CN109112099A - 一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞的诱导分化技术领域，特别涉及一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，包括以下物质：无机盐、有机物、氨基酸、氨基酸盐、植物凝集素、胰岛素、碳源、细胞生长因子、维生素及抗氧化剂、蛋白质、微量元素和pH值的指示剂。本发明提供的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，在多种皮生长因子诱导下，提高单核细胞转化比如血管内皮细胞等多潜能细胞，为临床上更合理的将单核细胞用于治疗提供了实验数据和理论依据。

Description

一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基
技术领域
本发明涉及细胞的诱导分化技术领域，特别涉及一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基。
背景技术
传统的观点认为，单核细胞仅是吞噬细胞的前体细胞，在体内不同环境下能分化为巨噬细胞、树突状细胞、Kupffer细胞、小胶质细胞。但近几年的研究发现，单核细胞经诱导具有多向性的分化潜能。比如现在研究较多的有单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化潜能的，在生长因子在内的多种因子诱导下，单核细胞能够转化成血管内皮细胞，比如采用Ficoll密度梯度离心法分离成人新鲜外周血单核细胞，用细胞培养基培养，然后分别用纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α诱导24h。但是目前的单核细胞向多潜能细胞转化率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，通过该培养基，将提高单核细胞诱导分化为成熟多潜能细胞。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，包括以下物质：无机盐、有机物、氨基酸、氨基酸盐、植物凝集素、胰岛素、碳源、细胞生长因子、维生素及抗氧化剂、蛋白质、微量元素和pH值的指示剂。
其中，所述的无机盐包括的各物质的浓度为，2000-3000mg/L的CaCl2，3000-4000mg/L的MgSO4，500-800mg/L的KCl，150-200mg/L的NaHCO3，1500-2000mg/L的NaCl，500-800mg/L的MgCl2，400-600mg/L的NaH2PO4，0.01-0.03mg/L的CoCl2-6H2O，0.01-0.02mg/L的MnCl2-4H2O，0.02-0.20mg/L的ZnCl2。
所述的有机物包括的各物质的浓度为，50-90mg/L的4-丁二胺二盐酸盐、200-400mg/L的盐酸吡哆醛、4000-6000mg/L的丙酮酸钠。
所述的氨基酸包括的各物质的浓度为，氨基酸包括的各物质的浓度为，100-300mg/L的L-丝氨酸，100-150mg/L的甘氨酸，100-150mg/L的L-色氨酸，160-260mg/L的胱氨酸，180-220mg/L的L-羟脯氨酸，200-300mg/L的L-谷氨酸，200-600mg/L的L-苏氨酸，300-400mg/L的L-酪氨酸，300-500mg/L的L-天门冬氨酸，300-500mg/L的L-异亮氨酸，300-600mg/L的L-蛋氨酸，400-600mg/L的L-丙氨酸，400-700mg/L的组氨酸，450-600mg/L的L-谷氨酰胺，700-1000mg/L的L-亮氨酸，900-1200mg/L的L-脯氨酸，1000-1500mg/L的缬氨酸，1200-1800mg/L的赖氨酸，1200-1800mg/L的精氨酸，1800-3200mg/L的L-天门冬酰胺，2500-3000mg/L的L-苯丙氨酸。
所述的氨基酸盐包括的各物质的浓度为，300-400mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、300-500mg/L的L-胱氨酸盐酸盐、300-500mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐、700-900mg/L的L-精氨酸盐酸盐、700-1000mg/L的L-酪氨酸盐酸盐，1000-1500mg/L的L-组氨酸盐酸盐。
植物凝集素的浓度为10-20mg/L。植物凝集素由以下方法制备所得，在45-50℃温度下，将豆类的种子粉碎到100目过筛，粉碎后的粉末加入浸泡液中，浸泡液为质量浓度1％的氯化钠水溶液，或pH＝6.5-7.2的磷酸缓冲盐溶液，料水比例为1∶5；浸泡过程中还施加超声波进行辅助提取，声强为20-40W/cm2；或者施加微波进行辅助提取，微波强度为10-20W/L；搅拌浸泡100-180分钟，过滤去除豆皮、豆渣，滤液离心分离得上清液，上清液浓缩得到浓缩液，浓缩液分离、纯化得到植物凝集素。
所述的胰岛素为重组人胰岛素，浓度为2-50μg/mL。
所述的碳源包括的各物质的浓度为，20-50mg/L的D-葡萄糖、0.3-0.9mg/L的油酸、0.2-0.4mg/L的亚油酸、5-20mg/L的肌醇、1-9mg/L的次黄嘌呤、1-5mg/L的烟酰胺、0.1-1mg/L的乙醇胺、0.2-1.5mg/L的胸苷。
所述的细胞生长因子包括的各物质的浓度为，5-50ng/mL的成纤维细胞生长因子、5-50ng/mL的血小板衍生生长因子、5-50ng/mL的表皮生长因子、5-50ng/mL的胰岛素样生长因子、5-50ng/mL的转化生长因子。
所述的维生素及抗氧化剂包括的各物质的浓度为，0.001-0.006mg/L的维生素H、5-10mg/L的叶酸、0.5-1mg/L的核黄素、0.160-0.200mg/L的烟酸，5-10mg/L的盐酸硫胺、0.004-0.010mg/L的对氨基苯甲酸，0.0003-0.0010mg/L的维生素B1，10-30mg/L的维生素B、0.002-0.010mg/L的盐酸吡哆醇，0.1-0.06mg/L的维生素B12、50-100mg/L的L-维生素C酸2-单磷酸三盐钠，0.5-1mg/L的硫辛酸、5-10mg/L的D-泛酸钙、5-10mg/L的氯化胆碱。
所述的蛋白质包括的各物质的浓度为：10-20mg/L的重组人转铁蛋白、5-10mg/L的重组人血白蛋白。
所述的微量元素包括的各物质的浓度为：0.1-0.5mg/L的七水硫酸亚铁、0.1-0.5mg/L的七水硫酸锌、0.05-0.1mg/L的九水硝酸铁、0.05-0.1mg/L的九水硅酸钠、0.05-0.1mg/L的二水钼酸钠、0.005-0.010mg/L的二水氟化银、0.05-0.1mg/L的二水偏钒酸钠、0.05-0.1mg/L的十八水硫酸铝、0.005-0.010mg/L的二水氯化钡、0.005-0.010mg/L的七水硫酸钴、0.005-0.010mg/L的九水硝酸铬、0.005-0.010mg/L的五水亚硒酸钠、0.005-0.010mg/L的溴化钾、0.005-0.010mg/L的七水硫酸锰、0.005-0.010mg/L的六水二氯化镍、0.005-0.010mg/L的氯化铷、0.005-0.010mg/L的三水锡酸钾、0.005-0.010mg/L的二水硝酸氧锆、0.0005-0.001mg/L的五水硫酸铜、0.0005-0.001mg/L的八水硫酸镉、0.0005-0.001mg/L的水合偏锗酸钠、0.0005-0.001mg/L的二水碘化钠。
所述的pH值的指示剂为酚红指示剂。
本发明具有以下优点：
本发明提供的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，在多种皮生长因子诱导下，提高单核细胞转化比如血管内皮细胞等多潜能细胞，为临床上更合理的将单核细胞用于治疗提供了实验数据和理论依据。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明，用成人新鲜外周血单核细胞进行诱导培养。
