JP2010207245A - 幹細胞からニューロンを生成する方法および幹細胞を培養するための培地 - Google Patents
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Abstract
【課題】 幹細胞からニューロンを生成する方法に関する。
【解決手段】 本発明は、培地中ニューロンを培養し、結果として得られた混合物中幹細胞を培養することを含む、幹細胞からニューロンを生成する方法に関する。本発明はさらに、基礎培地中ニューロンを培養することにより調製される幹細胞を培養するための培地に関する。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明は、培地中ニューロンを培養し、結果として得られた混合物中幹細胞を培養することを含む、幹細胞からニューロンを生成する方法に関する。本発明はさらに、基礎培地中ニューロンを培養することにより調製される幹細胞を培養するための培地に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は幹細胞からニューロンを生成する方法および幹細胞を培養するための培地に関する。
多くの臨床上一般的な慢性神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロンの変性および死の結果起こる。ニューロンは、上皮細胞および肝細胞と違って、迅速に再生できない。ＣＮＳ中には実際、通常の条件下またはニューロンが損傷を受けた場合のいずれかに複製し、分化できる幹細胞が存在するが、その複製は非常に遅く、ニューロンの分化の割合は非常に低い。ＣＮＳにおける幹細胞のほとんどは、分化して神経膠細胞になり、従って神経変性疾患を救済できない。
神経変性疾患の治療を行う目的でニューロン移植が取り上げられている。研究者らはインビトロおよびインビボの両方において様々な幹細胞からニューロンを生成しようと試みてきた。幹細胞は、自己再生、多能性、増殖、長命および分化をはじめとするある特徴を有すると考えられる。胎児、臍帯血および骨髄は、臨床的用途のためのヒト幹細胞の一般的供給源である。胎児において、中枢神経系の病的変化の治療に利用できる幹細胞は、主に胚盤胞の胚性幹細胞および神経幹細胞であった（非特許文献１）。研究者らは、脊髄損傷を修復するために胚性幹細胞（非特許文献２）または神経幹細胞（非特許文献３）を移植した後、これらの細胞は主に分化して星状膠細胞および乏希突起神経膠細胞になり、ごくわずかの細胞しかニューロン細胞にならないことを明らかにしている。回復が困難であること、移植後の生存率が低いこと、および神経細胞への変化率が非常に低いことに加え、胎児組織の移植は、人道的、法律および倫理的観点における論議によっても阻まれている。
臍帯血の造血幹細胞を直接移植することにより、損傷を受けた神経細胞を修復することはまだ研究されていない。しかしながら、インビトロモデルは、０．００１％のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中で培養された臍帯血の造血幹細胞を神経細胞の前駆体に変換し、次いでこれらの細胞の１０％をさらに神経細胞および神経膠細胞に分化させることができること示している（非特許文献４および５）。臍帯血幹細胞のニューロン細胞への変換率は比較的低いので、臍帯血の研究および適用は主に血液疾患に絞られていた。
骨髄は、赤血球、血小板、単球、顆粒球、およびリンパ球の原種の継続した供給源を提供する造血幹細胞を含む。さらに、骨髄は非造血組織の幹細胞の基準を満たす細胞も含む。成人骨髄から得られる造血幹細胞は、マウスの脳において小神経膠細胞および大神経膠細胞の両方に分化することができると報告されている（非特許文献６）。骨髄間質から得られる非造血幹細胞は、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）または骨髄間葉細胞と呼ばれる。ＢＭＳＣはインビトロにおいて分化して、骨原性、軟骨原性、脂肪生成、筋原性およびその他の系統になることができる（非特許文献７および８）。最近、ＢＭＳＣ（非特許文献９および１０）はインビボで分化してニューロンになることができると報告されている。
多能性細胞からニューロンを生成する前記の方法は全て１つの共通の問題を有する。すなわち、多能性幹細胞のほとんどは分化してニューロンではなく膠細胞（星状細胞、乏突起神経膠細胞など）になる。ＢＭＳＣのインビトロ培養についてのみ、ＢＭＥが神経分化に対して重大な影響を及ぼすことが観察され、これは培養されたＢＭＳＣの約８０％をニューロンに分化させる（非特許文献１１）。しかしながら、ＢＭＥはタンパク質に対して有毒であり、従って人間の身体における使用に適さない（非特許文献１２）。従って、幹細胞をニューロンに変換する有効な方法が依然として必要とされている。
R.L. Rietze et al., 2001, Nature 412: 736-739
J.W. McDonald et al., 1999, Nature Medicine 5: 1410-1412
Q.L. Cao et al., 2001, Experimental Neurology 167: 48-58
J. R. Sanchez-Ramos et al., 2001, Experimental Neurology 171: 109-115
Y. Ha et al., 2001, Neuroreport 12(16): 3523-3527
M. A. Eglitis et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4080-4085
M.F. Pittenger et al., 1999, Science 284: 143-147
B. E. Petersen et al., 1999, Science 284: 1168- 1170
S. A. Azizi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3908-3913
G. C. Kopen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 10711-10716
D. Woodbury et al., 2000, Journal of Neuroscience Research 61: 364-370
K. White et al., 1973, Journal of Pharmaceutical Sciences 62: 237-241
本発明は幹細胞からニューロンを生成する方法であって、ニューロンを培地中で培養し、結果として得られる混合物中で幹細胞を培養することを含む方法を提供する。
本発明はさらに、幹細胞を培養するための培地であって、基礎培地中でニューロンを培養することにより調製される培地をも提供する。
本発明はさらに、幹細胞を培養するための培地であって、基礎培地中でニューロンを培養することにより調製される培地をも提供する。
驚くべきことに、ニューロンを基礎培養培地にて６〜９日間培養することにより調製される培地において培養された幹細胞は、高い割合で（８７％）機能的有糸核分裂後のニューロンに分化できることが見いだされた。
特定の理論に限定されることを望まないが、何らかの物質が、培養されたニューロンから放出され、それが、幹細胞が分化してニューロンになるための最適の条件を提供するものと考えられる。
本発明において使用される「幹細胞」なる用語は任意の未分化の多能性または多型潜在性哺乳動物細胞を意味し、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性腫瘍（ＥＣ）細胞、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）、骨髄造血細胞、臍帯血細胞および臍間葉細胞を包含するが、これらに限定されない。臍間葉細胞を除く前記幹細胞はすべて、分化してニューロンおよび／または神経膠細胞になれることが報告されている。しかしながら、本発明の培養法により、臍間葉細胞さえも高い割合で機能的ニューロンに分化できる。
