만 아니라 세포들의 biology 에 대한 깊은 통찰을 할 수 있다. 다양한 조직으로부터 얻을 수 있는 성체줄기세포는 일반적으로 배아 줄기세포에 비해 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 훨씬 더 매력적이다. 더욱이, 제대혈로부터 분리한 줄기세포는 골수나 지방조직과 달리 기증자가 추가적인 해를 입을 염려가 없기 때문에 다른 성체줄기세포들보다 더 큰 장점을 가지고 있다.

시험관 내 (in vitro)에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 성공적으로 신경세포, 간세포, 골세포와 같은 다양한 종류의 세포에 성공적으로 도입되었다 (Sun, W. et al., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al., Tissue Engineering, 11:1407, 2005). 또한, 생체 내 (in vivo)에서, 제대혈 중간엽 줄기세포를 이용한 상처, 당뇨병, 심장 경색 (heart infraction) 등에 성공적인 이식이 여러 논문들을 통해 보고되어 왔다 (Nonome, K. et al., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., Circulation, 112:96, 2005). 전염병의 전달 위험이 적고, 이식 대 숙주 병 (graft-versus-host disease)에 걸릴 위험이 낮아, 제대혈 중간엽 줄기세포 이식은 소아, 성인 환자 모두에게 급속히 시술되고 있다 (Claudio G. B. et al., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006). 제대혈 이식이 몇몇 질병, 특히 조혈모 결함 (hematopoietic defection)과 관련된 질병들에 시술할 수 있는 방법으로 받아들여졌다 할지라도 (Grewal, SS. et al., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al., Blood, 103:489, 2004), 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 임상적 적용에 관한 연구는 여전히 제한되어 있다. 예를 들어, 척수 손상된 여성 및 버거병 (buerger's disease) 환자에서 완전한 회복은 아니지만, 부분적으로 성공한 보고들이 있다 (Kim, SW. et al., Stem Cells, 2006; Kang, KS. et al., Cytotherapy, 7:368, 2005). 그러나, 이러한 세포들의 발달 메커니즘 뿐만 아니라, 이 세포들을 어떻게 잘 배양하고 증식하는지에 대해서는 여전히 잘 알려져 있지 않다.

제대혈에서 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 분리방법을 적용하였을 때 세포의 분리율이 20% 내외이며, 5시간 이내의 신선한 혈액을 사용하였을 때는 50% 이지만, 그 이후가 되면 20% 이하로 떨어지고 분리 후에도 세포의 증식이 잘되지 않는 한계를 보였다.

이에 본 발명자들은, 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기에서 배양하여, 선형태 (spindle-shape)의 세포가 대량으로 증식되며, 집락을 이루는 것을 발견하고 이를 지속적으로 배양하였을 때, 세포의 특성이 일정정도 유지되는 것을 확인하였다. 그래서 기존의 방법에서 문제시 되는 제대혈 유래 비조혈계 만능 줄기세포 및 중간엽 줄기세포의 효율적 분리 및 대량증식이 가능한 배양방법으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 목적은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기 내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분리방법에 의해 분리된 제대혈 유래 만능 줄기세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제대혈 유래 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 함유하는 세포치료제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 신규한 줄기세포 배양용 배지를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 상기 배지에서 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 구 배양 또는 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 줄기성 증가방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 관점은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기 내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.

상기 배양물로부터 줄기세포를 회수함에 있어서, 줄기세포의 면역학적 특성을 이용하여 분리하는 것을 더 포함할 수 있다.

먼저, 제대혈로부터 단핵세포의 분리는 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는 제대혈과 Hetasep을 혼합하여 적혈구를 제거한 후 피콜상 (Ficoll-plaque)을 이용하여 단핵세포를 분리함으로써 얻을 수 있다. 여기서, 제대혈과 Hetasep의 혼합비는 제대혈 5ml 당 0.5~2ml로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 제대혈로부터 단핵세포의 분리 수율을 높이기 위해, 분만 직후 회수한 제대혈, 분만 직후 회수하여 실온에서 12~48시간 동안 보관한 제대혈 또는 3~5℃에서 6~72시간 동안 보관한 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 제대혈에서 분리된 단핵세포로부터 줄기세포를 분리하는 방법에 있어서, 피브로넥틴을 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어 '피브로넥틴을 포함하는 배양 용기'란, 단핵세포와 피브로넥틴이 접촉할 수 있는 상태를 의미한다. 예를 들면, 피브로넥틴은 배양 용기에 코팅되거나, 입자 형태 또는 3차원 구조물 형태로 배지에 포함될 수 있다. 한 양태로서, 피브로넥틴이 배양 용기에 코팅된 경우, 피브로넥틴은 0.1∼1mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에서 피브로넥틴은 특별한 제한 없이 동물로부터 유래된 것을 사용할 수 있으나, 사람으로부터 유래된 것이 바람직하다. 상기 피브로넥틴은 인공 합성 (예, 화학적 합성법, 단백질 합성 장치를 이용한 합성 등) 또는 생합성 (예, 재조합 DNA 기술, 섬유아세포 배양 등)을 통해 제조하거나, 사람을 포함한 동물의 혈장 또는 세포외기질로부터 분리함으로써 입수할 수도 있다. 상기 피브로넥틴은 피브로넥틴의 단편 (fragment) 또는 펩타이드이거나, 이를 포함할 수 있다.

단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기 내에서 배양할 때, 이용 가능한 배지는 특별히 제한되지 않으나, 기본 배지로는 SNU-1 또는 EGM-2를 이용하는 것이 바람직하다.

'SNU-1 배지'의 조성은 아래와 같다 (표 1).