实施例1
一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，包括以下物质：无机盐、有机物、氨基酸、氨基酸盐、植物凝集素、胰岛素、碳源、细胞生长因子、维生素及抗氧化剂、蛋白质、微量元素和pH值的指示剂。
其中，所述的无机盐包括的各物质的浓度为，2500mg/L的CaCl2，3200mg/L的MgSO4，600mg/L的KCl，200mg/L的NaHCO3，1500mg/L的NaCl，800mg/L的MgCl2，400mg/L的NaH2PO4，0.01mg/L的CoCl2-6H2O，0.01mg/L的MnCl2-4H2O，0.05mg/L的ZnCl2。
所述的有机物包括的各物质的浓度为，80mg/L的4-丁二胺二盐酸盐、400mg/L的盐酸吡哆醛、5000mg/L的丙酮酸钠。
所述的氨基酸包括的各物质的浓度为，氨基酸包括的各物质的浓度为，200mg/L的L-丝氨酸，150mg/L的甘氨酸，150mg/L的L-色氨酸，2500mg/L的胱氨酸，200mg/L的L-羟脯氨酸，300mg/L的L-谷氨酸，500mg/L的L-苏氨酸，400mg/L的L-酪氨酸，500mg/L的L-天门冬氨酸，400mg/L的L-异亮氨酸，400mg/L的L-蛋氨酸，500mg/L的L-丙氨酸，400mg/L的组氨酸，600mg/L的L-谷氨酰胺，800mg/L的L-亮氨酸，1200mg/L的L-脯氨酸，1000mg/L的缬氨酸，1400mg/L的赖氨酸，1800mg/L的精氨酸，2000mg/L的L-天门冬酰胺，3000mg/L的L-苯丙氨酸。
所述的氨基酸盐包括的各物质的浓度为，300mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、300mg/L的L-胱氨酸盐酸盐、500mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐、800mg/L的L-精氨酸盐酸盐、800mg/L的L-酪氨酸盐酸盐，1200mg/L的L-组氨酸盐酸盐。
植物凝集素的浓度为10-20mg/L，所述的胰岛素为重组人胰岛素，浓度为25μg/mL。
所述的碳源包括的各物质的浓度为，30mg/L的D-葡萄糖、0.5mg/L的油酸、0.3mg/L的亚油酸、10mg/L的肌醇、5mg/L的次黄嘌呤、4mg/L的烟酰胺、0.5mg/L的乙醇胺、1.2mg/L的胸苷。
所述的细胞生长因子包括的各物质的浓度为，20ng/mL的成纤维细胞生长因子、20ng/mL的血小板衍生生长因子、40ng/mL的表皮生长因子、30ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的转化生长因子。
所述的维生素及抗氧化剂包括的各物质的浓度为，0.004mg/L的维生素H、6mg/L的叶酸、0.5mg/L的核黄素、0.200mg/L的烟酸，10mg/L的盐酸硫胺、0.010mg/L的对氨基苯甲酸，0.0003mg/L的维生素B1，30mg/L的维生素B、0.002mg/L的盐酸吡哆醇，0.1mg/L的维生素B12、100mg/L的L-维生素C酸2-单磷酸三盐钠，1mg/L的硫辛酸、10mg/L的D-泛酸钙、5mg/L的氯化胆碱。
所述的蛋白质包括的各物质的浓度为：20mg/L的重组人转铁蛋白、5mg/L的重组人血白蛋白。
所述的微量元素包括的各物质的浓度为：0.3mg/L的七水硫酸亚铁、0.3mg/L的七水硫酸锌、0.05mg/L的九水硝酸铁、0.1mg/L的九水硅酸钠、0.1mg/L的二水钼酸钠、0.005mg/L的二水氟化银、0.05mg/L的二水偏钒酸钠、0.1mg/L的十八水硫酸铝、0.005mg/L的二水氯化钡、0.010mg/L的七水硫酸钴、0.005-0.010mg/L的九水硝酸铬、0.005mg/L的五水亚硒酸钠、0.010mg/L的溴化钾、0.005-0.010mg/L的七水硫酸锰、0.005mg/L的六水二氯化镍、0.005mg/L的氯化铷、0.005-0.010mg/L的三水锡酸钾、0.005mg/L的二水硝酸氧锆、0.001mg/L的五水硫酸铜、0.0005mg/L的八水硫酸镉、0.0005mg/L的水合偏锗酸钠、0.001mg/L的二水碘化钠。
所述的pH值的指示剂为酚红指示剂。
实施例2
一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，包括以下物质：无机盐、有机物、氨基酸、氨基酸盐、植物凝集素、胰岛素、碳源、细胞生长因子、维生素及抗氧化剂、蛋白质、微量元素和pH值的指示剂。
其中，所述的无机盐包括的各物质的浓度为，3000mg/L的CaCl2，3500mg/L的MgSO4，700mg/L的KCl，180mg/L的NaHCO3，1800mg/L的NaCl，800mg/L的MgCl2，600mg/L的NaH2PO4，0.03mg/L的CoCl2-6H2O，0.02mg/L的MnCl2-4H2O，0.10mg/L的ZnCl2。
所述的有机物包括的各物质的浓度为，60mg/L的4-丁二胺二盐酸盐、300mg/L的盐酸吡哆醛、5000mg/L的丙酮酸钠。
所述的氨基酸包括的各物质的浓度为，氨基酸包括的各物质的浓度为，200mg/L的L-丝氨酸，150mg/L的甘氨酸，100mg/L的L-色氨酸，250mg/L的胱氨酸，200mg/L的L-羟脯氨酸，300mg/L的L-谷氨酸，400mg/L的L-苏氨酸，400mg/L的L-酪氨酸，400mg/L的L-天门冬氨酸，400mg/L的L-异亮氨酸，600mg/L的L-蛋氨酸，500mg/L的L-丙氨酸，500mg/L的组氨酸，600mg/L的L-谷氨酰胺，8000mg/L的L-亮氨酸，1200mg/L的L-脯氨酸，1000mg/L的缬氨酸，1500mg/L的赖氨酸，1400mg/L的精氨酸，2800mg/L的L-天门冬酰胺，3000mg/L的L-苯丙氨酸。
所述的氨基酸盐包括的各物质的浓度为，400mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、500mg/L的L-胱氨酸盐酸盐、400mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐、900mg/L的L-精氨酸盐酸盐、900mg/L的L-酪氨酸盐酸盐，1500mg/L的L-组氨酸盐酸盐。
植物凝集素的浓度为10-20mg/L，所述的胰岛素为重组人胰岛素，浓度为40μg/mL。
所述的碳源包括的各物质的浓度为，40mg/L的D-葡萄糖、0.7mg/L的油酸、0.2mg/L的亚油酸、10mg/L的肌醇、5mg/L的次黄嘌呤、3mg/L的烟酰胺、1mg/L的乙醇胺、1.5mg/L的胸苷。
所述的细胞生长因子包括的各物质的浓度为，20ng/mL的成纤维细胞生长因子、30ng/mL的血小板衍生生长因子、10ng/mL的表皮生长因子、5ng/mL的胰岛素样生长因子、20ng/mL的转化生长因子。
所述的维生素及抗氧化剂包括的各物质的浓度为，0.004mg/L的维生素H、8mg/L的叶酸、0.9mg/L的核黄素、0.200mg/L的烟酸，7mg/L的盐酸硫胺、0.004mg/L的对氨基苯甲酸，0.0010mg/L的维生素B1，30mg/L的维生素B、0.010mg/L的盐酸吡哆醇，0.1mg/L的维生素B12、100mg/L的L-维生素C酸2-单磷酸三盐钠，1mg/L的硫辛酸、5mg/L的D-泛酸钙、8mg/L的氯化胆碱。
所述的蛋白质包括的各物质的浓度为：10mg/L的重组人转铁蛋白、10mg/L的重组人血白蛋白。
所述的微量元素包括的各物质的浓度为：0.5mg/L的七水硫酸亚铁、0.4mg/L的七水硫酸锌、0.08mg/L的九水硝酸铁、0.05mg/L的九水硅酸钠、0.1mg/L的二水钼酸钠、0.008mg/L的二水氟化银、0.05mg/L的二水偏钒酸钠、0.1mg/L的十八水硫酸铝、0.010mg/L的二水氯化钡、0.010mg/L的七水硫酸钴、0.010mg/L的九水硝酸铬、0.005mg/L的五水亚硒酸钠、0.010mg/L的溴化钾、0.005mg/L的七水硫酸锰、0.005mg/L的六水二氯化镍、0.010mg/L的氯化铷、0.010mg/L的三水锡酸钾、0.005mg/L的二水硝酸氧锆、0.001mg/L的五水硫酸铜、0.0005mg/L的八水硫酸镉、0.001mg/L的水合偏锗酸钠、0.0005mg/L的二水碘化钠。
