CN105087494A - 一种乳腺癌干细胞的培养方法 - Google Patents
一种乳腺癌干细胞的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105087494A CN105087494A CN201510593579.1A CN201510593579A CN105087494A CN 105087494 A CN105087494 A CN 105087494A CN 201510593579 A CN201510593579 A CN 201510593579A CN 105087494 A CN105087494 A CN 105087494A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- salmon
- breast cancer
- breast carcinoma
- mixed solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种乳腺癌干细胞的培养方法，包括如下步骤：将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含完全培养基中，制成细胞悬液；取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，混合均匀后，等体积加入鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；在软凝胶上方加入DMEM/F12培养液、1×B-27、上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。本发明使干细胞的分离更加稳定，实现有效扩增，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA+CD44+/CD24-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种乳腺癌干细胞的培养方法。
背景技术
乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病呈明显上升趋势，目前已成为女性最常见的恶性肿瘤。有学者认为肿瘤干细胞的存在是恶性肿瘤的根源所在。多年的治疗研究显示，乳腺癌干细胞在放疗中的抗药性和药物排除能力、化疗过程中的抵御辐射等行为以及术后的复发和转移仍是其治疗方面较棘手的问题。因此，亟需研发出合适的筛选方法以有效筛选出乳腺癌干细胞，从而用以乳腺癌发病机制和生物治疗等方面的研究。
现有技术主要采用流式细胞仪分选或免疫磁珠分选的方法分离乳腺癌肿瘤干细胞，其成本较高，流程繁琐，而且获得的细胞活力差，后续培养及研究难度大。
研究表明，CD44+CD24-是致瘤性乳腺癌干细胞最基本的表型标记，此类细胞亚群在乳腺癌中起着干细胞样作用，与乳腺癌侵袭、归巢和转移密切相关。因此，开发以乳腺癌干细胞为靶点的新一代抗肿瘤生物及免疫药物成为了根治乳腺癌的发展方向之一。然而，由于乳腺癌干细胞在乳腺癌组织中的比例只有1％左右，因此如何分离获得有效的乳腺癌干细胞，并在体外进行大规模扩增培养，建立乳腺癌干细胞系，成为了乳腺癌干细胞技术发展的瓶颈。
三维细胞培养技术是将细胞种植在一定的细胞外基质中，细胞外基质充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构。在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域，三维细胞培养技术得到了广泛的应用。许多研究发现，体外三维的培养环境比二维的培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥。研究表明，三维细胞培养系统能够有效地促进造血干细胞的活性，在无细胞因子存在时仍能够保持造血干细胞长期存活增加细胞数量，增强细胞分裂能力。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种乳腺癌干细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，制成细胞悬液；
S2、取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，使凝血酶的浓度为1～4U/mL，混合均匀后，等体积加入浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；
S3、按5×103～5×104个/mL的密度将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；
S4、在软凝胶上方加入体积为混合液1～2倍的DMEM/F12培养液、1×B-27、25～75ng/ml的上皮生长因子、10～30ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml的胰岛素样生长因子-1和0.4-0.6ng/ml氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。
其中，所述步骤S4中的培养条件为：温度37℃，5％CO2，且每周更换培养基2-3次。
其中，所述浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原采用完全培养基和鲑鱼胶原蛋白原配制。
其中，所述完全培养基为添加有9～16v/v％胎牛血清、82～158U/ml青霉素和82～158mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。
本发明具有以下有益效果：
利用BME使乳腺癌干细胞之间没有任何接触，并且加入促干细胞生长的因子，使干细胞的分离更加稳定，并实现有效扩增；采用水凝胶对人乳腺癌细胞进行三维培养，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA+CD44+/CD24-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中的培养条件为：温度37℃，5％CO2，且每周更换培养基2-3次。
所使用的浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原采用完全培养基和鲑鱼胶原蛋白原配制，其完全培养基为添加有9～16v/v％胎牛血清、82～158U/ml青霉素和82～158mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。
实施例1
S1、将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，制成细胞悬液；
S2、取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，使凝血酶的浓度为1U/mL，混合均匀后，等体积加入浓度为1.5mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；
S3、按5×103个/mL的密度将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，36℃下保温，使其凝固成软凝胶；
S4、在软凝胶上方加入体积为混合液1倍的DMEM/F12培养液、1×B-27、25ng/ml的上皮生长因子、10ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml的胰岛素样生长因子-1和0.4ng/ml氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。
实施例2
S1、将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，制成细胞悬液；
S2、取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，使凝血酶的浓度为4U/mL，混合均匀后，等体积加入浓度为3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；
S3、按5×104个/mL的密度将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，38℃下保温，使其凝固成软凝胶；
S4、在软凝胶上方加入体积为混合液1～2倍的DMEM/F12培养液、1×B-27、75ng/ml的上皮生长因子、30ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml的胰岛素样生长因子-1和0.6ng/ml氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。
实施例3
S1、将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，制成细胞悬液；
S2、取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，使凝血酶的浓度为2.5U/mL，混合均匀后，等体积加入浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；
S3、按27.5×104个/mL的密度将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，37℃下保温，使其凝固成软凝胶；
S4、在软凝胶上方加入体积为混合液1.5倍的DMEM/F12培养液、1×B-27、50ng/ml的上皮生长因子、20ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml的胰岛素样生长因子-1和0.5ng/ml氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，制成细胞悬液；
S2、取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，使凝血酶的浓度为1～4U/mL，混合均匀后，等体积加入浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；
S3、按5×103～5×104个/mL的密度将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；
S4、在软凝胶上方加入体积为混合液1～2倍的DMEM/F12培养液、1×B-27、25～75ng/ml的上皮生长因子、10～30ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml的胰岛素样生长因子-1和0.4-0.6ng/ml氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。
2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S4中的培养条件为：温度37℃，5％CO2，且每周更换培养基2-3次。
3.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于，所述浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原采用完全培养基和鲑鱼胶原蛋白原配制。