표 1

	SNU-1(mg/l)		SNU-1(mg/l)		SNU-1(mg/l)
CaCl2(anhyd.)	200	L-Isoleucine	78	i-Inositol	3
KCL	400	L-Leucine	78	Riboflavin	0.15
MgSO4(anhyd.)	97.67	L-Lysine HCL	108.75	Thiamine HCL	1.5
NaCl	7635	L-Methionine	22.5	L-Alianine	17.8
NaH2PO4 H2O	140	L-Pheylalanine	48	L-Asparagine H2O	30
D-Glucose	1000	L-Serin	21	L-Aspartic Acid	26.6
Phenol Red	10	L-Threonine	72	L-Glutamic acid	29.4
Sodium Pyruvate	110	L-Tryptophan	15	L-Proline	23
L-Arginine HCL	189	L-Tyrosine 2Na 2H2O	54	Nicotinamide	1.5
L-Cystine 2HCL	36	L-Valine	69	Pyridoxine Hcl	1.5
L-Glutamine	292	D-Ca pantothenate	1.5	NaHCO3	1000
Glycine	15	Choline Cholride	1.5
L-Histidine HCL H2O	63	Folic Acid	1.5

본 발명에서는 상기 기본 배지에 FGF-B (Fibroblast Growth Factor), 아스코르브산 (Ascorbic acid), EGF (Epodermal Growth Factor), 하이드로코르티손 (hydrocortisone), IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) 또는 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), 헤파린 (heparin)을 첨가하고, 필요에 따라 GA-1000 (Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B)을 추가로 첨가하는 것이 바람직하다.

보다 바람직하게는, 상기 기본 배지에, 우태아혈청 (FBS) 20%, bFGF (Fibroblast Growth Factor) 1~40ng/ml, 아스코르브산 0.1~5.0㎍/ml, EGF (Epidermal Growth Factor) 1~40ng/ml, 하이드로코르티손 0.1~1㎍/ml, IGF-I (Insulin-like Growth Factor-1) 1~40ng/ml 또는 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 1~5ng/ml 및 헤파린 20~25㎍/ml를 첨가하고, 필요에 따라 GA-1000 (Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B)을 추가로 첨가하는 것이다.

한편, 단핵세포를 배양하고 3일 후, 부착되지 못한 단핵세포는 제거하고 부착된 단핵세포만을 계속 배양한다. 이로써, 부착된 단핵세포 중 줄기세포만 선택적으로 증식하게 되며, 분리 후 12~20일 사이에 빠르게 증식하는 줄기세포를 관찰할 수 있다. 여기서, 배지는 2~3일 간격으로 교체하는 것이 바람직하다.

배양물로부터 제대혈 유래 만능 줄기세포를 수득하는 방법으로는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법 (Int. Immunol., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 중간엽 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법 (J. Immunol., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양물 등으로부터 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로는, 세포의 표면에 발현되어 분자 (이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 예시할 수 있다. 어떠한 방법도 세포의 표면 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로써, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), APC (allo-phycocyanin), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차 항체와 목적 세포 샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

본 발명에 의해 분리된, 제대혈 유래 만능 줄기세포는 하기 특성 중 적어도 한 특성을 가지고 있다:

(a) 전사조절인자인 c-myc, ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다.

(b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식한다.

(c) 30 내지 45의 CPDL (cumulative population doubling level)을 보인다.

(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다.

(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능하다.

(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다.

본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포가 Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc, ZNF281을 발현한다는 것은 미분화 상태가 유지되고 있음을 의미한다.

또한, 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 30~45의 CPDL (cumulative population doubling level)을 보여, 증식력이 우수함을 알 수 있다. 핵형 분석에 의해, 본 발명의 세포는 빠르게 증식하지만, 정상 염색체의 구조를 가지고 있음이 확증되었다.

본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 조혈모 줄기세포 마커 또는 면역거부반응 관련 마커로 알려진 CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이와 같이 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 조혈 및 면역거부반응 관련 마커가 결여되어 이식시 혈관형성과 거부반응을 최소화할 수 있어 동종간 이식 (allogenic transplantation)에 유용한 세포로 사용할 수 있다.

본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 중배엽의 골형성세포, 연골세포, 지방세포로의 분화뿐만 아니라 내배엽의 간세포 및 외배엽의 신경세포와 망막관련세포로도 분화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb 등 다양한 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다. 이러한 사이토카인 또는 케모카인을 분비함으로써 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.

이러한 특징을 갖는 줄기세포는 신규한 것으로서, 본 발명은 상기와 같은 특징을 갖는 제대혈 유래 만능 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포는 골형성세포, 연골세포, 지방세포, 간세포, 신경세포를 비롯한 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있어 그에 대응되게 다양한 질병 치료에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 함유하는 세포치료제를 제공한다. 본 발명의 세포치료제는 예를 들면, 신경질환 (예, 퇴행성 신경질환), 골관절염 (예, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염), 골결실 (예, 골다공증), 간질환 (예, 간경화), 심혈관계 질환을 포함한 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 세포치료제는 세포를 보호 및 유지하는 하나 이상의 희석제를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS (Phosphate Buffered Saline), HBSS (Hank's balanced salt solution) 등의 완충용액, 혈장 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.

한편, 본 발명은 신규한 줄기세포 배양용 배지에 관한 것이다. 상기 배지는, 우태아혈청 (FBS) 20%, bFGF (Fibroblast Growth Factor) 1~40ng/ml, 아스코르브산 0.1~5.0㎍/ml, EGF (Epidermal Growth Factor) 1~40ng/ml, 하이드로코르티손 0.1~1㎍/ml, IGF-I (Insulin-like Growth Factor-1) 1~40ng/ml 또는 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 1~5ng/ml 및 헤파린 20~25㎍/ml가 첨가되고, 필요에 따라 GA-1000 (Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B)이 추가로 첨가된 EGM-2 또는 SNU-1 배지를 포함한다.

상기 줄기세포 배양용 배지는 신규한 것으로서, 상술된 바와 같이 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법에서도 이용되었다. 본 발명의 배지는 제대혈 유래 줄기세포를 비롯한 모든 성체줄기세포의 증식에 유용하므로 성체줄기세포를 배양하는데 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 본 발명의 배지에서 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 상기 줄기세포는 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있다.