所述的pH值的指示剂为酚红指示剂。
实施例3
以上实施例中的植物凝集素由以下方法制备所得，在45-50℃温度下，将豆类的种子粉碎到100目过筛，粉碎后的粉末加入浸泡液中，浸泡液为质量浓度1％的氯化钠水溶液，或pH＝6.5-7.2的磷酸缓冲盐溶液，料水比例为1∶5；浸泡过程中还施加超声波进行辅助提取，声强为20-40W/cm2；或者施加微波进行辅助提取，微波强度为10-20W/L；搅拌浸泡100-180分钟，过滤去除豆皮、豆渣，滤液离心分离得上清液，浓缩得到浓缩液，浓缩液加入50％饱和度NH4SO4搅拌，静置沉淀后离心分离，得到的沉淀物加入到透析袋中，透析袋的截留孔径为8000-10000道尔顿，透析袋扎紧两端，放入100-300目的尼龙袋中，将袋子放入水中，水为蒸馏水或去离子水中，透析袋体积与水的体积比为1∶10-1∶15，水温为28-50℃，以60-120转/分的转速进行搅拌，透析时间为1-3小时得到植物凝集素。

Claims (10)

1.一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，包括以下物质：无机盐、有机物、氨基酸、氨基酸盐、植物凝集素、胰岛素、碳源、细胞生长因子、维生素及抗氧化剂、蛋白质、微量元素和pH值的指示剂。
2.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的无机盐包括的各物质的浓度为，2000-3000mg/L的CaCl2，3000-4000mg/L的MgSO4，500-800mg/L的KCl，150-200mg/L的NaHCO3，1500-2000mg/L的NaCl，500-800mg/L的MgCl2，400-600mg/L的NaH2PO4，0.01-0.03mg/L的CoCl2-6H2O，0.01-0.02mg/L的MnCl2-4H2O，0.02-0.20mg/L的ZnCl2。
3.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的有机物包括的各物质的浓度为，50-90mg/L的4-丁二胺二盐酸盐、200-400mg/L的盐酸吡哆醛、4000-6000mg/L的丙酮酸钠。
4.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的氨基酸包括的各物质的浓度为，氨基酸包括的各物质的浓度为，100-300mg/L的L-丝氨酸，100-150mg/L的甘氨酸，100-150mg/L的L-色氨酸，160-260mg/L的胱氨酸，180-220mg/L的L-羟脯氨酸，200-300mg/L的L-谷氨酸，200-600mg/L的L-苏氨酸，300-400mg/L的L-酪氨酸，300-500mg/L的L-天门冬氨酸，300-500mg/L的L-异亮氨酸，300-600mg/L的L-蛋氨酸，400-600mg/L的L-丙氨酸，400-700mg/L的组氨酸，450-600mg/L的L-谷氨酰胺，700-1000mg/L的L-亮氨酸，900-1200mg/L的L-脯氨酸，1000-1500mg/L的缬氨酸，1200-1800mg/L的赖氨酸，1200-1800mg/L的精氨酸，1800-3200mg/L的L-天门冬酰胺，2500-3000mg/L的L-苯丙氨酸；
所述的氨基酸盐包括的各物质的浓度为，300-400mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、300-500mg/L的L-胱氨酸盐酸盐、300-500mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐、700-900mg/L的L-精氨酸盐酸盐、700-1000mg/L的L-酪氨酸盐酸盐，1000-1500mg/L的L-组氨酸盐酸盐。