特定の理論に限定されることを望まないが、何らかの物質が、培養されたニューロンから放出され、それが、幹細胞が分化してニューロンになるための最適の条件を提供するものと考えられる。
本発明において使用される「幹細胞」なる用語は任意の未分化の多能性または多型潜在性哺乳動物細胞を意味し、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性腫瘍（ＥＣ）細胞、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）、骨髄造血細胞、臍帯血細胞および臍間葉細胞を包含するが、これらに限定されない。臍間葉細胞を除く前記幹細胞はすべて、分化してニューロンおよび／または神経膠細胞になれることが報告されている。しかしながら、本発明の培養法により、臍間葉細胞さえも高い割合で機能的ニューロンに分化できる。
従って、任意の哺乳動物幹細胞が本発明の方法における使用に適している。好ましくは、間葉細胞、例えば、ＢＭＳＣまたは臍間葉細胞が用いられる。
本発明の培地を調製するために用いられるニューロンは、哺乳動物の末梢神経系と中枢神経系の両方から得ることができる。好ましくは、ニューロンはＣＮＳ由来のものであり、さらに好ましくは脳由来であり、最も好ましくは海馬由来である。
ニューロンを任意の慣用の培地中で培養して、本発明の培地を得ることができる。本発明の基礎培地として使用するのに好適な培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地を包含するが、これらに限定されない。
本発明において用いられる基礎培地には、細胞培養に一般的に用いられる他の添加物を添加することができる。
本発明の培地を調製するために用いられるニューロンは、哺乳動物の末梢神経系と中枢神経系の両方から得ることができる。好ましくは、ニューロンはＣＮＳ由来のものであり、さらに好ましくは脳由来であり、最も好ましくは海馬由来である。
ニューロンを任意の慣用の培地中で培養して、本発明の培地を得ることができる。本発明の基礎培地として使用するのに好適な培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地を包含するが、これらに限定されない。
本発明において用いられる基礎培地には、細胞培養に一般的に用いられる他の添加物を添加することができる。
本発明では、ニューロンを基礎培地中、通常の方法で３ないし６日間、好ましくは５日間培養する。結果として得られる混合物を、幹細胞を培養するために直接用いることができる。
本発明では、幹細胞を本発明の培地中、通常の方法で、６ないし１２日間培養し、次いで成熟ニューロンを収穫する。好ましくは、ニューロンは培養の第９日目に収穫される。
培養されたニューロンを除去した後、本発明の培地を等分して、さらに使用するために貯蔵することができる。
本発明では、幹細胞を本発明の培地中、通常の方法で、６ないし１２日間培養し、次いで成熟ニューロンを収穫する。好ましくは、ニューロンは培養の第９日目に収穫される。
培養されたニューロンを除去した後、本発明の培地を等分して、さらに使用するために貯蔵することができる。
次の分析は、本発明の方法により調製されるニューロンを特徴づけるために行われる。
ＮＦ免疫細胞化学
神経フィラメント（ＮＦ）はニューロンにおける主要な細胞骨格であり、これはニューロンの樹状突起の大きさ、外観および直径を調節する。後期発生段階のニューロンまたは成熟ニューロンのみがＮＦを発現する。ＮＦの免疫染色は後期のニューロンを認識するために利用される。
ＮｅｕＮ免疫細胞化学
ニューロン特異性核タンパク質（ＮｅｕＮ）は脊椎動物の中枢神経系においてニューロンの核中に存在する特定のタンパク質である。ＮｅｕＮはインビトロでＤＮＡと結合する。ＮｅｕＮはニューロンの発生中にＮＦよりも早期に出現することが知られている。従って、ＮｅｕＮの免疫染色は、変換の早期段階のニューロンを識別するために利用される。
ＮＦ免疫細胞化学
神経フィラメント（ＮＦ）はニューロンにおける主要な細胞骨格であり、これはニューロンの樹状突起の大きさ、外観および直径を調節する。後期発生段階のニューロンまたは成熟ニューロンのみがＮＦを発現する。ＮＦの免疫染色は後期のニューロンを認識するために利用される。
ＮｅｕＮ免疫細胞化学
ニューロン特異性核タンパク質（ＮｅｕＮ）は脊椎動物の中枢神経系においてニューロンの核中に存在する特定のタンパク質である。ＮｅｕＮはインビトロでＤＮＡと結合する。ＮｅｕＮはニューロンの発生中にＮＦよりも早期に出現することが知られている。従って、ＮｅｕＮの免疫染色は、変換の早期段階のニューロンを識別するために利用される。
ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティング
グルタメートは哺乳動物ＣＮＳにおける主な興奮性神経伝達物質である。ほとんどのニューロンは興奮シグナルを受容するためにグルタメートレセプターを有する。主に２種のグルタメートレセプターのグループ：イオノトロピータイプとメタボトロピータイプがある。イオノトロピータイプレセプターは、その異なる選択的作用物質により、さらに：ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）レセプター、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）レセプター、およびＫＡ（カイネート）レセプターに分類できる。ＫＡレセプターはサブユニットＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１およびＫＡ２から形成される。従って、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティングは機能的タンパク質を合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
グルタメートは哺乳動物ＣＮＳにおける主な興奮性神経伝達物質である。ほとんどのニューロンは興奮シグナルを受容するためにグルタメートレセプターを有する。主に２種のグルタメートレセプターのグループ：イオノトロピータイプとメタボトロピータイプがある。イオノトロピータイプレセプターは、その異なる選択的作用物質により、さらに：ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）レセプター、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）レセプター、およびＫＡ（カイネート）レセプターに分類できる。ＫＡレセプターはサブユニットＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１およびＫＡ２から形成される。従って、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティングは機能的タンパク質を合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
Ｃａ２＋結合タンパク質免疫細胞化学
Ｃａ２＋は細胞のシグナル変換経路において重要な役割を果たす。しかしながら、たいていのＣａ２＋は細胞において単独で作用せず、Ｃａ２＋結合タンパク質により結合されて作用する。Ｃａ２＋結合タンパク質は、細胞中のＣａ２＋の濃度を緩衝し、さらにＣａ２＋の活性を調節する。ＣＮＳ中には多くのＣａ２＋結合タンパク質が存在し、最も広い分布を有するものは、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルビンジン−Ｄ２８Ｋ（ＣＢ）およびカルレチニンである。ＰＶおよびＣＢは両方ともＥＦハンドタイプのＣａ２＋結合タンパク質ファミリーに属する。胚の神経系の発生中、ＰＶおよびＣＢはニューロンにより特異的に発現されるＣａ２＋結合タンパク質と考えられる。従って、ＰＶおよびＣＢの免疫染色は、機能的タンパク質を合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