한 양태로서, 본 발명의 줄기세포 배양용 배지는 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포 배양에 이용될 수 있다. 본 발명의 제대혈 유래 만능 줄기세포를 본 발명의 배지에서 배양하면서 선 형태 (spindle-shape) 세포의 집락이 확인된 지 3~5일 후에 계대 배양하는 것이 바람직하다. 배양은 5% CO₂ 조건에서 실시하는 것이 적합하고, 배양은 5~30일 동안 지속할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 줄기세포를 구 배양 (sphere culture) 또는 삼차원

배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 줄기성 (stemness)을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 삼차원 배양시에 MEF (Mouse embryonic fibroblast cell)를 이용하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다. 또한 상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 더 포함할 수 있다.

상기에서, 줄기성 증가란, 배아 줄기세포양 집락 (Embryonic Stem Cell-like colony)을 형성하거나, Oct4, Sox2 등과 같은 전사조절인자를 더 강하게 발현하는 것을 의미한다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 만능 줄기세포는 인간 제대혈 유래로, 피브로넥틴을 포함하는 배양 용기 내에서 배양하면, 기존의 성체줄기세포에 비해 미분화 단계에서 오랜 기간 동안 왕성한 세포 성장을 하며, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 연골세포, 골형성세포 및 지방세포 등 여러 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 신경계 질환, 심혈관계, 골격계 질환 등의 치료에 효과적이다.

도 1은 인간 제대혈 유래 세포를 분리한 후, 각각 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째 세포 성장 형태를 나타낸 사진 (A, B, C, D 및 E) 및 새로운 용기에 옮긴 후 Passage 3에서 세포 성장을 나타낸 사진이다(F).

도 2는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 시간에 따른 세포 증식을 누적으로 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포를 장기간 배양한 후 핵형분석을 실시한 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포에 여러 가지 마커를 부착시켜 유세포분석을 한 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포가 미분화상태 줄기 세포 마커의 발현을 유세포분석기와 세포면역염색을 통하여 분석한 결과이다 (A: Oct4 유세포 분석 결과 그래프, B: 면역염색에서 Oct4 발현 사진 C: Oct4 발현 사진의 핵염색 사진, D: Oct4 발현사진과 핵 염색 사진의 합성).

도 6은 terra-1, hUCB-MSC, AD-MSC 및 AM에서 ZNF281의 발현을 확인한 결과(상)와 3 내지 9회 계대 배양된 hUCB-MSC에서 ZNF281의 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과(하)이다.

도 7은 본 발명에 따른 인간 제대혈 유래 만능 줄기세포가 ZNF281, Oct4, Sox2, c-myc 및 Rex-1과 같은 미분화상태를 유지하는데 있어 중요한 유전자를 발현하고 있음을 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.

도 8은 인간 제대혈 유래 만능 줄기세포가 각각 골형성세포, 지방세포, 연골세포 및 신경세포로 분화되었음을 나타내는 사진이다 (A: 골형성 세포로 분화 유도하지 않은 대조군을 Alizarin Red S로 염색한 사진, B: 골형성세포로 분화를 유도한 세포의 Alizarin Red S 염색 사진, C: 지방 세포로 분화를 유도하지 않은 대조군의 Oil Red O 염색 사진, D: 지방세포로 분화를 유도한 세포의 Oil Red O 염색 사진, E: 연골세포로 분화 유도한 세포의 Toluidine Blue 염색 사진, F: 연골세포로 분화 유도 후 촬영한 세포 pellet의 사진, G: 신경세포로 분화 유도 후 신경세포의 마커인 Tuj-1 및 MAP2로 면역형광염색한 사진).

도 9는 인간 제대혈 유래 만능 줄기세포를 골형성세포 및 지방세포로 분화를 유도한 후, RNA를 추출한 후 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다 ( PPAR-γ와 FABP-4는 지방 세포 분화의 마커이고, Collagen Type 1은 골형성세포 분화의 마커이다. PPAR-γ: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma, FABP-4: Fatty Acid Binding Protein-4, GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ).

도 10은 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 망막 관련 단백질의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 11은 인간 제대혈 유래 만능 줄기세포를 배양한 배양액을 수집하여 세포가 분비한 여러 사이토카인을 antibody array를 이용하여 분석한 사진이다 (A: hUCB-MSC1, B: hUCB-MSC2, C: hUCB-MSC3, D: 배열된 항체의 순서 POS: Positive control, NEG: Negative control, GCSF: Granulocyte-Colony Stimulating Factor, GM-CSF: Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor, ICAM-1: Intra-Cellular Adhesion Molecule, IFN-γ: Interferon-γ, IL: Interleukin, MCP: Monocyte Chemoattractant Protein, M-CSF: Monocyte-Golony Stimulating Factor, MIG: Monokine induced by Interferon Gamma, MIP: Macrophage Inflammatory Protein, RANTES: Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted, TGF-β: Transforming Growth Factor-β, TNF: Tumour Necrosis Factor, sTNFR: soluble Tumour Necrosis Factor Receptor, PDGF-BB: Platelet-Derived Growth Factor-BB, TIMP2: Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2).

도 12, 13은 본 발명에 의해 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포를 구 배양 (sphere culture) 및 mouse fibroblast cell인 STO cell을 이용하여 삼차원적으로 배양한 사진 및 전사조절인자인 Oct4, Sox2 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다 (도 12 : 구배양을 통한 제대혈 유래 만능 줄기세포의 삼차원배양, 도 13: STO 세포를 이용한 제대혈 유래 만능 줄기세포의 삼차원배양).

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 배양, 증식능 조사 및 핵형 분석

Full term UCB 샘플(n=20)은 산모 동의하에 수집하였다. 우선 Full term UCB를 HetaSep (Stem cells Technologies INC, Vancouver, BC)을 이용하여 적혈구를 우선적으로 분리를 하였다. 그 다음은 기존의 방법과 마찬가지로 피콜상 (ficoll gradient)에서 분리하였다. 분리한 단핵세포를 20% FBS를 함유한 EGM-2 SingleQuots을 첨가한 SNU-1 배지 또는 EGM-2 (Lonza)를 이용하여 피브로넥틴을 0.1mg/ml - 1 mg/ml의 농도로 코팅한 6 well plate에 1 x 10^5~8세포로 배양하였다. EGM-2 SingQouts의 구성은 heparin, Ascorbic acid, rhEGF, hydrocortisone, VEGF, rhFGF-B, R³-IGF-1, GA-1000으로 구성되어 있다. 세포를 배양한지 3일 후 부착되지 못한 단핵세포를 제거하고 배지는 2 내지 3일 간격으로 교체해주었다.

상기 분리 후, CO₂ 5% 조건에서 배양한 지 5~30일째에, 일정한 선형태의 세포들이 집락을 이루는 것을 확인하였다 (도 1A). 생성된 집락은 빠른 속도로 증식을 하였고, 집락이 관찰된 지 3일에서 7일 후, 0.125% Trypsin-EDTA로 부유시킨 후, 새로운 용기로 이동시켜, 세포를 계속 유지하였다 (도 1B, 도 1C, 도 1D, 도 1E 및 도 1F). 도 1은 이와 같은 과정을 보여주는 사진으로 시간이 경과함에 따라 세포 집락의 크기가 증가하는 것을 볼 수 있으며, 또한 계대배양 후에도 세포의 형상이 일정하게 유지되는 것을 관찰할 수 있다. (도 1. 본 실시예에 의해서 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포의 형성과 증식 과정을 보여주는 사진. A: 단핵 세포 배양 14일 후 초기 집락의 형태, B: 15일, C: 16일, D: 17일, E: 18일, F: 계대배양 후 passage 3에서 관찰한 세포의 사진).

지속적으로 세포를 배양하면서, 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포의 증식력이 어느 정도 되는지 조사하기 위하여 CPDL (cumulative population doubling level)을 측정하였다 (Cristofalo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95, 1998). 세포는 이분법을 이용하여 증식을 한다. 따라서 세포의 성장속도는 한 개의 세포가 두 개의 세포로 되는 시간이 어느 정도인지에 따라 결정된다. 이것을 Doubling time이라 하며 세포의 증식력을 평가할 수 있는 척도로 사용될 수 있다. 만약 CDPL값이 10이라면 하나의 세포가 10번의 분열을 함을 의미하며 이를 수치상으로 계산하면 하나의 세포가 약 1000개의 세포까지 증식함을 의미한다. 기존의 제대혈 유래 줄기세포의 가장 큰 문제점은 지방 조직이나 골수 유래의 중간엽 줄기세포에 비하여 현저히 떨어지는 증식력이었고 세포의 대량 증식인 임상적용 측면에서도 증식력이 중요하다고 볼 수 있다. 측정방법은 다음과 같이 진행하였다. 우선 다른 제대혈 샘플에서 분리한 세 종류의 제대혈 유래 만능 줄기세포를 100 디쉬에 2x10⁵개씩 배양을 하고, 3일 또는 4일 간격으로 계대를 하며 세포계산기를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 세포의 증식이 멈출 때까지 계속적으로 세포를 배양하며 세포 수를 측정하였다. 이렇게 구한 세포 수를 다음과 같은 수학식 1을 이용하여 CPDL값을 구한다.

[수학식 1]

N_H/N_I = 2^Xor [log(N_H) - log(N_I)]/log(2) = X

여기서 N_I는최초 배양을 시작할 때의 세포 수, N_H는 계대를 할 당시 포화상태에서의 세포 수를 의미한다.

이와 같은 방법으로 지속적으로 세포를 유지하며 값을 구하였다. 대조군으로는 역시 제대혈에서 유래한 내피전구세포 (hUCB-EPC; human Umbilical cord blood derived endothelial progenitor cells)를 이용하였다. 그 결과는 도 2의 그래프와 같이 제대혈 유래 내피전구세포가 두 달 정도의 배양 시간 동안 약 20 CPDL을 보인 반면, 제대혈 유래 만능 줄기세포의 경우 세 가지 다른 샘플 모두 40~45 CPDL을 보였다. 이러한 수치는 이론상으로 하나의 세포집락에서 10¹²까지 증식할 수 있음을 의미한다.

일반적으로, 이러한 왕성한 증식력을 보이는 세포는 암세포화되어 빠르게 폭발적으로 증가하는 경우가 있을 수 있다. 암세포화된 세포는 인체 내에서 여러 조절 신호들을 무시하고 크게 증식하는 경향이 있기 때문에, 세포치료제로 이용할 수 없으며 연구의 목적도 없다고 볼 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포가 정상적인 염색체를 가진 세포인지 확인을 반드시 해야 하며, 그 방법으로서 핵형분석을 통하여 세포의 염색체 이상을 확인해 보았다. 도 3에서 보는 바와 같이, passage 10의 세포에서도 정상 염색체의 구조를 가지고 있는 것이 확인되었다.

실시예 2: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 표면 항원 분석

배지 내에 현탁한 세포들을 특성을 분석하는 flow cytometry 실험을 하였다. 세포 표면 항원 phenotyping을 위해, 3-4 계대 세포들을 수득하여 fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 phycoerythrin (PE)가 결합된 항체로 염색하고, FACS Aria (Becton Dickinson, NY)으로 분석하였다.

