WO2015002474A1 - 인간 세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법 - Google Patents

인간 세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법 Download PDF

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WO2015002474A1
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이은주
김기환
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서울대학교병원
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N5/0662—Stem cells
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]

Definitions

  • the present invention relates to a method of increasing the stem cell capacity (stemness) of human cells.
  • Stem cells are cells capable of differentiating into various cells constituting biological tissues, which collectively refer to undifferentiated cells obtained from each tissue of embryo, fetus and adult. Stem cells are differentiated into specific cells by differentiation stimulation (environment), and unlike the cells in which cell division is stopped due to differentiation, proliferation is possible due to cell division (self-renewal). (Proliferation; expansion) is characterized by being able to differentiate into other cells by different environments or different differentiation stimulation, which is characterized by having plasticity (differentiation).
  • Stem cells are largely derived from embryos and have pluripotency embryonic stem cells (ES cells) with the potential to differentiate into all cells, and multipotency from each tissue.
  • ES cells pluripotency embryonic stem cells
  • Adult stem cells adult stem cells
  • the inner cell mass of the blastocyte the earliest embryonic development, is the part that will form the fetus in the future.
  • Embryonic stem cells formed from the intracellular mass can theoretically differentiate into cells of all tissues that make up an individual. It is a stem cell with potential. That is, embryonic stem cells are undifferentiated cells capable of unlimited proliferation, can differentiate into all cells, and unlike germ stem cells, can make germ cells and can be inherited to the next generation.
  • Human embryonic stem cells are prepared by isolating and culturing only inner cell mass when forming human blastocysts.
  • human embryonic stem cells made worldwide are obtained from frozen embryos remaining after infertility. This cell is characterized by its ability to differentiate into all cells, which can be differentiated into any tissue cell, and can also be cultured in immortal and undifferentiated state and also in the preparation of germ cells. And possibly inherited to the next generation (Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • Hung SC et al. Stem Cells, 20 (6): 522-529, 2002; Sanchez-Ramos J et al., Exp Neurol, 164 (2): 247-256, 2000 ), Cardiomyocytes (Kadivar M et al., Biochem Biophys Res Commun, 340 (2): 639-647, 2006), endothelial cells (Reyes M et al., Blood, 98 (9): 2615-2625, 2001) , And hepatocytes (Kang XQ et al., World J Gastroenterol, 11 (47): 7461-7465, 2005).
  • bone marrow MSCs express class I MHC antigens, but not class II, or express mutually stimulating molecules indicating that MSCs lack immunogenic activity (Klyushnenkova E et al., J Biomed Sci, 12 (1): 47-57). , 2005). Since MSCs exhibit immunosuppressive activity, they can be used as graft promoters and inhibitors of fetal grafts and host diseases (Le Blanc K et al., Lancet, 363 (9419): 1439-1441, 2004; El- Badri NS et al., Exp Hematol, 26 (2): 110-116, 1998).
  • MSCs can be isolated from various adult tissues such as bone marrow, adipose tissue, cord blood, peripheral blood, neonatal tissues, human placenta (Kassis I et al., Bone Marrow Transplant, 37 (10)). : 967-976, 2006; Wang HS et al., Stem Cells, 22 (7): 1330-1337, 2004; Fukuchi Y et al., Stem Cells, 22 (5): 649-658, 2004). However, the number of MSCs obtained from adult tissues is limited.
  • the minimum number of cells needed for cell therapy or regenerative medicine is about 1 ⁇ 10 9 . But the amount is even greater if we include experiments that set conditions and establish criteria. To supply this amount of existing mesenchymal stem cells of various origins requires at least 10 passages in vitro . The cells age and deform and no longer fit the concept of therapy. This is one of the problems to be solved in the current culture system of mesenchymal stem cells. In addition, even if the conditions and criteria are established with these cells, the cells may already run out when used for treatment, and the mesenchymal stem cells of another person may need to be used, in which case additional experiments based on another cell use may be repeated. Therefore, in order to use existing mesenchymal stem cells as cell therapy, a new method for solving these problems is required.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SF scatter factor
  • SF scatter factor
  • HGF is a multifunctional heterodimer (heterodimer) polypeptide produced by mesenchymal cells (mesenchymal cells).
  • HGF is a 69-kDa alpha-chain comprising an N-terminal finger domain and four kringle domains, and a 34 kDa beta-chain with similarity to the protease domain of the chymotrypsin-like serine protease. Consists of a structure that includes.
  • Human HGF is synthesized into precursors having 728 amino acids in a single chain form that are biologically inactive, and the R494 residue is cleaved by specific serum serine proteases to become biologically active HGF.
  • Active HGF is a heterodimer in which the 69-kDa alpha-chain and the 34-kDa beta-chain are linked by disulfide bonds.
  • telomeres are parts of DNA at the ends of chromosomes.
  • telomeres are DNAs that are about 10 kb long in the initial state, where the repetitive arrangement of TTAGGG continues.
  • various binding proteins bind to each other, and the ends of the DNA bind to each other to inhibit the formation of cyclic DNA, or to bind to the nuclear membrane.
  • Telomeres are found at the ends of eukaryotic chromosomes and are a special structure that prevents degradation or end-to-end fusion of chromosomes.
  • Telomere DNA is a primary structure consisting of short sequences of serial repeats (TTAGGG in humans), varying in length from hundreds of bp in lower eukaryotic cells to thousands of bp in mammalian cells.
  • the telomeric DNA portion exhibits GC-rich, as in the centromere region. This property results in incomplete replication of the G-strand by conventional DNA polymerases when the chromosome is replicated, such that the exposed opposite strand's C-strand is degraded by nucleic acid depletion enzymes or synthesized by telomerase. The site can be completed.
  • Telomerase is a ribonucleop rotein complex consisting of an active subunit, human telomerase reverse transcriptase (TERT) enzyme and Telomerase RNA (TR), an RNA component that provides a template for the synthesis of telomeric DNA. (Greider and Blackburn, 1989). conserveed domains in all telomerase activity subunits are structurally related to the active domains of reverse transcriptase (RT) from retroviruses and retro transposons. Although TERT and TR are the smallest units of the telomerase ribonucleoprotein structure, it has been found that other proteins are structurally or temporarily associated with this enzyme complex.
  • telomeres The main function of telomeres is to cap the chromosomal ends and to protect the chromosomes from degradation, end-to-end fusion, and atypical recombination, which is also involved in maintaining the safety of the genome and regulating cell proliferation. After repeated cell division, telomere shortening occurs, which limits cell proliferation by activating cell cycle limitations that induce replicative senescence or apoptosis, which are genetically unstable cells. In addition, there is a net function that prevents the accumulation of transformed cells, which are the origin of cancer, but also a dysfunction that limits the homeostasis, regeneration and survival of organs in the event of aging or disease.
  • genes such as Nanog, Oct4, Sox2 and c-Myc are indicators of stem cell ability, and the higher their expression, the better the yield of stem cells and the better stem cell characteristics. As it is known, it is useful for research.
  • the present invention has been made to solve the above problems in the prior art, confirming that the growth factor HGF is an important factor that can control the stem cell capacity of mesenchymal stem cells, human cells, and through this the existing mesenchymal By revealing that it is possible to overcome the limitation of in vitro culture of stem cells, it is suggested that the method of the present invention is a suitable invention capable of producing cells for cell therapy and regenerative medicine.
  • the present invention provides a method for increasing the stem cell capacity (stemness) of human cells comprising the step of treating the HGF (hepatocyte growth factor) in the cell culture.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the method may be to extend the chromosomal ends of human cells.
  • the method may be to extend the life of the human cell.
  • the method may be to inhibit aging of human cells.
  • the method may be to increase the growth of human cells.
  • the method may be to increase the viability of human cells.
  • the method may be to increase the differentiation efficiency into mesoderm.
  • the cells may be human stem cells.
  • the cells may be mesenchymal stem cells.
  • the method of the present invention By using the method of the present invention, long-term and large-scale culturing of human mesenchymal stem cells is possible, and stem cells in a state of maintaining differentiation capacity can be secured with high yield.
  • the method of the present invention is effective for cell therapy and regenerative medicine. Can be used.
  • telomere 1 is a result of confirming the length of telomeres in the cells of each of the BM-MSC and ES-MSC through real time quantitative PCR.
  • Figure 2 is the result of confirming the secretion amount of representative growth factors in the ES-MSC, BM-MSC and UCB-MSC by ELISA.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the telomere length change according to the presence or absence of HGF treatment in ES-MSC and BM-MSC.
  • FIG. 4 shows a method of treating HGF to BM-MSC (A), real time gDNA PCR results (B) using gDNA obtained from HGF-treated cells, and live and dead cell numbers in each HGF-treated cell. , And the results of confirming the total cell number (C).
  • FIG. 5 shows a method of treating neuHGF in ES-MSC (A), real time gDNA PCR results (B) using gDNA obtained from cells treated with neuHGF, and the number of living and dead cells in each cell treated with neuHGF. , And the results of confirming the total cell number (C).
  • Figure 7 shows the results confirmed by real time PCR TERT and RAD51 mRNA expression changes according to neuHGF treatment in ES-MSC.
  • the present inventors focused on the fact that embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (ES-MSC) have a faster growth rate and longer period of time for maintaining healthy cultures compared to bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC).
  • E-MSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • HGF is an important key factor that can control the stem cell capacity (stemness) of mesenchymal stem cells. Therefore, treatment of HGF with mesenchymal stem cells can extend telomeres, or chromosomal end portions, prolong cell life or inhibit aging, and increase cell growth and viability.
  • the present invention provides a method for increasing stem cell capacity (stemness) comprising the step of treating hepatocyte growth factor (HGF) in the cell culture.
  • stemness stem cell capacity
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the cell culture is a human cell culture
  • the human cells are mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells are bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, peripheral blood, neonatal tissue, human placenta, etc. It may be derived from various tissues and pluripotent stem cells of the human body, preferably derived from bone marrow, but is not limited thereto.
  • stem cell refers to an undifferentiated cell that is capable of differentiating into various cells constituting biological tissue, and can be reproduced without limitation to form specialized cells of tissues and organs. .
  • Stem cells are developable pluripotent or pluripotent cells. Stem cells can divide into two daughter stem cells, or one daughter stem cell and one derived (transit) cell, and then proliferate into mature, fully formed cells of the tissue.
  • mesenchymal stem cell refers to several types of mesenchymal lineages in vivo, such as osteocytes, chondrocytes, tendinocytes, and fat cells.
  • stem cells having multipotency that can differentiate into Adipocytes, Myocytes, and Fibroblasts, and include bone marrow, adipose tissue, cord blood, peripheral blood, and neonatal tissue. (neonatal tissues), human placenta and the like can be separated from various adult tissues.
  • the term "cell culture medium” refers to a medium containing cultured cells, and the "medium” means a medium for animal cells commonly used in the art.
  • the medium that can be used in the present invention may be any medium conventionally used for culturing animal cells, for example, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), ⁇ -MEM (Stanner, CP et al., Nat. New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio.
  • Preferably is selected from the group consisting of ⁇ -MEM, Eagles's MEM, Iscove's MEM, 199 medium, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752 / 1 and McCoy's 5A, most preferably ⁇ - MEM medium, but is not limited thereto.
  • the medium of the present invention further comprises serum.
  • the serum contained in the medium in the present invention is added for the purpose of recognizing in the art, and plays an important role as a source of growth factors in the proliferation of mesenchymal stem cells.
  • Serum that can be used is preferably fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BCS), horse serum or human serum, and most preferably may be FBS, but is not limited thereto. It doesn't happen.
  • the serum content of the serum of the invention is 4-30% by weight. More preferably, the serum content of the serum of the invention is 5-15% by weight, most preferably about 10% by weight.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent comprising stem cells induced and activated by the method of the present invention.
  • the cell therapeutic agent may be used for adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, nerve cells, cardiomyocyte formation, and the like.
  • cell therapeutic agent refers to a medicament (US FDA regulation) used for the purpose of treating, diagnosing, or preventing a disease as a cell or tissue prepared through isolation, culture, and special manipulation from humans.
  • Cell therapy agents are classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells. The present invention relates in particular to stem cell therapy, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a cell culture medium useful for enhancing the stem cell capacity of human cells including HGF (Hepatocyte growth factor).
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • the HGF of the present invention is preferably included in the medium at a concentration of 1-100 ng / ml, more preferably contained at a concentration of 1-10 ng / ml, but is not limited thereto. It is not.
  • the medium of the present invention further comprises serum
  • the medium of the present invention may include any component known in the art as a conventional stem cell culture composition for efficiently culturing stem cells in addition to serum. Can be.
  • the present inventors have a long growth period in which embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (ES-MSCs) grow faster and maintain healthy cultures in vitro when compared to conventional bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs).
  • E-MSCs embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSCs bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSC was purchased from Lonza, and ES-MSC was prepared and cultured by the following method.
  • Human embryonic stem cells (Yangyangin # 1, male, STO feeder) of Seoul National University Hospital, which remained undifferentiated, were treated with protease (dispase, 2mg / ml), isolated by micro-operation, and then in embryonic stem cell medium without bFGF. Incubated for 14 days in suspension.
  • Embryos produced by 14 days of floating culture were attached to tissue culture dishes and then induced mesenchymal stem cell differentiation.
  • the embryos were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) for 16 days in medium containing FBS (fetal bovine serum) (10% v / v), and the differentiation of mesenchymal stem cells was observed.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 1- (2) the cells were cultured for 16 days after attachment of embryos to treat differentiated mesenchymal stem cells with an enzyme (Trypsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na), disintegrated into single cells, and then tissues. Attached to petri dish.
  • an enzyme Trpsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na
  • hEGF 0.5 ml human epidermal growth factor
  • VEGF 0.5 ml Vascular Endothelial Growth Factor
  • hFGF-B 2 ml human Fibroblast Growth Factor-basic
  • IGF-1 0.5 ml
  • hydrocortisone 0.5 ml of ascorbic acid
  • basal medium ELM-2MV, CC4147, Lonza
  • RNA was isolated from cultivated BM-MSC and ES-MSC by TRIzol method, and the total amount of RNA and RNase-free water corresponding to 1ug extracted was mixed to make 9 ul of total amount, followed by 10min at 70 °C. After heating, the sample was immediately transferred onto ice, and mixed with vortex by adding RT-reaction mixture (25 mM MgCl 2, 10X RT bufer, 10 mM dNTP mixture, RNasin, Oli (dT) primer, AMV Reverse Transcriptase) 11ul. Then, PCR was performed at 50 ° C. for 1 hour, 95 ° C. for 5 minutes, and 4 ° C. sustained conditions to prepare cDNA in each cell.
  • RT-reaction mixture 25 mM MgCl 2, 10X RT bufer, 10 mM dNTP mixture, RNasin, Oli (dT) primer, AMV Reverse Transcriptase
  • telomere length in ES-MSC was significantly longer than about 2 times compared to BM-MSC (FIG. 1).
  • ELISA In order to identify the inducing factor causing the difference in the length of telomeres in the BM-MSC and ES-MSC in Example 1, in order to confirm the secretion amount of FGF-2, VEGF, HGF, which are representative growth factors in each cell, ELISA was performed.
  • a coating solution carbonate-bicabonate buffer capsules, sigma
  • a coating solution carbonate-bicabonate buffer capsules, sigma
  • the coating solution containing the antigen was removed, 200ul of blocking solution was added to each well, and then reacted at 37 ° C. for 30 minutes to 1 hour.
  • the blocking solution was removed, 300ul of TBST (0.1M Tris-buffered ssaline, pH7.4 with 0.1% Tween 20) was added thereto, and washed for 5 minutes.
  • the primary antibody HGF antibody (ab83760, 1: 1000 dilution); diluted VEGF antibody (ab1316, 1: 1000 dilution); diluted bFGF antibody (ab126861, 1: 1000 dilution) diluted in a coating solution for each well of a 96 well plate) ) 50 ul was added and reacted in a 37 ° C. incubator for 1 hour. The reacted plate was washed three times using TBST buffer, and then reacted directly with the primary antibody.
  • HGF antibody ab83760, 1: 1000 dilution
  • diluted VEGF antibody ab1316, 1: 1000 dilution
  • diluted bFGF antibody ab126861, 1: 1000 dilution
  • Secondary antibody labeled Secondary HGF antibody-Anti Rabbit IgG HRP (Sigma aldrich A0545-1ML, 1) : 1000 dilution); Secondary VEGF antibody-Donkey anti-mouse igG HRP (sc-2314, 1: 1000 dilution); Secondary bFGF antibody-Anti-Rabbit IgG HRP (Sigma aldrich A0545-1ML, 1: 1000 dilution)) 50 ul Was added and reacted for 1 hour in a 37 °C incubator.
  • the caoting solution containing the secondary antibody was removed, washed five times using TBST buffer, and then reacted using a substrate (4 mg OPD and 5ul hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer), and reacted with 1N H 2 SO 4.
  • the reaction was stopped using, and the absorbance was measured at 492 nm using an ELISA reader.
  • HGF growth factor was significantly secreted only in embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (ES-MSC) (FIG. 2).
  • Example 2 Based on the results of Example 2, in order to confirm that HGF growth factor is an important key factor in regulating the telomere length of stem cells, when HGF is blocked, the telomere length is increased in ES-MSC when a large amount of HGF is expressed. When the HGF was shortened and treated with HGF, it was experimentally confirmed under the assumption that the length of the telomeres in the BM-MSC, in which a small amount of HGF was expressed (FIG. 3), would be longer.
  • BM-MSC BM-MSC
  • HGF R & D Systems (cat no. 294-HG-005)) 10 ng / ml was treated and left for 24h. This was repeated for 5 days at intervals of 24 hours, and after 5 days, gDNA, Protein, and RNA samples were collected using gDNA, Protein lysis buffer, and RNA lysis buffer. Thereafter, using the obtained sample, real time gDNA PCR was performed as in the method described in Example 1 to compare the telomeres length according to HGF treatment.
  • Countess automated cell counter (Invitrogen) was used, and the materials used were Countess Cell Counting Chamber Slides (Invitrogen, Cat #. C10228) and Trypan blue stain 0.4% (Invitrogen, Cat #. T10282, Lot #. 1144043). It was.
  • the cell number was measured based on the following method.
  • the cells were collected by the cell centrifuge to the bottom of the tube (Cell Down), the supernatant was removed, 1ml media was added and pipetting was performed to release the cells, and then 4ml of media was added to make the final volume 5ml.
  • the cells diluted in Trypan blue and the media were added 1: 1 (10 ⁇ l each) to the Effendorf tube, and mixed well by pipetting, and 10 ⁇ l was added to the Countess Cell Counting Chamber Slides. Then, using the Countess ⁇ automated cell counter machine, the total number of cells per ml, viable cells, dead cells and viability were measured.
  • a cell so that the confluency of ES-MSC is 60% on a 60mm plate change the media to a new one before treating Neutralizing HGF antibody, and then Neutralizing HGF antibody (abcam (cat no. Ab10678)) 0.5ug / ml was treated and left for 24h. This was repeated for 5 days at intervals of 24 hours, and after 5 days, gDNA, Protein, and RNA samples were collected using gDNA, Protein lysis buffer, and RNA lysis buffer. Thereafter, using the obtained sample, as in the method described in Example 1, real time gDNA PCR was performed to compare the telomeres with or without HGF treatment.
  • Neutralizing HGF antibody abcam (cat no. Ab10678)
  • HGF can prolong the lifespan of cells, inhibit aging, and increase growth and viability.
  • the length of the chromosome telomeres is adjusted according to the presence or absence of HGF, and in order to confirm the mechanism, the recently known RAD51 together with TerT, which is a representative factor related to telomere extension, are identified. It was confirmed whether the expression of correlated with HGF.
  • mRNA expression rates of TERT and RAD51 were compared in cells treated with HGF to BM-MSCs and cells treated with neuHGF to ES-MSCs.
  • the real time PCR method of Example 1 was used.
  • TERT and RAD51 protein In order to confirm the expression level of TERT and RAD51 protein according to the presence or absence of HGF treatment in mesenchymal stem cells, the native expression level of TERT and RAD51 in ES-MSC and BM-MSC and the protein expression level after HGF treatment in BM-MSC It was confirmed by performing a western blot.
  • HGF regulates the telomeres of mesenchymal stem cells through transcriptionally activation of RAD51.
  • BM-MSC and ES-MSC basically have a difference in stem cell ability
  • the present inventors examined expression of the most common gene markers Oct4 and Nanog as stem cell function-related factors. Oct4 and Nanog expression level was higher than that of BM-MSC. Thus, when the HGF treatment to BM-MSC it was confirmed whether the expression level of Oct4 and Nanog also increased.
  • mRNA expression rates of Oct4 and Nanog were compared in HGF-treated cells in BM-MSC, and real time PCR was performed by the method of Example 1, but SEQ ID NOs: 9 and 10 Primers (Nanog amplification primers) and primers (Oct4 amplification primers) of SEQ ID NOs: 11 and 12 were used.
  • HGF can increase the stem cell capacity of mesenchymal stem cells.
  • Increasing the stem cell capacity of mesenchymal stem cells means that differentiation into various meoderm lineage cells such as Osteoblast, myoblast, adipocyte, chondrocyte, and fibloblast increases the possibility of application to a wider range of diseases as cell therapies. It is expected to be possible.
  • HGF can increase the stem cell capacity (stemness) of human cells, and has been shown to have an effect of extending the length of telomeres, which are aging indicators of cells, and thus can be applied as cell therapeutics including anti-aging factors. have.

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Abstract

본 발명은 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명에서는 다양한 성장 인자 중 HGF가 중간엽 줄기세포의 텔로미어 길이를 조절하는 등 줄기세포의 특성을 우수하게 유지하는데에 중요한 핵심 인자임을 확인하고, 중간엽 줄기세포에 HGF를 처리할 경우 줄기세포능 지표 인자의 발현이 증가하며, 염색체 말단이 연장됨으로써, 이를 통해 세포의 수명을 연장시키고, 노화를 억제할 뿐 아니라, 세포의 성장 및 생존력을 증대시켜 세포를 대량으로 배양할 수 있게 하여 종래 중간엽 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명의 방법이 세포치료 또는 재생의학에 효과적으로 이용될 수 있음을 밝혔다.

Description

인간 세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법
본 발명은 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화(differentiation)할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아 줄기 세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체 줄기 세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아 발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아 줄기 세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아 줄기 세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체 줄기 세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.
인간 배아 줄기 세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass)만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아 줄기 세포는 불임시술 뒤 남은 냉동 배아로부터 얻어진 것이다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화 가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).
하지만, 이렇듯 여러 세포로 분화할 수 있는 분화능을 가진 인간 배아 줄기세포를 세포 치료제로 이용하기 위한 다양한 시도는 아직 암화 형성과 면역 거부 반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하는 상황이다.
최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역 조절 기능을 가지고 있는 것으로 보고되고 있는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)가 제시되고 있다. Friendenstein 연구단(Exp Hematol, 4(5):267-274, 1976)에 의해 골수에서 처음 확인된 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)는 전능성 세포로, 재생 의학에서 큰 잠재성을 가진다. 상기 MSCs는 생체 내 여러 유형의 중간엽 계통, 예를 들어 골세포(Osteocytes), 연골세포(Chondrocytes), 힘줄세포(tendinocytes),지방세포(Adipocytes), 근육세포(Myocytes), 및 섬유아세포(Fibroblasts) 등으로 분화될 수 있다. 또한, 적절한 배지 조건에서는 신경 세포(Hung SC et al., Stem Cells, 20(6):522-529, 2002; Sanchez-Ramos J et al.,Exp Neurol, 164(2):247-256, 2000), 심근세포(Kadivar M et al., Biochem Biophys Res Commun, 340(2):639-647, 2006), 내피세포(Reyes M et al., Blood, 98(9):2615-2625, 2001), 및 간세포(Kang XQ et al., World J Gastroenterol, 11(47):7461-7465, 2005)로 교차 분화될 수 있다. 게다가 골수 MSCs는 클래스 II가 아닌 클래스 I MHC 항원을 발현하거나, MSCs가 면역원성 활성이 없는 것을 나타내는 상호 자극 분자들을 발현한다(Klyushnenkova E et al., J Biomed Sci, 12(1):47-57, 2005). MSCs는 면역억제 활성을 나타내므로, 이식 촉진제 및 태아 이식(fatal graft) 및 숙주 질환의 억제제로 사용될 수 있다(Le Blanc K et al., Lancet, 363(9419):1439-1441, 2004; El-Badri N.S et al., Exp Hematol, 26(2):110-116, 1998).
MSCs는 골수, 지방 조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 인간 태반 등의 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다(Kassis I et al., Bone Marrow Transplant, 37(10):967-976, 2006; Wang HS et al., Stem Cells, 22(7):1330-1337, 2004; Fukuchi Y et al., Stem Cells, 22(5):649-658, 2004). 그러나 성인 조직에서 수득한 MSCs의 개수에는 한계가 있다.
세포 치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1X109 정도이다. 그러나 조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 포함한다면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중간엽 줄기세포로 이 정도의 양을 공급하려면 최소 in vitro에서 10번 이상의 계대가 필요하게 된다. 세포는 노화되고 변형되어 더 이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다. 이는 지금의 중간엽 줄기세포의 배양시스템이 가지고 있는 풀어야 할 문제점의 하나이다. 또한 이러한 세포로 조건과 기준을 잡았다 하더라도 치료에 사용할 시에는 이미 그 세포는 바닥이 나고 다른 사람의 중간엽 줄기세포를 써야 하는 경우가 발생하고 그럴 경우 또 다른 세포이용에 따른 부가적인 실험을 다시 거처야 하므로, 기존의 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 방법 제시가 필요하다.
상기와 같은 문제점을 고려해 볼 때, 세포치료제의 가장 바람직한 재료로 기대되고 있는 중간엽 줄기세포의 체외기간을 늘려, 사용 가능한 세포 수를 다량 확보할 수 있는 방안의 개발이 필요한 실정이다.
한편, HGF(hepatocyte growth factor; 간세포성장인자)는 SF(scatter factor; 산란인자)라고도 하며, 간엽 간세포(mesenchymal cell)에 의해 생산되는 다기능성 이종이중체(heterodimer) 폴리펩타이드이다. HGF는 N-말단 핑거 도메인(finger domain) 및 4개의 크링글 도메인(kringle domain)을 포함하는 69 kDa의 알파-체인, 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 프로테아제 도메인과 유사성을 갖는 34 kDa 베타-체인을 포함하는 구조로 이루어져 있다. 인간 HGF는 생물학적으로 비활성인, 단일 체인 형태의 728개의 아미노산을 갖는 전구체로 합성되고, R494 잔기가 특이적 혈청 세린 프로테아제에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 HGF가 된다. 활성 HGF는 69 kDa의 알파-체인과 34 kDa의 베타-체인이 이황화결합으로 연결된 이종이량체이다. 현재까지 HGF 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주, 및 이를 이용한 간 질환의 치료 또는 예방 효과를 토대로, HGF와 줄기 세포와의 연관성이 개시된 적은 있으나(대한민국 공개특허 제10-2012-023656호), 아직까지 중간엽 줄기세포와 HGF와의 관련성에 대해서는 보고된 바 없다.
텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 존재하는 DNA의 부분으로, 사람 염색체 유전자의 경우에는 TTAGGG의 반복적인 배열이 계속되는 초기의 상태로는 약 10 kb 정도 길이의 DNA이다. 텔로미어에는 여러 가지 결합 단백질이 결합하여, DNA의 말단끼리 결합해서 환상의 DNA로 되는 것을 억제한다거나, 핵막과 결합하는 등의 기능을 하고 있다.
텔로미어(Telomeres)는 진핵세포 염색체의 말단에서 발견되며 염색체들의 분해나 말단-대-말단 융합을 방지하는 특별한 구조이다. 텔로머릭(telomeric) DNA는 짧은 염기서열의 직렬 반복(인간의 경우 TTAGGG)으로 구성된 일차적 구조로서, 그 길이는 하등 진핵세포의 수백 bp에서부터 포유동물 세포의 수천 bp까지 변화한다. 텔로머릭 DNA 부분은 동원체(centromere) 영역에서와 같이 GC의 불균형(GC-rich)을 나타낸다. 이러한 성질은 염색체가 복제될 때 종래 DNA 폴리머라제에 의한 G-가닥의 불완전 복제를 야기하여, 노출된 반대 가닥의 C-가닥이 핵산 제거 효소에 의해 분해되거나 텔로머라제에 의한 합성으로 텔로머릭 말단부위가 완성될 수 있다.
텔로머라제(Telomerase)는 활성 소단위인 TERT (human telomerase reverse transcriptase) 효소와 텔로머릭 DNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 RNA 성분인 TR(Telomerase RNA)로 구성된 리보뉴클레오프로테인(ribonucleop rotein) 복합체이다(Greider and Blackburn, 1989). 모든 텔로머라제 활성 소단위에서 보존된(conserved) 도메인은 레트로바이러스 및 레트로 트랜스포존로부터의 역전사효소(RT)의 활성 도메인과 구조적으로 관련되어 있다. 비록 TERT와 TR이 텔로머라제 리보뉴클레오프로테인 구조체의 최소 단위이지만, 다른 단백질들도 이 효소 복합체와 구조적으로 또는 일시적으로 연관되어 있음이 밝혀져 잇다.
텔로미어의 주요 기능은 염색체 말단을 캡핑하는 것과 분해, 말단 대 말단 융합, 및 비정형 재조합으로부터 염색체를 보호하는 것이며, 이는 게놈의 안전성 유지 및 세포 증식 조절과도 관련되어 있다. 반복된 세포 분열 후에 텔로미어의 단축(telomere shortening)이 일어나는데, 이는 복제형 노화(senescense)나 세포자살(apoptosis)를 유도하는 세포 주기 제한점 등을 활성화하여 세포 증식을 제한하게 되는데, 이는 유전적으로 불안정한 세포나 암의 기원이 될 변형세포들의 축적을 막는 순기능도 있지만, 노화나 질병이 발생할 때 장기의 항상성과 재생 그리고 생존을 제한하는 역기능도 있다. 텔로미어 단축으로 인한 조직 재생 기능의 감퇴는 줄기 세포의 기능 장애와도 관련이 있으며, 텔로미어 기능 장애는 세포 고유의 제한점들을 활성화시킬 뿐 아니라, 줄기세포를 둘러싼 미세 및 거시환경을 모두 변형시켜 줄기 세포의 기능손상을 유발한다(E Hiyama et al., British Journal of Cancer, 96: 1020-1024, 2007).
최근에는 중간엽 줄기세포와 텔로미어 길이 및 텔로머라제 활성, 및 이를 통한 분화 조절에 대한 연구가 이루어지고 있으나(Melissa A. Baxter et al., Stem cells, 22: 675-682, 2004; Dominik Parsch et al., J. Mol. MEd., 82: 49-55, 2004), 아직까지 이에 대한 명확한 기전에 대해서는 보고된 바 없다.
또한, Nanog, Oct4, Sox2 및 c-Myc 와 같은 유전자들은 줄기세포능(stemness) 관련 지표로서, 이들의 발현양이 높을수록 줄기세포의 배양 수율이 우수하고 줄기세포 특성이 우수하게 유지되고 있음을 알 수 있기 때문에 연구에 유용하게 이용되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 성장 인자인 HGF가 인간 세포인 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 조절할 수 있는 중요한 인자임을 확인하고, 이를 통해 기존의 중간엽 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명의 방법이 세포치료 및 재생의학에 필요한 세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 세포 배양액에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하는 단계를 포함하는 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 염색체 말단을 연장시키는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 수명을 연장시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 노화를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 성장을 증대시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 생존력을 증대시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 중배엽으로의 분화 효율을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 세포는 인간 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 인간 중간엽 줄기세포의 장기 및 대량 배양이 가능하고, 분화능을 유지한 상태의 줄기 세포를 높은 수율로 확보할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 세포치료 및 재생의학에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 BM-MSC와 ES-MSC 각각의 세포에서 텔로미어의 길이를 real time quantitative PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 ES-MSC, BM-MSC 및 UCB-MSC에서 대표적 성장인자의 분비량을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 3은 ES-MSC 및 BM-MSC에서 HGF를 처리 유무에 따른 텔로미어 길이 변화를 예상한 그림이다.
도 4는 BM-MSC에 HGF를 처리하는 방법(A), HGF가 처리된 세포에서 얻어진 gDNA를 이용한 real time gDNA PCR 결과(B), 및 HGF가 처리된 각 세포에서 살아있는 세포수, 죽은 세포수, 및 전체 세포수를 확인한 결과(C)이다.
도 5는 ES-MSC에 neuHGF를 처리하는 방법(A), neuHGF가 처리된 세포에서 얻어진 gDNA를 이용한 real time gDNA PCR 결과(B), 및 neuHGF가 처리된 각 세포에서 살아있는 세포수, 죽은 세포수, 및 전체 세포수를 확인한 결과(C)이다.
도 6은 BM-MSC에 HGF 처리에 따른 TERT 및 RAD51 mRNA 발현 변화를 real time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 ES-MSC에 neuHGF 처리에 따른 TERT 및 RAD51 mRNA 발현 변화를 real time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 BM-MSC 및 ES-MSC에서 자연적으로 발현되는 TERT 및 RAD51 단백질 발현양을 western blot을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 BM-MSC에서 HGF 처리에 따른 TERT 및 RAD51 단백질 발현 변화를 western blot을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 BM-MSC에 HGF 처리에 따른 Oct4 및 Nanog mRNA 발현 변화를 real time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 BM-MSC에서 HGF 처리에 따른 Oct4 및 Nanog 단백질 발현양을 western blot을 통해 확인한 결과이다.
본 발명자들은 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)가 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 성장속도도 빠르고, 건강한 상태로 배양을 유지할 수 있는 기간 또한 길다는 점에 착안하여, 이러한 차이를 유발하는 인자를 밝히기 위해 연구를 수행한 결과, 다양한 성장 인자 중 HGF가 중간엽 줄기세포의 줄기세포능(stemness)을 조절할 수 있는 중요한 핵심 인자임을 확인하였다. 따라서, 중간엽 줄기세포에 HGF를 처리할 경우, 텔로미어(telomere), 즉 염색체 말단 부분을 연장시킬 수 있으며, 세포의 수명을 연장시키거나 노화를 억제할 뿐 아니라, 세포의 성장 및 생존력을 증대시켜 세포를 대량으로 배양하여 기존의 중간엽 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복할 수 있음을 밝혔으며, 줄기세포능의 지표로 이용되는 Oct4 및 Nanog 등의 발현을 증가시킬 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명의 방법이 세포치료 및 재생의학에 효과적으로 적용될 수 있다는 사실을 규명하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포 배양액에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 배양액은 인간 세포 배양액이고, 상기 인간 세포는 중간엽 줄기세포이며, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 지방 조직, 제대혈, 말초혈, 신생아 조직, 인간 태반 등 인체의 여러 조직과 만능 줄기세포에서 유래할 수 있으며, 골수에서 유래한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸 줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래(전이(transit)) 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)"는 생체내 여러 유형의 중간엽 계통, 예를 들어 골세포(Osteocytes), 연골세포(Chondrocytes), 힘줄세포(tendinocytes),지방세포(Adipocytes), 근육세포(Myocytes), 및 섬유아세포(Fibroblasts) 등으로 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미하며, 골수, 지방 조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 인간 태반 등의 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 배양액"은 배양된 세포가 포함되어 있는 배지를 의미하고, 상기 "배지"는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner,C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)),McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 α-MEM, Eagles's MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752/1 및 McCoy's 5A로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 α-MEM 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 혈청을 추가적으로 포함한다. 본 발명에서 배지에 포함되는 혈청은 당업계에서 인식하는 목적으로 첨가되며, 중간엽 줄기세포의 증식에 있어서 성장인자(growth factors)의 공급원으로서 중요한 역할을 한다. 이용될 수 있는 혈청은, 바람직하게는 FBS(fetal bovine serum), BCS(bovine calf serum), 말 혈청(horse serum) 또는 인간 혈청(human serum)이며, 가장 바람직하게는 FBS일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 4-30 중량%이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 5-15 중량%이며, 가장 바람직하게는 약 10 중량%이다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 방법에 의해 유도 활성화된 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 형성 등에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포 치료제"는 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 또는 조직으로 질병의 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 HGF(Hepatocyte growth factor)를 포함하는 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는데 유용한 세포 배양 배지를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF는 1-100 ng/ml의 농도로 배지내에 포함되는 것이 바람직하고, 1-10 ng/ml의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 혈청을 추가적으로 포함하고, 본 발명의 배지에는 혈청 이외에 줄기세포를 효율적으로 배양하기 위해 통상적인 줄기세포 배양용 조성물로 당업계에 알려진 어떠한 성분도 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. BM-MSC와 ES-MSC 간 텔로미어 길이 비교
본 발명자들은 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)가 기존의 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 체외 배양시 성장속도도 빠르고 건강한 상태로 배양을 유지할 수 있는 기간이 길며, 세포치료제로서의 효능도 우수한 것으로 나타남에 따라, 그 원인을 분석하고자 실험을 수행하였다.
먼저, 체외 배양 기간의 차이를 유발할 수 있는 잣대로 BM-MSC 세포와 ES-MSC 각각 세포의 텔로미어 길이를 Real-Time Quantitative PCR을 수행하여 그 길이를 비교해 보았다.
BM-MSC는 Lonza에서 구매하여 사용하였고, ES-MSC는 하기의 방법에 의해 제작 및 배양하였다.
(1) 배아체 형성
미분화 상태로 유지되던 서울대병원 인간 배아줄기세포(동양인#1, 남성, STO feeder)에 대하여 단백질분해효소(dispase, 2mg/ml)로 처리하고 미세 작업으로 분리한 다음 bFGF가 없는 배아줄기세포 배지에서 부유 상태로 14일간 배양하였다.
(2) 중간엽 줄기세포로의 분화 유도
14일간의 부유 배양으로 만들어진 배아체를 조직 배양 접시에 부착시킨 다음 자연적으로 중간엽 줄기세포의 분화를 유도하였다. 상기 배아체를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 FBS(fetal bovine serum)를 첨가(10% v/v)한 배지에서 16일간 배양하면서 중간엽 줄기세포의 분화유도를 관찰하였다.
(3) 분화유도된 중간엽 줄기세포의 유지 및 증식 배양
상기 실시예 1-(2)에서 배아체 부착 후 16일간 배양하여 분화유도된 중간엽 줄기세포에 대하여 효소(Trypsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na) 를 처리하고 단일 세포로 해체시킨 다음 다시 조직 배양 접시에 부착시켰다. 이 후 배양액 총 500㎖ 중 hEGF 0.5㎖ (human Epidermal Growth Factor), VEGF 0.5㎖ (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B 2㎖ (human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1 0.5㎖ (Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손 (hydrocortisone) 0.2㎖ 및 아스코르브산 0.5㎖ 과 기본 배지 470㎖이 첨가된 배지 (EGM-2MV, CC4147, Lonza) 를 이용하여 37℃에서 유지 및 증식 배양시켰다.
각각 배양된 BM-MSC 및 ES-MSC에서 TRIzol 방법을 통해 RNA를 분리하고, 추출된 1ug에 해당하는 양의 RNA와 RNase-free water를 섞어 총량 9 ul가 되도록 만든 다음, 70℃에서 10분 동안 가열해준 후, 샘플을 바로 얼음 위로 옮긴 다음, RT-reaction mixture(25mM MgCl2, 10X RT bufer, 10mM dNTP mixture, RNasin, Oli해 (dT) primer, AMV Reverse Transcriptase) 11ul를 넣어 vortexing하여 섞어주었다. 이후, 50℃에서 1시간, 95℃에서 5분, 4℃ 지속 조건으로 PCR을 수행하여, 각 세포에서 cDNA를 제작하였다.
다음으로, 상기 제작된 cDNA를 Power SYBR Green PCR master mix(cat#ABS-4367659)를 이용하여, Real-time PCR을 수행하였다. 이때, 서열번호 1 및 2의 terlomere primer를 이용하였으며, 대조군으로 acidic ribosomal phosphoprotein O를 코딩하는 36B4를 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4의 36B4 primer를 이용하였다.
이때, 구체적인 PCR 조건은 하기 [표 1]과 같으며, 기본적으로, 보고자 하는 target은 한 sample 당 3번씩 반복 실험을 수행하였다.
표 1 Real time Quantitative PCR condition of telomere length
Telomere condition 36B4 condition
50℃ 2min 50℃ 2min
95℃ 10min 95℃ 10min
95℃ 15sec 95℃ 15sec
54℃ 2min 58℃ 1min
for 40 cycle for 40 cycle
그 결과, BM-MSC에 비해 ES-MSC에서 텔로미어의 길이가 약 2배 이상 유의적으로 긴 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. BM-MSC와 ES-MSC에서 대표적 성장인자의 분비량 확인
상기 실시예 1에서 BM-MSC와 ES-MSC에서 텔로미어의 길이 차이를 발생시키는 유발 인자를 발굴하기 위하여, 각각의 세포에서 대표적 성장인자인 FGF-2, VEGF, HGF의 분비량을 확인하기 위하여, ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 96 well plate의 각 well당 coating solution(carbonate-bicabonate buffer capsules, sigma)에 희석시킨 항원 50 ul(250ng/well)을 넣고, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 놓아두거나, 혹은 4℃에서 18시간 동안 놓아두어 항원을 코팅시켰다. 이후, 항원이 들어있는 coating solution을 제거하고, 각 well에 200ul의 blocking solution을 넣은 다음, 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, blocking solution을 제거하고, 300ul의 TBST(0.1M Tris-buffered ssaline, pH7.4 with 0.1% Tween 20)를 넣고, 5분 동안 washing하였다.
이후, 96 well plate의 각 well당 coating solution에 희석시킨 1차 항체(HGF antibody(ab83760, 1:1000 희석); VEGF antibody(ab1316, 1:1000 희석); bFGF antibody(ab126861, 1:1000 희석)) 50 ul을 넣어, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 plate는 TBST buffer를 이용하여, 3번 washing한 다음, 1차 항체와 직접적으로 반응하는, HRP가 labeling되어 있는 2차 항체(Secondary HGF antibody-Anti Rabbit IgG HRP(Sigma aldrich A0545-1ML, 1:1000 희석); Secondary VEGF antibody-Donkey anti-mouse igG HRP(sc-2314, 1:1000 희석); Secondary bFGF antibody-Anti-Rabbit IgG HRP(Sigma aldrich A0545-1ML, 1:1000 희석)) 50 ul를 넣어, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다.
그 다음, 2차 항체가 담긴 caoting solution을 제거하고, TBST buffer를 이용하여 5번 washing한 후, substrate(4mg OPD and 5ul hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer)를 이용하여 반응시키고, 1N H2SO4를 이용하여 반응을 중지시키고, ELISA reader를 이용하여 492nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)에서만 HGF 성장인자가 현저히 분비됨을 확인하였다(도 2).
실시예 3. HGF 처리 유무에 따른 줄기 세포의 텔로미어 길이 변화 및 세포 성장 확인
상기 실시예 2의 결과를 토대로, HGF 성장인자가 줄기세포의 텔로미어 길이를 조절하는 데 중요한 핵심 인자임을 확인하기 위하여, HGF를 차단하였을 경우에는 기존 HGF가 다량 발현되면 ES-MSC에서는 텔로미어의 길이가 짧아지고, HGF를 처리하였을 경우에는 기존 HGF가 소량 발현되던 BM-MSC에서 텔로미어의 길이가 길어질 것이라는 가정하에(도 3), 이를 실험적으로 확인하였다.
3-1. HGF 처리에 따른 BM-MSC의 텔로미어 길이 변화 및 세포 성장 확인
우선적으로, HGF 처리에 따른 BM-MSC의 텔로미어 길이 변화를 확인하기 위하여, recombinant HGF를 세포에 처리하였다.
구체적으로, 60mm plate에 BM-MSC의 confluency 가 60% 되도록 cell을 준비하고, HGF를 처리하기 전, media를 새것으로 갈아준 다음, HGF(R&D Systems (cat no. 294-HG-005)) 10 ng/ml을 처리하고 24h 동안 놓아두었다. 이를 24시간 간격으로 5일 동안 반복하고, 5일 후에, gDNA 및 Protein lysis buffer, RNA lysis buffer를 이용하여 gDNA, Protein, RNA 샘플을 수거하였다. 이후, 얻어진 sample을 이용하여, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 같이, Real time gDNA PCR을 수행하여 HGF 처리에 따른 텔로미어 길이를 비교하였다.
이와 함께, automated cell counter를 이용하여, 세포 생존율, 총 세포수, 살아있는 세포수, 죽은 세포수를 측정하여, HGF 처리 유무에 따른 줄기 세포의 성장 및 생존력 증대 효과를 확인하였으며, 이때, 사용 기기로는 Countess　 automated cell counter (Invitrogen)를 이용하였고, 사용재료로는 Countess Cell Counting Chamber Slides (Invitrogen, Cat#. C10228) 및 Trypan blue stain 0.4% (Invitrogen, Cat#. T10282, Lot#. 1144043)을 이용하였다.
구체적으로, 하기의 방법을 토대로 세포수를 측정하였다.
우선, 세포 원심분리기로 세포를 tube의 바닥으로 모은 후(Cell Down), 상층액을 제거하고, 1ml media를 넣고 pipetting 하여 세포를 풀어준 후, media 4ml를 더 넣어서 최종 볼륨이 5ml 되도록 하였다. Effendorf tube에 Trypan blue와 상기 media에 희석시킨 세포를 1:1로 넣어주었으며(각각 10μl 씩), pipetting으로 잘 섞어준 후, Countess　 Cell Counting Chamber Slides에 10μl를 넣어주었다. 그 다음, Countess　 automated cell counter 기계를 이용하여, ml당 총 세포 수와 살아있는 세포 수, 죽은 세포 수 및 생존율이 측정하였다.
그 결과, HGF가 발현되지 않던 BM-MSC에 HGF를 처리할 경우, 처리하지 않은 경우에 비해 약 8배 정도 텔로미어의 길이가 길어졌음을 확인하였으며(도 4B), 세포의 성장이 증가하였을 뿐 아니라, 죽은 세포수도 줄어들었음을 확인하였다(도 4C).
3-2. HGF 차단에 따른 ES-MSC의 텔로미어 길이 변화 및 세포 성장 확인
다음으로, HGF 차단에 따른 ES-MSC의 텔로미어 길이 변화를 확인하기 위하여, Neutralizing HGF 항체(neuHGF)를 세포에 처리하였다.
구체적으로, 60mm plate에 ES-MSC의 confluency 가 60% 되도록 cell을 준비하고, Neutralizing HGF 항체를 처리 하기 전, media를 새것으로 갈아준 다음, Neutralizing HGF 항체(abcam (cat no. ab10678)) 0.5ug/ml을 처리하고 24h 동안 놓아주었다. 이를 24시간 간격으로 5일 동안 반복하고, 5일 후에, gDNA 및 Protein lysis buffer, RNA lysis buffer를 이용하여 gDNA, Protein, RNA 샘플을 수거하였다. 이후, 얻어진 sample을 이용하여, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 같이, Real time gDNA PCR을 수행하여 HGF 처리 유무에 따른 텔로미어 길이를 비교하였다.
아울러, 상기 실시예 3-1에 기재된 세포수 측정 방법을 이용하여, HGF 차단 후, ES-MSC의 세포수 변화를 확인하였다.
그 결과, HGF가 강하게 발현되던 ES-MSC에 neutralizing HGF 항체를 처리하여 HGF를 차단할 경우, 처리하지 않은 경우에 비해 약 절반 정도로 텔로미어의 길이가 줄어들었음을 확인하였으며(도 5B), 세포의 성장이 줄어들었을 뿐 아니라, 죽은 세포수도 증가하였음을 확인하였다(도 5C).
상기 결과를 통하여, HGF는 중간엽 줄기세포의 염색체 말단을 연장시킴으로써, 세포의 수명을 연장시키고, 노화를 억제할 뿐 아니라, 성장 및 생존력을 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 중간엽 줄기세포에서 HGF의 텔로미어 연장 기전 규명
상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 중간엽 줄기세포에서 HGF 유무에 따라 염색체 말단인 텔로미어의 길이가 조절됨에 있어, 그 기전을 확인하기 위하여, 텔로미어 연장과 관련된 대표적 인자인 TerT와 함께 최근에 알려진 RAD51의 발현이 HGF와 상관성이 있는지를 확인하였다.