4.根据权利要求3所述的一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于，所述完全培养基为添加有9～16v/v％胎牛血清、82～158U/ml青霉素和82～158mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510593579.1A CN105087494A (zh) | 2015-09-11 | 2015-09-11 | 一种乳腺癌干细胞的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510593579.1A CN105087494A (zh) | 2015-09-11 | 2015-09-11 | 一种乳腺癌干细胞的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105087494A true CN105087494A (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=54568829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510593579.1A Pending CN105087494A (zh) | 2015-09-11 | 2015-09-11 | 一种乳腺癌干细胞的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105087494A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018194419A3 (ko) * | 2017-04-21 | 2019-01-17 | 연세대학교 산학협력단 | 대사적 스트레스를 통한 줄기세포성 암 세포주의 제조 방법 및 이를 통해 제조된 암 세포 |
| CN110396501A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-11-01 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种体外维持乳腺癌干细胞干性的三维球形体培养方法 |
| CN114525251A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-24 | 广东粤微食用菌技术有限公司 | 一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030175410A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-09-18 | Campbell Phil G. | Method and apparatus for preparing biomimetic scaffold |
| CN101248172A (zh) * | 2005-01-28 | 2008-08-20 | 诺瓦塞拉有限公司 | 胚胎干细胞培养方法 |
| CN102395673A (zh) * | 2009-03-20 | 2012-03-28 | 首尔大学校产学协力团 | 来自脐带血的表达znf281的万能干细胞的分离方法 |
| CN103396995A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-11-20 | 广州赛哲生物科技有限公司 | 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法 |
-
2015
- 2015-09-11 CN CN201510593579.1A patent/CN105087494A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030175410A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-09-18 | Campbell Phil G. | Method and apparatus for preparing biomimetic scaffold |
| CN101248172A (zh) * | 2005-01-28 | 2008-08-20 | 诺瓦塞拉有限公司 | 胚胎干细胞培养方法 |
| CN102395673A (zh) * | 2009-03-20 | 2012-03-28 | 首尔大学校产学协力团 | 来自脐带血的表达znf281的万能干细胞的分离方法 |
| CN103396995A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-11-20 | 广州赛哲生物科技有限公司 | 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李海志等: "悬浮培养联合化疗药物筛选乳腺癌干细胞", 《中国癌症杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018194419A3 (ko) * | 2017-04-21 | 2019-01-17 | 연세대학교 산학협력단 | 대사적 스트레스를 통한 줄기세포성 암 세포주의 제조 방법 및 이를 통해 제조된 암 세포 |
| CN110396501A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-11-01 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种体外维持乳腺癌干细胞干性的三维球形体培养方法 |
| CN114525251A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-24 | 广东粤微食用菌技术有限公司 | 一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhattacharya et al. | Mimicking tumor hypoxia and tumor-immune interactions employing three-dimensional in vitro models | |
| Poggi et al. | How to hit mesenchymal stromal cells and make the tumor microenvironment immunostimulant rather than immunosuppressive | |
| Barile et al. | Human cardiospheres as a source of multipotent stem and progenitor cells | |
| Ahn et al. | A three-dimensional hyaluronic acid-based niche enhances the therapeutic efficacy of human natural killer cell-based cancer immunotherapy | |
| EP4148124A1 (en) | Expansion of non-haematopoietic tissue-resident gamma delta t cells and uses of these cells | |
| CN103756961B (zh) | 一种体外诱导扩增nkt细胞的方法 | |
| CN103756962A (zh) | 一种体外扩增γδT细胞的方法 | |
| CN111411084A (zh) | 一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法 | |
| CN105087494A (zh) | 一种乳腺癌干细胞的培养方法 | |
| CN103740644B (zh) | 一种基于3d培养体系的扩增造血干细胞的方法 | |
| CN110452870A (zh) | 一种肿瘤特异性t细胞的分离培养方法及由其获得的产品 | |
| Yuan et al. | Cancer organoid co-culture model system: Novel approach to guide precision medicine | |
| Lanzoni et al. | Isolation of stem cell populations with trophic and immunoregulatory functions from human intestinal tissues: potential for cell therapy in inflammatory bowel disease | |
| CN105543169A (zh) | 一种人tscm细胞的制备方法及应用 | |
| CN101037666A (zh) | 一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法 | |
| CN109295001A (zh) | 一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法 | |
| Shen et al. | [Retracted] Mesenchymal Stem Cell‐Derived Exosomes and Their Potential Agents in Hematological Diseases | |
| CN103088065A (zh) | 一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法 | |
| Atherton | Growth stimulation of endothelial cells by simultaneous culture with sarcoma 180 cells in diffusion chambers | |
| CN103396995B (zh) | 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法 | |
| Zhang et al. | Decoding the multidimensional signatures of resident and expanded natural killer cells generated from perinatal blood | |
| Gao et al. | Biophysical cues to improve the immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells: The progress and mechanisms | |
| CN105441390A (zh) | Nk细胞的体外三维扩增培养方法 | |
| CN103239479B (zh) | 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法 | |
| KR20210060922A (ko) | 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151125 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |