CN103396995A

CN103396995A - 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法

Info

Publication number: CN103396995A
Application number: CN2013102992242A
Authority: CN
Inventors: 曾宏彬; 戴果鲜; 康涛; 郭玲玲; 陈丽丹
Original assignee: GUANGZHOU SAGENE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Sagene Biotech Co ltd
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-16
Also published as: CN103396995B

Abstract

本发明公开了一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法，采用水凝胶对人乳腺癌细胞进行三维培养，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA⁺CD44⁺/CD24^-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性，该发明方法是可靠的乳腺癌干细胞筛选方法。本发明操作简单，且与流式细胞仪筛选法等现有技术相比，大大降低了试剂耗材、仪器使用和人力资源等方面的成本。

Description

一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法。

背景技术

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病呈明显上升趋势，目前已成为女性最常见的恶性肿瘤。有学者认为肿瘤干细胞的存在是恶性肿瘤的根源所在。多年的治疗研究显示，乳腺癌干细胞在放疗中的抗药性和药物排除能力、化疗过程中的抵御辐射等行为以及术后的复发和转移仍是其治疗方面较棘手的问题。因此，亟需研发出合适的筛选方法以有效筛选出乳腺癌干细胞，从而用以乳腺癌发病机制和生物治疗等方面的研究。

现有技术主要采用流式细胞仪分选或免疫磁珠分选的方法分离乳腺癌肿瘤干细胞，其成本较高，流程繁琐，而且获得的细胞活力差，后续培养及研究难度大。

研究发现，肿瘤干细胞具有某些独特的特点，这有助于在体外培养中形成形态各异的细胞群落。如人神经胶质瘤细胞系U251的一小部分细胞在培养中能形成紧凑、圆形的群落，这些群落中的大多数细胞都具有自我更新的能力，可以形成肿瘤球，而且可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。乳腺癌干细胞具有多个亚群，学者们推测其亦有独特的结构特点。在体外培养中，这些特性或许可以使得乳腺癌干细胞形成形态各异的细胞群落。Ponti等（Ponti D, et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res,2005,65:5506-5511.）研究发现，从3例乳腺癌组织和一个确定的乳腺癌细胞系中取出细胞进行体外培养，可得到不黏附的肿瘤细胞球，这些细胞球中有些细胞具有自我更新和不断增殖能力的未分化细胞。该研究提示，这种体外培养模型可作为获得乳腺癌干细胞的方法之一。

三维细胞培养技术是将细胞种植在一定的细胞外基质中，细胞外基质充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构。在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域，三维细胞培养技术得到了广泛的应用。许多研究发现，体外三维的培养环境比二维的培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥。研究表明，三维细胞培养系统能够有效地促进造血干细胞的活性，在无细胞因子存在时仍能够保持造血干细胞长期存活增加细胞数量，增强细胞分裂能力。考虑到生物支架材料——胶原在干细胞体外大规模培养领域的应用，如果把乳腺癌细胞接种在由胶原制成的三维支架材料中进行培养，将会成为一个更有效的乳腺癌干细胞培养方式。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法，包括如下步骤：

1) 获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入完全培养基中，制成细胞悬液，细胞密度调整至1×10⁴～1×10⁵个/mL；

2) 将鲑鱼凝血酶加入细胞悬液，使凝血酶的浓度为1～4U/mL，混合均匀，得到混合液A，冰浴备用；

3) 用完全培养基将鲑鱼胶原蛋白原稀释至1.5～3mg/mL，得到混合液B，冰浴备用；

4) 将混合液A与混合液B等体积混匀，得到混合液C，接种至细胞培养板，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；

5) 在软凝胶上方加入体积为混合液C1～2倍的完全培养基，置于细胞培养箱内培养，每2～4天更换培养基一次；

6) 培养至9～11天，即得到乳腺癌干细胞微球。

优选的，步骤1）中使用的人乳腺癌细胞为MCF-7。

优选的，所述完全培养基为添加有10～15v/v%胎牛血清、80～150U/ml青霉素和80～150mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

优选的，步骤2）中，混合液A中鲑鱼凝血酶的浓度为4U/mL。

优选的，步骤3）中，混合液B中鲑鱼纤维蛋白原的浓度为2mg/mL。

优选的，步骤5）中，培养条件为：37.0～37.5℃，4.9～5.1%CO₂，饱和湿度。

本发明的有益效果是：

本发明采用水凝胶对人乳腺癌细胞进行三维培养，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA⁺CD44⁺/CD24^-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性，因此该发明方法是可靠的乳腺癌干细胞筛选方法。本发明操作简单，且与流式细胞仪筛选法等现有技术相比，大大降低了试剂耗材、仪器使用和人力资源等方面的成本。

附图说明

图1为实施例1培养形成的肿瘤干细胞微球。

图2为免疫荧光检测CD44、CD24的结果。

图3为实时荧光定量PCR检测ESA、CD44、CD24表达量的结果。

图4为Western-blot检测CD44、CD24蛋白表达量的结果。

具体实施方式

有研究报道，培养基质的机械强度能够调节小鼠内皮干细胞的分化和自我更新。较软的基质可维持内皮干细胞的自我更新，而较硬的基质则会促进内皮干细胞的分化。本发明通过调节纤维蛋白原的浓度使形成的水凝胶的硬度在80～100pa范围内，使乳腺癌干细胞能够在基质中增殖，并维持其自我更新的特性，从而筛选获得肿瘤干细胞微球。

下面结合实施例进一步阐述本发明内容。实施例中所用MCF-7细胞由中科院上海细胞库提供，鲑鱼纤维蛋白原和鲑鱼凝血酶均购自Reagent Protein公司。

实施例1

1) 用胰蛋白酶消化MCF-7细胞系，获得单细胞状态的MCF-7细胞，加入完全培养基（添加有15v/v%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基）中，制成乳腺癌细胞悬液，用完全培养基（添加有10v/v%胎牛血清、80U/ml青霉素和80mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基）将细胞密度调整至10000 cell/mL；

2) 将鲑鱼凝血酶（0.1U/μL）10μL与250μL细胞悬液混合均匀，得到混合液A，置于冰上备用；

3) 用完全培养基将鲑鱼纤维蛋白原稀释至2mg/mL，得到混合液B，置于冰上备用；

4) 将混合液A与混合液B等体积混匀后，立即接种至24孔板，每孔体积为500μL；37℃保温15min，待其凝固成软凝胶；

5) 在软凝胶的上方加入完全培养基1mL，置于细胞培养箱内，培养条件为37℃、5.0%CO₂，饱和湿度，每2～4天更换培养基一次；

6) 每天观察肿瘤干细胞微球的形成情况，进行拍照；培养至第9～11天，微球直径可达到50～100μm，如图1所示。

实施例2

1) 用胰蛋白酶消化MCF-7细胞系，获得单细胞状态的MCF-7细胞，加入完全培养基（添加有10v/v%胎牛血清、150U/ml青霉素和150mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基）中，制成乳腺癌细胞悬液，用完全培养基（添加有15v/v%胎牛血清、150U/ml青霉素和150mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基）将细胞密度调整至1×10³ cell/mL；

2) 将鲑鱼凝血酶（0.1U/μL）5μL与250μL细胞悬液混合均匀，得到混合液A，置于冰上备用；

3) 用完全培养基将鲑鱼纤维蛋白原稀释至1.5mg/mL，得到混合液B，置于冰上备用；

4) 将混合液A与混合液B等体积混匀后，立即接种至24孔板，每孔体积为500μL；36℃保温18min，待其凝固成软凝胶；

5) 在软凝胶的上方加入完全培养基1mL，置于细胞培养箱内，培养条件为37.5℃、5.1%CO₂，饱和湿度，每2～4天更换培养基一次；

6) 每天观察肿瘤干细胞微球的形成情况，进行拍照；培养至第11天，微球直径可达到60～100μm。

实施例3

1) 用胰蛋白酶消化MCF-7细胞系，获得单细胞状态的MCF-7细胞，加入完全培养基（添加有15v/v%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基）中，制成乳腺癌细胞悬液，用完全培养基（添加有12v/v%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基）将细胞密度调整至1×10⁵ cell/mL；

2) 将鲑鱼凝血酶（0.1U/μL）20μL与500μL细胞悬液混合均匀，得到混合液A，置于冰上备用；

3) 用完全培养基将鲑鱼纤维蛋白原稀释至3mg/mL，得到混合液B，置于冰上备用；

4) 将混合液A与混合液B等体积混匀后，立即接种至24孔板，每孔体积为500μL；38℃保温15min，待其凝固成软凝胶；

5) 在软凝胶的上方加入完全培养基1mL，置于细胞培养箱内，培养条件为37℃、4.9%CO₂，饱和湿度，每2～4天更换培养基一次；

6) 每天观察肿瘤干细胞微球的形成情况，进行拍照；培养至第9天，微球直径可达到50～80μm。

检测指标：

(1) 细胞形态观察：每天观察肿瘤微球的形成情况，进行拍照。第9～11天，在显微镜下对形成的微球进行计数，其形成率约为4～10%。

(2) 干细胞标记物的检测：收集细胞，采用免疫荧光法进行标记物的检测，鉴定其是否具有CD44⁺/CD24^-/low的表型。

待实施例1培养至第10天，将混合了细胞的凝胶接种在盖玻片上，用4%的多聚甲醛固定30min，0.5%的TritonX-100通透10min，10%牛血清封闭30min，分别加CD44一抗（CD44 antigen isoform 4 antibody，Pierce）、CD24一抗（CD24 Antibody，Pierce）孵育过夜，漂洗，然后分别加FITC标记的二抗（山羊抗兔IgG，FITC标记，sigma；驴抗小鼠IgG，FITC标记，invitrogen）孵育45min，最后再用DAPI染色10min，滴上封片剂，在荧光显微镜下观察拍照。

结果如图2所示，左图经FITC标记的CD44抗体孵育后，荧光显微镜下细胞呈现明亮的黄绿色荧光，表明为CD44阳性；右图FITC标记的CD24抗体未能检测到信号，只见DAPI染色的蓝色细胞核，表明为CD24^-/low。此结果符合乳腺癌肿瘤干细胞的表型CD44⁺/CD24^-/low。通过实时荧光定量PCR检测ESA、CD44、CD24的mRNA表达量：收集实施例1培养至第10天的细胞，抽提细胞的总RNA，取一定量的RNA逆转录成cDNA，配制PCR体系，上机检测，通过δδ比较CT法进行数据处理。

同上述方法，检测培养筛选前的MCF-7细胞的ESA、CD44、CD24的mRNA表达量。

结果如图3所示，获得的肿瘤干细胞与筛选前相比，其ESA和CD44基因的表达均有显著上升，而CD24并无明显变化，符合乳腺癌肿瘤干细胞ESA⁺/CD44⁺/CD24^-/low的表型特征。

(3) 通过Western-blot检测CD44、CD24蛋白的表达量：收集实施例1培养至第10天的细胞，抽提蛋白，取一定量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离后，电转移到硝酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭，分别添加一抗（CD44 antigen isoform 4 antibody，Pierce；CD24 Antibody，Pierce）孵育、二抗（羊抗兔IgG (H+L)，HRP 标记，Pierce以及羊抗小鼠IgM，HRP标记，Pierce）孵育，发光、显影，拍照，软件分析光密度值。

同上述方法，检测培养筛选前的MCF-7细胞的CD44、CD24蛋白的表达量。

结果如图4所示，Western-blot检测结果显示，经该三维培养方法筛选出的细胞，CD44蛋白的表达量与筛选前相比显著增加，CD24蛋白的表达量与筛选前相比显著降低，结果符合乳腺癌肿瘤干细胞的表型CD44⁺/CD24^-/low。

Claims

1.一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法，包括如下步骤：

1)获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入完全培养基中，制成细胞悬液，细胞密度调整至1×10⁴～1×10⁵个/mL；

2)将鲑鱼凝血酶加入细胞悬液，使凝血酶的浓度为1～4U/mL，混合均匀，得到混合液A，冰浴备用；

3)用完全培养基将鲑鱼胶原蛋白原稀释至1.5～3mg/mL，得到混合液B，冰浴备用；

4)将混合液A与混合液B等体积混匀，得到混合液C，接种至细胞培养板，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；

5)在软凝胶上方加入体积为混合液C1～2倍的完全培养基，置于细胞培养箱内培养，每2～4天更换培养基一次；

6)培养至9～11天，即得到乳腺癌干细胞微球。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中使用的人乳腺癌细胞为MCF-7。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述完全培养基为添加有10～15v/v%胎牛血清、80～150U/ml青霉素和80～150mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，混合液A中鲑鱼凝血酶的浓度为4U/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，混合液B中鲑鱼纤维蛋白原的浓度为2mg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5）中，培养条件为：37.0～37.5℃，4.9～5.1%CO₂，饱和湿度。