4-1. Real time PCR 결과 확인
우선, 상기 실시예 3-1 및 3-2의 방법과 같이, BM-MSC에 HGF를 처리한 세포 및 ES-MSC에 neuHGF를 처리한 세포에서 TERT와 RAD51의 mRNA 발현율을 비교하였으며, 이때, 상기 실시예 1의 real time PCR 방법을 이용하였다.
구체적으로, RAD51 및 TERT mRNA 발현율 비교를 위한 Real time PCR은 서열번호 5 및 6의 프라이머(hRAD51 증폭 프라이머), 및 서열번호 7 및 8의 프라이머(hTERT 증폭 프라이머)를 이용하였으며, 그 구체적인 PCR 조건은 하기 [표 2]와 같다.
표 2 Real time PCR condition for TERT and RAD51 mRNA expression level identification
50℃ 2min95℃ 10sec
95℃ 15sec60℃ 1min 40 cycle
95℃ 15sec60℃ 1min95℃ 30sec60℃ 15sec
그 결과, 중간엽 줄기세포에 HGF를 처리할 경우, RAD51 mRNA 발현이 증가하고, HGF를 차단할 경우, RAD51 mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다(도 6 및 7).
4-2. Western blot 결과 확인
중간엽 줄기세포에 HGF 처리 유무에 따른 TERT 및 RAD51의 단백질 발현양을 확인하기 위하여, ES-MSC 및 BM-MSC에서 TERT 및 RAD51의 native expression level 및 BM-MSC에 HGF를 처리한 후의 protein expression level을 western blot을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, western blot은 상기 실시예 2의 방법을 토대로 수행하였으며, 이때 사용된 1차 항체 및 2차 항체의 종류 및 희석 비율을 하기 [표 3]과 같다.
표 3
Protein Size(kDa) Primary AB Secondary AB ECL
TERT 122 Anti-Telomerase reverse transcriptase antibody [Y182](Abcam ab32020)1:1000 D anti-rabbit IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A0545)1:2000 D 1h
RAD51 37 Rad51 (D4B10) Rabbit mAb(Cell signaling #8875)1:500 D anti-rabbit IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A0545)1:2000 D 20min
Positive control(α-tubulin) 55 1:10000 D anti-mouse IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)1:2000 D 5s
그 결과, native 상태에서는 ES-MSC에서 BM-MSC에 비해 많은 양의 RAD51의 단백질 발현양이 현저히 많음을 확인하였고(도 8), BM-MSC에 HGF를 처리하면, RAD51의 양이 현저히 증가함을 확인하였다(도 9).
상기와 같은 결과를 통하여, HGF가 RAD51의 transcriptionally activation을 통해 중간엽 줄기세포의 텔로미어 길이를 조절함을 알 수 있었다.
실시예 5. BM-MSC와 ES-MSC의 줄기세포능 확인
본 발명자들은 BM-MSC와 ES-MSC가 기본적으로 줄기세포능(stemness)의 차이를 가지는지 확인하고자, 줄기세포능 관련 인자로 가장 일반적인 유전자 마커 Oct4와 Nanog의 발현을 살펴본 결과, ES-MSC에서 Oct4와 Nanog의 발현 정도가 BM-MSC에 비해 더 높은 것을 알 수 있었다. 이에, BM-MSC에 HGF를 처리할 경우 Oct4와 Nanog의 발현 정도도 높아지는지 확인하였다.
5-1. Real time PCR 결과 확인
상기 실시예 3-1의 방법과 같이, BM-MSC에 HGF를 처리한 세포에서 Oct4와 Nanog의 mRNA 발현율을 비교하였으며, real time PCR은 상기 실시예 1의 방법으로 수행하되, 서열번호 9 및 10의 프라이머(Nanog 증폭 프라이머), 및 서열번호 11 및 12의 프라이머(Oct4 증폭 프라이머)를 이용하였다.
그 결과, BM-MSC에 HGF를 처리할 경우, Oct4 및 Nanog의 mRNA 발현이 모두 증가함을 확인하였다(도 10).
5-2. Western blot 결과 확인
BM-MSC에서 HGF 처리에 따른 Oct4와 Nanog의 단백질 발현양을 확인하기 위하여, BM-MSC에 HGF를 처리한 후의 protein expression level을 western blot을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, western blot은 상기 실시예 2의 방법을 토대로 수행하였으며, 이때 사용된 1차 항체 및 2차 항체의 종류 및 희석 비율은 하기 [표 4]와 같다.
표 4
Protein Size(kDa) Primary AB Secondary AB ECL
Oct4 43 santacruz anti-Oct4 antibody sc-90811:2000 D Anti-Goat IgG (whole molecule)Peroxidase antibody produced in rabbit(Sigma-Aldrich A5420)1:3000 D 7min
Nanog 35 abcamanti-Nanog abab-754841:2000 D anti-mouse IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)1:2000 D 20min
Positive control(α-tubulin) 55 1:10000 D anti-mouse IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)1:2000 D 5s
그 결과, BM-MSC에 HGF를 처리하면 Oct4 및 Nanog의 단백질 수치가 현저하게 증가함을 확인하였다(도 11).
상기 결과로부터, HGF가 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 높일 수 있음을 알 수 있다. 중간엽 줄기세포의 줄기세포능이 높아진다는 것은 Osteoblast, myoblast, adipocyte, chondrocyte, fibloblast 등 다양한 중배엽 계통(mesoderm lineage) 세포로의 분화 가능성이 높아진다는 것을 의미하므로, 세포치료제로서 더 많은 영역의 질환에 적용 가능할 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에서는 HGF가 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시킬 수 있으며, 세포의 노화 표시자인 텔로미어의 길이를 연장시키는 효과가 있음을 밝혔으므로, 이를 노화 방지 인자를 비롯한 세포 치료제로서 적용할 수 있다.
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Telomere forward primer
<400> 1
ggtttttgag ggtgagggtg agggtgaggg tgagggt
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Telomere reverse primer
<400> 2
tcccgactat ccctatccct atccctatcc ctatcccta
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 36B4 forward primer
<400> 3
cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 36B4 reverse primer
<400> 4
cccattctat catcaacggg tacaa
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hRAD51 forward primer
<400> 5
gcataaatgc caacgatgtg
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hRAD51 reverse primer
<400> 6
gtggtgaaac ccattggaac
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTERT forward primer
<400> 7
ggagtagcag agggaggccg
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTERT reverse primer
<400> 8
agccagtctc accttcaacc gc
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanog forward primer
<400> 9
accttccaat gtggagcaac
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanog reverse primer
<400> 10
gaatttggct ggaactgcat
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct4 forward primer
<400> 11
gaggcaacct ggagaatttg
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct4 reverse primer
<400> 12
tagcctgggg taccaaaatg

Claims (8)

  1. 세포 배양액에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하는 단계를 포함하는 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 인간 세포의 염색체 말단을 연장시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 인간 세포의 수명을 연장시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 인간 세포의 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 인간 세포의 성장을 증대시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 인간 세포의 생존력을 증대시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 중배엽으로의 분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
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