JP2015091254A - Znf281を発現する臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収する、臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法。分離された臍帯血由来の万能幹細胞、前記の臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含む細胞治療剤。また、新規な幹細胞培養用培地、この培地で幹細胞を培養して増殖させる、幹細胞の培養方法、及び幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養する、幹細胞の幹性(stemness)増加方法。
【選択図】図6
Description
ており、このような独特の性質を用いて再生医学の観点から多様な退行性疾病の治療のための解決方法として提示されるだけでなく、細胞などのバイオロジーに対する深い通察ができる。多様な組職から得ることができる成体幹細胞は、一般的に胚芽幹細胞に比べて無制限的なソースと研究者らが直面できる倫理的な問題を避けることができるため、遥かに魅力的である。さらに、臍帯血から分離された幹細胞は、骨髓や脂肪組職と異なって寄贈者が追加的な害を被る恐れがないので、他の成体幹細胞などよりもさらに大きい長所を有している。
間葉系幹細胞を用いた傷、糖尿病、心臓梗塞(heart infraction)などに成功的な移植が多くの論文などを介して報告されて来た(Nonome, K. et al., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., Circulation, 112:96, 2005)。伝染病の伝達危険が少なく、移植片
対宿主病(graft-versus-host disease)にかかる危険が低いため、臍帯血間葉系幹細胞移
植は、小児、大人患者の皆に急速に施術されている(Claudio G. B. et al., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006)。臍帯血移植がいくつかの疾病、特に、造血母欠陷(hematopoietic defection)に係った疾病などに施術することができる方法として受け入れられたと言っても(Grewal, SS. et al., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al., Blood, 103:489, 2004)、臍帯血由来の間葉系幹細胞の臨床的な適用に関する研究は、依然として制限されている。例えば、脊髓損傷された女性及びバージャー病(buerger's disease)患者において、完全な回復ではないが、部分的に成功した報告などがある(Kim, SW. et al., Stem Cells, 2006; Kang, KS. et al., Cytotherapy, 7:368, 2005)。しかし、このような細胞などの発達メカニズムだけでなく、この細胞などをどんなによく培養して増殖するかに対しては、依然としてよく知られていない。
を成すことを見付け、これを持続的に培養した時、細胞の特性が一定ほど維持されることを確認した。それで既存の方法において問題視されている臍帯血由来の非造血係万能幹細胞及び間葉系幹細胞の效率的分離及び大量増殖が可能な培養方法として本発明を完成した。
した後、フィコール−プラーク(Ficoll-plaque)を用いて単核細胞を分離することによっ
て得ることができる。ここで、臍帯血とHetasepの混合比は、臍帯血5ml当たり0.5
〜2mlにするのが好ましい。
ィブロネクチンは、培養容器にコーティングされるとか、粒子形態または三次元構造物の形態として培地に含まれることができる。一つの態様として、フィブロネクチンが培養容器にコーティングされた場合、フィブロネクチンは、0.1〜1mg/mlの濃度で含ま
れることができる。
ば、組換えDNA技術、繊維芽細胞培養など)を通じて製造するとか、ヒトを含む動物の
血漿または細胞外基質から分離することによって入手することもできる。前記フィブロネクチンは、フィブロネクチンの断片(fragment)またはペプチドであるとか、これを含むことができる。
e)、IGF−1(Insulin-like Growth Factor-1)またはVEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)、ヘパリン(heparin)を添加し、必要に応じてGA−1000(Gentamycin
Sulfate、 Amphotericin-B)を更に添加するのが好ましい。
GF(Epidermal Growth Factor)1〜40ng/ml、ヒドロコルチゾン0.1〜1μg
/ml、IGF−I(Insulin-like Growth Factor-1)1〜40ng/mlまたはVEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)1〜5ng/ml及びヘパリン20〜25μg/mlを添加し、必要に応じてGA−1000(Gentamycin Sulfate、 Amphotericin-B)を
更に添加することである。
(a)転写調節因子であるc−myc、ZNF281に対して陽性の免疫学的な特性を示す。
(b)細胞外基質がコーティングされた底に付着され、付着の後5〜30日の間に紡錘形または球形態の細胞集落を成しながら増殖する。
(c)30〜45のCPDL(cumulative population doubling level)を示す。
(d)CD14、CD31、CD34、CD45及びHLA−DRに対して陰性の免疫学的特性を示す。
(e)中胚葉、内胚葉及び外胚葉の細胞に分化可能である。
(f)TIMP−2、TGF−β、RANTES CINC−3、EOTAXIN、GM−CSF、IFN−γ、IL−1b、IL−3、IL−6、IL−8、IL−10、IL12p40、IL13、IL−16、IP−10、Leptin、MCP−2、MIG、MIP−3a、b−NGFm、sTNFRI、PFGF−bbからなる群から選択された少なくとも一つのサイトカインまたはケモカインを分泌する。
る。
関節炎)、骨欠損(例えば、骨粗鬆症)、肝疾患(例えば、肝硬変)、心血管系疾患を含む多
様な疾病を治療するのに利用され得る。
alanced salt solution)などの緩衝溶液、血漿または血液成分などがあり得る。
ml、ヒドロコルチゾン0.1〜1μg/ml、IGF−I(Insulin-like Growth Factor-1)1〜40ng/mlまたはVEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)1〜5ng/ml及びヘパリン20〜25μg/mlが添加され、必要に応じてGA−1000(Gentamycin Sulfate、Amphotericin-B)が更に添加されたEGM−2またはSNU−1培地を含む。
。培養は、5%CO2条件下で行うのが適合し、培養は、5〜30日間長続くことができるが、これに制限されるのではない。
また、前記幹細胞は、成体幹細胞であるものを更に含むことができる。
を形成するとか、Oct4、Sox2などのような転写調節因子をさらに強く発現することを意味する。
Full term UCBサンプル(n=20)は、産婦の同意下で集めた。まず、Full term UCBをHetaSep(Stem cells TechnologiesINC,Vancouver,BC)を用いて赤血球を優先的に分離した。その後は、既存の方法と同様にフィコール相(ficoll gradient)から分離を行った。分離した単核細胞を20%FBSを含有したEGM−2 SingleQuotsを添加したSNU−1培地またはEGM−2(Lonza)を用いてフィブロネクチンを0.1mg/ml−1mg/mlの濃度でコーティングした6 well plateに1×105〜8細胞で培養した。EGM−2 SingQoutsの構成は、ヘパリン(heparin)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)、rhEGF、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、VEGF、rhFGF−B、R3−IGF−1、GA−1000から構成されている。細胞を培養してから3日後に付着されなかった単核細胞を除去し、培地は2〜3日ごとに交替させた。
殖する。したがって、細胞の成長速度は、1つの細胞が2つの細胞になる時間がどのくらいなのかに応じて決定される。これをDoubling timeといい、細胞の増殖力を評価できる尺度として使用され得る。もし、CDPL値が10であれば、1つの細胞が10回の分裂をすることを意味し、これを数値上で計算すれば、1つの細胞が約1000個の細胞まで増殖することを意味する。既存の臍帯血由来の幹細胞の最大の問題点は、脂肪組職や骨髓由来の間葉系幹細胞に比べて著しく落ちる増殖力であり、細胞の大量増殖である臨床適用の側面からも増殖力が重要であると見られる。測定方法は、次のように行った。まず、異なる臍帯血サンプルから分離した3種類の臍帯血由来の万能幹細胞を100ディッシュに2×105個ずつ培養し、3日または4日ごとに継代を行い、細胞計算機を用いて細胞数を測定した。細胞の増殖が止めるまで継続的に細胞を培養して細胞数を測定した。このように求めた細胞数を次のような数学式1を用いてCPDL値を求める。
内皮前駆細胞が2ヶ月程度の培養時間に約20CPDLを示した一方、臍帯血由来の万能幹細胞の場合は、3種類の異なるサンプルのすべてが40〜45CPDLを示した。このような数値は、理論上に1つの細胞集落から1012まで増殖できることを意味する。
培地内に懸濁した細胞などを特性を分析するフローサイトメトリー(flow cytometry)実験を行った。細胞表面抗原のフェノタイピング(phenotyping)のために、3−4継代細胞
などを取得してFITC(fluorescein isothiocyanate)またはPE(phycoerythrin)が結
合された抗体で染色し、FACS Aria(Becton Dickinson,NY)にて分析を行った。
の特性を分析するために、標識抗原としては、CD10(T細胞マーカー)、CD14(単
核細胞マーカー)、CD24(上皮細胞マーカー)、CD29(単核細胞マーカー)、CD3
1(内皮細胞マーカー)、CD34(造血母幹細胞マーカー)、CD44(間葉系幹細胞マー
カー)、CD45(非造血母幹細胞マーカー)、CD51/61(破骨細胞マーカー)、CD
73(間葉系幹細胞マーカー)、CD90(間葉系幹細胞マーカー)、CD105(間葉系幹
細胞マーカー)、CD133(造血母幹細胞マーカー)、HLA−DR(免疫拒否反応関連マーカー)を使用し、これをフローサイトメトリーを用いて分析を行った。実施結果は、表
2の通りである。図4は、下記の結果をグラフで表示したものである。
ZNF281(Zinc finger protein 281)は、ESCで核心転写因子中の一つである(Wang J et al.(2006) Nature 444,364-368)。初期にZBP−99と命名された、ZNF
281は、ZBP−89と91%アミノ酸配列類似性及び79%配列同一性を共有する4つのKrppel型ジンクフィンガーを保有している。また、2つの遺伝子のカルボキシ末端切片には、よく保存されたアミノ酸配列が存在する。ZNF281 cDNAの予想されるオープンリーディングフレームは、99kDaタンパク質を暗号化する。EMSA(Electrophoretic mobility shift as say)の結果では、ガストリン(GASTRIN)及びオルニチン脱炭酸酵素(ORNITHINE DECARBOXYLASE)遺伝子のGC−リッチ(rich)プロモーター部
位に特異的に結合することを示す(Law DJ et al.(1999) Biochem Biophys Res Commun 262,113-120; Lisowsky T et a l.(1999) FEBS Lett 453,369-374)。ZNF281は、質量スペクトル多次元タンパク質同定技術(mass spectral multidimensional protein identification technology)と組合されたタンデム親和度精製(tandem affinity purification)によってc−MYC連関タンパク質のうちの一つとして同定された(Koch HB et al.(2007) Cell Cycle 6,205-217)。
で10分間透過処理(permeabilize)した。スライドとディッシュは、ヒトOct4(1:
200)に対するマウス1次抗体で1時間インキュベーションした後、PBS(phosphate buffered saline; Gibco)で洗浄し、赤色蛍光染料であるAlexa594が結合された
goat抗マウスIgG2次抗体(Invitrogen)で1時間インキュベーションして免疫染色を行い、対照染色としてDAPIを用いて核を染色した。
骨形成細胞へ分化を誘導するために細胞を付着させ、細胞が付着してから約70−80%のコンフルアンシ(confluency)になるまで培養した。70−80%のコンフルアンシに到逹した場合に骨分化誘導培地に交換した。骨分化誘導培地は、DMEM(low glucose)
に10%のFBSを添加し、10mMのβ−グリセロリン酸(beta-glycerophosphate)(Sigma-Aldrich)、0.1μMのデキサメタゾン(Dexamethasone)(Sigma-Aldrich)、50μMのアスコルビン酸塩(ascorbate)(Sigma-Aldrich)を添加して製造した。培地は、3日ごとに交換させ、分化誘導は、約2週間行った。
ある。培地を除去した後に蒸溜水を用いて2回洗浄した後、冷たい70%のEtOHを使用して4℃で1時間固定した。再び蒸溜水で2回洗浄した後、40mMのアリザリンレッドS(Alizarin red s)を使用して常温で10分間染色した。その後に蒸溜水を用いて5回洗浄した。
脂肪細胞分化を誘導するために、細胞が付着してから約70−80%のコンフルアンシになるまで培養した。70−80%のコンフルアンシに到逹した場合に脂肪分化誘導培地に交換した。脂肪分化誘導培地は、DMEM(low glucose)に10%のFBSを添加した
。1μMのデキサメタゾン(Dexamethasone)、10μg/mlのインシュリン(insulin)(Sigma-Aldrich)、0.5mMの3−イソブチル−1−メチルキサンチン(3-isobutyl-1-methylxanthine)(Sigma-Aldrich)、0.2mMのインドメタシン(indomethacin)(Sigma-Aldrich)を添加して分化培地を製造した。分化誘導培地は、3日ごとに交換させ、分化誘導は、約2−3週間行った。
確認する。培地を除去してPBSを用いて洗浄した後、10%のホルマリンを入れて常温で5分間置いた。ホルマリンを除去し、再び新しいホルマリンを同量入れて常温で最小1時間以上固定した。ホルマリンを除去した後、60%のイソプロパノール(isopropanol)
を用いて洗浄した。完全に乾くまで待った後、オイルレッドO(Oil red O)染色薬を入れ
て常温で10分間染色した。染色薬を除去した後、直ちに蒸溜水を入れて洗浄した。
た時に赤い色を示すが、オイルレッドO(Oil red O)は、脂肪細胞の脂肪滴(lipid droplet)を赤い色で染色するからである。図8C及び図8Dからわかるように、分化を誘導しない図8Cは、脂肪滴(lipid droplet)が多く見えないだけでなく染色もほとんどできなか
ったが、分化を誘導した図8Dは、脂肪滴(lipid droplet)が多く見えて赤い色に染色さ
れたことを観察できる。
軟骨細胞へ分化を誘導するために、ロンザ(Lonza)から出たrTGF−beta 3を
含有した軟骨細胞形成培地(PT-3003)に3週間処理した。培地は、一週間に2回ずつ交換
させ、軟骨細胞形成(osteogenesis)は、1週間ごとに測定した。
時間ピクリン酸(picric acid)で固定した。その後、クリオセクション(cryosection)して3分間トルイジンブルー染色(toluidine blue staining)を行い、ヘマトキシリン(hematoxilin)で3秒間対比染色(counterstaining)を行った。
幹細胞は、分化過程を経ながら遺伝子発現の様相が著しく変化することを観察することができる。一般的に、幹細胞が脂肪細胞へ分化をするようになると、PPAR−γ(Peroxisome Proloferator-activated Receptor-γ)やFABP4(Fatty Acid Binding Protein
4)のような遺伝子の発現が増加し、骨形成細胞へ分化するようになると、コラーゲン型
1(Collagen Type 1)などの遺伝子発現が増加する(Mat hews et al.,J Am Acad Dermatol,56(3),472-492,2007; Cho et al.,J.Cell.Biochem.,96,533-542,2005)。したがって、分化を誘導した後、特定細胞で発現する遺伝子の発現レベルを見ることによって、間接的に分化を確認することができる。実験方法は、下記の通りである。
DNAを合成し、Maxime PCR PreMix Kit(Intronbio)を用いてP
CRを行った。
た細胞で大きく増加することが見られた。一方、ローディングコントロール(loading control)であるGAPDHの場合、分化を誘導した細胞としない細胞とのいずれも同一に出
たし、したがって、実験結果の正当性を裏付けた。
神経細胞へ分化を誘導するために、一応5%のFBS、10ng/mlのbFGF(basic Fibroblast Growth Factor)を含有したDMEMから構成された培地で24時間前処理(preincubation)した。本格的な神経分化を誘導するために、1%のDMSO、100u
MのBHA、0.5mMのVPA、10mMのKCl、10ng/mlのNGF、B27を含有したDMEMから構成された神経細胞形成培地に24時間処理した。神経細胞へ分化したのか調べるために、細胞を4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)に固定した後、Tuj−1、MAP−2、GFAP、ニューロフィラメント−160(Neurofilament-160)の神経細胞マーカーで免疫染色を行った場合、4種類のマーカーを発現すること
を確認することができた(図8G)。
本実施例は、臍帯血由来の万能幹細胞で網膜(retina)関連特性を調べるために、免疫蛍光染色法を用いて発現程度及びパターンに関して確認した。網膜(retina)だけで特異的に発現するタンパク質の発現様相を確認した。
proteinは、網膜を構成する細胞のうちの1つである神経節細胞(ganglion cell)及びアマクリン細胞(amacrine cell)で特異的に発現するタンパク質である。一般的な細胞培養状態では発現しないことを確認した。B)では、オプシン(Opsin)とロドプシン(Rhodopsin)との発現様相を確認した。オプシンの場合は、錘体細胞(Cone cell)に特異的に