Ｃａ２＋は細胞のシグナル変換経路において重要な役割を果たす。しかしながら、たいていのＣａ２＋は細胞において単独で作用せず、Ｃａ２＋結合タンパク質により結合されて作用する。Ｃａ２＋結合タンパク質は、細胞中のＣａ２＋の濃度を緩衝し、さらにＣａ２＋の活性を調節する。ＣＮＳ中には多くのＣａ２＋結合タンパク質が存在し、最も広い分布を有するものは、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルビンジン−Ｄ２８Ｋ（ＣＢ）およびカルレチニンである。ＰＶおよびＣＢは両方ともＥＦハンドタイプのＣａ２＋結合タンパク質ファミリーに属する。胚の神経系の発生中、ＰＶおよびＣＢはニューロンにより特異的に発現されるＣａ２＋結合タンパク質と考えられる。従って、ＰＶおよびＣＢの免疫染色は、機能的タンパク質を合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重標識
ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）は細胞および核膜を自由に横切り、核中のＤＮＡと結合できる蛍光色素であり、通常、細胞の数を定量化するために用いられる。さらに、複製中、細胞は、染色体のさらなる組を合成することを必要とし、チミジンの類似体である添加されたＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）を合成された染色体中に組み入れる。従って、ＢｒｄＵ取り込みの観察は細胞の複製を確認するために利用される。ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重標識はニューロンの複製を確認できる。
ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）は細胞および核膜を自由に横切り、核中のＤＮＡと結合できる蛍光色素であり、通常、細胞の数を定量化するために用いられる。さらに、複製中、細胞は、染色体のさらなる組を合成することを必要とし、チミジンの類似体である添加されたＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）を合成された染色体中に組み入れる。従って、ＢｒｄＵ取り込みの観察は細胞の複製を確認するために利用される。ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重標識はニューロンの複製を確認できる。
ＢｒｄＵおよびＮＦ二重標識
前記のように、ＮＦの免疫染色はニューロンを確認するために利用され、ＢｒｄＵ標識は細胞の複製を確認するために利用される。ＮＦおよびＢｒｄＵ二重標識はニューロンの複製能力を確認できる。
ＧＡＤ免疫細胞化学
神経伝達物質の一つであるＧＡＢＡのグルタミン酸からの合成は、酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）により触媒される。従って、ＧＡＤの免疫染色は神経伝達物質ＧＡＢＡを合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
本発明の方法から生成されるニューロンは、神経変成疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側策硬化症または発作および外傷から誘発されるニューロンの死の治療において用いることができる。
本発明はさらに、以下の実施例により説明されるが、この実施例は本発明の範囲に対する制限と見なすべきではない。
前記のように、ＮＦの免疫染色はニューロンを確認するために利用され、ＢｒｄＵ標識は細胞の複製を確認するために利用される。ＮＦおよびＢｒｄＵ二重標識はニューロンの複製能力を確認できる。
ＧＡＤ免疫細胞化学
神経伝達物質の一つであるＧＡＢＡのグルタミン酸からの合成は、酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）により触媒される。従って、ＧＡＤの免疫染色は神経伝達物質ＧＡＢＡを合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
本発明の方法から生成されるニューロンは、神経変成疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側策硬化症または発作および外傷から誘発されるニューロンの死の治療において用いることができる。
本発明はさらに、以下の実施例により説明されるが、この実施例は本発明の範囲に対する制限と見なすべきではない。
ヒト臍間葉細胞の調製
分娩を取り扱う診療所、Tsai産科クリニック(72, Sec. 1, Shi Pai Rd., Beitou, Taipei)からヒト臍帯を入手した。無菌操作により臍帯を採取し、ＨＢＳＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌ２０１−１０）中４℃で２４時間以下保存した。
臍帯をまず衛生化のために３０秒間７５％エタノール中に浸漬した。衛生化された臍帯を、無菌層流中、無Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋緩衝液（ＣＭＦ、Ｇｉｂｃｏ１４１８５−０５２）中に入れ、オートクレーブ滅菌された道具で縦に切断し、これから血管および間葉組織（ホウォートンゼリー）を除去した。間葉組織をさいの目に切って約０．５ｃｍ３の立方体にし、２５０ｘｇで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、適当な量の無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１２１００−０４６）を添加し、２５０ｘｇで５分間遠心分離にかけることにより沈殿（間葉組織）を２回洗浄した。間葉組織をコラゲナーゼで３７℃で１４〜１８時間処理し、洗浄し、次いで３７℃で３０分間撹拌下、２．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ１５０９０−０４６）で処理した。ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７１．０３）を間葉組織に添加して、トリプシンの活性を失活させた。この時点で、間葉組織は間葉細胞になった。
間葉細胞を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理して分散させ、計数した。間葉細胞はこれで培養に直接用いることができる。
分娩を取り扱う診療所、Tsai産科クリニック(72, Sec. 1, Shi Pai Rd., Beitou, Taipei)からヒト臍帯を入手した。無菌操作により臍帯を採取し、ＨＢＳＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌ２０１−１０）中４℃で２４時間以下保存した。
臍帯をまず衛生化のために３０秒間７５％エタノール中に浸漬した。衛生化された臍帯を、無菌層流中、無Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋緩衝液（ＣＭＦ、Ｇｉｂｃｏ１４１８５−０５２）中に入れ、オートクレーブ滅菌された道具で縦に切断し、これから血管および間葉組織（ホウォートンゼリー）を除去した。間葉組織をさいの目に切って約０．５ｃｍ３の立方体にし、２５０ｘｇで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、適当な量の無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１２１００−０４６）を添加し、２５０ｘｇで５分間遠心分離にかけることにより沈殿（間葉組織）を２回洗浄した。間葉組織をコラゲナーゼで３７℃で１４〜１８時間処理し、洗浄し、次いで３７℃で３０分間撹拌下、２．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ１５０９０−０４６）で処理した。ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７１．０３）を間葉組織に添加して、トリプシンの活性を失活させた。この時点で、間葉組織は間葉細胞になった。
間葉細胞を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理して分散させ、計数した。間葉細胞はこれで培養に直接用いることができる。
ニューロン−培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの調製
ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの調製に用いられるニューロンを、７日令のスプラグ・ドーリーラット（the Animal Center of National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan, ROC）の脳から入手した。
２４ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを含有する５０ｍｌの遠心管を、その後の操作の前に３７℃のインキュベーター中に入れた。
ｉ．ｐ．注射により０．３ｍｌの１０％塩化物水和物をラットに投与した。３〜４分後、全身麻酔されたラットの全身を７５％エタノールで消毒した。無菌層流中、ラットの脳を除去し、ＣＭＦ中に入れた。脳を９００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを沈殿（脳組織）に添加した。脳組織を１５回ピペットで移して単一細胞中に分散させた。細胞分散液を前記のようにして調製した５０ｍｌの遠心管に添加し、内部でＦＢＳ−ＤＭＥＭとよく混合した。混合物を２４ウェルプレートのポリ−Ｌ−リシンでコートされたウェル中に添加し、３７℃のインキュベーター中で培養した。次の日、Ａｒａｃを培養物に最終濃度２μＭまで添加した。
培養の第５日に培地を除去して、臍間葉細胞の培養に使用した。
ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの調製に用いられるニューロンを、７日令のスプラグ・ドーリーラット（the Animal Center of National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan, ROC）の脳から入手した。
２４ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを含有する５０ｍｌの遠心管を、その後の操作の前に３７℃のインキュベーター中に入れた。
ｉ．ｐ．注射により０．３ｍｌの１０％塩化物水和物をラットに投与した。３〜４分後、全身麻酔されたラットの全身を７５％エタノールで消毒した。無菌層流中、ラットの脳を除去し、ＣＭＦ中に入れた。脳を９００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを沈殿（脳組織）に添加した。脳組織を１５回ピペットで移して単一細胞中に分散させた。細胞分散液を前記のようにして調製した５０ｍｌの遠心管に添加し、内部でＦＢＳ−ＤＭＥＭとよく混合した。混合物を２４ウェルプレートのポリ−Ｌ−リシンでコートされたウェル中に添加し、３７℃のインキュベーター中で培養した。次の日、Ａｒａｃを培養物に最終濃度２μＭまで添加した。
培養の第５日に培地を除去して、臍間葉細胞の培養に使用した。
臍間葉細胞のニューロンへの変換
実施例１において得られた臍間葉細胞を、実施例２において調製されたニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中またはＦＢＳ−ＤＭＥＭ中（対照）、３７℃のインキュベーター中、で培養した。培養された細胞を第３日、６日、９日および１２日に採取した。
図１（Ａ）に示すように、ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中６日間（対照）の臍間葉細胞培養物の形態は紡錘形を示し、増殖のために互いに密接に結合していた。ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中６日間培養された臍間葉細胞は、細胞体退縮、プロセス加工、および細胞クラスターを含むニューロン表現型を示した（図１Ｂ）。
実施例１において得られた臍間葉細胞を、実施例２において調製されたニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中またはＦＢＳ−ＤＭＥＭ中（対照）、３７℃のインキュベーター中、で培養した。培養された細胞を第３日、６日、９日および１２日に採取した。
図１（Ａ）に示すように、ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中６日間（対照）の臍間葉細胞培養物の形態は紡錘形を示し、増殖のために互いに密接に結合していた。ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中６日間培養された臍間葉細胞は、細胞体退縮、プロセス加工、および細胞クラスターを含むニューロン表現型を示した（図１Ｂ）。
分析
実施例３において採取した細胞を以下の分析に供して、その結果を以下に記載する：
（Ｉ）ＮＦ免疫染色
カバーガラス上で６日間成長する細胞を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いでブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
処置された細胞を次いで第一の抗体（ウサギ抗神経フィラメント２００ポリクローナルＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１９８２）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：１０００希釈、Ｓｉｇｍａ ｂ−８８９５）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いで３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
実施例３において採取した細胞を以下の分析に供して、その結果を以下に記載する：
（Ｉ）ＮＦ免疫染色
カバーガラス上で６日間成長する細胞を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いでブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
処置された細胞を次いで第一の抗体（ウサギ抗神経フィラメント２００ポリクローナルＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１９８２）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：１０００希釈、Ｓｉｇｍａ ｂ−８８９５）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いで３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２）下で観察した。
図２（Ａ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＮＦを発現し、このことは、これらがニューロンに変換されたことを示唆する。
ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭでの処理後の様々な時間で、ＮＦを発現する臍間葉細胞の割合を測定した。図３に示すように、５９．４％の臍間葉細胞が処理後第３日にＮＦを発現し、ＮＦを発現する細胞の割合は処理後第６日に最大の８７．４％に達した。この割合は時間とともに増大も、減少もしなかった（ｎ＝３、ワンウェイＡＮＯＶＡ、続いてＬＳＤ試験；ｐ＜０．０１）。
図２（Ａ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＮＦを発現し、このことは、これらがニューロンに変換されたことを示唆する。
ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭでの処理後の様々な時間で、ＮＦを発現する臍間葉細胞の割合を測定した。図３に示すように、５９．４％の臍間葉細胞が処理後第３日にＮＦを発現し、ＮＦを発現する細胞の割合は処理後第６日に最大の８７．４％に達した。この割合は時間とともに増大も、減少もしなかった（ｎ＝３、ワンウェイＡＮＯＶＡ、続いてＬＳＤ試験；ｐ＜０．０１）。
（ＩＩ）ＮｅｕＮ免疫染色：
カバーガラス上６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いでブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を第一の抗体（マウス抗ニューロン核モノクローナルＩｇＧ、１：１００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３７７）と４℃で少なくとも３６時間から４２時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＰ１２４Ｂ）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２）下で観察した。
図２（Ｂ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＮＦを発現し、このことは、これらがニューロンに変換されたことを示唆する。
カバーガラス上６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いでブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を第一の抗体（マウス抗ニューロン核モノクローナルＩｇＧ、１：１００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３７７）と４℃で少なくとも３６時間から４２時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＰ１２４Ｂ）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２）下で観察した。
図２（Ｂ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＮＦを発現し、このことは、これらがニューロンに変換されたことを示唆する。
（ＩＩＩ）ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティング
（ａ）細胞膜の調製
異なる時間、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理された臍間葉細胞および７日令ラットの脳から細胞膜を調製した。培養された細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液で３分間２回洗浄した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を細胞に４℃で添加し、細胞を培養皿からスクレーパーで削りとった。削り取られた細胞を１５ｍｌテフロンガラスホモジナイザー中に入れ、２０回粉砕して均質化し、次いで３００００ｇで３０分間、４℃で遠心分離にかけた。ほとんど細胞膜である得られたペレットを再び粉砕し、適当な体積のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、後に使用するために−２０℃の冷蔵庫中に保存した。
（ｂ）タンパク質濃度の決定
ウェスタンブロッティング分析において使用するために、前記で得られた各サンプル中のタンパク質の濃度を、５９５ｎｍでの吸収を測定することにより決定した。タンパク質濃度の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に基づいて行った（MM. Bradford, 1976, Analytical Biochemistry 72: 248-254.）。
（ａ）細胞膜の調製
異なる時間、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理された臍間葉細胞および７日令ラットの脳から細胞膜を調製した。培養された細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液で３分間２回洗浄した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を細胞に４℃で添加し、細胞を培養皿からスクレーパーで削りとった。削り取られた細胞を１５ｍｌテフロンガラスホモジナイザー中に入れ、２０回粉砕して均質化し、次いで３００００ｇで３０分間、４℃で遠心分離にかけた。ほとんど細胞膜である得られたペレットを再び粉砕し、適当な体積のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、後に使用するために−２０℃の冷蔵庫中に保存した。
（ｂ）タンパク質濃度の決定
ウェスタンブロッティング分析において使用するために、前記で得られた各サンプル中のタンパク質の濃度を、５９５ｎｍでの吸収を測定することにより決定した。タンパク質濃度の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に基づいて行った（MM. Bradford, 1976, Analytical Biochemistry 72: 248-254.）。
（ｃ）電気泳動
サンプル中のタンパク質を２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲル中の分離されたタンパク質を次いでウェスタンブロッティング分析を行うためにＰＶＤＦ紙（ＮＥＷ、ＮＥＦ１００２）上に移した。
（ｄ）ウェスタンブロッティング
タンパク質を含有するＰＶＤＦ紙をＴＢＳ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３０分間２回洗浄した。ＴＢＳ緩衝液中に溶解させた５％スキムミルク粉末を用いて６０分間ブロッキングを行った。次いで、ＰＶＤＦ紙をブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％正常ヤギ血清および３％ＢＳＡ）中に６０分間浸漬し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、第一の抗体（ウサギ抗ＫＡ２ポリクローナルＩｇＧ、１：１８００希釈、ＵＰＳＴＡＴＥ０６−３１５；ヤギ抗ＧｌｕＲ５ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６１７；ヤギ抗ＧｌｕＲ６ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６１８：ヤギ抗ＧｌｕＲ７ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６２０；およびウサギ抗グルタメートデカルボキシラーゼポリクローナルＩｇＧ、１：１５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１０８）と４℃で１２〜１８時間反応させた。
サンプル中のタンパク質を２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲル中の分離されたタンパク質を次いでウェスタンブロッティング分析を行うためにＰＶＤＦ紙（ＮＥＷ、ＮＥＦ１００２）上に移した。
（ｄ）ウェスタンブロッティング
タンパク質を含有するＰＶＤＦ紙をＴＢＳ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３０分間２回洗浄した。ＴＢＳ緩衝液中に溶解させた５％スキムミルク粉末を用いて６０分間ブロッキングを行った。次いで、ＰＶＤＦ紙をブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％正常ヤギ血清および３％ＢＳＡ）中に６０分間浸漬し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、第一の抗体（ウサギ抗ＫＡ２ポリクローナルＩｇＧ、１：１８００希釈、ＵＰＳＴＡＴＥ０６−３１５；ヤギ抗ＧｌｕＲ５ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６１７；ヤギ抗ＧｌｕＲ６ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６１８：ヤギ抗ＧｌｕＲ７ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６２０；およびウサギ抗グルタメートデカルボキシラーゼポリクローナルＩｇＧ、１：１５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１０８）と４℃で１２〜１８時間反応させた。
反応が完了した後、ＰＶＤＦ紙をＴＴＢＳ（０．０５％ＴＢＳ中Ｔｗｅｅｎ−２０）で３０分間２回洗浄し、ブロッキング溶液中に６０分間浸漬し、次いで第二の抗体（ＧｌｕＲ５／６／７については、ビオチン−抗ヤギ／ヒツジＩｇＧ、１：２００希釈、Ｓｉｇｍａ Ｂ−３１４８；およびＫＡＲ２／ＧＡＤについてはビオチン−抗ウサギＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＰ１８７Ｂ）と室温で１時間反応させた。反応したＰＶＤＦ紙をＴＴＢＳで３０分間２回洗浄し、アビジン−ビオチニル化−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ、再びＴＴＢＳで３０分間２回洗浄し、最後にＤＡＢ（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２、ｐＨ７．４）で発色させた。
図４に示されるように、カイニン酸レセプター（ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）サブユニットは、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの処理前の臍間葉細胞において発現されなかった。ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭでの処理の６日目に、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２を包含するカイニン酸レセプターサブユニットは少量で発現され、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２は１２日目に著しく発現された。
図４に示されるように、カイニン酸レセプター（ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）サブユニットは、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの処理前の臍間葉細胞において発現されなかった。ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭでの処理の６日目に、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２を包含するカイニン酸レセプターサブユニットは少量で発現され、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２は１２日目に著しく発現された。
（ＩＶ）パルブアルブミン（ＰＶ）およびカルビンジン−Ｄ２８Ｋ（ＣＢ）免疫染色：
カバーガラス上で６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドおよび７．５％ピリン酸）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次いで第一の抗体（ヤギ抗パルブアルブミンポリクローナルＩｇＧ、１：４０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７４４９；およびヤギ抗カルビンジンポリクローナルＩｇＧ、１：４０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６９１）と４℃で少なくとも１２から１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合マウス抗ヤギ／ヒツジモノクローナルＩｇＧ，１：２５０希釈、Ｓｉｇｍａ Ｂ３１４８）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し、３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
カバーガラス上で６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドおよび７．５％ピリン酸）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次いで第一の抗体（ヤギ抗パルブアルブミンポリクローナルＩｇＧ、１：４０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７４４９；およびヤギ抗カルビンジンポリクローナルＩｇＧ、１：４０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７６９１）と４℃で少なくとも１２から１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合マウス抗ヤギ／ヒツジモノクローナルＩｇＧ，１：２５０希釈、Ｓｉｇｍａ Ｂ３１４８）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し、３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２）下で観察した。
図５に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で９日間培養された臍間葉細胞は、パルブアルブミン（図５Ａ）およびカルビンジン−Ｄ２８Ｋ（図５Ｂ）の両方を発現し、このことは２つのＣａ２＋結合タンパク質を合成できるニューロンに変換されたことを示唆する。
図５に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で９日間培養された臍間葉細胞は、パルブアルブミン（図５Ａ）およびカルビンジン−Ｄ２８Ｋ（図５Ｂ）の両方を発現し、このことは２つのＣａ２＋結合タンパク質を合成できるニューロンに変換されたことを示唆する。
（Ｖ）ＧＡＤ免疫染色およびウェスタンブロッティング：
カバーガラス上６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドおよび７．５％ピリン酸）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次に第一の抗体（ウサギ抗グルタメートデカルボキシラーゼポリクローナルＩｇＧ、１：１５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１０８）と４℃で少なくとも１２から１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：３００希釈、Ｓｉｇｍａ ｂ−８８９５）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
カバーガラス上６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドおよび７．５％ピリン酸）で２０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次に第一の抗体（ウサギ抗グルタメートデカルボキシラーゼポリクローナルＩｇＧ、１：１５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１０８）と４℃で少なくとも１２から１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：３００希釈、Ｓｉｇｍａ ｂ−８８９５）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ ＤＡＢ、１０μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２）下で観察した。
図６（Ａ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＧＡＤを発現し、このことは、これらが神経伝達物質ＧＡＢＡを合成できるニューロンに変換されたことを示唆する。図６（Ｂ）に示すように、臍間葉細胞のＧＡＤを発現する能力は、処理後６日目に誘発され、ＧＡＤ発現レベルは第１２日に著しく増大した。
（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の結果は、本発明の方法により誘導されるニューロンは機能的であり、ニューロンに特徴的なタンパク質および神経伝達物質を合成できることを証明する。
図６（Ａ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＧＡＤを発現し、このことは、これらが神経伝達物質ＧＡＢＡを合成できるニューロンに変換されたことを示唆する。図６（Ｂ）に示すように、臍間葉細胞のＧＡＤを発現する能力は、処理後６日目に誘発され、ＧＡＤ発現レベルは第１２日に著しく増大した。
（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の結果は、本発明の方法により誘導されるニューロンは機能的であり、ニューロンに特徴的なタンパク質および神経伝達物質を合成できることを証明する。
（ＶＩ）ＤＡＰＩ染色
処理後、細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液で２回、それぞれ５分間洗浄し、次いで５０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで３０分間染色した。細胞を次いでＴｒｉｓ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ＝７．３）でよく洗浄し、マウンティング培地（Ｔｒｉｓ：グリセロール＝１：１）で取り付け、蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、計数した。
図７（Ａ）は、細胞密度を示す顕微鏡写真である。処理後０、第３日、６日および９日の細胞数を測定するためにＤＡＰＩ標識（青）を行った。図７（Ｂ）はニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中での処理の様々な時間の後の臍間葉細胞の細胞密度を示す。様々な処理後の時点で、細胞密度における変化を測定するためにＤＡＰＩ染色を行った。結果は、処理後第９日の細胞密度は第３日よりも著しく高いことを示した（ｎ＝３、ワンウェイＡＮＯＶＡ続いてＬＳＤ試験；Ｐ＜０．０１）。
（ＶＩＩ）ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重染色
カバーガラス上で成長する細胞により、最終濃度５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ Ｂ−５００２、５０ｍＭストック溶液として調製）が得られ、２４時間さらに成長させた。細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（５０ｍＭグリシン緩衝液中７０％エタノール、ｐＨ２．０）で−２０℃で３０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理後、細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液で２回、それぞれ５分間洗浄し、次いで５０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで３０分間染色した。細胞を次いでＴｒｉｓ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ＝７．３）でよく洗浄し、マウンティング培地（Ｔｒｉｓ：グリセロール＝１：１）で取り付け、蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、計数した。
図７（Ａ）は、細胞密度を示す顕微鏡写真である。処理後０、第３日、６日および９日の細胞数を測定するためにＤＡＰＩ標識（青）を行った。図７（Ｂ）はニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中での処理の様々な時間の後の臍間葉細胞の細胞密度を示す。様々な処理後の時点で、細胞密度における変化を測定するためにＤＡＰＩ染色を行った。結果は、処理後第９日の細胞密度は第３日よりも著しく高いことを示した（ｎ＝３、ワンウェイＡＮＯＶＡ続いてＬＳＤ試験；Ｐ＜０．０１）。
（ＶＩＩ）ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重染色
カバーガラス上で成長する細胞により、最終濃度５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ Ｂ−５００２、５０ｍＭストック溶液として調製）が得られ、２４時間さらに成長させた。細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（５０ｍＭグリシン緩衝液中７０％エタノール、ｐＨ２．０）で−２０℃で３０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次いで第一の抗体（マウス抗ＢｒｄＵモノクローナルＩｇＧ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３２２２、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中０．６６ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭβ−メルカプトエタノールで１：１００希釈）と４℃で少なくとも３６〜４２時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（フルオレセイン接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＰ１２４Ｆ）および１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ｄ９５４２）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄した。カバーガラスをスライド上にマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｈ−１０００）で取り付け、マニキュア液で密封し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０）下で観察した。単位面積内の合計細胞数およびＢｒｄＵ標識された細胞数を計数する。
（ＶＩＩＩ）ＢｒｄＵおよびＮＦ二重染色
カバーガラス上で成長する細胞により、最終濃度５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ Ｂ−５００２、５０ｍＭストック溶液として調製）が得られ、２４時間さらに成長させた。細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（５０ｍＭグリシン緩衝液中７０％エタノール、ｐＨ２．０）で−２０℃で３０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
カバーガラス上で成長する細胞により、最終濃度５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ Ｂ−５００２、５０ｍＭストック溶液として調製）が得られ、２４時間さらに成長させた。細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（５０ｍＭグリシン緩衝液中７０％エタノール、ｐＨ２．０）で−２０℃で３０分間固定し；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次いで第一の抗体（マウス抗ＢｒｄＵモノクローナルＩｇＧ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３２２２、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中０．６６ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭβ−メルカプトエタノールで１：１００希釈）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；もう一つの第一の抗体（ウサギ抗神経フィラメントポリクローナルＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１９８２）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（フルオレセイン接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＰ１２４Ｆ；およびローダミン接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＰ１３２Ｒ）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ ＰＢＳで５分間３回洗浄した。カバーガラスをスライド上にマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｈ−１０００）で取り付け、マニキュア液で密封し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０）下で観察した。
図８は、ニューロン培養１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで３日間処理された臍間葉細胞の増殖分析の結果を示す（Ａ〜Ｆ）。ＤＡＰＩで標識された細胞のほとんど（Ａにおいて青色）はＢｒｄＵ陽性であった（Ｂにおいて緑色）。（Ｃ）は（Ｃ）と（Ｄ）の結果を合わせたものである。処理後第３日に、これらの細胞は、ＮＦを発現する細胞（Ｄにおいて赤色）にすでに分化しているが、依然としてＢｒｄＵで標識された（Ｅにおいて緑色）。（Ｆ）は（Ｄ）と（Ｅ）の結果を合わせたものである。ニューロン培養１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理した後第９日の細胞はその増殖能力を失った（Ｇ〜Ｌ）。ＤＡＰＩで標識された細胞はすべて（Ｇにおいて青色）ＢｒｄＵ陰性であった（Ｈにおいて緑色）。（Ｉ）は（Ｇ）と（Ｈ）の結果を合わせたものである。処理後第９日に、ＮＦを発現する細胞（Ｊにおいて赤色）に分化したこれらの細胞は、ほとんどＢｒｄＵで標識されなかった（Ｋにおいて緑色）。（Ｌ）は（Ｊ）および（Ｋ）の結果を合わせたものである。要約すると、細胞のほとんどはニューロンに変換され、第９日に増殖を停止し、このことは第９日のニューロンは有糸核分裂後の段階に入ったことを示唆する。
（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の結果は、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭと共に培養された臍間葉細胞は増殖し、分化して、ニューロンになることができることを示す。
（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の結果は、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭと共に培養された臍間葉細胞は増殖し、分化して、ニューロンになることができることを示す。
前記載事項から、当業者らは、本発明の本質的特徴を容易に理解することができ、その精神および範囲から逸脱することなく本発明を様々に変更および修飾し、様々な用途および条件に適用することができる。
Claims (1)
- 培養培地においてヒトを除く動物の海馬細胞（ニューロンを含む）を培養し、該海馬細胞の培養液から取り出した培地中で幹細胞を培養することを特徴とする、幹細胞からニューロンを生成させる方法。
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| WO2002086108A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Hyun Soo Kim | Method for differentiating mesenchymal stem cells into neural cells |
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|---|---|---|---|---|
| WO2002086108A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Hyun Soo Kim | Method for differentiating mesenchymal stem cells into neural cells |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JPN6012039338; Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． Ｖｏｌ．１２, 2003, ｐ．６８１-６８８ * |
| JPN6012039340; Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｖｏｌ．３２, 1995, ｐ．１９７-２１０ * |
| JPN6012039345; Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． Ｖｏｌ．８９, 1998, ｐ．２９７-３０２ * |
| JPN6012039348; Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｖｏｌ．１９， Ｎｏ．１, 1999, ｐ．１３３-１４６ * |
| JPN6013019032; Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｖｏｌ．８７, 1990, ｐ．５４５４-５４５８ * |
| JPN6013019034; Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．１２４, 1993, ｐ．３６８-３７１ * |
| JPN6013019035; ＥＭＢＯ Ｊ． Ｖｏｌ．９， Ｎｏ．８, 1990, ｐ．２４５９-２４６４ * |
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