본 발명에 의해 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포 (partially pluripotent stem cell)의 특성을 분석하기 위해 표지 항원으로는 CD10 (T세포 마커), CD14 (단핵세포 마커), CD24 (상피세포 마커), CD29 (단핵세포 마커), CD31 (내피세포 마커), CD34 (조혈모 줄기세포 마커), CD44 (중간엽 줄기세포 마커), CD45 (비조혈모 줄기세포 마커), CD51/61 (파골세포 마커), CD73 (중간엽 줄기세포 마커), CD90 (중간엽 줄기세포 마커), CD105 (중간엽 줄기세포 마커), CD133 (조혈모 줄기세포 마커), HLA-DR(면역거부반응 관련 마커)를 사용하였고, 이를 Flow cytometer를 이용하여 분석하였다. 실시 결과는 표 2과 같다. 도 4는 아래의 결과를 그래프로 표시한 것이다.

표 2

제대혈유래 만능줄기세포의 CD 항원에 대한 양성 세포 비율

CD 시리즈 항체들	양성으로 염색된 세포 / 총 세포 (%)
CD10	0.2 ± 0.1
CD14	2.0 ± 1.0
CD24	68.7 ± 2.9
CD29	100 ± 0.0
CD31	0.4 ± 0.7
CD34	3.5 ± 3.4
CD44	100 ± 0.1
CD45	0.0 ± 0.1
CD51/61	6.4 ± 10.8
CD73	99.6 ± 0.5
CD90	99.7 ± 0.3
CD105	99.5 ± 0.8
CD133	0.1 ± 0.1
HLA-DR	2.0 ± 3.2

실시예 3: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 ZNF281 발현 및 Core transc ription factor 발현 양상 분석

ZNF281 (Zinc finger protein 281)은 ESC에서 핵심 전사 인자 중 하나이다 (Wang J et al. (2006) Nature 444, 364-368). 초기에 ZBP-99로 명명된, ZNF2 81은 ZBP-89와 91% 아미노산 서열 유사성 및 79% 서열 동일성을 공유하는 4개의 Krppel형 징크 핑거를 보유하고 있다. 또한, 두 유전자의 카르복시 말단 절편에는 잘 보존된 아미노산 서열이 존재한다. ZNF281 c DNA의 예상되는 오픈리딩 프레임은 99kDa 단백질을 암호화한다. EMSA (Electrophoretic mobility shift as say) 결과로는 GASTRIN 및 ORNITHINE DECARBOXYLASE 유전자의 GC-리치(rich) 프로모터 부위에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다 (Law DJ et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 262, 113-120; Lisowsky T et a l. (1999) FEBS Lett 453, 369-374). ZNF281은 mass spectral multidimensional protein identification t echnology와 조합된 탠덤 친화도 정제(tandem affinity purification)에 의해 c-MYC 연관 단백질 중 하나로 동정되었다 (Koch HB et al. (2007) Cell Cycle 6, 205-217.).

POU family transcri ption factors와 같은 Oct3/4 유전자들은 분화된 조직에서는 존재하지 않고, 높은 증식능을 함유하는 미분화된 줄기 세포들에서 특별히 발현되는 것으로 알려져 있다 (Tai M-H. et al., Carcinogenesis 26:4 95, 2005; Tondreau T. et al., Stem cells, 23:1105, 2005). 일반적으로 배아 줄기세포의 마커로서 쓰이지만, 위와 같은 특성으로 미분화상태를 의미하는 마커로서 쓰이기도 한다. 그리하여 stemness의 마커로서 Oct4를 사용하여 세포 콜로니를 염색한 결과, 많은 세포들이 핵 부위에 Oct4가 염색되는 것을 확인할 수 있었으며, Flow cytometry를 통한 분석에 있어서도 많은 세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

세포 내 단백질 (intracellular proteins)의 염색을 위해, 세포들은 4℃에서 4% 포름알데히드로 하룻밤 동안 고정하고, 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)으로 10분 동안 permeabilize하였다. 슬라이드와 접시는 인간 Oct4 (1:200)에 대한 마우스 1차 항체로 1시간동안 인큐베이션한 다음, PBS (phosphate buffered saline; Gibco)로 세척하고, 적색형광염료인 Alexa594가 결합된 goat 항마우스 IgG 2차 항체 (Invitrogen)로 1시간 동안 인큐베이션하여 면역염색을 실시하고, 대조염색으로 DAPI를 이용하여 핵을 염색하였다 .

도 5, 6에 나타난 바와 같이, Oct4 염색 결과, 많은 제대혈 유래 만능 줄기세포에서 Oct4를 발현하는 것으로 나타났다 (도 5A: Oct4 유세포 분석 결과 그래프, B: 면역염색에서 Oct4 발현 사진 C: Oct4 발현 사진의 핵염색 사진, D: Oct4 발현사진과 핵염색 사진의 합성 사진).

이러한 Oct4와 같은 유전자는 줄기세포의 stemness와 매우 밀접하게 관련되어 있으며, 실제로 Oct4, Sox2등과 같은 유전자를 과발현시켜 성체줄기세포에서 배아줄기세포와 유사한 구조의 전능성을 지닌 세포를 유도하는 기술 또한 최근에 연구되었다 (Takahashi et al, Cell, 131(5), 861-872, 2007). 따라서 줄기세포에서 이러한 유전자의 발현은 줄기세포의 stemness를 잃지 않으면서 미분화상태를 유지하는데 있어 매우 중요하다 할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포에서 기존의 논문에 의해 알려진 ZNF2 81, Oct-4, Sox2와 같은 유전자의 발현이 어떻게 나타나는지 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 확인해 보기로 하였다.

본 실시예를 위해 작제된 프라이머는 다음 표 3와 같다.