発現するタンパク質であり、ロドプシンの場合は、杆体細胞(rod cell)に特異的に発現するタンパク質である。一般的な細胞培養状態でオプシンは発現しなかったが、ロドプシンは発現することを確認した。C)では、CRX及びリカバリン(Recoverin)との発現様相
を確認した。CRXは、pan−photoreceptor markerとして知られており、リカバリンは、photoreceptor markerとして知られている。一般的な細胞培養状態では発現しないことを確認した(倍率400倍、scale
bar=50um)。
幹細胞を用いた治療の可能性は、大きく2つに分けられ得る。第1は、損傷された細胞への直接的な分化を介した治療効果であり、第2は、生体内で既存の細胞などに治療効果を示すことができる肯定的な変化を起こす多くのサイトカインや成長因子を分泌する能力である。一般的に、幹細胞は多くのサイトカインまたは成長因子を分泌するものとして知られている(Kim et al.Cytokine.2005)。このような効果をパラクリン効果(paracrine effect)と呼ぶ。本発明によって分離・増殖した臍帯血由来の万能幹細胞のサイトカイン
分泌様相がどうか調べるために、ヒトサイトカイン抗体アレイ(human Cytokine antibody
array)(RaybioTech.Norc ross,USA)を用いて調査して見た。
β、RANTES、CINC−3、エオタキシン(EOTAXIN)、GM−CSF、IFN−γ
、IL−1b、IL−3、IL−6、IL−10、IL12p40、IL13、IL−16、IP−10、レプチン(Leptin)、MCP−2、MIG、MIP−3a、b−NGFm、sTNFRI、PFGF−bbのようなサイトカインなども分泌することを確認することができた(図11A:hUCB−MSC1の配列分析写真、図11B:hUCB−MS
C2、図11C:hUCB−MSC3、図11D:抗体配列手順)。
成体幹細胞は、一般的に培養ディッシュ(culture dish)で単層(monolayer)へ増殖する
。しかし、2Dではない3D状態の球(sphere)で増殖させると、さらに幹性(stemness)の高い細胞を選別して増殖させ得ることを実験を介して確認した。球(sphere)の形成のために培養ディッシュ(culture dish)を0.7%のアガロース(agarose)でコーティングさせ
るが、細胞がディッシュの底に侵透できないようにコーティングは5mm以上になるようにする。細胞を接種(seeding)する時に、単細胞(single cell)間の付着を最小化するために、cm2当り2000個未満の細胞を振り撤いた。このように得られた球(sphere)は、40μmのストレーナ(strainer)を用いて球(sphere)を形成できなかった単細胞(single cell)と区分した。その結果、図12からわかるように、球培養(sphere culture)時に細
胞死せず、球(sphere)を形成して幹細胞の特徴を維持することを観察できる。また、図12A−Dのように、球培養(sphere culture)を介して培養した細胞は、単層(monolayer)
で培養した幹細胞に比べて相対的にOCT4、SOX2などの胚芽マーカー(embryonic marker)の発現が高く示されることを観察できた。
した後、0.1%のゼラチン(gelatin)がコーティングされたディッシュに2×105c
ell/mlで接種(seeding)した後24時間培養した後に臍帯血由来の万能幹細胞を接
種(seeding)した。その結果、図13からわかるように、時間が過ぎることに応じて細胞
がSTO細胞上で胚芽幹細胞(Embryonic stem cell)と類似するように増殖することを観
察できる。
Claims (1)
- ZNF281を発現する臍帯血由来幹細胞であって、下記の特性を有する幹細胞:(a)転写調節因子であるc−mycに対して陽性の免疫学的特性を示す;
(b)細胞の外基質がコーティングされた底に付着して付着後5〜30日間に紡錘形または球形態の細胞集落を成しながら増殖する;
(c)30〜45のCPDL(cumulative population doubling level)を示す;
(d)CD14、CD31、CD34、CD45及びHLA−DRに対して陰性の免疫学的特性を示す;
(e)中胚葉、内胚葉及び外胚葉の細胞に分化可能である;及び、
(f)TIMP−2、TGF−β、RANTES、CINC−3、エオタキシン(EOTAXIN)、GM−CSF、IFN−γ、IL−1b、IL−3、IL−6、IL−8、IL−10、IL12p40、IL13、IL−16、IP−10、レプチン(Leptin)、MCP−2、MIG、MIP−3a、b−NGFm、sTNFRI、PFGF−bbからなる群から選択された少なくとも一つのサイトカインまたはケモカインを分泌する。
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