5.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，植物凝集素的浓度为10-20mg/L，植物凝集素由以下方法制备所得，在45-50℃温度下，将豆类的种子粉碎到100目过筛，粉碎后的粉末加入浸泡液中，浸泡液为质量浓度1％的氯化钠水溶液，或pH＝6.5-7.2的磷酸缓冲盐溶液，料水比例为1∶5；浸泡过程中还施加超声波进行辅助提取，声强为20-40W/cm2；或者施加微波进行辅助提取，微波强度为10-20W/L；搅拌浸泡100-180分钟，过滤去除豆皮、豆渣，滤液离心分离得上清液，上清液浓缩得到浓缩液，浓缩液分离、纯化得到植物凝集素。
6.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的胰岛素为重组人胰岛素，浓度为2-50μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的碳源包括的各物质的浓度为，20-50mg/L的D-葡萄糖、0.3-0.9mg/L的油酸、0.2-0.4mg/L的亚油酸、5-20mg/L的肌醇、1-9mg/L的次黄嘌呤、1-5mg/L的烟酰胺、0.1-1mg/L的乙醇胺、0.2-1.5mg/L的胸苷。
8.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的细胞生长因子包括的各物质的浓度为，5-50ng/mL的成纤维细胞生长因子、5-50ng/mL的血小板衍生生长因子、5-50ng/mL的表皮生长因子、5-50ng/mL的胰岛素样生长因子、5-50ng/mL的转化生长因子。
9.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的维生素及抗氧化剂包括的各物质的浓度为，0.001-0.006mg/L的维生素H、5-10mg/L的叶酸、0.5-1mg/L的核黄素、0.160-0.200mg/L的烟酸，5-10mg/L的盐酸硫胺、0.004-0.010mg/L的对氨基苯甲酸，0.0003-0.0010mg/L的维生素B1，10-30mg/L的维生素B、0.002-0.010mg/L的盐酸吡哆醇，0.1-0.06mg/L的维生素B12、50-100mg/L的L-维生素C酸2-单磷酸三盐钠，0.5-1mg/L的硫辛酸、5-10mg/L的D-泛酸钙、5-10mg/L的氯化胆碱。
10.根据权利要求1所述的一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基，其特征在于，所述的微量元素包括的各物质的浓度为：0.1-0.5mg/L的七水硫酸亚铁、0.1-0.5mg/L的七水硫酸锌、0.05-0.1mg/L的九水硝酸铁、0.05-0.1mg/L的九水硅酸钠、0.05-0.1mg/L的二水钼酸钠、0.005-0.010mg/L的二水氟化银、0.05-0.1mg/L的二水偏钒酸钠、0.05-0.1mg/L的十八水硫酸铝、0.005-0.010mg/L的二水氯化钡、0.005-0.010mg/L的七水硫酸钴、0.005-0.010mg/L的九水硝酸铬、0.005-0.010mg/L的五水亚硒酸钠、0.005-0.010mg/L的溴化钾、0.005-0.010mg/L的七水硫酸锰、0.005-0.010mg/L的六水二氯化镍、0.005-0.010mg/L的氯化铷、0.005-0.010mg/L的三水锡酸钾、0.005-0.010mg/L的二水硝酸氧锆、0.0005-0.001mg/L的五水硫酸铜、0.0005-0.001mg/L的八水硫酸镉、0.0005-0.001mg/L的水合偏锗酸钠、0.0005-0.001mg/L的二水碘化钠。
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