표 3

Target Gene	방향	서열	서열번호
OCT-4	센스 프라이머	5'-CGAAAGAGAAAGCGAACCAG-3'	1
OCT-4	안티 센스 프라이머	5'-GCCGGTTACAGAACCACACT-3'	2
SOX2	센스 프라이머	5'-CCTCCGGGACATGATCAG-3‘	3
SOX2	안티 센스 프라이머	5'-TTCTCCCCCCTCCAGTTC-3'	4
C-MYC	센스 프라이머	5'-TACCCTCTCAACGACAGCAG-3'	5
C-MYC	안티 센스 프라이머	5'-GGGCTGTGAGGAGGTTTG-3'	6
ZNF281	센스 프라이머	5'-ACGTAACAGCGCAGACAGAA-3'	7
ZNF281	안티 센스 프라이머	5'-GTGTTGAAGCCCAAGTGGTT-3'	8
REX-1	센스 프라이머	5'-TGAAAGCCCACATCCTAACG-3'	9
REX-1	안티 센스 프라이머	5'-CAAGCTATCCTCCTGCTTTGG-3'	10

도 7에서 실험 결과를 보면, Oct-4, Sox2, c-myc, ZNF281, REX-1 등의 유전자가 발현하는 것을 확인할 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포의 만능 줄기세포로서의 능력을 보여 주는 것이라 할 수 있을 것이다.

실시예 4: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 골형성세포로의 분화

골형성세포로 분화를 유도하기 위하여 세포를 부착시키고, 세포가 부착되고 나서 약 70-80% confluency가 될 때까지 배양하였다. 70-80% confluency에 도달했을 경우 골분화 유도 배지로 교환하였다. 골분화 유도 배지는 DMEM low glucose에 10% FBS를 첨가하고, 10 mM beta-glycerophosphate (Sigma-Aldrich), 0.1 μM D examethasone (Sigma-Aldrich), 50 μM ascorbate (Sigma-Aldrich)를 첨가하여 제조하였다. 배지는 3일마다 교환해주고, 분화유도는 약 2주간 실시하였다.

2주후 골분화로 인한 calcium mineralization을 확인하기 위해 Alizarin red s staining을 실시하였다. 염색방법은 다음과 같다. 배지를 제거한 다음 증류수를 이용해 2번 세척 후, 차가운 70% EtOH를 사용하여 4℃에서 1시간 고정하였다. 다시 증류수로 2회 세척 후 40mM Alizarin red s 를 사용하여 상온에서 10분간 염색하였다. 그리고 나서 증류수를 이용하여 5회 세척하였다.

염색을 실시한 결과, 도 8A, 도 8B에 나타난 바와 같이 분화를 유도하지 않은 도 8A는 Alizarin reds에 염색된 칼슘이 거의 보이지 않지만, 분화를 유도한 도 8B 에서는 적색으로 염색이 되는 것을 관찰할 수 있다. 이것은 제대혈 유래 만능 줄기세포가 골형성세포로 분화하며 칼슘을 분비함을 의미한다고 볼 수 있다.

실시예 5: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 지방세포로의 분화

지방세포 분화를 유도하기 위해서 세포가 부착되고 나서 약 70-80% confluency가 될 때까지 배양하였다. 70-80% confluency에 도달했을 경우 지방분화 유도 배지로 교환하였다. 지방분화 유도 배지는 DMEM low glucose에 10% FBS를 첨가하였다. 1μM Dexamethasone, 10㎍/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.5 mM 3-i sobutyl-1-methylxanthine (Sigma-Aldrich), 0.2 mM indomethacin (Sigma-Aldrich)을 첨가하여 분화배지를 제조하였다. 분화유도 배지는 3일마다 교환해주고, 분화유도는 약 2-3주간 실시하였다.

2-3 주후 Oil red O 염색을 실시하여 지방분화가 유도된 것을 확인한다. 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세척한 후 10% formalin을 넣고 상온에서 5분간 두었다. 포르말린을 제거하고, 다시 새로운 포르말린을 동량 넣고 상온에서 최소 1시간 이상 고정하였다. 포르말린을 제거한 후에, 60% isopropanol을 이용하여 세척하였다. 완전히 마를 때까지 기다린 후, Oil Red O 염색약을 넣고 상온에서 10분간 염색하였다. 염색약을 제거한 후, 곧바로 증류수를 넣고 세척하였다.

지방 줄기세포로의 분화를 거치는 세포들은 oil red O에 의해 염색되었을 때 붉은 색을 나타내는데, oil red O는 지방세포의 lipid droplet을 붉은 색으로 염색하기 때문이다. 도 8C 및 8D에서 보는 바와 같이, 분화를 유도하지 않은 도 8C는 lipid droplet이 많이 보이지 않을 뿐만 아니라 염색도 거의 되지 않지만, 분화를 유도한 도 8D는 lipid droplet이 많이 보이고 붉은 색으로 염색된 것을 관찰할 수 있다.

실시예 6: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 연골세포로의 분화

연골세포로 분화를 유도하기 위해, Lonza에서 나온 rTGF-beta 3을 함유한 연골세포 형성 배지 (PT-3003)에 3주 동안 처리하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, 연골세포 형성 (osteogenesis)은 1주 간격으로 측정하였다.

연골세포로 분화되었는지 알아보기 위해, toluidine blue staining을 실시하였다. 세포들을 10시간 동안 4% 포름알데하이드로 고정하고, 그 후 다시 10시간 동안 picric acid로 고정하였다. 그 후 cryosection 하여 3분동안 toluidine blue staining을 하였고, hematoxilin으로 3초 동안 counterstaining을 하였다.

연골세포로의 분화를 거치는 세 포들은 pellet이 무너지지 않고 일정한 형태를 유지하며 toluidine blue에 의해 염색되었을 때 푸른색을 나타내는데, 도 8E 및 도 8F에서 나타난 바와 같이, 푸른색으로 염색되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 형태도 잘 유지하고 있는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 골형성세포 및 지방세포로 분화 유도 후 유전자 발현 레벨의 변화

줄기세포는 분화 과정을 거치면서 유전자 발현의 양상이 현저하게 변화하는 것을 관찰할 수 있다. 일반적으로 줄기세포가 지방세포로 분화를 하게 되면 PPAR-γ (Peroxisome Proloferator-activated Receptor-γ)나 FABP4 (Fatty Acid Binding Protein 4)와 같은 유전자의 발현이 증가하고, 골형성세포로 분화하게 되면 Collagen Type 1등의 유전자 발현이 증가한다 (Mat hews et al., J Am Acad Dermatol, 56(3), 472-492, 2007; Cho et al., J. Cell. Biochem., 96, 533-542, 2 005). 따라서 분화를 유도한 후 특정 세포에서 발현하는 유전자의 발현 레벨을 봄으로써 간접적으로 분화를 확인할 수 있다. 실험 방법은 다음과 같다.

골형성세포와 지방세포를 각각 유도 2 -3주 후에 Trizol (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하였다. AccuPower RT Premix (Bioneer)를 사용하여 cDNA를 합성하고, Maxime PCRPreMix Kit (Intronbio)를 이용하여 PCR을 수행하였다.

본 실시예에 사용하기 위해 작제한 프라이머는 다음 표 4와 같다.

표 4

Target Gene	방향	서열	서열번호
PPAR-γ	센스 프라이머	5'-TGCTTTTGTAGGTACCTGGA-3'	11
PPAR-γ	안티 센스 프라이머	5'-CATAAACTCTCGTGGAAGTG-3'	12
FABP4	센스 프라이머	5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'	13
FABP4	안티 센스 프라이머	5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'	14
Collagen Type 1	센스 프라이머	5'-GAGAGAGAGGCTTCCCTGGT-3'	15
Collagen Type 1	안티 센스 프라이머	5'-CACCACGATCACCACTCTTG-3'	16

실험을 실시한 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이 지방세포 분화 마커인 PPAR-γ와 FABP4는 분화를 유도한 세포에서 발현이 크게 증가하는 것을 볼 수 있으며, 골형성세포의 분화 마커인 Collagen Type 1의 경우도 마찬가지로 분화 유도한 세포에서 크게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 한편, loading control인 GAPDH의 경우 분화 유도한 세포와 하지 않은 세포 모두 동일하게 나왔으며, 따라서 실험결과의 정당성을 뒷밤침 하였다.

실시예 8: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 신경세포로의 분화

신경세포로 분화를 유도하기 위해, 일단 5% FBS, 10ng/ml bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) 를 함유한 DMEM으로 구성된 배지에서 24시간 동안 전처리 (preincubation)하였다. 본격적인 신경 분화를 유도하기 위해서 1% DMSO, 100uM BHA, 0.5mM VPA, 10mM KCl, 10ng/ml NGF, B27를 함유한 DMEM으로 구성된 신경세포 형성 배지에 24시간 동안 처리하였다. 신경세포로 분화되었는지 알아보기 위해, 세포를 4% paraformaldehyde에 고정한 후 Tuj-1, MAP-2, GFAP, Neurofilament-160의 신경세포 마커로 면역염색을 하였을 경우 네 가지 마커를 발현하는 것을 확인할 수 있었다 (도 8G).

실시예 9: 본 발명에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 망막(retina) 관련 특성 단백질 발현 분석

본 실시예는 제대혈 유래 만능 줄기세포에서 망막 (retina) 관련 특성을 알아보기 위해서 면역형광염색법을 이용하여 발현정도 및 패턴에 관해 확인하였다.

망막 (retina)에서만 특이적으로 발현하는 단백질의 발현 양상을 확인하였다.

도 10는 망막에서 특이적으로 발현하는 단백질을 면역형광염색을 통하여 발현 양상을 확인한 사진이다. A)에서는 PAX6 및 Hu protein의 발현양상을 관찰하였다. PAX6는 retina progenitor marker로 알려져 있으며, Hu protein은 망막을 구성하는 세포 중 하나인 ganglion cell 및 amacrine cell에서 특이적으로 발현하는 단백질이다. 일반적인 세포 배양 상태에서는 발현하지 않는 것을 확인하였다.

B)에서는 Opsin과 Rhodopsin의 발현양상을 확인하였다. Opsin의 경우는 Cone cell에 특이적으로 발현하는 단백질이며, Rhodopsin의 경우는 rod cell에 특이적으로 발현하는 단백질이다. 일반적인 세포 배양 상태에 서 Opsin은 발현하지 않았지만 Rhodopsin은 발현하는 것을 확인하였다.

C)에서는 C RX 및 Recoverin의 발현양상을 확인하였다. CRX는 pan-photoreceptor marker로 알려져 있으며, Recoverin 은 photoreceptor marker로 알려져 있다. 일반적인 세포 배양 상태에서는 발현하지 않는 것을 확인하였다. (배율 400배, scale bar = 50um)

실시예 10: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포에서 분비된 사이토카인 분석

줄기세포를 이용한 치료의 가능성은 크게 두 가지로 나뉠 수 있다. 첫 번째는 손상된 세포로의 직접적인 분화를 통한 치료효과이며, 두 번째는 생체 내에서 기존의 세포들에게 치료효과를 나타낼 수 있는 긍정적인 변화를 일으킬 여러 사이토카인이나 성장인자를 분비하는 능력이다. 일반적으로 줄기세포는 여러 사이토카인 또는 성장인자를 분비하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al. Cytokine. 2005). 이러한 효과를 paracrine effect라 부른다. 본 발명에 의하여 분리, 증식한 제대혈 유래 만능 줄기세포의 사이토카인 분비 양상이 어떠한지 알아보기 위해, human Cytokine antibody array (RaybioTech. Norc ross, USA)를 이용하여 조사해 보았다.

우선 FBS와 Supplement를 제거한 배양액을 이용하여 세포를 24시간 안정화시킨 후, 2시간 간격으로 배지를 1ml씩 수집하였다. 수집한 배지를 100㎕씩 합쳐 단백질 정량법을 이용하여 정량한 후, array를 실시하였다.

도 11에서 볼 수 있듯이, 세 개의 다른 샘플로부터 분리한 제대혈 유래 만능 줄기세포에서 공통적으로 IL-8, TIMP-2 등이 분비되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 외 TGF-β, RANTES, CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb 와 같은 사이토카인들도 분비되는 것을 확인할 수 있었다 (도 11A: hUCB-MSC1의 array 분석 사진, 도 11B: hUCB-MSC2 , 도 11C: hUCB-MSC3, 도 11D: antibody 배열 순서).

실시예 11: 본 발명에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포의 삼차원 배양

성체줄기세포는 일반적으로 culture dish에서 monolayer로 증식한다. 하지만 2D가 아닌 3D상태의 sphere로 증식시키면 더욱 stemness가 높은 세포를 선별하고 증식시킬 수 있음을 실험을 통해 확인하였다. sphere의 형성을 위하여 culture dish를 0.7% agarose로 coating을 시키는데 세포가 dish 바닥으로 침투하지 못하게 coating은 5mm 이상 되도록 한다. 세포를 seeding할 때에, single cell간의 부착을 최소화하기 위해 ㎠당 2000개 미만의 세포를 뿌렸다. 이렇게 얻어진 sphere는 40㎛ strainer를 이용하여 sphere를 형성하지 못한 single cell과 구분하였다. 그 결과 도 12에서 보는 바와 같이 sphere culture 시에 세포사하지 않고 sphere를 형성하여 줄기세포의 특징을 유지하는 것을 관찰할 수 있다. 또한 도 12A-D와 같이sphere culture를 통해 배양한 세포는 monolayer에서 배양한 줄기세포에 비해 상대적으로 OCT4, SOX2 등의 embryonic marker의 발현이 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.

Embryonic stem cell의 배양은 Mouse embryonic fibroblast cell 상에서 이루어진다. Mouse embryonic fibroblast cell이 내놓는 LIF 등 여러 가지 chemokine이 ES cell의 형태를 유지하고 분화하지 않도록 막는 역할을 해주기 때문이다. 제대혈 유래 만능 줄기세포를 mouse embryonic fibroblast cell line 상에서 배양한 결과 일반적인 성체줄기세포의 형태처럼 편평한 것이 아니라 삼차원적인 형태로 colony를 이루는 것을 관찰하였다. STO cell은 mitomycin C를 0.1 mg/ml로 처리하여 증식을 억제한 후에 0.1% gelatin이 coating된 dish에 2 x 10⁵ cell/ml로 seeding한 후 24시간 배양한 후 제대혈 유래 만능 줄기세포를 seeding하였다. 그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이 시간이 지남에 따라 세포가 STO cell위에서 Embryonic stem cell과 유사하게 증식하는 것을 관찰할 수 있다.

본 발명에 따른 만능 줄기세포는 인간 제대혈 유래로, 피브로넥틴을 포함하는 배양 용기 내에서 배양하면, 기존의 성체줄기세포에 비해 미분화 단계에서 오랜 기간 동안 왕성한 세포 성장을 하며, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 연골세포, 골형성세포 및 지방세포 등 여러 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 신경계 질환, 심혈관계, 골격계 질환 등의 치료에 사용될 수 있다.

Claims

제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기 내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 만능 줄기세포의 분리방법.
제 1항에 있어서,

상기 단핵세포는 제대혈을 Hetasep과 혼합하여 적혈구를 제거한 후 피콜상 (Ficoll-plaque)을 이용하여 단핵세포를 분리하는 단계를 거쳐서 수득하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 2항에 있어서,

제대혈과 Hetasep의 혼합 비율은 제대혈 5ml당 0.5~2ml로 하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

상기 제대혈은 분만 직후 회수한 제대혈, 분만 직후 회수하여 실온에서 12~48시간 동안 보관한 제대혈 또는 3~5℃에서 6~72시간 동안 보관한 제대혈인 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

상기 피브로넥틴이 포함된 배양 용기는 피브로넥틴은 배양 용기에 코팅되거나, 입자 형태 또는 3차원 구조물 형태로 배지에 포함된 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 5항에 있어서,

피브로넥틴이 배양 용기에 코팅된 경우, 피브로넥틴은 0.1∼1mg/ml로 포함되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

상기 피브로넥틴은 동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 7항에 있어서,

상기 동물은 사람인 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

상기 피브로넥틴은 인공적으로 합성되거나, 생합성된 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

상기 피브로넥틴은 피브로넥틴의 단편 또는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

배양시에는 우태아혈청(FBS) 20%, bFGF 1~40ng/ml, 아스코르브산 0.1~5.0㎍/ml, EGF 1~40ng/ml, 하이드로코르티손 0.1~1㎍/ml, IGF-I 1~40ng/ml 또는 VEGF 1~5ng/ml 및 헤파린 20~25㎍/ml를 포함하는 EGM-2 또는 SNU-1 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 있어서,

배양물로부터 줄기세포를 회수함에 있어서, 줄기세포의 면역학적 특성을 이용하여 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제 1항에 의해 분리된, 하기 특징 중 적어도 한 특성을 갖는 만능 줄기세포:

(a) 전사조절인자인 c-myc, ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식함;

(c) 30 ~ 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보임;

(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능함;

(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES, CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비함.
제 13항에 따른 제대혈 유래 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 함유하는 세포치료제.
우태아혈청 (FBS) 20%, bFGF 1~40ng/ml, 아스코르브산 0.1~5.0㎍/ml, EGF 1~40ng/ml, 하이드로코르티손 0.1~1㎍/ml, IGF-I 1~40ng/ml 또는 VEGF 1~5ng/ml 및 헤파린 20~25㎍/ml가 추가된 EGM-2 또는 SNU-1 배지를 포함하는 줄기세포 배양용 배지.
제 15항에 있어서,

상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 배지.
줄기세포를 제15항 또는 제16항에 따른 배지에서 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법.
제 17항에 있어서,

상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 배양방법.
줄기세포를 구 배양 (sphere culture) 또는 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 줄기성(stemness)을 증가시키는 방법.
제 19항에 있어서,

삼차원 배양시에 MEF (Mouse embryonic fibroblast cell)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서,

상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.